JP3778603B2 - ソルビトールオキシダーゼ、その製造法およびその用途 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は下記反応式
【0002】
【化2】
【0003】
にて示される反応を触媒し、かつD−ソルビトールに基質特異性を有し、D−グルコースに実質的に作用しない理化学的性質を特徴とするソルビトールオキシダーゼ(Sorbitol oxidase)、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属する当該ソルビトールオキシダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物から当該ソルビトールオキシダーゼを採取してなる当該ソルビトールオキシダーゼの製造法および当該ソルビトールオキシダーゼを含有してなるD−ソルビトール測定用組成物に関する。
【0004】
【従来技術】
D−ソルビトールはポリオールのうちの代表的な物であり、生体内ではD−グルコースからアルドース還元酵素により生成される。糖尿病において高血糖状態が続き細胞内におけるD−ソルビトール産生が亢進すると、D−ソルビトールは微量しか細胞外に拡散しないために細胞内に過剰蓄積し、蓄積されたD−ソルビトールにより神経細胞等への種々の障害をきたすことが明らかとなってきた(堀田饒ら,ホルモンと臨床,35,309−313,1987)。従ってD−ソルビトールを正確に定量する事は糖尿病患者の合併症を把握する上で重要である。
【0005】
D−ソルビトールは特に水晶体、神経、赤血球などに存在していることから、各臓器におけるD−ソルビトールの測定が試みられているが、例えば赤血球中のD−ソルビトールの濃度は全血に換算した場合、糖尿病患者においてさえ10μM〜50μM程度と低濃度であることが知られている(J.Maloneら,Diabetes,29,861−864,1980)。
【0006】
D−ソルビトールの測定法としてはガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、ソルビトールデヒドロゲナーゼ(L−Iditol:NAD+2−oxidoreductase(EC1.1.1.14))を用いた酵素法などが知られている。しかし、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法は操作が煩雑であった。またソルビトールデヒドロゲナーゼを用いた酵素法では、ソルビトールデヒドロゲナーゼのD−ソルビトールに対する基質特異性が低いためにD−ソルビトールを正確に測定し難く、またソルビトールデヒドロゲナーゼの安定性が悪く、さらに補酵素が必要であるため試料中の夾雑物質の影響を受けやすいという欠点を有している。
【0007】
そこで、本発明者らはD−ソルビトールに作用する酵素のうち補酵素を必要としないソルビトールオキシダーゼについて検索したところ、リンゴの葉由来(S.Yamaki,Plant Cell Physiol.,21(4),591−599,1980)のものが補酵素を必要とすることなくD−ソルビトールをD−グルコースへ変換することが述べられているがこの酵素反応は下記反応式
【0008】
【化3】
【0009】
にて示され、過酸化水素の生成を伴わない反応である。
また微生物由来としてはキサントモナス属(特開平6−169764号公報)のものが知られ、このソルビトールオキシダーゼは下記反応式
【0010】
【化4】
【0011】
にて示される酵素反応を示すものである。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
酵素反応に補酵素を必要とせず試料中に含まれる補酵素などの夾雑物質の影響を受けにくいという点でソルビトールデヒドロゲナーゼより上記反応式2で示されるソルビトールオキシダーゼの方が優れている。しかしこの上記反応式2で示されるソルビトールオキシダーゼを用いて高血糖状態で生じてくるD−ソルビトールを定量的に測定するに当たって、被検液である例えば赤血球を含む血液においてD−ソルビトールの濃度に比べて約500〜1000倍程度D−グルコースを内在していることからD−グルコースに実質的には作用せず、D−ソルビトールに対する基質特異性が高いソルビトールオキシダーゼの開発が求められている。この点、上記のキサントモナス属由来のソルビトールオキシダーゼはD−ソルビトールに比較してD−グルコースに対して相対活性0.54%の作用を有するためD−ソルビトールの測定誤差を生じやすい欠点があった。
【0013】
本発明は、D−グルコースに実質的に作用しない基質特異性の優れたソルビトールオキシダーゼを提供し、D−ソルビトールの優れた測定用組成物を提供するものである。
【0014】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、D−グルコースに実質的に作用しない基質特異性に優れたソルビトールオキシダーゼおよびその製造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、京都市内の土壌から単離したストレプトミセス・エスピーSO−1118株と同定した微生物がD−グルコースに実質的に作用せず、D−ソルビトールに基質特異性を有する下記反応式
