JPH0284177A - L―フコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
L―フコースデヒドロゲナーゼInfo
- Publication number
- JPH0284177A JPH0284177A JP63234745A JP23474588A JPH0284177A JP H0284177 A JPH0284177 A JP H0284177A JP 63234745 A JP63234745 A JP 63234745A JP 23474588 A JP23474588 A JP 23474588A JP H0284177 A JPH0284177 A JP H0284177A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fucose
- fdh
- dehydrogenase
- nadp
- coenzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010023240 L-fucose dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- PNNNRSAQSRJVSB-KCDKBNATSA-N aldehydo-L-fucose Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-KCDKBNATSA-N 0.000 title abstract 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims abstract description 39
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 claims abstract description 38
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 23
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- OSXGMQNNCKRLKP-UHFFFAOYSA-M sodium;1h-imidazole;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.C1=CNC=N1.C1=CNC=N1.C1=CNC=N1 OSXGMQNNCKRLKP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 2
- 102000002247 NADPH Dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 abstract description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 abstract 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 abstract 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 abstract 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 abstract 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 abstract 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940062827 2'-fucosyllactose Drugs 0.000 description 1
- HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 2-O-alpha-L-Fucosyl-lactose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 2-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N L-galactose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N UNPD26986 Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)OC(CO)C(O)C1O SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 229940046892 lead acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000019086 sulfide ion homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000001052 yellow pigment Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、L−7コースに作用してL−フコノラクトン
にすると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチドリン酸(NADP)を還元型二フチン7ミド
・アデニン・ジヌクレオチドリン酸(NADPH)に還
元する新規なL−フコースデヒドロゲナーゼ(以下L−
FDHという)とその製造法及びL−FDHを用いる′
L−7コースの酵素的定量方法及びその定量用キットに
関するものである。
にすると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチドリン酸(NADP)を還元型二フチン7ミド
・アデニン・ジヌクレオチドリン酸(NADPH)に還
元する新規なL−フコースデヒドロゲナーゼ(以下L−
FDHという)とその製造法及びL−FDHを用いる′
L−7コースの酵素的定量方法及びその定量用キットに
関するものである。
〈従来の技術〉
蛋白質や脂質に結合している複合糖質が、生体の情報伝
達の一部を担っていることが指摘されて以来、これらの
糖質に関する知見が急速に増加している。それらの中に
、肺ガンの病態に呼応して、そのL−フコースが増減す
るという報告(C1in、 Chem、、 Vol、2
2. No、9.1516〜1521゜(1976)]
がある。故にこの糖を測定することは、この種の患者の
病態に関して有用な情報を与えると思われる。
達の一部を担っていることが指摘されて以来、これらの
糖質に関する知見が急速に増加している。それらの中に
、肺ガンの病態に呼応して、そのL−フコースが増減す
るという報告(C1in、 Chem、、 Vol、2
2. No、9.1516〜1521゜(1976)]
がある。故にこの糖を測定することは、この種の患者の
病態に関して有用な情報を与えると思われる。
その測定法は、酵素を用いた方法が精度と簡便性の上に
おいて優れている。L−7コース定量用の酵素としては
、ブタ肝臓由来のL−FDH(J。
おいて優れている。L−7コース定量用の酵素としては
、ブタ肝臓由来のL−FDH(J。
Biol、 Chem、、 Vol、244. 4
785〜4792. (1969)]羊肝臓由来のL
−F D H[Arch、 Biochem、 Bi
o−phys、、 Vol、186.184〜188.
(1978)] 、ウサギ肝臓由来のL −F D
H[J、 Biochem、、 Vol、86゜155
9〜1565. (1979)) 、コリネバクテリウ
ム属細菌由来のL−FDH(特開昭62−155085
) 、プルラリアプルランス由来のL−FDH(Arq
、 Biol。
785〜4792. (1969)]羊肝臓由来のL
−F D H[Arch、 Biochem、 Bi
o−phys、、 Vol、186.184〜188.
(1978)] 、ウサギ肝臓由来のL −F D
H[J、 Biochem、、 Vol、86゜155
9〜1565. (1979)) 、コリネバクテリウ
ム属細菌由来のL−FDH(特開昭62−155085
) 、プルラリアプルランス由来のL−FDH(Arq
、 Biol。
Tecnol、、 Vol、30.361〜366、
(1987))などが知られているが、いずれも補酵素
としてニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(N
AD)を利用スるデヒドロゲナーゼである。
(1987))などが知られているが、いずれも補酵素
としてニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(N
AD)を利用スるデヒドロゲナーゼである。
これらを利用してL−フコースを定量する試みも、また
いくつか提出されている。たとえば、特開昭62−17
5197やAnal、 Biochem、、 Vol、
121゜129〜134. (1982)やAnal、
Biochem、、 Vol、112゜76〜81.
(1981)およびMethods Enzym、
Anal。
いくつか提出されている。たとえば、特開昭62−17
5197やAnal、 Biochem、、 Vol、
121゜129〜134. (1982)やAnal、
Biochem、、 Vol、112゜76〜81.
