JPH09220098A - α−アミラーゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 醸造物由来の至適ｐＨが３．０以上５．０未
満であるα−アミラーゼを含有する試料に、エキソ型糖
加水分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導体と
共役酵素系とを添加して酵素反応を行わせ、遊離する化
合物を定量してα−アミラーゼを測定する。 【効果】 醸造物由来のα−アミラーゼを、極めて簡便
に、短時間に、精度（感度）よく測定でき、さらに多数
の試料を同時に測定することができる。例えば清酒、焼
酎、みりん、醤油、みそなどの製造に供されるアスペル
ギルス属などを用いた麹、培養物、もろみ中のα−アミ
ラーゼ測定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、醸造物に由来する
α−アミラーゼを含有する試料中のα−アミラーゼの測
定方法であり、さらに詳しくは、本発明は、例えば清
酒、焼酎、みりんなどの酒類製造、醤油、みそなどの食
品類製造などに用いられる至適ｐＨが酸性域であるα−
アミラーゼを含有する麹、培養物、もろみなどの試料中
の該α−アミラーゼを測定する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】通常、清酒、焼酎、みりん、醤油、みそ
などを製造する際には、麹などが利用されており、それ
らは、先ず常法により蒸煮などの処理をした炭水化物原
料又は炭水化物原料とタンパク質原料とを混合した原料
に、例えばアスペルギルス属に属する麹菌などを接種
し、所定期間培養して麹が製造される。前記麹中には、
麹菌によりα−アミラーゼ、プロテアーゼなどの酵素が
生産され、これらの酵素により原料が分解され、生じた
グルコースやアミノ酸の量は、その後の発酵工程及び製
品の品質に大きく影響する。特に清酒、焼酎などの醸造
においては、アスペルギルス属の生産するα−アミラー
ゼの活性が、その後の酵母によるアルコール発酵などの
出発原料となるグルコースの量に大きく関わることか
ら、もろみの発酵に大きな影響を与えることとなる。従
って、例えば麹中のα−アミラーゼ活性を正しく把握し
ておくことは、酒類、食品の発酵管理の上で非常に重要
な意義を有している。このようなことから、α−アミラ
ーゼを簡便に測定することは、酒類製造、食品製造、あ
るいはα−アミラーゼを用いてぶどう糖、水飴などを製
造するデンプン加工工業などの業者から強く要望されて
いるところである。

【０００３】従来、醸造物に由来するα−アミラーゼ含
有試料中のα−アミラーゼを測定する方法として、例え
ば、試料中に、可溶性デンプンを添加して一定時間反
応させ、ヨウ素溶液を加えて比色定量する方法（国税庁
所定分析法注解、第四回改正、第２１８〜２２１頁、１
９９３年）、試料中に、可溶性デンプンあるいはアミ
ロースを添加して反応させ、遊離する還元糖の増加量を
定量する方法（ジ・エンザイムズ（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ）、第３版、第５巻、第１１５頁、１９７１年）、
試料中に、可溶性デンプンを添加して反応させ、散乱
光量の減少を測定する方法（日本醸造協会誌、第７９
巻、第５６〜５８頁、１９８４年）などが知られてい
る。

【０００４】しかしながら、前記〜に示す方法は、
基質として可溶性デンプンあるいはアミロースなどの天
然基質を用いるため該品質のバラツキがあることから、
測定値にバラツキを生じて精度に難点があること、天然
基質溶解液は長期間保存できないため、測定の都度、基
質液を調製する必要があること、操作が煩雑で測定に熟
練を要すること、あるいはα−アミラーゼ含有試料を一
夜透析しなければならず、短時間で測定できないことな
どの欠点を有する。

【０００５】一方、近年、至適ｐＨが６．０〜８．０の
ヒトに由来するα−アミラーゼを対象とした臨床化学の
分野では、α−アミラーゼ含有試料中に、マルトペン
タオースあるいはマルトテトラオースと共役酵素系とを
添加して反応させ、最終生成物、例えば還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）などを定量
する方法（アミラーゼ、第１６５〜１６７頁、１９８６
年、学会出版センター出版）、α−アミラーゼ含有試
料中に、エキソ型糖加水分解酵素で切断されないマルト
オリゴシド誘導体と共役酵素系とを添加して酵素反応を
行わせ、遊離する化合物を定量する方法（臨床化学検査
領域におけるアミラーゼ研究情報誌・アミラーゼ、特集
・第１回アミラーゼ公開勉強会、第１巻、第１号、第８
３〜８７頁、１９９４年）などが知られている。

