JPS6049477B2

JPS6049477B2 - グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法

Info

Publication number: JPS6049477B2
Application number: JP52044146A
Authority: JP
Inventors: 治寺田; 孝之上島; 明見原; 和夫相阪; 裕子秋田; 敏晃永井; 嘉昭清水
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1977-04-19
Filing date: 1977-04-19
Publication date: 1985-11-01
Also published as: DK151266B; NL189144B; JPS53130488A; DE2817087C3; IT1107881B; FR2387992B1; NO781363L; SE438509B; NL7804133A; DK151266C; CA1124191A; IT7867878A0; NO152975C; DE2817087B2; NO152975B; NL189144C; DE2857338C2; FR2387992A1; SE7804370L; DE2817087A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明はグリセロールを酸化する酵素〔以下グリセロー
ル酸化酵素（グリセロール・オキシダーゼ）という〕お
よびその製造法ならびにグリセロール酸化酵素を用いる
グリセロールの新規な定量法に関する。

本発明によつて、新規な酵素、グリセロール酸化酵素が
始めて提供され、該酵素を用いて、グリセロールの新規
な定量法が提供された。

本発明者らは、アスペルギルス属およびニユーロスポラ
属に属する種々の研究を行つた。

その結果、アスベルギルス●ジヤポニクスＫＹ−４５、
ニユーロスポラ・クラツサＫＹ４６２などの微生物の培
養物中に酵素が存在する事実を見いだした。発明者らは
、この酵素の諸性質を調べ、本酵素がグリセロールを選
択的に酸化する新しい酵素であることを見いだし本酵素
をグリセロール酸化酵素（グリセロール・オキシダーゼ
）と命名した。従来から、グリセロール・オキシダーゼ
はその提供が望まれているが、まだその存在は確認され
ノておらず、勿論提供されていない。

本発明によつて提供される新規な酵素は、次の如き諸性
質を有している。

１作用酵素の存在下グリセロールを酸化し、過酸化水二素とグ
リセルアルデハイドを生成する。

２基質特異性グリセロールに極めて特異的に作用する。

３至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲３．１至適ＰＨ；アスペルギルス属の微生物が産出する酵素（以下アスペ
ルギルス属酵素と略称する）
ＰＨ７〜８ニユーロスポラ属の微生物が産出する
酵素（以下ニユーロスポラ属酵素と略称する）３８．
０〜８．５３．２安定ＰＨ範囲アスペルギルス属酵素ＰＨ５．Ｏ〜８．０二ユ
ーロスポラ属酵素ＰＨ５．Ｏ〜８．０４力価の
測定法３ｒＣにて酸素の存在下、１分間にグリセロール
を１μＭＯｌ分解する酵素量を１単位とする。

力価の測定は、グリセロールに酵素を振とうしつつ作用
させ、生成する過酸化水素に、パーオキシダーゼの存在
下、４−アミノアンチピリンとフェノールを作用させ、
キノンイミン色素に導く。この生成したキノンイミン色
素の可視部の吸収を測定した過酸化水素量を求めること
によつて酵素の力価を測定する。

（以下、この方法を４一品法と略称する）尚、以下本発
明に於いては、比活性は蛋白１ｍｇ当りの活性（Ｕｎｉ
ｔ）で表示した。

又、酵素蛋白量は銅−ＦＯＩｉｎ試薬を用いる１０ｗｒ
ｙの方法〔０．Ｈ．Ｌ０ｗｒｙ，Ｎ．Ｊ．Ｒ０ｓｅｂｒ
０ｕｇｈ，Ａ．Ｌ．ＦａｒｒａｎｄＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａ
１１，Ｊ．Ｂ１０１．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５（１
９５１）．〕によつて測定した。】作用適温の範囲アスペルギルス属酵素：約４０しＣニユーロスポラ属酵素：４０−４５３ｐＨ１温度などによる失活の条件（１）温度による失活の条件 −スペルギルス属酵素：４５℃で約６０％、
６０′Ｃて殆んど失活する。

２ユーロスポラ属酵素：２５゜Ｃで約５０％、
５０℃て殆んど失活する。

・）ＰＨによる失活の条件一スペルギルス属酵素：ＰＨ
ｌＯ以上、又はＰＨ４以下で失活
する。

−ユーロスポラ属酵素：同上阻害、活性化および安定化１）阻害剤について阻害剤無添加時の酵素活性を１００とし、阻害剤（１
ｍＭ）を添加した時の酵素の発揮する活性を無添加時と
比較して第一表に示す。