【0015】
【化5】
【0016】
で示すソルビトールオキシダーゼの生産能を有することを初めて見いだし、D−ソルビトールの優れた測定用組成物を見いだし、本発明を完成させた。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、下記反応式
【0017】
【化6】
【0018】
にて示される反応を触媒し、かつD−ソルビトールに基質特異性を有し、D−グルコースに実質的に作用しない理化学的性質を特徴とするソルビトールオキシダーゼおよびストレプトミセス属に属する当該ソルビトールオキシダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からソルビトールオキシダーゼを採取することを特徴とするソルビトールオキシダーゼの製造法、さらに上記ソルビトールオキシダーゼを含有してなるD−ソルビトール測定用組成物である。
【0019】
また本発明のソルビトールオキシダーゼでは50℃、1時間の熱処理で95%以上の活性を保持する熱安定性に優れた理化学的性質を有していることから液状化試薬として優れたものとして提供できるものである。
以下本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のソルビトールオキシダーゼ生産菌について、ストレプトミセス属に属するソルビトールオキシダーゼを生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ソルビトールオキシダーゼを生産する能力を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはストレプトミセス属に属するSO−1118株が挙げられる。
【0020】
本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。
なお本菌株の同定に当たっては、実験結果をBergey’s Manualof Systematic Bacteriology Vol.4に対比して同定を行った。また色の表示はColor Harmony ManualVol.4、Container Corporation of Americaに従った。
1.各種培地における生育状態、28℃20日間
イースト麦芽寒天培地
生育:良好
基生菌糸の色:Beaver(3li)
気菌糸:良好、Ashes(5fe)
拡散性色素:生じない
オートミール寒天培地
生育:良好
基生菌糸の色:Beaver(4li)
気菌糸:中程度、Ashes(5fe)
拡散性色素:生じない
スターチ・無機塩寒天培地
生育:良好
基生菌糸の色:Beaver(4li)
気菌糸:中程度〜良好、Ashes(5fe)
拡散性色素:生じない
グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育:良好
基生菌糸の色:Beaver(3li)
気菌糸:中程度、Ashes(5fe)
拡散性色素:生じない
2.形態的性質
基生菌糸:曲線状に分岐を伴って伸長、直径0.5μm前後、培養後期に菌糸が分断。
【0021】
気菌糸:直線上または曲線状に単純分岐をなして伸長、菌糸の直径0.6μm前後、胞子数10〜30個の連鎖胞子を形成。
胞子:短円筒形、0.6〜0.8×0.8〜1.0μm、表面は平滑
胞子嚢、運動性胞子、厚膜胞子、集束菌糸、疑似胞子嚢、菌核:なし
3.生理学的性質
生育温度範囲:10〜42℃
メラニン様色素の生成
ペプトン・イースト・鉄寒天培地 −
チロシン寒天培地 −
4.炭素源の利用性(基礎培地:プリドハム・ゴトリーブ寒天培地)
L−アラビノース +
D−グルコース +
ラフィノース +
D−キシロース +
D−フルクトース (+)
イノシトール −
D−マンニトール −
L−ラムノース −
シュークロース −
5.化学分類的性質
Staneckらの方法(Applied Microbiorogy 28226−231(1974))に従って分析した結果、LL−ジアミノピメリン酸が検出され、meso−型は検出されない。
【0022】
以上のように本菌株は、真性の基生菌糸より多数の胞子連鎖を形成する気菌糸を生じ、ジアミノピメリン酸がLL−型であり、運動性胞子や胞子嚢を形成しない等の特徴を有している。これらの特徴をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.4より検索した結果、本菌株はストレプトミセス属に属するものと同定し、本菌株をストレプトミセス・エスピーSO−1118株と命名し、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号15307(FERM P−15307)として寄託した。
【0023】
本発明者らはストレプトミセス属の菌株がソルビトールオキシダーゼを生産することを見いだし、該酵素の精製および諸性質の検討を行った。