【０００６】しかしながら、に示す方法に関しては、
醸造物、例えばアスペルギルス属などに由来するα−ア
ミラーゼの測定に応用した例は見られず、しかも該試料
中に、グルコースあるいはα−グルコシダーゼやグルコ
アミラーゼが混在すると著しい測定誤差が生じてしまう
欠点を有する。またに示す方法は、臨床化学分野で、
ヒト由来α−アミラーゼの測定が中性域（ｐＨ６．０〜
８．０）で既に行われており、その有用性が示唆されて
いるが、醸造物、例えばアスペルギルス属に由来するα
−アミラーゼのような至適ｐＨが酸性域、例えばｐＨ
３．０以上５．０未満のα−アミラーゼの測定に応用さ
れた例は全く報告されておらず、その実用性についても
知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来の醸造物由来α−アミラーゼの測定方法が有する欠
点を克服し、醸造物由来の至適ｐＨが３．０以上５．０
未満であるα−アミラーゼを含有する試料中のα−アミ
ラーゼを、簡便な操作で、短時間にしかも精度良く測定
する方法を提供することを目的としてなされたものであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、醸造物由来の
至適ｐＨが３．０以上５．０未満であるα−アミラーゼ
を測定するための基質として、特定のマルトオリゴシド
誘導体が極めて好適であり、該マルトオリゴシド誘導体
と共役酵素系とを用いて該α−アミラーゼを測定するこ
とにより、前記した欠点を克服し得ることを見い出し、
この知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、醸造物由来の至適ｐＨが３．０以上５．
０未満であるα−アミラーゼを含有する試料に、エキソ
型糖加水分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導
体と共役酵素系とを添加して酵素反応を行わせ、遊離す
る化合物を定量することを特徴とするα−アミラーゼの
測定方法である。以下、本発明について詳細に説明す
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】まず、本発明における醸造物由来
の至適ｐＨが３．０以上５．０未満であるα−アミラー
ゼを含有する試料としては、該α−アミラーゼを含有す
るものであればいかなるものでもよく、例えばアスペル
ギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス
・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、
アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋ
ａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス
属、リゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属、モナスカス（Ｍｏ
ｎａｓｃｕｓ）属などを用いた清酒、焼酎、みりん、醤
油、みそなどの製造に供される麹、培養物、、もろみな
どが挙げられる。そして、該試料は、そのままあるいは
ろ過して定量に供してもよく、また例えば水、緩衝液な
どで適宜の濃度になるように抽出（濃縮）又は希釈して
供してもよい。定量に際しては、これらの試料のｐＨは
無調整でもよいが、適宜なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫
酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどによ
り、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７に調整するのが
望ましい。

【００１０】次に、本発明のα−アミラーゼの測定に用
いる各成分及び測定方法について述べる。なお、本発明
のα−アミラーゼの測定に用いる前述のマルトオリゴシ
ド誘導体及び共役酵素系などの添加量は、試料に含まれ
るα−アミラーゼ含有量、酵素反応条件などにより適宜
選択される。まず、本発明に用いられるエキソ型糖加水
分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導体として
は、２−クロロ−４−ニトロフェニル ６⁵−アジド−
６⁵−デオキシ−β−マルトペンタオシド（以下、Ｎ₃Ｇ
₅Ｎという）、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４⁴，
６⁴−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６⁵−Ｏ−
ベンジル−α−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−
ニトロフェニル ６⁴−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−β−マルトテトラオシド、２−フルオロ−４−ニト
ロフェニル ６⁷−ブロモ−６⁷−デオキシ−α−マルト
ヘプタオシド、フェノールインド−３’−クロロフェニ
ル ４⁶，６⁶−ジＯ−メタンスルホニル−β−マルトヘ
キサオシド、４−メチルウンベリフェロニル ６⁴−Ｏ
−ｐ−トルエンスルホニル−α−マルトテトラオシド、
５−Ｏ−フラクトフラノシル ６⁵−アジド−６⁵−デオ
キシ−α−マルトペンタオシド、６⁵−デオキシ−６⁵−
ヨードマルトペンタオース、４⁷，６⁷−ジＯ−メチルマ
ルトヘプタオースなどが挙げられる。これらのうち、下
記一般式（１）