(1981)およびMethods Enzym、
Anal。
(3rd Ed、)、 Vol、6.387〜398等
である。
である。
〈発明が解決しようとする問題点〉
生体の一部、たとえば血清などを試料としてその成分を
酵素的に測定する場合、当然のことながら、生体に本来
含有されている対岸系の酵素や対岸物の影響ができるだ
け少ない様に測定系を組み立てることが望ましい。
酵素的に測定する場合、当然のことながら、生体に本来
含有されている対岸系の酵素や対岸物の影響ができるだ
け少ない様に測定系を組み立てることが望ましい。
この観点から見て、NADPを補酵素として利用するデ
ヒドロゲナーゼを測定に用いるのは、NADを補酵素と
して利用するデヒドロゲナーゼを用いるのに比べて、優
れている。なぜならば、血清等には、NAD (または
NADH)を利用する酵素(たとえば、ラクテート・デ
ヒドロゲナーゼなど)が比較的多く含まれており、また
、その対岸物(たとえば、ピルビン酸や、乳酸など)も
常に含有されており、NADの定量系では、これらの影
響を受は易いからである。
ヒドロゲナーゼを測定に用いるのは、NADを補酵素と
して利用するデヒドロゲナーゼを用いるのに比べて、優
れている。なぜならば、血清等には、NAD (または
NADH)を利用する酵素(たとえば、ラクテート・デ
ヒドロゲナーゼなど)が比較的多く含まれており、また
、その対岸物(たとえば、ピルビン酸や、乳酸など)も
常に含有されており、NADの定量系では、これらの影
響を受は易いからである。
本発明者等は、操作が簡単で、しかも精度の高いし一フ
フースの測定法について検討したところ、土壌から分離
したシュードモナス属に属する一細菌が、L−フコース
に作用して、L−フコノラクトンにすると共にNADP
をNADPHに還元する新規な酵素を生産し、この酵素
がL−フコースの測定に有効に利用できることを見出し
、本発明を完成した。
フースの測定法について検討したところ、土壌から分離
したシュードモナス属に属する一細菌が、L−フコース
に作用して、L−フコノラクトンにすると共にNADP
をNADPHに還元する新規な酵素を生産し、この酵素
がL−フコースの測定に有効に利用できることを見出し
、本発明を完成した。
すなわち、本発明はL−7コースに作用して、L−7コ
ノラクトンにすると共にNADPをNADPHに還元す
る新規な酵素L−FDHであり、また本発明は、シェー
ドモナス属に属し、NADPを補酵素として利用するL
−FDH生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
りL−FDHを採取することを特徴とするL−FDHの
製造法である。
ノラクトンにすると共にNADPをNADPHに還元す
る新規な酵素L−FDHであり、また本発明は、シェー
ドモナス属に属し、NADPを補酵素として利用するL
−FDH生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
りL−FDHを採取することを特徴とするL−FDHの
製造法である。
そしてまた、本発明は、L−フコース含有試料にNAD
Pを補酵素とするL−FDHを作用させ、生成するNA
DPHを測定するし一7コースの定量法であり、また、
L−フコース含有試料にL−7コシダーゼとL−FDH
を順次に又は、同時に作用させ、生成するNADPHを
測定する結合形L−フコースの定量法であり、さらに少
なくとも、該L−FDH,NADP、及び緩衝液を含む
定量法キットである。
Pを補酵素とするL−FDHを作用させ、生成するNA
DPHを測定するし一7コースの定量法であり、また、
L−フコース含有試料にL−7コシダーゼとL−FDH
を順次に又は、同時に作用させ、生成するNADPHを
測定する結合形L−フコースの定量法であり、さらに少
なくとも、該L−FDH,NADP、及び緩衝液を含む
定量法キットである。
〈問題点を解決するための手段〉
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における新規酵素L−FDHの理化学的性質は下
記の通りである。
記の通りである。
(1)作用及び基質特異性
次の反応式に示されるごとく、L−フコースとNADP
の共存下でL−フコースをL−フコノラクトンに酸化す
ると共にNADPをNADPHに還元する。
の共存下でL−フコースをL−フコノラクトンに酸化す
ると共にNADPをNADPHに還元する。
L−フコース+NADP
+
L−フコ/ラクトン+NADPH+H
本酵素は、L−フコース(100%)に最も特異性が高
いが、L−ガラクトース(96%)、D−7ラビノース
(1%)などにも作用する。しかし、他の通常存在する
糖類には、はとんど、または全く作用しない。
いが、L−ガラクトース(96%)、D−7ラビノース
(1%)などにも作用する。しかし、他の通常存在する
糖類には、はとんど、または全く作用しない。
また、本酵素は、補酵素としてNADP(100%)を
要求し、NAD (1%)に対しては、わずかしか作用
を示さない。
要求し、NAD (1%)に対しては、わずかしか作用
を示さない。
(2)至適pH及び安定pH範囲
トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、第1図に示すとおり、9.0〜10.0である。
場合、第1図に示すとおり、9.0〜10.0である。
安定pH範囲は同じく第2図tこ示すごと<、8.0〜
10.5である。
10.5である。
(3)作用適温の範囲
第3図に示すごとく、40〜60’Cである。
(4)pH1温度等による失活の条件
第4図に示すごとく、10分間の熱処理では、40°C
まで安定であり、それ以上の温度では急速に失活する。
まで安定であり、それ以上の温度では急速に失活する。
30’C,60分間の熱処理ではpH8、O〜10,5
で安定であり、p H6,0以下では特に不安定である
。
で安定であり、p H6,0以下では特に不安定である
。
(5)阻害剤の影響及び安定化
上表は、各種金属塩及び阻害剤を2mMの濃度で含有す
る反応液中での酵素活性を測定したものである。
る反応液中での酵素活性を測定したものである。
その他、CaCl2. Mg5On、 N15O,Cu
SO4,EDTA。
SO4,EDTA。
O−フェナントロリン α、α9−ジピリジル。
KCN、 NaN3等の阻害及び活性化は観察されなか
った0 (6)精製方法 本酵素の単離精製は、常法に従って行うことができる。
った0 (6)精製方法 本酵素の単離精製は、常法に従って行うことができる。
たとえば、硫安沈殿、フェニルセファロースを用いたカ
ラムクロマトグラフィー、DEAEセファデックスを用
いたカラムクロマトグラフィー、セファデックスG−1
00によるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組
合わせて使用する。
ラムクロマトグラフィー、DEAEセファデックスを用