本発明のストレプトミセス属に属するソルビトールオキシダーゼ生産菌の培養を実施するに当たっては、抗生物質、酵素等の生産に使用される通常の方法で培養することができる。その培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。また使用する培地の栄養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源の他、ストレプトミセス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【0024】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース、キシロース、マルトース、ソルビトール、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸などの他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。
窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウムなどが挙げられる。また有機窒素源としては、例えば大豆、米、トウモロコシ、小麦粉の粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。
【0025】
無機塩および微量栄養素としては、例えばリン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、マンガン等の塩類の他、ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤などの菌の生育やソルビトールオキシダーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、ソルビトールオキシダーゼが産生する範囲であれば良く、通常10℃〜42℃、好ましくは25℃〜35℃である。培養時間は、条件により異なるがソルビトールオキシダーゼが最も産生される時間まで培養すれば良く、通常15〜200時間程度である。
【0026】
ソルビトールオキシダーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ソルビトールオキシダーゼの抽出法を例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に懸濁し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製のソルビトールオキシダーゼ含有液を得る。
【0027】
粗製のソルビトールオキシダーゼ含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離精製手段を用いて精製ソルビトールオキシダーゼを得る。例えば、粗製のソルビトールオキシダーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用してソルビトールオキシダーゼを沈殿させ、回収する。
【0028】
さらに、この沈殿物を必要に応じ透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。またこれらの方法を適当に組み合わせることによりソルビトールオキシダーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【0029】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のソルビトールオキシダーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行っても良く、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどの1種または2種以上を0.1〜10%程度添加しても良い。
【0030】
また本発明のD−ソルビトール測定用組成物はD−ソルビトールを含有する試料に該ソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素、D−グルコースまたは消費される酸素量を測定してD−ソルビトールを測定する。
D−ソルビトールを含む試料としては例えば、赤血球、全血またはその細胞破砕液等の生体試料や食品などを挙げることができる。
【0031】
過酸化水素の測定法としては過酸化水素電極を用いて測定しても良く、過酸化水素と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組成物を用いて測定しても良い。またこの指示薬組成物としては通常色調の変化を可視にて生ずる呈色組成物、紫外線照射により蛍光を発する蛍光組成物や発光する発光組成物など分光光学的にその変化を定量しうる組成物が用いられる。例えば呈色組成物としてはパーオキシダーゼ作用を有する物質と発色試薬との含有物が用いられる。パーオキシダーゼ作用を有する物質としては、西洋わさび由来のパーオキシダーゼが通常良く用いられ、また発色試薬としては電子受容体とフェノール誘導体またはアニリン誘導体の組み合わせが通常良く用いられる。