【００１１】

【化２】

【００１２】（ｎは２〜５、Ｒは芳香族発色性基、Ｘは
アジド基、ハロゲン原子、アルキル若しくはアリールオ
キシ基、アルキル若しくはアリールスルホニルオキシ基
又はカルバモイルオキシ基、Ｙは水素原子、アルキル
基、アルキル若しくはアリールスルホニル基又はカルバ
モイル基）で表わされるβ−マルトオリゴシド誘導体
は、遊離する芳香族発色性化合物を定量する系がα−ア
ミラーゼ含有試料中のグルコースやマルトースなどに妨
害されないこと、この発色系が単純でかつ鋭敏であるこ
とからその定量が容易であること、β−マルトオリゴシ
ド誘導体であるためα−アミラーゼ含有試料中のα−グ
ルコシダーゼやグルコアミラーゼなどに影響されないこ
と、またこれら誘導体が長期間安定であることなどから
基質として好適である。

【００１３】これら前記の基質は、例えば特開平５−１
０９１号公報、特開平４−３４６９９４号公報、特開平
３−２６４５９６号公報、特開平３−９１４９６号公
報、特開昭６３−３０１８９２号公報などに記載の方法
で製造することができ、例えば還元末端の修飾に関して
は、化学的にはマルトオリゴ糖をまず無水酢酸などでア
セチル化し、次いで三臭化リンなどで還元末端をブロム
化し、これに過塩素酸銀などの存在下、２−クロロ−４
−ニトロフェノールを始めとする検出に必要なフエノー
ル類やアルコール類を作用させてオリゴ糖部と結合さ
せ、最後に炭酸ナトリウムなどを用いて脱アセチル化す
ることによって行うことができる。またシクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼなどの酵素の転移反応
を利用して還元末端に適当な糖若しくはグリコシドを導
入することもよく知られた方法である。

【００１４】一方、非還元末端の修飾に関しては、マル
トオリゴ糖に、例えばテトラメトキシメタンなどを作用
させて非還元末端４，６位ＯＨをジメトキシメチリデン
化した後、アセチル化し、得られた生成物のジメトキシ
メチリデン基を酢酸／水などを作用させて除去し、４，
６位ＯＨ誘導体とし、続いて所望の修飾基への変換反応
（例えばトシルクロライドを作用させたＯ−トシル化反
応、Ｏ−トシル化体にさらにアジ化ナトリウムを作用さ
せたアジド化反応、イソシアナートなどを作用させたカ
ルバモイル化反応、ハロゲン化剤を作用させる反応な
ど）を行った後、脱アセチル化することによって行うこ
とができる。またガラクトシダーゼなどの酵素の転移反
応を用いて糖残基などを導入する方法なども知られてい
る。

【００１５】次に、本発明に用いる共役酵素系として、
エキソ型糖加水分解酵素で切断されないマルトオリゴシ
ド誘導体のα−アノマーを該α−アミラーゼの測定に使
用する場合には、グルコアミラーゼ若しくはα−グルコ
シダーゼあるいはその両方を用いることが必要であり、
またエキソ型糖加水分解酵素で切断されないマルトオリ
ゴシド誘導体のβ−アノマーを使用する場合には、グル
コアミラーゼ若しくはα−グルコシダーゼあるいはその
両方に加えてさらにβ−グルコシダーゼを併用すること
が必要である。なお、必要に応じてβ−アミラーゼを用
いることもできる。

【００１６】α−アミラーゼと共役酵素系により遊離さ
れる化合物が、ニトロフェノール類やインドフェノール
類などの芳香族発色性化合物のときは、常法に従ってそ
のままで、あるいは必要に応じてｐＨを調整するなどし
た後に、適当な吸光波長で測定すればよい。また遊離す
る化合物が、グルコース、マルトース若しくはフラクト
ースなどの糖類のときは、各種オキシダーゼ類、デヒド
ロゲナーゼ類、ホスホリラーゼ類、キナーゼ類など、例
えばグルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダー
ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フラクトースデヒド
ロゲナーゼ、マルトースホスホリラーゼ、ヘキソキナー
ゼ、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼなどを更
に定量系の共役酵素として加え、過酸化水素系や酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）→還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）系などの定量系に組み込んで測定することができ
る。前記グルコアミラーゼは、動物、植物、微生物など
いかなる起源のものを用いてもよいが、例えばリゾプス
属（Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）などに由来するものが安
価に入手できるので好ましく用いられる。