尚、活性測定は発生するＨ２Ｏ２を４−アミノアンチピ
リン系色素に導く４−ＡＡ法により測定した。２）活性
化特に活性化する薬剤は未だ見い出されてい＝ない。

３）安定化アスペルギルス属酵素は、０．１ｍＭ〜１．０Ｔ１Ｍ
（７）ＭｅｒＣａＰｔＯｅｔｈａｎＯｌ，ＤｊｔｈｉＯ
ｔｈｒｅｉｔＯｌ等のＳＨ基保護剤を添加することによ
つて安定．化する。

８精製方法別途詳述する如く、１硫安による分画沈殿、２ＤＥＡＥ
セルローズ塔によるカラムクロマト、３セフアデツクス
による篩別分画、４ハイドロキシアパタイト塔によるカ
ラムクロマト、５活性区分の凍結乾燥等の常法に従い精
製できる。

９分子量アスペルギルス属酵素は、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２（４
）塔を用いた分析によれば、その溶出パターンから３０
万以上と推定された。

１０結晶構造および元素分析未だ結晶化に至つていないので未実施。

本発明によつて提供される酵素は以上の如き諸性質を持
つ新しい酵素、即ちグリセロール・オキシダーゼである
ことが明らかにされた。

次に、本発明によつて提供される新規な酵素の製造法な
らびに精製法について詳述する。グリセロール●オキシ
ダーゼは、アスペルギルス属もしくはニユーロスポラ属
に属するグリセロール・オキシダーゼ生産能を有する微
生物を適当な炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄
養素を含む栄養培地中に培養し、該培養物中よりグリセ
ロール●オキシダーゼを採取することによつて得られる
。

用いられる微生物はアスペルギルス属もしくは二ユーロ
スポラ属に属し、グリセロール・すキシダーゼを生産す
る能力を有する微生物てあｉばいずれも用いることがで
きる。

゛具体的に好適な微生物をあげると、たとえば、アスペ
ルギルス・ジヤ・ポニクスＫＹ−４５（微工研菌寄第３
９５９号、ＮＲＲＬｌｌｌＯ２）、アスペルギルス・オ
リザエＫＹ−６３（ＮＲＲＬｌｌｌＯ３）、アスペルギ
ルス◆パラシテイクスＫＹ−７７（ＮＲＲＬｌｌｌＯ４
）、アスペルギルスｅフラバスＫＹ−９８（ＮＲＲＬｌ
ｌｌＯ５）、ニユーロスポラ・クラツサＫＹ−４６２（
微工研菌寄第３９６０号、ＮＲＲＬｌｌｌＯ６）などが
あげられる。これらの微生物の菌学的性質は次の文献に
記載がある。

アスペルギルス●ジヤポニクスニＴＨＥＧＥＮＵＳＡＳ
ＰＥＲＧＬＬＵＳＴｌｌｅＷｌｌｌｌａｍｓ＆ＷｉｌｋｉｎｓＣＯ．
ＢａｌｔｌｍＯｒｅｌ９６５Ｐ．３２７〜３２８アスペ
ルギルス●オリザエニ同上、Ｐ３７Ｏ〜３７３アスペルギルス◆パラシテイクスニ同上、Ｐ３６９〜３７１アスペルギルス◆フラバスニ同上、Ｐ３６ｌ〜３６５二ユーロスポラ・クラツサニＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥＭＯＲＰＨＯＬＯＧＹＯＦＦＵ
ＮＧＩＭＣＧＲＡＷ− ＨＩＬＬＢＯＯＫＣＯＭＰＡＮ
Ｙ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹＯｒｋ＆ＬＯＮＤＯＮｌｌ９２８
，Ｐ．２２７，ＪＯｕｒ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．，３４，Ｐ
．ｌＯｌ９〜１０４２（１９２７）本発明て使用する培
地としては、炭素源、窒素源、無機物その他栄養素を程
よく含有する培地ならば合成培地または天然培地のいず
れも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、シユクロース、廃糖密な
どの糖類、グリセロール、ソルビトール、マンニトール
などの糖アルコール類が使用できる。

窒素源としては、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、燐酸アンモニウムなどの各種無機および有機のアンモ
ニウム化合物、尿素などの窒素化合物、ペプトン、酵母
工キズ、力ティン加水分解物、脂肪大豆あるいはその消
化物などの窒素性有機物質などが使用できる。

無機物としては、ナトリウム、カリウム、マンガン、マ
グネシウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛、
銅などの金属の塩類、クロム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸
などの塩類が使用できる。