さらに電子受容体としては、例えば4−アミノアンチピリン、4−アミノ−3−ヒドラジノ−5−メルカプト−1,2,4−トリアゾール、2−ヒドラジノベンゾチアゾール、3−メチル−2−ベンゾチアゾロンヒドラチン、2−アミノベンゾチアゾール等が用いられ、またフェノール誘導体としては例えばフェノール、p−ヒドロキシ安息香酸Na、p−クロロフェノール、2,4−ジクロロフェノール、4,6−ジクロロ−o−クレゾール、2,4−ジブロムフェノール、3,5−ジクロロ−2−ヒドロキシベンゼンスルホン酸Na、3,5−キシレノール等が挙げられ、アニリン誘導体としては、例えば3−メチル−N−エチル−N−(β−ヒドロキシエチル)アニリン、N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチルアニリン、N,N−ジエチル−m−トルイジン、N,N−ジエタノール−m−トルイジン、N,N−ジメチル−m−メトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−m−トルイジンNa、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、3−アセトアミノ−N,N−ジエチルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−m−アニシジン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−アニシジン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイジン、N−スルホプロピルアニリン等が挙げられる。
【0032】
また蛍光組成物や発光組成物における発光性基質としては、公知の種々のものが挙げられ、例えば2,4,6−トリクロロフェノール、オキザレート、フェニルチオヒダントイン、ホモバニリン酸、4−ヒドロキシフェニル酢酸、バニリルアミン、3−メトキシチラミン、フロレチン酸、ホルデニン、ルミノールモノアニオン、アクリジニウムエステル、ルミゲニン、ロフイン等が挙げられ、化学発光反応によって発光を得るには過酸化水素の分解を促進する触媒としてK2 S2 O2 、NaClO、Fe(II)塩、Mn(II)塩、NH3 −Cu2+、K3 Fe(CN)6 、Co(II)アミン錯塩、ヘモグロビン、ヘミン、パーオキシダーゼ等を作用させればよい。また発光反応時、発蛍光物質を共存させることにより検出感度を高め、同時に発光波長を蛍光剤の蛍光波長に変えることができる。好ましい発蛍光剤は2−メチルウンベリフェロン、フルオレッセイン、9,10−ジフェニルアントラセン等が挙げられる。
【0033】
グルコースの測定法としてはグルコースデヒドロゲナーゼによる紫外部測定法、ヘキソキナーゼ/グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼによる紫外部測定法などがある。またジアホラーゼ等を用いたホルマザン反応を用いる方法もある。消費する酸素の測定法としては、ワールブルグ検圧法および酸素電極等を用いる方法が挙げられる。
【0034】
本発明のD−ソルビトール測定用組成物に用いるソルビトールオキシダーゼの濃度は0.01U/mL〜100U/mL、好ましくは0.1U/mL〜10U/mLの濃度範囲で用いられる。
本発明のD−ソルビトール測定用組成物のpHは緩衝液により例えばpH6〜pH8.5、好ましくはpH7〜pH8に保たれているのが望ましい。また発蛍光反応時はpH6〜pH11、好ましくはpH8〜pH10が望ましい。使用する緩衝液としてはトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液またはGOODの緩衝液が好ましい。
【0035】
本発明の組成物を用いて測定する条件としては、特に厳密に規制されるものではないが、反応温度は酵素活性の発現する温度約20℃〜40℃の間で行えば良く、37℃が好適に用いられ、好ましくは該ソルビトールオキシダーゼを5〜15分反応させて行う。
本発明では測定対象であるD−ソルビトールをレート法によってもエンドポイント法によっても測定することができる。
【0036】
本発明のD−ソルビトール測定用組成物は必要により、上記の測定対象物、例えば過酸化水素の測定における発色試薬は、0.01mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mM、パーオキシダーゼは通常0.1U/ml〜10U/mL、好ましくは0.5U/mL〜2U/ml程度用いられる。発蛍光試薬および触媒は0.01mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mM程度用いられ、発蛍光物質は通常発光物質の2倍モル〜1/100倍モル用いればよい。また例えばグルコースの測定においてグルコースデヒドロゲナーゼは0.01U/mL〜500U/mL、好ましくは0.1U/mL〜50U/mL、用いられ基質としてNAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)0.01mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mMが用いられる。またヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼは0.01U/mL〜500U/mL、好ましくは0.1U/mL〜50U/mL用いられ、基質としてATP(アデノシン−3−リン酸)、Mg2+およびNADは0.01mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mMが用いられる。また前記酵素反応系にホルマザン反応を組み合わせて、例えばNTB(ニトロテトラゾリウムブルー)を基質として0.001%〜0.1%、ジアホラーゼを0.01U/mL〜500U/mL、好ましくは0.1U/mL〜50U/mLを用いて行うこともできる。これらの他に適宜界面活性剤、防腐剤、活性化剤、安定化剤等を加えることができる。