いたカラムクロマトグラフィー、セファデックスG−1
00によるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組
合わせて使用する。
(7)分 子 量
0、05 Mリン酸カリウム緩衝液(0,I M Na
C1含有)ヲ用いてセファデックスG−100カラムに
よるゲル濾過法により測定した値は、約32. OOO
〜36. OOOである。
C1含有)ヲ用いてセファデックスG−100カラムに
よるゲル濾過法により測定した値は、約32. OOO
〜36. OOOである。
(8)ポリアクリルアミドゲル電気泳動15%ポリアク
リルアミドゲルを用いて、常法によって電気泳動を行っ
た結果、第5図に示すごとく、はぼ単一のバンドが認め
られた。ブロムフェノールブルーを指標とした時の相対
泳動距離は、7.5%ゲルの場合が0.79.10%ゲ
ルの場合が0.57.15%ゲルの場合が0.37であ
った。
リルアミドゲルを用いて、常法によって電気泳動を行っ
た結果、第5図に示すごとく、はぼ単一のバンドが認め
られた。ブロムフェノールブルーを指標とした時の相対
泳動距離は、7.5%ゲルの場合が0.79.10%ゲ
ルの場合が0.57.15%ゲルの場合が0.37であ
った。
(9)等 電 点
アクリルアミド焦点電気泳動法によって測定した値は、
5.2である。
5.2である。
(10)活性の測定法
トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液(各々0
.12M含有液を4NNaOHでp H9,5m調製す
る)2.5mgに15mMNADP溶液0.2 M!/
を加える。37°Cに5分間保った後に酵素液0.1ゴ
を加え、更に150mML−フコース溶液0.2いtを
加えて混合し、反応を始める。直ちに37°Cに保った
吸光度測定用セル(1cm光路)に移し、340 nm
の波長で2分または必要であれば、それ以上の時間にわ
たって吸光度を測定する。1単位は、1分間に1μモル
のNADPHを生成させる酵素量である。
.12M含有液を4NNaOHでp H9,5m調製す
る)2.5mgに15mMNADP溶液0.2 M!/
を加える。37°Cに5分間保った後に酵素液0.1ゴ
を加え、更に150mML−フコース溶液0.2いtを
加えて混合し、反応を始める。直ちに37°Cに保った
吸光度測定用セル(1cm光路)に移し、340 nm
の波長で2分または必要であれば、それ以上の時間にわ
たって吸光度を測定する。1単位は、1分間に1μモル
のNADPHを生成させる酵素量である。
以上のように本酵素は、その補酵素にNADPを用いる
という点で従来知られていなかった新規なL−FDHで
ある。
という点で従来知られていなかった新規なL−FDHで
ある。
次に、本発明による新規な酵素L−FDHの製造法につ
いて説明する。
いて説明する。
使用される微生物は、シュードモナス属に属し、該L−
FDH生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、シュードモナスsp、 No。
FDH生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、シュードモナスsp、 No。
1143が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株モ用い
られる。シュードモナスsp、 No、1143は、本
発明者等が土壌中より分離した菌株であり、その菌学的
性質は下記の通りである。
られる。シュードモナスsp、 No、1143は、本
発明者等が土壌中より分離した菌株であり、その菌学的
性質は下記の通りである。
(a)形 態
顕微鏡的観察(24°C1肉汁寒天培地、16時間培養
) ■細胞の大きさ二0.4〜0.5×0.7〜1.0μm
の桿菌 ■細胞の多形性:均一な桿菌であり、末端で相互に連な
った短い連鎖状態も見られる。
) ■細胞の大きさ二0.4〜0.5×0.7〜1.0μm
の桿菌 ■細胞の多形性:均一な桿菌であり、末端で相互に連な
った短い連鎖状態も見られる。
■運 動 性:運動性あり(極毛)。2個連鎖したもの
は、回転する。
は、回転する。
■胞子の有無:形成しない。
■ダラム染色性:陰性
■抗 酸 性:陰性
(b)各培地における生育状態
■肉汁寒天平板培養:30°C2日間の培養で直径1朋
で円状、淡黄色油質様光沢を持つコロニとなる。周縁は
やや波状であるが、更に時間がたつと、金縁となる。
で円状、淡黄色油質様光沢を持つコロニとなる。周縁は
やや波状であるが、更に時間がたつと、金縁となる。
■肉汁寒天斜面培養:生育は普通で淡黄色油質様光沢の
ある菌で表面は円滑である。培地の着色は見られない。
ある菌で表面は円滑である。培地の着色は見られない。
■肉汁液体培養=30°C振盪培養では1日で良く生育
し、5日程で溶菌な始め、7日では完全に溶けて透明に
なった。30°C静置培養では、表面にわずかの菌環と
、少しの白い沈殿を作り、全体かわずかに混濁した。
し、5日程で溶菌な始め、7日では完全に溶けて透明に
なった。30°C静置培養では、表面にわずかの菌環と
、少しの白い沈殿を作り、全体かわずかに混濁した。
■肉汁寒天穿刺培養= (30°C7日培養)側条にそ
ってわずかに生育し、糸状になる。
ってわずかに生育し、糸状になる。
■リドマスミルク:底部分がわずかに還元して脱色し、
わずかに酸性化する。
わずかに酸性化する。
■BCP ミルク:わずかに酸性化する。
■ゼラチン穿刺培養:24°C’7日間の培養によって
、表面が少し液化した。
、表面が少し液化した。
(c)生理的性質
■硝酸塩の還元:陽性
■脱窒反応:嫌気的生育は見られるが、ガスの生成はな
し。
し。
■MRテスト:陰性
■VPテスト:陰性
■インドールの生成:陰性
■硫化水素の生成:陽性(酢酸鉛試験紙法)■デンプン
の分解:陽性 ■クエン酸の利用:陰性 ■無機窒素源の利用:アンモニウム塩は利用するが、硝
酸塩は利用しない。
の分解:陽性 ■クエン酸の利用:陰性 ■無機窒素源の利用:アンモニウム塩は利用するが、硝
酸塩は利用しない。
■色素の生成:黄色の非拡散性色素を生成する。
0ウレアーゼ:陰性
■オキシダーゼ:陰性
■カタラーゼ:陽性
■生育の範囲:温度16〜38°C
(至適27°C付近)
p H5,0〜9.8
(至適pH7付近)
■酸素に対する態度:好気的
@O−Fテスト:変化なし
■糖類から酸及びガスの生成
酸の生成 ガスの生成
1)L−7ラビノース +
(2) D−キシロース +
[3]D−グルコース +
11mD−マンノース +
111D−7ラクトース +
(5) D−ガラクトース
■ マルトース +
(3) シュクロース 十
m ラクトース 十
口 トレハロース +
[0]D−ソルビット
[]]D−マンニット +
ロ イノジット
旧 グリセリン +
口 デンプン +
(d)その他の性質
■菌体内ポリハイドロキシブチレートf)B積陰性