【００１７】また前記α−グルコシダーゼもいかなる起
源のものを用いてもよいが、例えば酵母由来のものが用
いられる。さらにまた、β−グルコシダーゼもいかなる
起源のものを用いてもよく、例えばアーモンドの種子か
ら得たものが用いられる。そして、β−アミラーゼもい
かなる起源のものを用いてもよいが、例えば細菌や植物
由来のものを用いることができる。

【００１８】このような共役酵素系に、前記成分以外
に、本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に
応じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定
化剤などとして、界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブ
リッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩など）、牛血清
アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、スクロースな
ど）などを添加することもできるし、α−アミラーゼ活
性化剤として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、Ｃａ
Ｃｌ₂、ＣａＣｌ₂・Ｈ₂Ｏなどの形で用いられるＣｌ^-イ
オン、Ｃａ²⁺イオン、Ｍｇ²⁺イオンなどを加えてもよ
い。これらは１種を用いてもよいし、２種以上を組み合
わせて用いてもよいし、また前記系の調製の適当な段階
でこれらを加えることができる。

【００１９】次に、本発明のα−アミラーゼを測定する
ための有利な系としては、例えばエキソ型糖加水分解酵
素で切断されないマルトオリゴシド誘導体０．１〜１０
ｍＭ及び緩衝液２〜３００ｍＭを含有し、かつ共役酵素
としてα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ
がそれぞれ５〜１０００Ｕ／ｍｌ、さらにβ−グルコシ
ダーゼを用いるときはβ−グルコシダーゼ０．５〜３０
Ｕ／ｍｌ、を含有するｐＨ３〜５の系が挙げられる。前
記の系に用いられる緩衝剤としては、例えば酢酸塩、リ
ン酸塩、グッズ（Ｇｏｏｄ’ｓ）の緩衝剤、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。

【００２０】本発明に用いる試薬は、乾燥物又は溶解し
た状態で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート
含浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。また使用酵
素は、常法により固定化させて反復使用してもよい。こ
のような本発明の試薬を用いることにより、各種の試料
に含有される該α−アミラーゼを簡単な操作で精度よく
測定することができる。

【００２１】次に、本発明の測定方法の好適な１例を示
す。まず、前述したα−アミラーゼを含有する試料に、
共役酵素としてのα−グルコシダーゼ若しくはグルコア
ミラーゼあるいはその両方をそれぞれ５〜１０００Ｕ／
ｍｌ、好ましくは１０〜５００Ｕ／ｍｌ加え、エキソ型
糖加水分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導体
がβ−アノマーを含むときは、さらにβ−グルコシダー
ゼを０．５〜３０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１５Ｕ／ｍ
ｌ加え、これと同時又はこれらの後に、エキソ型糖加水
分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導体０．１
〜１０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭを緩衝剤１０〜
２００ｍＭと共に添加した後、温度２０〜４５℃、好ま
しくは３０〜４０℃で、ｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ３
〜５の条件下で１〜６０分間、好ましくは５〜２０分間
酵素反応させ、遊離した化合物を、常法に従いそのまま
であるいは必要に応じてｐＨを調整した後又は更に各種
共役酵素系や発色系を加えて反応させた後に、適当な吸
光波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定し、
あらかじめ測定した該α−アミラーゼ標品の吸光度変化
量と対比させ、試料中の該α−アミラーゼ活性を算出す
る。また、遊離する化合物が芳香族発色性化合物である
場合は、その分子吸光係数から算出することもできる。

【００２２】

【実施例】次に、実験例及び実施例により本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら
限定されるものではない。