本発明においては、グリセロール・オキシダー・ゼ生産
性菌株をグリセロールを含有した培地中で培養した時に
グリセロール・オキシダーゼを最も収量よく得られる。
例えばグリセロール含有培地中で培養して得られるグリ
セロール・オキシダーゼの生産力価はグルコース１％、
麦芽工キズ１％、イーストエキス０．５％の組成の培地
あるいはＺａｐｅｃｋの培地中で培養したときに得られ
るグリセロール●オキシダーゼの生産力価に比べて１０
〜１０皓になる。培養温度は通常２０〜４０℃の範囲で
好適には２５〜３５℃の範囲で行なわれる。

培養開始時のＰＨは通常６〜８の範囲で好適には７附近
で行なわれる。

このような条件下で３０〜ノｎ時間振とうもしくは深部
攪拌培養すれは、培養物中にグリセロール・オキシダー
ゼが！生成する。かくして培養物中に生成したグリセロ
ール・オキシダーゼは次のごとき方法で採取される。

グリセロール・オキシダーゼは通常菌体中に存在するの
で、菌体中の酵素の採取法について述べる。培溶終了後
、培養液を酒過して得られた菌体を水又は緩衝液でよく
洗浄する。得られた菌体を適量の緩衝液に懸濁し菌体を
破砕する。破砕には゛機械的破砕（例えば乳鉢、ダイノ
ミル、マントンガウリン、フレンチプレス、フユーズプ
レス、超音波破砕機その他による）によつて行なわれる
。かくして得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過
もしくは遠心分離によつて除去し、次いで破砕液中のグ
リセロール・オキシダーゼは酵素単離の常法によつて採
取される。例えば、１）硫安による分画沈殿、２）ＤＥ
ＡＥセルローズ塔によるカラムクロマト、３）セフアデ
ツクスによる篩別分画、４）ハイドロキシアパタイト塔
によるカラムクロマト、５）活性区分の凍結乾燥の工程
に従つて酵素粉末を得ることができる。勿論同一操作を
くり返すこと、他の常法の精製手段を必要に応じ組み合
せて用いることもできる。

かくして得られたグリセロール・オキシダーゼの理化学
的性質について以下に詳述する（なおグリセロール・オ
キシダーゼは実施例１，２で得られた各精製標品を用い
た）。

Ｉ作用酸素の存在下グリセロールを特異的に酸化して過酸化水
素とグリセルアルデハイドを生成する。

（イ）過酸化水素の生成の確認１グリセロールに酸素
の存在下グリセロール・オキシダーゼを作用させ、次い
で該酵素にパーオキシダーゼ、フェノール、４−アミノ
アンチピリンを加えて反応させると反応系にキノンイミ
ン色素が生成する。

〔過酸化水素とパーオキシダーゼ、フェノールおよび４
一アミノアンチピリンの反応については５Ｃ１］Ｎ．Ｃ
ｈｅｍ．２Ｏ、４７０頁（１９７４）に示されている〕
２グリセロールに酸素の存在下グリセロール・オキシ
ダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、該発生した
過酸化水素をカタラー１０ゼで処理して分解した後、該
反応系にパーオキシダーゼ、フェノール、４−アミノア
ンチピリンを加えて上記と様に反応させても反応系には
同じキノンイミン系色素が生成しない。

１５３グリ
セロールに酸素の存在下、グリセロール・オキシダーゼ
を作用させた反応系にカタラーゼを共存させると酸素の
吸収量が半減する現象か観察される。この事実は以下の
実験事実によつて支持さ２０れる。

反応組成Ａ（カタラーゼ無添加系）試薬０．０１Ｍグリセロール水溶液０．５ｍｔ０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１．０ｍ１
２：．グリセロール・オキシグーゼ水溶液０．２ｍ１※
１２．４ｍＭ４−アミノアンチピリン水溶液０．５ｍ１
４２Ｔ１１Ｍフェノール水溶液０．５ｍ１
マーオキシダーゼ水溶液０．２ｍＬ※２
水０．１ｍｔ３ｃ※１本発明
の実施例１て得られた比活性３０のグリセロール◆オキ
シダーゼ５μ ＭＯＩｅを含む ※２シグマ社製（米国）、比活性１０００のものを
２００Ｕｎ１メを含む３．反応組成り
（カタラーゼ添加系）試薬０．０１Ｍグリセロール水溶液０．５ｍ１０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１．０ｍｔ
グリセロール●オキシダーゼ水溶液０．２ｍ１※１４カ
タラーゼ水溶液１．０ＴＩＩＬ※３
水０．３ｍ１※１反応組成
Ａに同じ。

※３シグマ社（米国）、比活性１００のカタラーゼ
を１００ＵｎｉｔＳを含む反応操作カタラーゼ無添加系の場合、反応組成Ａに示した各試薬
を混ぜ、３７℃で攪拌下に反応させ消費される酸素の量
をワーブルグ検圧計によつて測定した。

結果は第１図に示す。カタラーゼ添加系の場合、反応組
成りに示した各試薬を混ぜ３ｒＣで反応させた。

同様に消費される酸素の量を測定し、第１図に併せて示
した。第１図から明らかな如く５．０μＭＯｌｅのグリ
セロールを基質にして、カタラーゼ無存在下（第１図の
曲線Ａ）で４．９５μＭＯｌｅの酸素を消費した。また
、カタラーゼ存在下（第１図の曲線Ｂ）ては２．４９μＭＯｌｅの酸素を消費し、（Ａ）に
比べて２分の１に減少していることが判る。

以上１，２，３記載の事実より、本酵素が過酸化水素を
生成することが確認された。

なお、発生する過酸化水素量の定量的な測定は生成した
キノンイミン系色素の比色定量によつて求めた。即ち、
反応組成Ａの系において生成した過酸化水素を４一品法
て定量した結果、５μＭＯｌｅのグリセロールから４．
９２μＭＯｌｅの過酸化水素の生成が確認された。

］）グリセルアルデハイドの生成の確認（１）グリセロールに酸素の存在下、グリセロール・オ
キシダーゼを作用させ、反応生成物をグリセルアルデヒ
ドと同定した。

同定の手順１）反応液グリセロール・５０ｍｇ／ＭＬの水溶液５滴、グリセロ
ール・オキシダーゼ溶液１０Ｕ／ｍｌ、５滴（４）．０
２Ｍトリス塩酸緩衝液中）、カタラーゼ１４０００Ｕ／
ＭＬｌｌ滴を合し、約２０時間、３０゜Ｃで振とう下に
反応した。

２）同定この反応液中の生成物は以下に示す薄層クロマトグラ
フィー（以下ＴＬＣと略す）の結果、標品と比較してグ
リセルアルデハイドであると同定した。

使用した薄層プレートはシリカゲル・Ｇ一６０Ｆ′−２
５４（商品名、Ｅメルク社製、西ドイツ）で、展開溶剤
は溶剤系１〔ブタノールニ酢酸：水＝４：１：１（容
量比）〕、溶剤系２〔ブタノールニピリジンニ水＝３：
２：１．５（容量比）〕である。

展開後、プレート上でアニシジン反応、過ヨウ素−ベン
チジン反応、２，４ージニトロ＊フェニルヒドラジン反
応の三種類の反応を行つて、反応生成物のＲｆ値および
上記各反応により生ずるスポットの色調が標品のそれら
と一致することを確認した。

結果を第２表に示す。（）内はスポットの色調を表示ただし、過ヨウ素酸−ベンチジン試薬の楊合の（＋）×
は青色地に白色のＳｐＯｔを意味する。

注１）ｐ−アニシジン塩酸試薬：糖類等の還元性のカル
ボニル化合物はｐ−アニシジン塩酸と反応して各々構造
に特有の発色を示す。

２）過ヨウ素酸−ベンチジン試薬：ポリアルコール及び
類似の構造は過ヨウ素酸を消費し、ベンチジン試薬に反
応しなくなり、白色のスポットとして検出される。

３）２，４ージニトロフェニルヒドラジン試薬：カルボ
ニル化合物は２，４ージニトロフェニルヒドラジンと反
応して２，４−ジニトロフエニルヒドラゾンを作り、橙
色のスポットとして検出される。

上表に示した如く生成物とグリセルアルデハイド標品が
Ｒｆ値および各発色試薬による発色において完全に一致
することから両者の同一性が確認された。

即ちグリセロールに酸素の存在下、グリセロール・オキ
シダーゼを作用させて得られる生成物がグリセルアルデ
ハイドであることが確認された。（２）グリセロールに
酸素の存在下、グリセロール・オキシダーゼを作用させ
たときに生成するグリセルアルデハイドの量は、反応系
に２，４ージニトロフェニルヒドラジンを加えて生成物
の２，４−ジニトロフエニルヒドラゾンを作り、これを
比色法により定量して消費されたグリセロールとほぼ等
モルのグリセルアルデハイドが生成していることから確
認した。

（ハ）酸素の吸収量の確認グリセロールにグリセロール・オキシダーゼを作用させ
た系中の酸素の消費は、酸素電極およびワールブルグ検
圧計によつて測定した。

その結果、グリセルアルデハイドの生成量に見合う量の
酸素の吸収が確認された。（ニ）（イ），（口），（ハ
）の三項に記載された方法によつて求められた過酸化水
素量、グリセルアルデハイド量、酸素の吸収量（消費量
）の定量結果が化学量論的に極めてよく対応することが
確認された。

以上述べた定性的および定量的な実験結果より、下式に
従つて本酵素がグリセロールを（特異的に）酸化するこ
と、過酸化水素を発生させること、グリセロールを酸化
してグリセルアルデハイドを生成すること、即ち、本酵
素がグリセロール・オキシダーゼであることが確認され
た。

■ 基質特異性グリセロールに対する活性を１００としたときの他の基
質に対する相対活性の測定結果を第３表に示す。

相対活性は後に記載の４−ＡＡ法による力価の測定法に
おいてグリセロールと同モル量の他の基質を用いて測定
した。

ｌ至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲アスペルギルス属酵素の至適ＰＨはＰＨ７〜８の範囲に
ある。

測定は３７℃、１紛、各ＰＨでの活性を測定した。

結果は第２図に示す。２アスペルギルス属酵素の安定
ＰＨ範囲はＰＨ５．Ｏ〜８．０てある。

測定は３０℃で、３０分、各ＰＨ（下記の緩衝液を使用
した）て処理后、残存活性を測定した。結果を第３図に
示す。注）ＰＨ４〜５：酢酸緩衝液使用。

ＰＨ６〜７：リン酸緩衝液使用。

ＰＨ８〜９：ホウ酸緩衝液使用。

３ニユーロスポラ属酵素の至適ＰＨはＰＨ８．Ｏ〜８
．５である。

測定は３ｒＣ１１０分、各ＰＨての活性を測定した。結
果は第４図に示す。４ニユーロスポラ属酵素の安定Ｐ
Ｈ範囲はＰＨ５〜８．０である。

測定は、２項と同様に行つた。結果を第５図に示す。１
■ 力価の測定法：イ）原理酵素活性の測定は、酵素によつて発生する過酸化水素を
、パーオキシダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリ
ンとフェノールを反応させ、生成したキノンイミンを定
量することによつて行なう。

反応式は次式（１），（２）で示される。

尚、式（２）の反応原理はＣ．Ｃ．ＡｌｌａｊｎＬ−）
Ｃｌｌｎ．Ｃｈｅｍ，２Ｏ、４７０（１９７４）に示さ
れている。

（ロ）試薬１基質：０．１Ｍグリセロール水溶液０．
５ｍ１２緩衝液：０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８）１．
０ｍＬ３４−アミノアンチピリンニ２４ｍＭ水溶液
０．５ｍ１４フエ
ノールニ４２ｒＴ１Ｍ（水溶液）０．５ｍ１５パー
オキシダーゼ水溶液：（蛋白量２ｍｇ／Ｔ！Ｌｌ，比活
性１００）０．１ｍ１６水
０．３ｍ１７酵素水溶液
０．１ｍ１（ハ）操作上記試薬１〜６を試験
管に入れ、よく振とうし、５分間、３７℃で振とうする
。

次いて酵素（液）を加えて溶液の全量を３ＴｆＬＬに調
整する、３７℃で１紛間振とうして反応させる。一方コ
ントロールとして基質の代りに、水を用いたものこを同
様に処理する。反応液の５００１１ｍでの吸収値を求め
コントロールとの差を求めΔ０Ｄとする。（ニ）力価の
計算法グリセロール・オキシダーゼの１単位は３ｒｃ４で１分
間にグリセロールを１μＭＯｌｅ分解する酵素量である
。

一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は５．３３と報
告されている〔Ｃｌｌｎ．Ｃｈｅｍ．２Ｏ，４７Ｏ（１
９７４）〕から、（ハ）の操作て求められた。

反応液３ｍ１の５００ｎｍの吸収（Δ０Ｄ）をａと表示
すると、求める酵素溶液１ｍ１当りの力価（Ａ）はＡ＝
ａ×±×３Ｘｈ５．３３＝ａ×０．５６（１１Ｎｉｔ／ｍｌ）より求められる。

尚、力価の測定において反応時間をかえて反応させ反応
液の５００ｒ１ｍ（７）０Ｄ値を測定すると、第６図に
示す如き結果が得られた。

第６図より反応時間と、５００ｒ１ｍ（７）０Ｄ値は直
線関係にあることがわかる。（ここに述べた酵素の力価
の測定法を４−アミノアンチピリン法、略して４−ＡＡ
法という）。Ｖ作用適温の範囲１）アスペルギルス属の酵素について、ＰＨ＼反応時間１吟における至適温度を検討した結果を
第７図に示す。

至適温度は４０℃付近に存在した。２）ニユーロスポラ
属の酵素について、ＰＨ＆．反応時間１吟において、各温度における酵素活
性を調べた結果を第８図に示す。

反応至適温度が３５〜４５℃付近にあることが判かる。
■ＰＨｌ温度などによる失活条件ＰＨ条件による失活に
ついて ■の至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲の項で述べた如く、ア
スペルギルス属の酵素はＰＨ似下もしくは１０以上で殆
んど１００％失活する。

ニユーロスポラ属酵素も同様にＰＨ似下又はＰＨｌＯ以
上て殆んど１００％失活する。温度による失活について
０．１Ｍリン酸緩衝液中、ＰＨ７．Ｏで３紛間加熱処理
ｊして、残存活性を測定した。

アスペルギルス属酵素については結果を第９図、ニユー
ロスポラ属酵素については第１０図に結果を示すが、前
者は４０℃迄１００％安定、４５℃で約６０％失活した
。

後者は３０℃て約５０％、５０゜Ｃで約１１００％失活
した。なお前者（アスペルギルス属酵素）は０．１ｍＭ
のジチオスレイトール（ＤｉｔｈｉＯｔｈｒｅｊｔＯｌ
）の添加によつて安定化し、耐熱性も増加した。

（第９図参照）（約５０℃迄安定）■ 阻害、活性化お
よび安定化について前記した通りである。

次に本発明によつて提供される新規な酵素、グリセロー
ル・オキシダーゼを利用するグリセロールの定量法につ
いて説明する。

グリセロールの定量法には（イ）酸素の存在下グリセロ
ールにグリセロール●オキシダーゼを作用させ、生成し
た過酸化水素を定量する方法◎ 同じく生成するグリセ
ルアルデハイドに２，４ージニトロフェニルヒドラジン
を作用させ，て、２，４−ジニトロフエニルヒドラゾン
を生成せしめ、この２，４−ジニトロフエニルヒドラゾ
ンを比色法により定量することにより、グリセロールを
定量する方法（ハ）酸素の存在下グリセロールにグリセ
ロール●オキシダーゼを作用させ、この系の酸素の吸収
量を測定する方法があげられる。

（イ）、◎および（ハ）の原理、方法は既に１．（酵素
の）作用の項において夫々述べたとおりである。

しかしながら以下に（イ）の、生成する過酸化水素量を
測定することにより、グリセロールを定量する方法につ
いて述べる。即ち、■、（口）試薬の項中、基質グリセ
ロール溶液の濃度を０．１ｍＭ１０．２ｒＴ１Ｍ１０．
５ｒＴ１Ｍ１１．０ｒＴ１Ｍ１５．０１１１Ｍ１１０．
０ｒＴ１Ｍと変え１ｍ１中に比活性３．２の酵素０．１
ｍｇを含む溶液を用いて■．（ハ）項記載の操作を行つ
て５００ｎｍでの反応液の吸収率を求めると次のような
結果が得られた。

即ち、基質濃度（グリセロール濃度）と５００ｎｍでの
反応液の０Ｄ値とは直線関係が認められる。

この原理により、溶液中の未知の濃度グリセロールを定
量できる。又、この様に溶液中のグリセロール濃度がグ
リセロール・オキシダーゼによつて測定可能になつた。
この事実は、グリセロールの定量が関与する分野におい
て新たな定量手法、定量用キットの作成を示唆するもの
である。

従来より、例えば生化学の分野においてグリセロールの
定量法が必要とされていた。

即ち血清中のトリグリセライドを加水分解してグリセロ
ールと脂肪酸にして、このグリセロールを測定してトリ
グリセライドを定量する方法が種々知られている。グリ
セロールの化学的定量法としては、クロモトロープ酸法
、アセチルアセトン法、トリアゾール法、Ｒａｎｄｒｕ
ｐ法、ＭｅｎｄｅｌｓＯｈｎ螢光法が知られているが、
いずれも反応が非特異的という欠点を有している。

又酵素法として、グリセロキナーゼーを用いる方法が知
られているが、反応をピルビン酸キナ−ゼー、乳酸脱水
素酵素で共役させる結果測定に時間がかかるので、多数
検体の処理には不向きという欠点がある。しかしながら
本発明によつて提供されるグリセロール・オキシダーゼ
を用いることによつてグリセロールを直接酸化し、過酸
化水素が化学量論的に生成してくることが判明した。

従つてこの過酸化水素を発色系に導き、比色定量によつ
て極めて簡単に又特異的にグリセロールの定量即ちトリ
グフリセライドの定量が可能になる。次に実施例によつ
て本発明を詳しく説明する。

実施例１アスペルギルス●ジヤポニカスＫＹ−４５〔Ａ
ＴＣＣｌＯ４２，ＮＲＲＬｌｌｌＯ２（微工研菌寄第３
９５９号）］を２ｅ三角フラスコ中、グリセロール１０
ｙ／ｅ１麦芽工キズ１０ｑ／ｅ１酵母工キズｙ／ｅの組
成を有する種培地（殺菌前ＰＨ６．２）３００ｗＬｔに
植菌し、３０゜Ｃで４８１１ｒ振盪培養する。

この種培養液９００ｍ１（フラスコ３本分）を、３０ｅ
ジヤーフアーメンター中上記種培地と同じ培地１５ｅに
植菌し、３０℃で４０時間、通気（１５′／分）攪拌（
２５０ｒｐｍ）培養する。培養後、この培養液をブフナ
ー漏斗を用いて淵過し、水で洗浄後、菌体約１５０ｙ（
乾重量）を得る。この菌体を１０ｒｒ）Ｍ燐酸バッファ
ー（ＰＨ７．７）５′に懸濁し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（
ＷｌｌｌｙＡＢａｃｈＯｆｅｎ社製、スイス）にかけ菌
体を磨砕する。磨砕した後、冷凍遠心機にて遠心分離（
２００００×Ｖ，２Ｏ分）し、上清液４．７′（蛋白量
５１ｑ１比活性０．０５ｕｎｊｔ／Ｍ９）を得る。得ら
れた上清液に硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウ
ム３０〜７０％飽和て沈殿する区分をとり、１０ｒＴ１
Ｍ燐酸バッファ（ＰＨ７．Ｏ）５０Ｔ！ＬＬに溶解する
。この溶液をセロファンチューブを透析膜として１０１
１Ｍ燐酸バッファー１０ｅに対して透析する。１詩間お
きに透析液をとりかえながら、合計４０′の透析液てお
時間透析する。

透析した酵素液を予め１０ｒｒ１Ｍ燐酸バッファー（Ｐ
Ｈ７．Ｏ）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｅｒ
ｖａ社製、西独）のカラム（５．５×４０ｃＴｎ）に通
す。この操作で、酵素は２吸着され、同じバッファーで
、吸着されない不純蛋白を洗滌し次に０．０１Ｍリン酸
バッファー（ＰＨ７．Ｏ）、１１及び０．２Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ７．Ｏ）、１ｆを用いて濃度勾配法て溶出す
ると、グリセロール・オキシダーゼは溶出される。５こ
の活性分画５００ｍ１（蛋白量１．２ｙ１比活性１．１
）を合わせ、硫酸アンモニウムを７０％飽和になるよう
に添加し、酵素を沈澱させる。

次に、遠心分離（２００００Ｘｙ，２０分）で沈澱を集
め、１０ｎ１Ｍ燐酸バッファー（ＰＨ７．Ｏ）５０ｍ１
に溶３解する。

これを１０ｒｒ１Ｍ燐酸バッファー（ＰＨ７．Ｏ）で平
衡化しておいたセフアデツクスＧ−１００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｊａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社製、スウエーデ
ン）のカラム（５．５×８０Ｃ７７りに通す。１０ｒＴ
１Ｍ燐酸バッファー１ｆを流し分画した溶出液を得る。