■蛍光性物質の生産 陽性■アルギ
ニン・ジハイドロラーゼの生産 陰性以上の新規なL−
FDH生産能を有する本菌の分類学的諸性質を、「パー
ジエイズ・マニーアル・オブ・システマチック・バクテ
リオロジー」(1984年)第1巻の分類と対比すると
、本菌は、ダラム染色性が陰性、好気性の無胞子桿菌で
種名を持つカタラーゼ陽性菌であることから、シェード
モナス属に属すると思われる。菌体内にポリハイドロキ
シブチレートを蓄積せず、蛍光性物質を生産し、アルギ
ニン・ジハイドロラーゼを生産しないオキシダーゼ陰性
菌という事から、シ1−トモナス°シリンガニ(Pse
udomonas sy−ringae)またはシェー
ドモナス・ビリシフラバ(Pseudomonas v
iridiflava)に近縁と思わわ、るが、デンプ
ンの分解性や脱窒反応、黄色色素の生産等の点で異なっ
ており、従来知られていない新規な菌株と思われる。
ニン・ジハイドロラーゼの生産 陰性以上の新規なL−
FDH生産能を有する本菌の分類学的諸性質を、「パー
ジエイズ・マニーアル・オブ・システマチック・バクテ
リオロジー」(1984年)第1巻の分類と対比すると
、本菌は、ダラム染色性が陰性、好気性の無胞子桿菌で
種名を持つカタラーゼ陽性菌であることから、シェード
モナス属に属すると思われる。菌体内にポリハイドロキ
シブチレートを蓄積せず、蛍光性物質を生産し、アルギ
ニン・ジハイドロラーゼを生産しないオキシダーゼ陰性
菌という事から、シ1−トモナス°シリンガニ(Pse
udomonas sy−ringae)またはシェー
ドモナス・ビリシフラバ(Pseudomonas v
iridiflava)に近縁と思わわ、るが、デンプ
ンの分解性や脱窒反応、黄色色素の生産等の点で異なっ
ており、従来知られていない新規な菌株と思われる。
以上の理由により本菌をシュードモナス5p5No、
l 143と命名した。なおシ′ニー トモナスsp。
l 143と命名した。なおシ′ニー トモナスsp。
No、 1143は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第2056号(FERM B
P−2056)として寄託されている。
技術研究所に微工研条寄第2056号(FERM B
P−2056)として寄託されている。
次に本発明で使用する培地としては、炭素源。
窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地な
らば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能で
ある。
らば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能で
ある。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトー
ス、マルトース、グリセリン等を用いることかできる。
ス、マルトース、グリセリン等を用いることかできる。
窒素源としては、アンモニウム塩の他にペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素
性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム、カリウム マグネシウム マンガン、カルシウム
、鉄等の塩類が使用できる。
イン消化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素
性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム、カリウム マグネシウム マンガン、カルシウム
、鉄等の塩類が使用できる。
本発明においては、該L−FDH生産能を有する菌株を
L−フコースを含有する培地で培養したときにL−FD
Hが収率よく得られる。該培養培地の好適な例としては
、L−・フコース0.3%、ペプトン0.1%、イース
トエキス0.1%、リン酸−カリウム0.09%、リン
酸二カリウム0.11%。
L−フコースを含有する培地で培養したときにL−FD
Hが収率よく得られる。該培養培地の好適な例としては
、L−・フコース0.3%、ペプトン0.1%、イース
トエキス0.1%、リン酸−カリウム0.09%、リン
酸二カリウム0.11%。
i%マグネシウム0105%、硫酸第一鉄0.OO1%
(p H7,0)の培地例が挙げられる。そして該培地
で30°C924時間好気的に培養した場合は、L−7
コースを他の炭素源におきかえた場合の10〜100倍
の生産力価を得ることができる。
(p H7,0)の培地例が挙げられる。そして該培地
で30°C924時間好気的に培養した場合は、L−7
コースを他の炭素源におきかえた場合の10〜100倍
の生産力価を得ることができる。
培養温度は通常20〜35°Cの範囲で、好適には30
°C近辺で行なわれる。培養開始のpHは通常6〜8の
条件であり、好適には7付近である。
°C近辺で行なわれる。培養開始のpHは通常6〜8の
条件であり、好適には7付近である。
この様な条件下で、20〜40時間、振盪または深部撹
拌培養を行うと、該培養物にL−FDHが生成蓄積する
。
拌培養を行うと、該培養物にL−FDHが生成蓄積する
。
L−FDHは、通常菌体中に存存するので、培養物を遠
心分離、あるし・は濾過等の方法で、菌体だけを分離す
るのが好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素
を可溶化することによって溶液中へ放出させる。
心分離、あるし・は濾過等の方法で、菌体だけを分離す
るのが好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素
を可溶化することによって溶液中へ放出させる。
菌体の破壊方法は、ダイノミル フレンチプレス、超音
波等の物理的なものや、トリトンX −100、ラウリ
ル硫酸ソーダ、ED’TA等の化学的な方法、リゾチー
ム等の酵素的な方法を単独、または併用して用いること
ができる。このようにして得られた菌体破壊液から核酸
を常法によって除去し、濾過または遠心によって不溶物
を除き、L −F D Hを得る。更に該L −F D
Hは必要により酵素の単離精製の常法に従って、例え
ば、(1)硫安分画(2)フェニルセファロースによる
カラムクロマトグラフィー (3)D E A Eセフ
ァデックスによるカラムクロマトグラフィー (4)セ
ファデックスG−100によるゲル濾過等の方法、また
はその他の方法を必要に応じて組合わせて用いることに
より、精製されたL−FDHを得ることができる。
波等の物理的なものや、トリトンX −100、ラウリ
ル硫酸ソーダ、ED’TA等の化学的な方法、リゾチー
ム等の酵素的な方法を単独、または併用して用いること
ができる。このようにして得られた菌体破壊液から核酸
を常法によって除去し、濾過または遠心によって不溶物