【００２３】実験例１（アスペルギルス属に由来するα
−アミラーゼの至適ｐＨの測定） （１）α−アミラーゼ標品 アスペルギルス属に由来するα−アミラーゼ標品とし
て、市販品（シグマ社製、アスペルギルス・オリゼ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ））を使用した。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 精製水に、以下の成分を以下の濃度又は単位で溶解する
ことにより、α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止
液を調製した。なお、本実験例１、後記の実験例２及び
実施例３の至適ｐＨの測定結果から、反応ｐＨは４．０
が好適であった。 〔測定用試薬〕 成 分 濃度又は単位 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０） １００ｍＭ Ｎ₃Ｇ₅Ｎ ２．０ｍＭ グルコアミラーゼ ５０Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ ６Ｕ／ｍｌ ＮａＣｌ ５０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ２．０ｍＭ なお、至適ｐＨの測定には、ｐＨ３〜６の範囲に調整し
た同濃度の酢酸緩衝液を使用した。 〔反応停止液〕 成 分 濃度又は単位 Ｎａ₂ＣＯ₃ ４００ｍＭ

【００２４】（３）至適ｐＨの測定 α−アミラーゼ標品を、２００Ｕ／ｍｌになるように前
記国税庁所定分析法注解に記載されている塩化ナトリウ
ム溶液（０．５％塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭ酢
酸緩衝液、ｐＨ５．０）に溶解したものを、更に１５０
０倍に希釈してα−アミラーゼ含有試料とした。ｐＨを
３〜６の範囲に調整した前記測定用試薬２．０ｍｌそれ
ぞれを、小試験管に入れて３７℃で３分間保温し、これ
に前記のα−アミラーゼ含有試料０．１ｍｌを添加して
３７℃で１０分間反応を行った後、反応停止液１．０ｍ
ｌを加えて酵素反応を停止し、遊離した２−クロロ−４
−ニトロフェノールを４００ｎｍにおける吸光波長で測
定した。なお対照は、前記測定用試薬の成分のうちのα
−アミラーゼ含有試料の代わりに前記塩化ナトリウム溶
液０．１ｍｌを加える以外はすべて前記と同一操作によ
り吸光度を測定した。各ｐＨにおける吸光度増加量（△
ＯＤ）は、反応液の吸光度（ＯＤs）から対照の吸光度
（ＯＤb）を差し引いて求めた。そして、最大の吸光度
増加量を示す値を１００％とし、各ｐＨにおける吸光度
増加量を相対活性値（％）として求め、その結果を図１
に示す。

【００２５】図１から明らかなように、アスペルギルス
・オリゼに由来する前記標品のα−アミラーゼの至適ｐ
Ｈは、３．５〜４．５であった。なお、α−アミラーゼ
の力価は、本実験例の試薬を用いて前記の反応条件によ
り得られた測定値から算出し、１分間に１μｍｏｌの２
−クロロ−４−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１
単位（Ｕ）とした。

【００２６】実験例２（焼酎用麹α−アミラーゼの至適
ｐＨの測定） （１）焼酎用麹α−アミラーゼ標品 焼酎用麹α−アミラーゼ標品として、アスペルギルス・
カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）
を用いて常法通りに作製した焼酎用麹１０ｇに、実験例
１に記載した塩化ナトリウム溶液５０ｍｌを加え、低温
室で時々振りまぜながら一夜浸出した後にろ過したもの
を使用した。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液は、実験例
１に記載したと同様にして調製した。なお、至適ｐＨの
測定には、ｐＨ２．５〜６．０の範囲に調整した同濃度
の酢酸緩衝液を使用した。

【００２７】（３）至適ｐＨの測定 前記の焼酎用麹α−アミラーゼ標品を、前記塩化ナトリ
ウム溶液を用いて２倍に希釈してα−アミラーゼ含有試
料とした。ｐＨを３〜６の範囲に調整した測定用試薬の
代わりに、ｐＨを２．５〜６．０の範囲に調整した測定
用試薬を用いる以外は実験例１と同様の操作により、前
記試料中の酵素活性を測定した。そして、最大の吸光度
増加量を示す測定値を１００％として、各ｐＨにおける
吸光度増加量（△ＯＤ）を相対活性値（％）として求
め、その結果を図２に示す。

【００２８】図２から明らかなように、焼酎用麹（アス
ペルギルス・カワチ由来）α−アミラーゼの至適ｐＨ
は、３．０〜４．５と広範囲であった。なお、アスペル
ギルス属によって生産されるα−アミラーゼの至適ｐＨ
は、種によって異なるが、多くの場合３．０以上５．０
未満の範囲にあった。

【００２９】実験例３（本発明の測定方法における反応
性の検討） （１）α−アミラーゼ標品 α−アミラーゼ標品は、実験例１に記載したものを使用
した。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液は、実験例
１に記載したと同様にして調製した。

【００３０】（３）反応性の検討 前記測定用試薬２．０ｍｌを小試験管に入れて３７℃で
３分間保温し、これに実験例１と同様にして調製したα
−アミラーゼ含有試料０．１ｍｌを添加して３７℃で、
２．５、５．０、１０、１５及び２０分間反応を行った
後、反応停止液１．０ｍｌを加えて酵素反応を停止し、
遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノールを４００ｎ
ｍにおける吸光波長で測定した。各反応時間における吸
光度増加量（△ＯＤ）は、反応液の吸光度（ＯＤs）か
ら実験例１と同様にして得られた対照の吸光度（ＯＤ
b）を差し引いて求めた。各反応時間（分）に対する吸
光度増加量をプロットした結果を図３に示す。

【００３１】図３から明らかなように、反応時間と吸光
度増加量との間には極めて高い相関（ｒ＝０．９９９）
があり、直線的関係（Ｙ＝０．０７４２Ｘ＋０．００１
２）を示すことが判り、しかも試料中のα−アミラーゼ
量を簡便に、短時間に、正確に、かつ感度良く測定でき
た。

【００３２】実施例１（検量線の作成） （１）α−アミラーゼ標品 α−アミラーゼ標品は、実験例１に記載のものを使用し
た。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液は、実験例
１に記載したと同様にして調製した。

【００３３】（３）検量線の作成 α−アミラーゼ標品を、２００Ｕ／ｍｌになるように前
記塩化ナトリウム溶液に溶解したものを更に希釈して、
０．０５、０．１、０．２、０．３及び０．４Ｕ／ｍｌ
になるようにα−アミラーゼ含有試料を調製した。酵素
量を上記のように変えた試料を用いる以外は実験例１と
同様の操作をして、各試料の酵素活性を測定した。各酵
素量（Ｕ／ｍｌ）における吸光度増加量（△ＯＤ）は、
実験例１と同様にして求め、酵素量に対する吸光度増加
量をプロットした結果を図４に示す。

【００３４】図４から明らかなように、α−アミラーゼ
量と吸光度増加量との間には極めて高い相関（ｒ＝０．
９９９）があり、直線的な関係（Ｙ＝５．４３Ｘ＋０．
０１）が認められ、したがって、試料中のα−アミラー
ゼ量を、短時間に、簡便に、精度よく、しかも多数の試
料を同時に測定することができ、検量線として有効であ
ることがわかる。

【００３５】実施例２（検量線の作成） （１）α−アミラーゼ標品 α−アミラーゼ標品は、実験例１に記載のものを使用し
た。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 実験例１に記載されているα−アミラーゼの測定用試薬
のうち、グルコアミラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）の代わりに
α−グルコシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を用いる以外は実
験例１と同様にして測定用試薬を調製した。また、反応
停止液も、実験例１と同様にして調製した。

【００３６】（３）検量線の作成 実施例１に記載と同様にしてα−アミラーゼ含有試料を
調製し、前記測定用試薬を用いる以外は実施例１と同様
にして各試料の酵素活性を測定し、酵素量（Ｕ／ｍｌ）
に対する吸光度増加量（△ＯＤ）をプロットした結果を
図５に示す。図５から明らかなように、α−アミラーゼ
酵素量と吸光度増加量との間には極めて高い相関（ｒ＝
０．９９８）があり、原点を通る直線的な関係（Ｙ＝
５．５９Ｘ＋０．０２）が認められ、これを検量線とし
て有効に用いることができ、グルコアミラーゼと同等に
α−グルコシダーゼを使用することができた。

【００３７】実施例３（清酒用麹及び焼酎用麹α−アミ
ラーゼの測定） （１）清酒用麹及び焼酎用麹α−アミラーゼ標品 清酒用麹α−アミラーゼ標品として、アスペルギルス・
オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に属
する種麹（吟醸酒用（３種類）、純米酒用（２種類）、
本醸造酒用（１種類））を用いて常法通りに作製した各
清酒用麹１０ｇに、前記の塩化ナトリウム溶液５０ｍｌ
を加えて低温室でときどき振りまぜながら一夜浸出した
後にろ過したものを使用した。また、焼酎用麹α−アミ
ラーゼ標品として、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）を用いて常法通り
に作製した焼酎用麹（製麹時間；４４、４６及び４８時
間の麹）各１０ｇに、前記の塩化ナトリウム溶液５０ｍ
ｌを加え、低温室で時々振りまぜながら一夜浸出した後
にろ過したものを使用した。 （２）α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液の調
製 α−アミラーゼの測定用試薬及び反応停止液は、実験例
１に記載したと同様にして調製した。

【００３８】（３）清酒用麹及び焼酎用麹α−アミラー
ゼの測定 前記清酒用麹α−アミラーゼ標品（６試料）は、前記塩
化ナトリウム溶液を用いて５０倍に希釈して、また焼酎
用麹α−アミラーゼ標品（３試料）は、前記塩化ナトリ
ウム溶液を用いて２倍に希釈してそれらをα−アミラー
ゼ含有試料とした。各試料のアミラーゼ量は、実験例１
と同様にして測定した。なお、前記清酒用麹α−アミラ
ーゼの至適ｐＨは、実験例２の焼酎用麹α−アミラーゼ
と同様にして測定したところ、ｐＨ３．５〜４．５であ
った。α−アミラーゼ量（Ｕ／ｍｌ）を実験例１に記載
したα−アミラーゼの力価の定義にしたがって算出し、
その結果を表に示す。

【００３９】

【表】

【００４０】表に示すように、清酒用麹α−アミラーゼ
の力価は、焼酎用麹α−アミラーゼの力価の約１０倍以
上であり、従来から報告されている結果（例えば日本醸
造協会誌、第７６巻、第３５０〜３５３及び３５４〜３
５５頁、１９８１年）とよく一致していることから、本
発明の測定方法を用いることにより、アスペルギルス属
に由来する各種麹試料中のα−アミラーゼを、簡便な操
作で、短時間に、精度良く、しかも多数の試料を同時に
測定することができることがわかる。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、醸造物由来の至適ｐＨ
が３．０以上５．０未満であるα−アミラーゼを含有す
る試料、例えば清酒、焼酎、みりん、醤油、みそなどの
製造に供されるアスペルギルス属などを用いて製造され
る麹、培養物、もろみなどの試料中の該α−アミラーゼ
を、従来法に比較して極めて簡便な操作で、短時間に、
精度（感度）よく測定でき、さらに多数の試料を同時に
測定できるので、産業上有用である。

【図面の簡単な説明】

【１図】実験例１におけるアスペルギルス・オリゼ由来
α−アミラーゼの至適ｐＨを示すグラフ。

【２図】実験例２における焼酎用麹α−アミラーゼの至
適ｐＨを示すグラフ。

【３図】実験例３における反応時間と吸光度増加量の関
係を示すグラフ。

【４図】実施例１におけるα−アミラーゼ量と吸光度増
加量の関係の検量線を示すグラフ。

【５図】実施例２におけるα−アミラーゼ量と吸光度増
加量の関係の検量線を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 勝 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 醸造物由来の至適ｐＨが３．０以上５．
   ０未満であるα−アミラーゼを含有する試料に、エキソ
   型糖加水分解酵素で切断されないマルトオリゴシド誘導
   体と共役酵素系とを添加して酵素反応を行わせ、遊離す
   る化合物を定量することを特徴とするα−アミラーゼの
   測定方法。
2. 【請求項２】 醸造物由来の至適ｐＨが３．０以上５．
   ０未満であるα−アミラーゼを含有する試料が、アスペ
   ルギルス属由来の試料である請求項１記載のα−アミラ
   ーゼの測定方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載のエキソ型糖加水分解酵素
   で切断されないマルトオリゴシド誘導体が、下記一般式
   （１） 【化１】 （ｎは２〜５、Ｒは芳香族発色性基、Ｘはアジド基、ハ
   ロゲン原子、アルキル若しくはアリールオキシ基、アル
   キル若しくはアリールスルホニルオキシ基又はカルバモ
   イルオキシ基、Ｙは水素原子、アルキル基、アルキル若
   しくはアリールスルホニル基又はカルバモイル基）で表
   わされるβ−マルトオリゴシド誘導体であり、該β−マ
   ルトオリゴシド誘導体と、請求項１記載の共役酵素系
   が、グルコアミラーゼ若しくはα−グルコシダーゼある
   いはその両方とβ−グルコシダーゼである共役酵素系と
   を添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化
   合物を定量する請求項１記載のα−アミラーゼの測定方
   法。