４１溶出液の分画中で、比活性の高い区分３００ｍ１
（蛋白量３１０ｍｇ、比活性３．２）を得、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和まで添加し、酵素を沈澱させる。次
に沈澱を遠心分離（２００００Ｘｙ１２０分）で集め、
１０ｒｒ１Ｍ燐酸バッファー（ＰＨ７．Ｏ）２０ｍｔで
溶解させる。この溶液をセロファン●チューブを透析膜
として用い、１０［ＴｌＭ燐酸バッファー５ｆで２回透
析液を替えて、２４１１ｒ透析する。透析後酵素液を、
１０ｒｒ１Ｍ燐酸バッファー（ＰＨ７．Ｏ）で平衡化し
ておいたハイドロオキシ・アパタイトのカラム（５．５
×加ｄ）に通す。同バッファー２５０ｍ１をさらに通し
、溶出液を分画回収する。比活性の高い分画を集め、凍
結乾燥しグリセロール・オキシダー・ゼの粉末精製酵素
標品１０．２ｍｇ（比活性３０．２）を得る。精製酵素
は細胞抽出液に比べて比活性は約６１皓に上昇し、活性
の収率は１２％である。実施例２実施例１のアスペルギ
ルス●ジヤポニカスＫＹ−４５に代えて、ニユーロスポ
ラ●クラツサＫＹ一４６２（ＮＲＲＬｌｌｌＯ阪微工研
菌寄第３９帥号）を用いる他は実施例１と同様にグリセ
ロール１０９／ｆ１麦芽工キズ１０ダ／′、酵母工キズ
５ｙ／ｌの組成を有する培地（殺菌前ＰＨ６．２）３０
０ｍ１を容れた２ｅ−三角フラスコ５本に植菌し、３０
℃、北時間振とう培養する。

得られた培養液を実施例１と同様に抽出・精製を行なつ
た結果、グリセロール・オキシダーゼの精製酵素１．１
ｍｇ（比活性１４．１）を収率１０．５％で得る。

実施例３（イ）用いる試薬（１）被検液グリセロール含有水溶液（濃度未知）〕
０．５ュ（２）緩衝液、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８）１．０ｍ１（３）４−アミ
ノアンチピリンニ２．４ｍＭ水溶液
０．５ｍ１（４）フエノールニ
４２ｍＭ水溶液０．５ｍｔ（５）パーオキシダ
ーゼ水溶液（蛋白量２．０ｍ９／Ｍｌｌ比活性１０００
）０．１ｗＬｔ（６）水
０．３ｍ１（７）酵素（蛋白量１．０ｍ９／Ｍｌｌ比
活性３．２）０．１ｍ１（ロ）操作上記試薬（１）〜（
６）を試験管に入れ、５分間、３７℃でよく振とうする
。

次いで酵素液を加えた後、液量を３ｍ１に調整する。３
７℃で１紛間振とう反応させる。

一方コントロールとして、被検液の代りに水を用いたも
のを同様に処理する。被検液の５００ｒ１ｍでの吸収値
を求め、コントロールとの差、Δ０Ｄは０．２３０であ
つた。第１１図の検量線より、被検液中のグリセロール
含量は０．３８０ｎ１Ｍであると分析した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グリセロールに酸素の存在下、グリセロール
・オキシダーゼを作用させた反応系における酸素の吸収
量を示す（図中、Ａは反応系にカタラーゼを共存させな
い場合の酸素の吸収量であり、Ｂはカタラーゼを共存さ
せた場合の酸素の吸収量である）。

Claims

【特許請求の範囲】１下記性質を有するグリセロール酸化酵素。（ａ）作用酵素の存在下グリセロールを酸化し、過酸化
水素とグリセルアルデハイドを生成する。（ｂ）基質特異性グリセロールに極めて特異的に作用する。（ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ７〜８（アスペルギルス属微生物産出酵素）ｐＨ８
．０〜８．５（ニユーロスポラ属微生物産出酵素）（ｄ
）安定ｐＨ範囲：ｐＨ５．０〜８．０（ｅ）分子量：３０万以上（ｆ）作用適温の範囲至適温度４０℃付近（アスペルギルス属微生物産出酵素）至適温度３５〜４５℃ （ニユーロスポラ属微生物産出酵素）（ｇ）ｐＨ、温度などによる失活条件ｐＨ条件による失活ｐＨ＿４以下もしくはｐＨ１０以上で殆ど１００％失活
する。温度による失活アスペルギルス属微生物産出酵素は４０℃迄１００％安
定、４５℃で約６０％失活する。ニユーロスポラ属微生物産出酵素は３０℃で約５０％、
５０℃で約１００％失活する。２アスペルギルス属ま
たはニユーロスポラ属に属するグリセロール酸化酵素生
産能を有する微生物を培地中に培養し、培養物中よりグ
リセロール酸化酵素を採取することを特徴とするグリセ
ロール酸化酵素の製造法。３グリセロールに酵素の存在下グリセロール酸化酵素
を作用せしめてこの系の酸素消費量を測定するかあるい
は生成する過酸化水素もしくはグリセルアルデハイドを
定量することを特徴とするグリセロールの定量法。