を除き、L −F D Hを得る。更に該L −F D
Hは必要により酵素の単離精製の常法に従って、例え
ば、(1)硫安分画(2)フェニルセファロースによる
カラムクロマトグラフィー (3)D E A Eセフ
ァデックスによるカラムクロマトグラフィー (4)セ
ファデックスG−100によるゲル濾過等の方法、また
はその他の方法を必要に応じて組合わせて用いることに
より、精製されたL−FDHを得ることができる。
次に本発明によるL−フコースの定量法及び定量用キッ
トについて具体的に説明する。
トについて具体的に説明する。
本発明の測定原理は下記に示す通りである。
−FDH
L−フコース+NADP
+
L−フコノラクトン+NADPH+H
試料中のL−フコースにL−FDHを作用させ、生成さ
れたNADPHを公知の測定方法、たとえば紫外部34
0nmの吸光度を測定する方法等によって測定すること
ができる。
れたNADPHを公知の測定方法、たとえば紫外部34
0nmの吸光度を測定する方法等によって測定すること
ができる。
本発明に用いるL−FDHは、補酵素としてNADPを
利用するものであれば、いかなる起源のものでも使用で
きるが、たとえば、微生物、殊にシュードモナス属に属
する細菌から選ばれた菌を培養して得られるL−FDH
な用いることが好ましい。
利用するものであれば、いかなる起源のものでも使用で
きるが、たとえば、微生物、殊にシュードモナス属に属
する細菌から選ばれた菌を培養して得られるL−FDH
な用いることが好ましい。
シュードモナス属に属する上記酵素生産菌としては、た
とえば、シュードモナスsp、No、 1143(FE
RM BP−2056)等が挙げられる。
とえば、シュードモナスsp、No、 1143(FE
RM BP−2056)等が挙げられる。
試料中のし一7コースに上記L−FDHを作用させる場
合には、pH7〜10及び温度60°C以下、好ましく
はpH3〜10及び温度35〜50°Cの条件で、通常
は2〜20分間程度反応させる。pHの調整には、前記
pH範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害し
ない任意の緩衝液が用いられ、たとえば、リン酸カリウ
ム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ
緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液等が好適に使用できる。
合には、pH7〜10及び温度60°C以下、好ましく
はpH3〜10及び温度35〜50°Cの条件で、通常
は2〜20分間程度反応させる。pHの調整には、前記
pH範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害し
ない任意の緩衝液が用いられ、たとえば、リン酸カリウ
ム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ
緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液等が好適に使用できる。
L−FDHの作用により生成されるNADPHの定量は
、いかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いら
れている方法は、紫外部340nmにおける吸光度を測
定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転換して
定量する方法は、NADPHをフェナジンメトサルフェ
ートとニトロブルーテトラゾリウムとで反応させて、生
成したグイホルマザンを570nmにおける吸光度で測
定するものや、フェナジンメトサルフェートまたは、そ
れに類する作用をする電子伝達体または金属イオンと反
応させて生成した過酸化水素をパーオキシダーゼと各種
色原体と共に発色させて、それぞれの好適な波長での吸
光度を測定するものなどがある。過酸化水素に導かれた
ものは、ルミノールと共に発光させて検出することもで
きる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬と電子
伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量的に検
出することも可能である。
、いかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いら
れている方法は、紫外部340nmにおける吸光度を測
定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転換して
定量する方法は、NADPHをフェナジンメトサルフェ
ートとニトロブルーテトラゾリウムとで反応させて、生
成したグイホルマザンを570nmにおける吸光度で測
定するものや、フェナジンメトサルフェートまたは、そ
れに類する作用をする電子伝達体または金属イオンと反
応させて生成した過酸化水素をパーオキシダーゼと各種
色原体と共に発色させて、それぞれの好適な波長での吸
光度を測定するものなどがある。過酸化水素に導かれた
ものは、ルミノールと共に発光させて検出することもで
きる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬と電子
伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量的に検
出することも可能である。
これらの検出方法は、その特徴によって使いわければ良
い。
い。
またL−フコースの定量を実施する場合には、試料中の
L−フコースは遊離の状態にあることが必要であり、複
合糖質の一部として結合しているL−フコースを測定す
る場合には、α−L−フコシダーゼなどを作用させて遊
離状態にすることが必要である。この場合に使用するα
−L−フコシダーゼは、いかなる起源のものでも良いが
、複合糖質のα−L−フコシド結合を素早く切断できる
ことが必要である。この例としては、アスペルギルス属
由来のα−L−フコシダーゼ(J、 Biol。
L−フコースは遊離の状態にあることが必要であり、複
合糖質の一部として結合しているL−フコースを測定す
る場合には、α−L−フコシダーゼなどを作用させて遊
離状態にすることが必要である。この場合に使用するα
−L−フコシダーゼは、いかなる起源のものでも良いが
、複合糖質のα−L−フコシド結合を素早く切断できる
ことが必要である。この例としては、アスペルギルス属
由来のα−L−フコシダーゼ(J、 Biol。
Chem、、 Vol、245.299〜304. (
1970))や海産巻貝由来のa−L−フコシダーゼ(
J、 Biochem、 。
1970))や海産巻貝由来のa−L−フコシダーゼ(
J、 Biochem、 。
Vol、70.75〜78. (1971))や動物由
来(J、 Biol。
来(J、 Biol。