【0037】
上記の如くの組成物は凍結品、凍結乾燥品として溶解液を組み合わせても良く、また簡便性を考慮して近年主流になりつつある液状品として調製しても良い。
次に本発明で得られるソルビトールオキシダーゼ活性測定法および理化学的性質を述べる。
ソルビトールオキシダーゼの活性測定法
0.2MのPIPES(ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸))緩衝液(pH7.5)0.2mL、0.2MのD−ソルビトール水溶液0.5mL、0.3%の4−アミノアンチピリン0.1mL、0.3%のTOOS(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイジン)0.1mL、45U/mLのパーオキシダーゼ0.1mLよりなる反応液1mLを37℃で5分間予備加温した後、0.1mLの酵素液を添加して10分間反応させる。反応後、2mLの0.5%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を添加して反応を停止させ、5分以内に層長1.0cmセルを用いて波長555nmにおける吸光度(As)を測定する。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水0.1mLを用いて同一の操作を行って吸光度(Ab)を測定する。この酵素液使用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(As−Ab)より酵素活性を求める。酵素活性1単位は37℃で1分間に1マイクロモルの過酸化水素を精製させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
【0038】
【数1】
理化学的性質
(1)酵素作用
基質としてD−ソルビトールを用いた酵素作用を以下に示す。
【0039】
【化7】
【0040】
(2)基質特異性
ソルビトールオキシダーゼの基質特異性を示す。
各種基質に対する特異性は表1の通りである。
【0041】
【表1】
【0042】
なお、相対活性が0%とは実質的に作用しない性質を意味するものであって、反応の検出限界を考慮するとD−ソルビトール活性に比べて0.1%以下の相対活性を示す。
(3)Km値
D−ソルビトールに対して0.26mM±0.02mMであった。
(4)等電点
pH3.5〜10.0のキャリアーアンフォライトを用いた電気泳動法により本酵素の等電点は5.2±0.5であった。
(5)分子量
ファルマシア製Sephadex G−75を用いたゲル濾過法およびSDSポリアクリルアミド電気泳動法により測定した本酵素の分子量は45000±5000であった。
(6)至適pH
前記酵素活性測定法にしたがって至適pHを求め、その結果を図1に示した。
pH3.0〜5.0の範囲は100mMの酢酸ナトリウム緩衝液(図中、▼)、pH5.0〜7.0の範囲は100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(図中、□)、pH7.0〜9.0の範囲は100mMのトリス−塩酸緩衝液(図中、●)、pH9.0〜10.5の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(図中、○)を使用した場合の活性値を示すもので、至適pHは7〜7.5であった。
(7)pH安定性
100mM各種緩衝液(ソルビトールオキシダーゼ0.5U/mL)を4℃、40時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図2に示した。pH3.0〜5.0の範囲は100mMの酢酸ナトリウム緩衝液(図中、▼)、pH5.0〜7.0の範囲は100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(図中、□)、pH7.0〜9.0の範囲は100mMのトリス−塩酸緩衝液(図中、●)、pH9.0〜10.5の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(図中、○)を使用した。pH7〜10の範囲で最も良好な安定性を示した。
(8)至適温度
前記酵素活性測定法に従って温度を5℃〜80℃の範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図3に示した。本酵素の至適温度は30℃〜37℃であった。
(9)熱安定性