Chew、、 Vol、247.23〜32. (19
72))などがある。
72))などがある。
本発明のし一7コース定量用キットは、L−FDH,N
ADPと生成されるNADPHを定量するための酵素や
試薬類、及びこれらの反応を円滑に進めるための緩衝用
試薬からなっている。この試薬類、酵素類は、液剤、固
形剤もしくは凍結乾燥製剤とし、必要に応じて使用前に
緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
ADPと生成されるNADPHを定量するための酵素や
試薬類、及びこれらの反応を円滑に進めるための緩衝用
試薬からなっている。この試薬類、酵素類は、液剤、固
形剤もしくは凍結乾燥製剤とし、必要に応じて使用前に
緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
L−フコースの測定方法は、L−フコース含有試料に直
接作用させることによってNADPHを生成させる。そ
して、これをそのまま、あるいはNADPH定量用試薬
を加えることによってNADPHを測定する。これらの
測定方法は、1試薬系でも2試薬系でも良く、さらに何
試薬系で測定しても良い。
接作用させることによってNADPHを生成させる。そ
して、これをそのまま、あるいはNADPH定量用試薬
を加えることによってNADPHを測定する。これらの
測定方法は、1試薬系でも2試薬系でも良く、さらに何
試薬系で測定しても良い。
〈発明の効果〉
本発明の新規なL−FDHを用いると、L−フコースの
定量を精度良く行うことができ、肺ガン等の病態診断に
有益な情報を得ることができる。
定量を精度良く行うことができ、肺ガン等の病態診断に
有益な情報を得ることができる。
また、本発明によれば、操作が簡単でしかも共存するグ
ルコースやピルビン酸、乳酸、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼなどの影響を受けない正確性の高いL−フコース定
量が可能となり、複合糖質の研究分野において極めて有
意義である。
ルコースやピルビン酸、乳酸、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼなどの影響を受けない正確性の高いL−フコース定
量が可能となり、複合糖質の研究分野において極めて有
意義である。
次に本発明を実施例により説明する。
〈実施例〉
実施例1
シュードモナスsp、 No、1143 (F ERM
BP−2056)を1501!/の三角フラスコに入っ
た3 Q atの滅菌種培地(L−フコ−3013冗、
ペプトン0.1%、酵母エキス0.1%、リン酸−カリ
ウム0.09%、リン酸二カリウム0.11%、硫酸マ
グネシウム0.05%、硫酸第1鉄0、001%、pH
7,0)に植菌し、30°Cにて振盪培養した。これを
同じ組成をもった培地21が入ったジャーファーメンタ
−(株式会社いわしや生物科学部)に10ゴ接種した。
BP−2056)を1501!/の三角フラスコに入っ
た3 Q atの滅菌種培地(L−フコ−3013冗、
ペプトン0.1%、酵母エキス0.1%、リン酸−カリ
ウム0.09%、リン酸二カリウム0.11%、硫酸マ
グネシウム0.05%、硫酸第1鉄0、001%、pH
7,0)に植菌し、30°Cにて振盪培養した。これを
同じ組成をもった培地21が入ったジャーファーメンタ
−(株式会社いわしや生物科学部)に10ゴ接種した。
30’C,24時間9通気(2g/win)、撹拌(4
00rpm)培養した。この培養液を8,000rpm
で20分間遠心分離して菌体を集めた。L−FDHは菌
体部分に蓄積されていた。
00rpm)培養した。この培養液を8,000rpm
で20分間遠心分離して菌体を集めた。L−FDHは菌
体部分に蓄積されていた。
実施例2
実施例1のようにして培養した後集菌して、−20°C
に凍結保存してあった生菌体1.1 kgを、0.02
Mリン酸カリウム緩衝液(pH8,0)(以下これを標
準緩衝液という)5071に分散させて、リゾチーム(
長瀬産業製)25Iiを加え、24°Cに18時間放置
した。これに硫安1.32kg、トリトンX−100の
10%水溶液500 dを添加して、均一に撹拌した。
に凍結保存してあった生菌体1.1 kgを、0.02
Mリン酸カリウム緩衝液(pH8,0)(以下これを標
準緩衝液という)5071に分散させて、リゾチーム(
長瀬産業製)25Iiを加え、24°Cに18時間放置
した。これに硫安1.32kg、トリトンX−100の
10%水溶液500 dを添加して、均一に撹拌した。
これにエチレンイミンポリマー水溶液(10%、pH8
,0)80ゴを少しづつ添加して、生じた沈殿を濾過し
て除いた。
,0)80ゴを少しづつ添加して、生じた沈殿を濾過し
て除いた。
濾液を、ホローファイバー限外濾過装置(AIL−20
11、旭化成工業株式会社製)によって51まで濃縮し
た。冷却した後、硫安1.08 kgを加えて溶かし、
2時間放置して生じた沈殿を8.000rpm、 20
分間遠心分離して除いた。得られた上澄に更に硫安0.
74 kgを加えて再び2時間放置して生じた沈殿を8
.00 Orpm、 20分間遠心分離して集めた。こ
の沈殿を標準緩衝液11に溶かした。これに硫安14o
yを加えて溶かし、あらかじめ硫安14%を含有した標
準緩衝液ニ平衡化シタフェニルセファロースCL−4B
(スウェーデン、ファーマシ7社製)のカラム(直径1
3.3 cm 、高さ38個)に通して、酵素を吸着さ
せた。これをエチレングリコールの濃度勾配(0→30
%)と硫安の逆濃度勾配(14→0%)を持った標準緩
衝液501で溶出した。
11、旭化成工業株式会社製)によって51まで濃縮し
た。冷却した後、硫安1.08 kgを加えて溶かし、
2時間放置して生じた沈殿を8.000rpm、 20
分間遠心分離して除いた。得られた上澄に更に硫安0.
74 kgを加えて再び2時間放置して生じた沈殿を8
.00 Orpm、 20分間遠心分離して集めた。こ
の沈殿を標準緩衝液11に溶かした。これに硫安14o
yを加えて溶かし、あらかじめ硫安14%を含有した標
準緩衝液ニ平衡化シタフェニルセファロースCL−4B
(スウェーデン、ファーマシ7社製)のカラム(直径1
3.3 cm 、高さ38個)に通して、酵素を吸着さ
せた。これをエチレングリコールの濃度勾配(0→30
%)と硫安の逆濃度勾配(14→0%)を持った標準緩
衝液501で溶出した。
活性部分をホローファイバー限外濾過装置で500耐ま
で濃縮し、更に0. I Mの塩化カリウムを含有した
標準緩衝液3Eで透析濾過を行った。
で濃縮し、更に0. I Mの塩化カリウムを含有した
標準緩衝液3Eで透析濾過を行った。
これをあらかじめ0. I M塩化カリウムを含有した
標準緩衝液に平衡化させたDEAE−セファデックスA
−50のカラム(直径6α、高さ35cm)に通して酵
素を吸着させ、塩化カリウムの濃度勾配(0,1→0.
8 M )を持った標準緩衝液101で溶出した。活性
部を限外濾過装置(米国、アミコン社製)で15m/ま
で濃縮し、このうち2mlをあらかじめ0,1M塩化カ
リウム含有の標準緩衝液に平衡化したセファデックスG
−100カラム(直径2.5 cm 、高さ100cm
)にかけて、ゲル濾過を行った。活性部を集めて濃縮し
、た。すべての酵素をゲル濾過した結果、L−フコース
脱水素酵素34. OOO単位を得た。これは第5図に
示す通りほとんど単一バンドを示す酵素標品であった。
標準緩衝液に平衡化させたDEAE−セファデックスA
−50のカラム(直径6α、高さ35cm)に通して酵
素を吸着させ、塩化カリウムの濃度勾配(0,1→0.
8 M )を持った標準緩衝液101で溶出した。活性
部を限外濾過装置(米国、アミコン社製)で15m/ま
で濃縮し、このうち2mlをあらかじめ0,1M塩化カ
リウム含有の標準緩衝液に平衡化したセファデックスG
−100カラム(直径2.5 cm 、高さ100cm
)にかけて、ゲル濾過を行った。活性部を集めて濃縮し
、た。すべての酵素をゲル濾過した結果、L−フコース
脱水素酵素34. OOO単位を得た。これは第5図に
示す通りほとんど単一バンドを示す酵素標品であった。
実施例3
溶液中のし一7コースの濃度を下記試料を用いて下記方
法により定量した。
法により定量した。
1、試薬
0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(p H7,0)1、
57 rnl NADP (15mM) 0.065r
ttlL−FDH(44単位/ me ) 0.0
65 ml試料溶液 0.30
m12、定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、37°Cで5分
間反応させ、340nmで吸光度を測定した。同様にし
て試料溶液のかわりに水を同量加えて反応させた場合の
吸光度を差し引いて試料溶液の吸光度とした。
57 rnl NADP (15mM) 0.065r
ttlL−FDH(44単位/ me ) 0.0
65 ml試料溶液 0.30
m12、定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、37°Cで5分
間反応させ、340nmで吸光度を測定した。同様にし
て試料溶液のかわりに水を同量加えて反応させた場合の
吸光度を差し引いて試料溶液の吸光度とした。
別に、既知濃度のL−フコース溶液を同様にして得た検
量線から試料溶液中のL−フコースの濃度を求めた。第
6図にその検量線を示す。
量線から試料溶液中のL−フコースの濃度を求めた。第
6図にその検量線を示す。
実施例4
溶液中のL−7コースの濃度を下記の試薬を用いて下記
方法により定量した。
方法により定量した。
1、試薬
0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8,0)(0,1
% ト リ ト ンX−100含有)
150 μ lフェナジンメトサルフェート(1j1
g/ rRl )5μl ニトロブル−テトラゾリウム(10my/ at )5
μ1 NADP (15mM) 15pl
L−FDH(44単位/m/) 15μl試
料溶液 10μ12、定量方
法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37°Cで1
0分間反応させた。その後、0.3規定塩酸2、 Om
lを添加して良く撹拌した。
% ト リ ト ンX−100含有)
150 μ lフェナジンメトサルフェート(1j1
g/ rRl )5μl ニトロブル−テトラゾリウム(10my/ at )5
μ1 NADP (15mM) 15pl
L−FDH(44単位/m/) 15μl試
料溶液 10μ12、定量方
法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37°Cで1
0分間反応させた。その後、0.3規定塩酸2、 Om
lを添加して良く撹拌した。
生成した色素を570nmで吸光度を測定した。
試料溶液のかわりに水を同量添加して同様に反応処理し
たものの吸光度をブランクとして差し引いた。
たものの吸光度をブランクとして差し引いた。
別に既知濃度のし一7コース溶液を同様にして得た検量
線から試料溶液中のL−フコースの濃度を求めた。
線から試料溶液中のL−フコースの濃度を求めた。
実施例5
2′−フコシルラクトース中のL−フコースを下記の試
薬を用い、下記の方法により定量した。
薬を用い、下記の方法により定量した。
1、試薬
0.1Mリン酸カリウム緩衝液(p H7,0)215
μ1 NADP (15mM) 15pl
L−FDH(44単位/ me ) 60μl
α−L−フコシダーゼ(牛上皮由来) (12単位/屑/) 100μE2
、定量方法 上記試薬を所定量マイクロキエペットにとり、37°C
で5分間保った後、これに2゛−フコシルラクトース(
シグマ社製)の0.3 、0.6 、0.9および1.
2 mM溶液10μEをそれぞれ添加した。
μ1 NADP (15mM) 15pl
L−FDH(44単位/ me ) 60μl
α−L−フコシダーゼ(牛上皮由来) (12単位/屑/) 100μE2
、定量方法 上記試薬を所定量マイクロキエペットにとり、37°C
で5分間保った後、これに2゛−フコシルラクトース(
シグマ社製)の0.3 、0.6 、0.9および1.