0.5U/mLのソルビトールオキシダーゼを100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で調製し、各温度で1時間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図4に示される通りであって、少なくとも40℃まで100%安定で、50℃1時間の処理では95%以上の残存活性を保持していた。
(10)金属イオンおよび汎用有機添加物の活性に及ぼす影響
各種金属イオンおよび診断用組成物において汎用される有機添加物のソルビトールオキシダーゼ活性への影響について調べた結果は表2に示した。
【0043】
【表2】
【0044】
この表2に示す通り、鉄イオン、水銀イオンやアジ化ナトリウムによって阻害を受けた。
以上の結果から本発明のソルビトールオキシダーゼと従来から知られているキサントモナス属由来のソルビトールオキシダーゼ(特開平6−169764号公報)との性質を比較すると次の通りである。
【0045】
Km値
本酵素:0.26±0.02mM(D−ソルビトールに対して)
キサントモナス・マルトフィリア由来:0.60mM(D−ソルビトールに対して)
上記の通り本発明のソルビトールオキシダーゼはD−ソルビトールに基質特異性を有し、D−グルコースに実質的に作用しないの理化学的性質において従来より知られている酵素とは明らかに異なる新規な酵素と判断され、さらに等電点が5.2±0.5、至適温度が30〜37℃である理化学的性質においても明らかに異なるとともに、本発明のソルビトールオキシダーゼはD−グルコースに実質的に作用せず、至適温度がD−ソルビトール測定条件に近似していること、Km値が小さいとの優れた性質を有し、D−ソルビトールの測定用酵素として優れたものである。特に血液中には、D−グルコース、D−フルクトースが多量に含まれており、これらに実質的に作用しないという性質はD−ソルビトール測定用酵素として非常に望ましい性質である。
【0046】
【発明の実施の形態】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【0047】
【実施例1】
ストレプトミセス・エスピーSO−1118株を1.0%のグルコース、0.5%のポリペプトン、0.5%の肉エキスおよび0.3%の塩化ナトリウムからなる培地(pH7.0)を30mLの試験管に5mLずつ分注したものに植菌した後、30℃、36時間振とう培養した。この培養液1mLを上記と同一組成培地を500mLの坂口フラスコに100mLずつ分注したものに移し、さらに30℃、24時間振とう培養を行い、種培養液を得た。得られた種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地(pH7.0)の20Lのジャーファーメンターに400mL添加し30℃で20時間培養した。培養終了後、培養物を濾過し、湿菌体約990gを回収した。
【0048】
この菌体を5mMのEDTA・2Na、1mMのPMSF(ふっ化フェニルメチルスルフォニル)を含む25mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)6Lに加え懸濁後、超音波破砕装置を用いて可溶化を行った。その後、破砕液を4500rpmで30分間遠心し、不溶物を除去してその上清6.79L(247.5U)を得た。
【0049】
ついでこの上清を25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE−セファロースFF(5.0×80cm)(ファルマシア製)を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は0〜0.5Mの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、1フラクション100mLとし、活性画分としてフラクションNo.43〜47を回収後、同緩衝液に対して一晩透析し600mL(178.2U)の酵素液を得た。
【0050】
次にこの酵素液を25mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したQ−セファロースHP(3.2×20cm)(ファルマシア製)を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は0〜0.5Mの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、1フラクション5mLとし活性画分としてフラクションNo.18〜23を回収し、80%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、4℃一晩放置後、15000rpm、20分間遠心し、沈殿を回収した。この沈殿を150mMの塩化ナトリウムと5mMのEDTAを含む25mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、141mL(95.7U)の懸濁液を得た。
【0051】
この懸濁液を同緩衝液にて平衡化したセファデックスG−75(5.0×80cm)(ファルマシア製)を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。1フラクション20mLとし活性画分としてフラクションNo.26〜33を回収後、20mMリン酸ナトリウム緩衝液に対して一晩透析を行い、160mL(72.6U)の酵素液を得た。
【0052】
ついでこの酵素液を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)にて平衡化したMono−Q(1.0×10cm)(ファルマシア製)を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は0〜0.5Mの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、1フラクション1mLとし活性画分としてフラクションNo.18〜30を回収し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して一晩透析し25.6mL(59.4U)の酵素液を得た。
【0053】
ついでこの酵素液を約6倍に濃縮後、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)にて平衡化したハイドロキシアパタイト(1.0×5cm)(ペンタックス社製)を用いてクロマトグラフィーを行った。カラムに吸着はさせず、平衡化に用いた緩衝液により素通しさせた画分を回収し、電気泳動的に単一バンドを示す、精製ソルビトールオキシダーゼ液4.3mL(29.7U)を得た。
【0054】
このようにして得られたソルビトールオキシダーゼの理化学的性質は前記した通りである。
【0055】
【実施例2】
反応液として40mMのPIPES緩衝液(pH7.5)、0.03%の4−アミノアンチピリン、0.03%のTOOS、4.5U/mLのパーオキシダーゼおよび本発明のソルビトールオキシダーゼ0.5U/mlを含む反応液を調製し、この反応液1mLを用いてD−ソルビトール濃度0〜0.5mMの試料溶液50μLを添加して反応を開始した。37℃で5分間反応させ、分光光度計を用いて波長555nmにおける吸光度を測定した結果は図5に示すとおりであって、D−ソルビトールの濃度0.5mMまで定量が可能であった。
【0056】
【発明の効果】
本発明により、新規なソルビトールオキシダーゼおよびストレプトミセス属に属する微生物によるソルビトールオキシダーゼの新規な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるD−ソルビトール測定用組成物を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は本発明のソルビトールオキシダーゼの至適pH曲線を示す。
【図2】図2は本発明のソルビトールオキシダーゼのpH安定曲線を示す。
【図3】図3は本発明のソルビトールオキシダーゼの至適温度曲線を示す。
【図4】図4は本発明のソルビトールオキシダーゼの熱安定曲線を示す。
【図5】図5は本発明のソルビトールオキシダーゼを用いて測定したD−ソルビトールの検量線である。
Claims (6)
- ストレプトミセス属由来の以下の物理学的性質、及び理化学的性質を有するソルビトールオキシダーゼ。
(1)酵素作用
基質としてD−ソルビトールを用いた酵素作用を以下に示す。
基質特異性として、D−ソルビトールに高い反応性を示し、且つ、D−グルコースに実質的に作用しない
(3)Km値
ソルビトールに対して0.26mM±0.02mM
(4)等電点
5.2±0.5(電気泳動法)
(5)分子量
45000±5000(ゲル濾過法またはSDSポリアクリルアミド電気泳動法)
(6)至適pH
6.5〜8.0(トリス塩酸緩衝液、pH7.5における活性値の90%以上を表す活性)
(7)pH安定性
pH7〜10
(8)熱安定性
55℃まで安定(pH7.5で15分間熱処理後90%以上の残存) - ストレプトミセス属由来が、ストレプトミセスエスピーSO−1118(FERM P−15307)株由来である請求項1記載のソルビトールオキシダーゼ。
- 請求項1記載のソルビトールオキシダーゼを生産するストレプトミセス属に属する生産菌を培地に培養し、その培養物から当該ソルビトールオキシダーゼを採取することを特徴とする当該ソルビトールオキシダーゼの製造法。
- 請求項1記載のソルビトールオキシダーゼを生産するストレプトミセス属に属する生産菌が、ストレプトミセス・エスピーSO−1118(FERMP 15307)株である請求項3記載のソルビトールオキシダーゼの製造法。
- 請求項1又は2記載のソルビトールオキシダーゼを含有してなるD−ソルビトール測定用組成物。
- 請求項5記載のソルビトールオキシダーゼを含有してなるD−ソルビトール測定用組成物を用いることを特徴とする赤血球中のD−ソルビトール濃度の測定方法であって、試料に該ソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素、D−グルコースまたは消費される酸素量を測定してD−ソルビトール濃度を測定する方法。
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