2 mM溶液10μEをそれぞれ添加した。
37°Cで15分間反応させた後、これらを34OnI
11で吸光度を測定した。2°−フコシルラクトース溶
液のかわりに水を同量添加した場合の吸光度をブランク
として差し引いた結果、添加した2゜−フコシルラクト
ースと、340nmの吸光度の増加量には、良好な直線
関係が得られた。
11で吸光度を測定した。2°−フコシルラクトース溶
液のかわりに水を同量添加した場合の吸光度をブランク
として差し引いた結果、添加した2゜−フコシルラクト
ースと、340nmの吸光度の増加量には、良好な直線
関係が得られた。
第1図は、本酵素の至適pHを示すグラフであり、第2
図は、安定pHを示すグラフである。 第3図は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであり
、第4図は、本酵素の熱安定性を示すグラフである。 第5図は、電気泳動によるバンドを示す図であるO 第6図は、実施例3におけるし一7コースの検量線であ
る。 特許出願人 財団法人野田産業科学研究所Fl″′l ラム度 (00) 渇−足
図は、安定pHを示すグラフである。 第3図は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであり
、第4図は、本酵素の熱安定性を示すグラフである。 第5図は、電気泳動によるバンドを示す図であるO 第6図は、実施例3におけるし一7コースの検量線であ
る。 特許出願人 財団法人野田産業科学研究所Fl″′l ラム度 (00) 渇−足
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)L−フコースから水素を奪ってL−フコノラクトン
にすると共に補酵素NADPをNADPHに還元するL
−フコースデヒドロゲナーゼ 2)下記(1)〜(2)の理化学的性質を有するL−フ
コースデヒドロゲナーゼ (1)作用及び基質特異性 L−フコースから水素を奪ってL−フコノラクトンにす
ると共に補酵素NADPをNADPHに還元する。 (2)至適pH及び安定pH範囲 トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、至適pHは9.0〜10.0であり、安定pH範
囲は8.0〜10.5である。 3)シュードモナス属に属しNADPを補酵素とするL
−フコースデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養し、培養物より該L−フコースデヒドロゲナーゼ
を採取することを特徴とするL−フコースデヒドロゲナ
ーゼの製造法。 4)L−フコース含有試料にNADPを補酵素とするL
−フコースデヒドロゲナーゼを作用させ、生成するNA
DPHを測定することを特徴とするL−フコースの定量
方法。 5)L−フコース含有試料にα−L−フコシダーゼ及び
NADPを補酵素とするL−フコースデヒドロゲナーゼ
を順次若しくは同時に作用させ生成するNADPHを測
定することを特徴とするL−フコースの定量方法。 6)L−フコースデヒドロゲナーゼ、NADP及び緩衝
液を含むL−フコース定量用キット。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63234745A JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | L―フコースデヒドロゲナーゼ |
US07/407,148 US5260197A (en) | 1988-09-21 | 1989-09-14 | L-fucose dehydrogenase, a process for production thereof, quantitative assay for L-fucose using said enzyme and a kit for quantitative assay |
DE3931377A DE3931377C2 (de) | 1988-09-21 | 1989-09-20 | L-Fucose-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung, quantitative Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung des genannten Enzyms, sowie Kit für die quantitative Bestimmung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63234745A JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | L―フコースデヒドロゲナーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0284177A true JPH0284177A (ja) | 1990-03-26 |
JPH0667316B2 JPH0667316B2 (ja) | 1994-08-31 |
Family
ID=16975692
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63234745A Expired - Fee Related JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | L―フコースデヒドロゲナーゼ |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5260197A (ja) |
JP (1) | JPH0667316B2 (ja) |
DE (1) | DE3931377C2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001197900A (ja) * | 1999-11-10 | 2001-07-24 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | マンノースの定量法及び定量用試薬 |
US7221387B2 (en) | 1998-06-10 | 2007-05-22 | Dennis S. Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US7355621B1 (en) | 1998-06-10 | 2008-04-08 | Fernandez Dennis S | Digital television with subscriber conference overlay |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101744341B1 (ko) | 2010-06-15 | 2017-06-09 | 삼성전자주식회사 | 3,6-l-ahg 전환효소의 활성측정용 조성물, 이를 이용한 3,6-l-ahg 전환효소의 활성 측정방법 및 3,6-l-ahg의 정량분석용 조성물 |
CN114739936A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-07-12 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62175197A (ja) * | 1986-01-29 | 1987-07-31 | Takara Shuzo Co Ltd | L−フコ−スの定量方法 |
-
1988
- 1988-09-21 JP JP63234745A patent/JPH0667316B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-09-14 US US07/407,148 patent/US5260197A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-20 DE DE3931377A patent/DE3931377C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62175197A (ja) * | 1986-01-29 | 1987-07-31 | Takara Shuzo Co Ltd | L−フコ−スの定量方法 |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7221387B2 (en) | 1998-06-10 | 2007-05-22 | Dennis S. Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US7355621B1 (en) | 1998-06-10 | 2008-04-08 | Fernandez Dennis S | Digital television with subscriber conference overlay |
US7802275B1 (en) | 1998-06-10 | 2010-09-21 | Dennis S. Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US7880762B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-02-01 | Dennis Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US7900235B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-03-01 | Dennis S. Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US7917937B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-03-29 | Dennis S. Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US8032915B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-10-04 | Dennis Sunga Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
US8072480B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-12-06 | Fernandez Dennis S | Digital television with subscriber conference overlay |
JP2001197900A (ja) * | 1999-11-10 | 2001-07-24 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | マンノースの定量法及び定量用試薬 |
JP4526654B2 (ja) * | 1999-11-10 | 2010-08-18 | 積水メディカル株式会社 | マンノースの定量法及び定量用試薬 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0667316B2 (ja) | 1994-08-31 |
DE3931377A1 (de) | 1990-03-29 |
DE3931377C2 (de) | 1997-06-12 |
US5260197A (en) | 1993-11-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4882280A (en) | Uricase and a method for the preparation thereof | |
US4246342A (en) | Process for the manufacture of pyruvate oxidase, and analytical method and kit for the use of the same | |
JP2850515B2 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
JPS61268178A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
KR960015263B1 (ko) | 신규의 모노글리세라이드 리파제를 이용한 모노글리세라이드의 분석방법 | |
JPH0284178A (ja) | N−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるn−アセチルグルコサミン又はn−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット | |
JPH0284177A (ja) | L―フコースデヒドロゲナーゼ | |
JPS61162174A (ja) | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法 | |
JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
JP3216739B2 (ja) | ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 | |
CA1125205A (en) | PROCESS FOR PRODUCTION OF L-.alpha.-GLYCEROPHOSPHATE OXIDASE | |
US4965194A (en) | Pyruvate oxidase and an analytical method using the same | |
KR950012760B1 (ko) | 신규 nad 합성효소 및 그 제조법 및 이를 이용한 측정방법 | |
JP3114838B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼおよびその用途 | |
JP2684238B2 (ja) | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 | |
JP3642344B2 (ja) | クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
JP3781806B2 (ja) | 新規ピルビン酸オキシダーゼ及びその製造法 とピルビン酸分析法 | |
JP2827002B2 (ja) | アシルカルニチンの測定法 | |
JPS6368099A (ja) | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 | |
JPH0661278B2 (ja) | ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 | |
JPS5889183A (ja) | Nad(p)依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 | |
JPS5813159B2 (ja) | コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウ | |
JP2886846B2 (ja) | 1,5−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 | |
JPH0833482A (ja) | 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 | |
JPS63148999A (ja) | N−アセチルマンノサミンの定量方法及びその定量用キツト |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |