JPH0284177A

JPH0284177A - Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ

Info

Publication number: JPH0284177A
Application number: JP63234745A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Horiuchi; 掘内　達雄; Minoru Hiruma; 蛭間　稔; Toshiyuki Suzuki; 敏之鈴木
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1988-09-21
Publication date: 1990-03-26
Anticipated expiration: 2009-08-31
Also published as: US5260197A; JPH0667316B2; DE3931377A1; DE3931377C2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、Ｌ−７コースに作用してＬ−フコノラクトン
にすると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を還元型二フチン７ミド
・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に還
元する新規なＬ−フコースデヒドロゲナーゼ（以下Ｌ−
ＦＤＨという）とその製造法及びＬ−ＦＤＨを用いる′
Ｌ−７コースの酵素的定量方法及びその定量用キットに
関するものである。

〈従来の技術〉蛋白質や脂質に結合している複合糖質が、生体の情報伝
達の一部を担っていることが指摘されて以来、これらの
糖質に関する知見が急速に増加している。それらの中に
、肺ガンの病態に呼応して、そのＬ−フコースが増減す
るという報告（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、２
２．　Ｎｏ、９．１５１６〜１５２１゜（１９７６）］
がある。故にこの糖を測定することは、この種の患者の
病態に関して有用な情報を与えると思われる。

その測定法は、酵素を用いた方法が精度と簡便性の上に
おいて優れている。Ｌ−７コース定量用の酵素としては
、ブタ肝臓由来のＬ−ＦＤＨ（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　Ｖｏｌ、２４４．　４
７８５〜４７９２．　　（１９６９）］羊肝臓由来のＬ
　−Ｆ　Ｄ　Ｈ［Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏ−ｐｈｙｓ、、　Ｖｏｌ、１８６．１８４〜１８８．
　（１９７８）］　、ウサギ肝臓由来のＬ　−Ｆ　Ｄ　
Ｈ［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、８６゜１５５
９〜１５６５．　（１９７９））　、コリネバクテリウ
ム属細菌由来のＬ−ＦＤＨ（特開昭６２−１５５０８５
）　、プルラリアプルランス由来のＬ−ＦＤＨ（Ａｒｑ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｔｅｃｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、３０．３６１〜３６６、　
（１９８７））などが知られているが、いずれも補酵素
としてニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）を利用スるデヒドロゲナーゼである。

これらを利用してＬ−フコースを定量する試みも、また
いくつか提出されている。たとえば、特開昭６２−１７
５１９７やＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、
１２１゜１２９〜１３４．　（１９８２）やＡｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、１１２゜７６〜８１．
　（１９８１）およびＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、　
Ａｎａｌ。

（３ｒｄ　Ｅｄ、）、　Ｖｏｌ、６．３８７〜３９８等
である。

〈発明が解決しようとする問題点〉生体の一部、たとえば血清などを試料としてその成分を
酵素的に測定する場合、当然のことながら、生体に本来
含有されている対岸系の酵素や対岸物の影響ができるだ
け少ない様に測定系を組み立てることが望ましい。

この観点から見て、ＮＡＤＰを補酵素として利用するデ
ヒドロゲナーゼを測定に用いるのは、ＮＡＤを補酵素と
して利用するデヒドロゲナーゼを用いるのに比べて、優
れている。なぜならば、血清等には、ＮＡＤ　（または
ＮＡＤＨ）を利用する酵素（たとえば、ラクテート・デ
ヒドロゲナーゼなど）が比較的多く含まれており、また
、その対岸物（たとえば、ピルビン酸や、乳酸など）も
常に含有されており、ＮＡＤの定量系では、これらの影
響を受は易いからである。

本発明者等は、操作が簡単で、しかも精度の高いし一フ
フースの測定法について検討したところ、土壌から分離
したシュードモナス属に属する一細菌が、Ｌ−フコース
に作用して、Ｌ−フコノラクトンにすると共にＮＡＤＰ
をＮＡＤＰＨに還元する新規な酵素を生産し、この酵素
がＬ−フコースの測定に有効に利用できることを見出し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明はＬ−７コースに作用して、Ｌ−７コ
ノラクトンにすると共にＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元す
る新規な酵素Ｌ−ＦＤＨであり、また本発明は、シェー
ドモナス属に属し、ＮＡＤＰを補酵素として利用するＬ
−ＦＤＨ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
りＬ−ＦＤＨを採取することを特徴とするＬ−ＦＤＨの
製造法である。

そしてまた、本発明は、Ｌ−フコース含有試料にＮＡＤ
Ｐを補酵素とするＬ−ＦＤＨを作用させ、生成するＮＡ
ＤＰＨを測定するし一７コースの定量法であり、また、
Ｌ−フコース含有試料にＬ−７コシダーゼとＬ−ＦＤＨ
を順次に又は、同時に作用させ、生成するＮＡＤＰＨを
測定する結合形Ｌ−フコースの定量法であり、さらに少
なくとも、該Ｌ−ＦＤＨ，ＮＡＤＰ、及び緩衝液を含む
定量法キットである。

〈問題点を解決するための手段〉以下、本発明を具体的に説明する。

本発明における新規酵素Ｌ−ＦＤＨの理化学的性質は下
記の通りである。

（１）作用及び基質特異性次の反応式に示されるごとく、Ｌ−フコースとＮＡＤＰ
の共存下でＬ−フコースをＬ−フコノラクトンに酸化す
ると共にＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する。

Ｌ−フコース＋ＮＡＤＰ＋Ｌ−フコ／ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ本酵素は、Ｌ−フコース（１００％）に最も特異性が高
いが、Ｌ−ガラクトース（９６％）、Ｄ−７ラビノース
（１％）などにも作用する。しかし、他の通常存在する
糖類には、はとんど、または全く作用しない。

また、本酵素は、補酵素としてＮＡＤＰ（１００％）を
要求し、ＮＡＤ　（１％）に対しては、わずかしか作用
を示さない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、第１図に示すとおり、９．０〜１０．０である。

安定ｐＨ範囲は同じく第２図ｔこ示すごと＜、８．０〜
１０．５である。

（３）作用適温の範囲第３図に示すごとく、４０〜６０’Ｃである。

（４）ｐＨ１温度等による失活の条件第４図に示すごとく、１０分間の熱処理では、４０°Ｃ
まで安定であり、それ以上の温度では急速に失活する。

３０’Ｃ，６０分間の熱処理ではｐＨ８、Ｏ〜１０，５
で安定であり、ｐ　Ｈ６，０以下では特に不安定である
。

（５）阻害剤の影響及び安定化上表は、各種金属塩及び阻害剤を２ｍＭの濃度で含有す
る反応液中での酵素活性を測定したものである。

その他、ＣａＣｌ２．　Ｍｇ５Ｏｎ、　Ｎ１５Ｏ，Ｃｕ
ＳＯ４，ＥＤＴＡ。

Ｏ−フェナントロリン　α、α９−ジピリジル。

ＫＣＮ、　ＮａＮ３等の阻害及び活性化は観察されなか
った０（６）精製方法本酵素の単離精製は、常法に従って行うことができる。

たとえば、硫安沈殿、フェニルセファロースを用いたカ
ラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥセファデックスを用
いたカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ−１
００によるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組
合わせて使用する。

（７）分　子　量０、０５　Ｍリン酸カリウム緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１含有）ヲ用いてセファデックスＧ−１００カラムに
よるゲル濾過法により測定した値は、約３２．　ＯＯＯ
〜３６．　ＯＯＯである。

（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動１５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、常法によって電気泳動を行っ
た結果、第５図に示すごとく、はぼ単一のバンドが認め
られた。ブロムフェノールブルーを指標とした時の相対
泳動距離は、７．５％ゲルの場合が０．７９．１０％ゲ
ルの場合が０．５７．１５％ゲルの場合が０．３７であ
った。

（９）等　電　点アクリルアミド焦点電気泳動法によって測定した値は、
５．２である。

（１０）活性の測定法トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液（各々０
．１２Ｍ含有液を４ＮＮａＯＨでｐ　Ｈ９，５ｍ調製す
る）２．５ｍｇに１５ｍＭＮＡＤＰ溶液０．２　Ｍ！／
を加える。３７°Ｃに５分間保った後に酵素液０．１ゴ
を加え、更に１５０ｍＭＬ−フコース溶液０．２いｔを
加えて混合し、反応を始める。直ちに３７°Ｃに保った
吸光度測定用セル（１ｃｍ光路）に移し、３４０　ｎｍ
の波長で２分または必要であれば、それ以上の時間にわ
たって吸光度を測定する。１単位は、１分間に１μモル
のＮＡＤＰＨを生成させる酵素量である。

以上のように本酵素は、その補酵素にＮＡＤＰを用いる
という点で従来知られていなかった新規なＬ−ＦＤＨで
ある。

次に、本発明による新規な酵素Ｌ−ＦＤＨの製造法につ
いて説明する。

使用される微生物は、シュードモナス属に属し、該Ｌ−
ＦＤＨ生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、シュードモナスｓｐ、　　Ｎｏ。

１１４３が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株モ用い
られる。シュードモナスｓｐ、　Ｎｏ、１１４３は、本
発明者等が土壌中より分離した菌株であり、その菌学的
性質は下記の通りである。

（ａ）形　　態顕微鏡的観察（２４°Ｃ１肉汁寒天培地、１６時間培養
） ■細胞の大きさ二０．４〜０．５×０．７〜１．０μｍ
の桿菌 ■細胞の多形性：均一な桿菌であり、末端で相互に連な
った短い連鎖状態も見られる。

■運　動　性：運動性あり（極毛）。２個連鎖したもの
は、回転する。

■胞子の有無：形成しない。

■ダラム染色性：陰性 ■抗　酸　性：陰性（ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養：３０°Ｃ２日間の培養で直径１朋
で円状、淡黄色油質様光沢を持つコロニとなる。周縁は
やや波状であるが、更に時間がたつと、金縁となる。

■肉汁寒天斜面培養：生育は普通で淡黄色油質様光沢の
ある菌で表面は円滑である。培地の着色は見られない。

■肉汁液体培養＝３０°Ｃ振盪培養では１日で良く生育
し、５日程で溶菌な始め、７日では完全に溶けて透明に
なった。３０°Ｃ静置培養では、表面にわずかの菌環と
、少しの白い沈殿を作り、全体かわずかに混濁した。

■肉汁寒天穿刺培養＝　（３０°Ｃ７日培養）側条にそ
ってわずかに生育し、糸状になる。

■リドマスミルク：底部分がわずかに還元して脱色し、
わずかに酸性化する。

■ＢＣＰ　ミルク：わずかに酸性化する。

■ゼラチン穿刺培養：２４°Ｃ’７日間の培養によって
、表面が少し液化した。

（ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元：陽性 ■脱窒反応：嫌気的生育は見られるが、ガスの生成はな
し。

■ＭＲテスト：陰性 ■ＶＰテスト：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■硫化水素の生成：陽性（酢酸鉛試験紙法）■デンプン
の分解：陽性 ■クエン酸の利用：陰性 ■無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが、硝
酸塩は利用しない。

■色素の生成：黄色の非拡散性色素を生成する。

０ウレアーゼ：陰性 ■オキシダーゼ：陰性 ■カタラーゼ：陽性 ■生育の範囲：温度１６〜３８°Ｃ（至適２７°Ｃ付近）ｐ　Ｈ５，０〜９．８（至適ｐＨ７付近） ■酸素に対する態度：好気的＠Ｏ−Ｆテスト：変化なし ■糖類から酸及びガスの生成酸の生成　ガスの生成１）Ｌ−７ラビノース　　　＋（２）　Ｄ−キシロース　　　　＋［３］Ｄ−グルコース　　　　＋１１ｍＤ−マンノース　　　　＋１１１Ｄ−７ラクトース　　　＋（５）　Ｄ−ガラクトース ■　マルトース　　　　　　＋（３）　シュクロース　　　　　十ｍ　ラクトース　　　　　　十口　トレハロース　　　　　＋［０］Ｄ−ソルビット［］］Ｄ−マンニット　　　＋ロ　イノジット旧　グリセリン　　　　　＋口　デンプン　　　　　　　＋（ｄ）その他の性質 ■菌体内ポリハイドロキシブチレートｆ）Ｂ積陰性 ■蛍光性物質の生産　　　　　　　　　　陽性■アルギ
ニン・ジハイドロラーゼの生産　陰性以上の新規なＬ−
ＦＤＨ生産能を有する本菌の分類学的諸性質を、「パー
ジエイズ・マニーアル・オブ・システマチック・バクテ
リオロジー」（１９８４年）第１巻の分類と対比すると
、本菌は、ダラム染色性が陰性、好気性の無胞子桿菌で
種名を持つカタラーゼ陽性菌であることから、シェード
モナス属に属すると思われる。菌体内にポリハイドロキ
シブチレートを蓄積せず、蛍光性物質を生産し、アルギ
ニン・ジハイドロラーゼを生産しないオキシダーゼ陰性
菌という事から、シ１−トモナス°シリンガニ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙ−ｒｉｎｇａｅ）またはシェー
ドモナス・ビリシフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖ
ｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）に近縁と思わわ、るが、デンプ
ンの分解性や脱窒反応、黄色色素の生産等の点で異なっ
ており、従来知られていない新規な菌株と思われる。

以上の理由により本菌をシュードモナス５ｐ５Ｎｏ、　
ｌ　１４３と命名した。なおシ′ニー　トモナスｓｐ。

Ｎｏ、　１１４３は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２０５６号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２０５６）として寄託されている。

次に本発明で使用する培地としては、炭素源。

窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地な
らば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能で
ある。

炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトー
ス、マルトース、グリセリン等を用いることかできる。

窒素源としては、アンモニウム塩の他にペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素
性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム、カリウム　マグネシウム　マンガン、カルシウム
、鉄等の塩類が使用できる。

本発明においては、該Ｌ−ＦＤＨ生産能を有する菌株を
Ｌ−フコースを含有する培地で培養したときにＬ−ＦＤ
Ｈが収率よく得られる。該培養培地の好適な例としては
、Ｌ−・フコース０．３％、ペプトン０．１％、イース
トエキス０．１％、リン酸−カリウム０．０９％、リン
酸二カリウム０．１１％。

ｉ％マグネシウム０１０５％、硫酸第一鉄０．ＯＯ１％
（ｐ　Ｈ７，０）の培地例が挙げられる。そして該培地
で３０°Ｃ９２４時間好気的に培養した場合は、Ｌ−７
コースを他の炭素源におきかえた場合の１０〜１００倍
の生産力価を得ることができる。

培養温度は通常２０〜３５°Ｃの範囲で、好適には３０
°Ｃ近辺で行なわれる。培養開始のｐＨは通常６〜８の
条件であり、好適には７付近である。

この様な条件下で、２０〜４０時間、振盪または深部撹
拌培養を行うと、該培養物にＬ−ＦＤＨが生成蓄積する
。

Ｌ−ＦＤＨは、通常菌体中に存存するので、培養物を遠
心分離、あるし・は濾過等の方法で、菌体だけを分離す
るのが好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素
を可溶化することによって溶液中へ放出させる。

菌体の破壊方法は、ダイノミル　フレンチプレス、超音
波等の物理的なものや、トリトンＸ　−１００、ラウリ
ル硫酸ソーダ、ＥＤ’ＴＡ等の化学的な方法、リゾチー
ム等の酵素的な方法を単独、または併用して用いること
ができる。このようにして得られた菌体破壊液から核酸
を常法によって除去し、濾過または遠心によって不溶物
を除き、Ｌ　−Ｆ　Ｄ　Ｈを得る。更に該Ｌ　−Ｆ　Ｄ
　Ｈは必要により酵素の単離精製の常法に従って、例え
ば、（１）硫安分画（２）フェニルセファロースによる
カラムクロマトグラフィー　（３）Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅセフ
ァデックスによるカラムクロマトグラフィー　（４）セ
ファデックスＧ−１００によるゲル濾過等の方法、また
はその他の方法を必要に応じて組合わせて用いることに
より、精製されたＬ−ＦＤＨを得ることができる。

次に本発明によるＬ−フコースの定量法及び定量用キッ
トについて具体的に説明する。

本発明の測定原理は下記に示す通りである。

−ＦＤＨＬ−フコース＋ＮＡＤＰ＋Ｌ−フコノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ試料中のＬ−フコースにＬ−ＦＤＨを作用させ、生成さ
れたＮＡＤＰＨを公知の測定方法、たとえば紫外部３４
０ｎｍの吸光度を測定する方法等によって測定すること
ができる。

本発明に用いるＬ−ＦＤＨは、補酵素としてＮＡＤＰを
利用するものであれば、いかなる起源のものでも使用で
きるが、たとえば、微生物、殊にシュードモナス属に属
する細菌から選ばれた菌を培養して得られるＬ−ＦＤＨ
な用いることが好ましい。

シュードモナス属に属する上記酵素生産菌としては、た
とえば、シュードモナスｓｐ、Ｎｏ、　１１４３（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−２０５６）等が挙げられる。

試料中のし一７コースに上記Ｌ−ＦＤＨを作用させる場
合には、ｐＨ７〜１０及び温度６０°Ｃ以下、好ましく
はｐＨ３〜１０及び温度３５〜５０°Ｃの条件で、通常
は２〜２０分間程度反応させる。ｐＨの調整には、前記
ｐＨ範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害し
ない任意の緩衝液が用いられ、たとえば、リン酸カリウ
ム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ
緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液等が好適に使用できる。

Ｌ−ＦＤＨの作用により生成されるＮＡＤＰＨの定量は
、いかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いら
れている方法は、紫外部３４０ｎｍにおける吸光度を測
定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転換して
定量する方法は、ＮＡＤＰＨをフェナジンメトサルフェ
ートとニトロブルーテトラゾリウムとで反応させて、生
成したグイホルマザンを５７０ｎｍにおける吸光度で測
定するものや、フェナジンメトサルフェートまたは、そ
れに類する作用をする電子伝達体または金属イオンと反
応させて生成した過酸化水素をパーオキシダーゼと各種
色原体と共に発色させて、それぞれの好適な波長での吸
光度を測定するものなどがある。過酸化水素に導かれた
ものは、ルミノールと共に発光させて検出することもで
きる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬と電子
伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量的に検
出することも可能である。

これらの検出方法は、その特徴によって使いわければ良
い。

またＬ−フコースの定量を実施する場合には、試料中の
Ｌ−フコースは遊離の状態にあることが必要であり、複
合糖質の一部として結合しているＬ−フコースを測定す
る場合には、α−Ｌ−フコシダーゼなどを作用させて遊
離状態にすることが必要である。この場合に使用するα
−Ｌ−フコシダーゼは、いかなる起源のものでも良いが
、複合糖質のα−Ｌ−フコシド結合を素早く切断できる
ことが必要である。この例としては、アスペルギルス属
由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、２４５．２９９〜３０４．　（
１９７０））や海産巻貝由来のａ−Ｌ−フコシダーゼ（
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

Ｖｏｌ、７０．７５〜７８．　（１９７１））や動物由
来（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、２４７．２３〜３２．　（１９
７２））などがある。

本発明のし一７コース定量用キットは、Ｌ−ＦＤＨ，Ｎ
ＡＤＰと生成されるＮＡＤＰＨを定量するための酵素や
試薬類、及びこれらの反応を円滑に進めるための緩衝用
試薬からなっている。この試薬類、酵素類は、液剤、固
形剤もしくは凍結乾燥製剤とし、必要に応じて使用前に
緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。

Ｌ−フコースの測定方法は、Ｌ−フコース含有試料に直
接作用させることによってＮＡＤＰＨを生成させる。そ
して、これをそのまま、あるいはＮＡＤＰＨ定量用試薬
を加えることによってＮＡＤＰＨを測定する。これらの
測定方法は、１試薬系でも２試薬系でも良く、さらに何
試薬系で測定しても良い。

〈発明の効果〉本発明の新規なＬ−ＦＤＨを用いると、Ｌ−フコースの
定量を精度良く行うことができ、肺ガン等の病態診断に
有益な情報を得ることができる。

また、本発明によれば、操作が簡単でしかも共存するグ
ルコースやピルビン酸、乳酸、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼなどの影響を受けない正確性の高いＬ−フコース定
量が可能となり、複合糖質の研究分野において極めて有
意義である。

次に本発明を実施例により説明する。

〈実施例〉実施例１シュードモナスｓｐ、　Ｎｏ、１１４３　（Ｆ　ＥＲＭ
ＢＰ−２０５６）を１５０１！／の三角フラスコに入っ
た３　Ｑ　ａｔの滅菌種培地（Ｌ−フコ−３０１３冗、
ペプトン０．１％、酵母エキス０．１％、リン酸−カリ
ウム０．０９％、リン酸二カリウム０．１１％、硫酸マ
グネシウム０．０５％、硫酸第１鉄０、００１％、ｐＨ
７，０）に植菌し、３０°Ｃにて振盪培養した。これを
同じ組成をもった培地２１が入ったジャーファーメンタ
−（株式会社いわしや生物科学部）に１０ゴ接種した。

３０’Ｃ，２４時間９通気（２ｇ／ｗｉｎ）、撹拌（４
００ｒｐｍ）培養した。この培養液を８，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離して菌体を集めた。Ｌ−ＦＤＨは菌
体部分に蓄積されていた。

実施例２実施例１のようにして培養した後集菌して、−２０°Ｃ
に凍結保存してあった生菌体１．１　ｋｇを、０．０２
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）（以下これを標
準緩衝液という）５０７１に分散させて、リゾチーム（
長瀬産業製）２５Ｉｉを加え、２４°Ｃに１８時間放置
した。これに硫安１．３２ｋｇ、トリトンＸ−１００の
１０％水溶液５００　ｄを添加して、均一に撹拌した。

これにエチレンイミンポリマー水溶液（１０％、ｐＨ８
，０）８０ゴを少しづつ添加して、生じた沈殿を濾過し
て除いた。

濾液を、ホローファイバー限外濾過装置（ＡＩＬ−２０
１１、旭化成工業株式会社製）によって５１まで濃縮し
た。冷却した後、硫安１．０８　ｋｇを加えて溶かし、
２時間放置して生じた沈殿を８．０００ｒｐｍ、　２０
分間遠心分離して除いた。得られた上澄に更に硫安０．
７４　ｋｇを加えて再び２時間放置して生じた沈殿を８
．００　Ｏｒｐｍ、　２０分間遠心分離して集めた。こ
の沈殿を標準緩衝液１１に溶かした。これに硫安１４ｏ
ｙを加えて溶かし、あらかじめ硫安１４％を含有した標
準緩衝液ニ平衡化シタフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ
（スウェーデン、ファーマシ７社製）のカラム（直径１
３．３　ｃｍ　、高さ３８個）に通して、酵素を吸着さ
せた。これをエチレングリコールの濃度勾配（０→３０
％）と硫安の逆濃度勾配（１４→０％）を持った標準緩
衝液５０１で溶出した。

活性部分をホローファイバー限外濾過装置で５００耐ま
で濃縮し、更に０．　Ｉ　Ｍの塩化カリウムを含有した
標準緩衝液３Ｅで透析濾過を行った。

これをあらかじめ０．　Ｉ　Ｍ塩化カリウムを含有した
標準緩衝液に平衡化させたＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０のカラム（直径６α、高さ３５ｃｍ）に通して酵
素を吸着させ、塩化カリウムの濃度勾配（０，１→０．
８　Ｍ　）を持った標準緩衝液１０１で溶出した。活性
部を限外濾過装置（米国、アミコン社製）で１５ｍ／ま
で濃縮し、このうち２ｍｌをあらかじめ０，１Ｍ塩化カ
リウム含有の標準緩衝液に平衡化したセファデックスＧ
−１００カラム（直径２．５　ｃｍ　、高さ１００ｃｍ
）にかけて、ゲル濾過を行った。活性部を集めて濃縮し
、た。すべての酵素をゲル濾過した結果、Ｌ−フコース
脱水素酵素３４．　ＯＯＯ単位を得た。これは第５図に
示す通りほとんど単一バンドを示す酵素標品であった。

実施例３溶液中のし一７コースの濃度を下記試料を用いて下記方
法により定量した。

１、試薬０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）１、
５７　ｒｎｌＮＡＤＰ　（１５ｍＭ）　　　　　　　　０．０６５ｒ
ｔｔｌＬ−ＦＤＨ（４４単位／　ｍｅ　）　　　０．０
６５　ｍｌ試料溶液　　　　　　　　　　　　０．３０
　ｍ１２、定量方法各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、３７°Ｃで５分
間反応させ、３４０ｎｍで吸光度を測定した。同様にし
て試料溶液のかわりに水を同量加えて反応させた場合の
吸光度を差し引いて試料溶液の吸光度とした。

別に、既知濃度のＬ−フコース溶液を同様にして得た検
量線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。第
６図にその検量線を示す。

実施例４溶液中のＬ−７コースの濃度を下記の試薬を用いて下記
方法により定量した。

１、試薬０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）（０，１
％　ト　リ　ト　ンＸ−１００含有）　　　　　　　　
　１５０　μ　ｌフェナジンメトサルフェート（１ｊ１
ｇ／　ｒＲｌ　）５μｌニトロブル−テトラゾリウム（１０ｍｙ／　ａｔ　）５
μ１ＮＡＤＰ　（１５ｍＭ）　　　　　　　　　　１５ｐｌ
Ｌ−ＦＤＨ（４４単位／ｍ／）　　　　　　１５μｌ試
料溶液　　　　　　　　　　　　　１０μ１２、定量方
法上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、３７°Ｃで１
０分間反応させた。その後、０．３規定塩酸２、　Ｏｍ
ｌを添加して良く撹拌した。

生成した色素を５７０ｎｍで吸光度を測定した。

試料溶液のかわりに水を同量添加して同様に反応処理し
たものの吸光度をブランクとして差し引いた。

別に既知濃度のし一７コース溶液を同様にして得た検量
線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。

実施例５２′−フコシルラクトース中のＬ−フコースを下記の試
薬を用い、下記の方法により定量した。

１、試薬０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）２１５
μ１ＮＡＤＰ　（１５ｍＭ）　　　　　　　　　　１５ｐｌ
Ｌ−ＦＤＨ（４４単位／　ｍｅ　）　　　　　６０μｌ
α−Ｌ−フコシダーゼ（牛上皮由来）（１２単位／屑／）　　　　　　　　　　１００μＥ２
、定量方法上記試薬を所定量マイクロキエペットにとり、３７°Ｃ
で５分間保った後、これに２゛−フコシルラクトース（
シグマ社製）の０．３　、０．６　、０．９および１．
２　ｍＭ溶液１０μＥをそれぞれ添加した。

３７°Ｃで１５分間反応させた後、これらを３４ＯｎＩ
１１で吸光度を測定した。２°−フコシルラクトース溶
液のかわりに水を同量添加した場合の吸光度をブランク
として差し引いた結果、添加した２゜−フコシルラクト
ースと、３４０ｎｍの吸光度の増加量には、良好な直線
関係が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２
図は、安定ｐＨを示すグラフである。第３図は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであり
、第４図は、本酵素の熱安定性を示すグラフである。第５図は、電気泳動によるバンドを示す図であるＯ第６図は、実施例３におけるし一７コースの検量線であ
る。特許出願人　財団法人野田産業科学研究所Ｆｌ″′ｌラム度　（００）渇−足

Claims

【特許請求の範囲】１）Ｌ−フコースから水素を奪ってＬ−フコノラクトン
にすると共に補酵素ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元するＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ２）下記（１）〜（２）の理化学的性質を有するＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼ（１）作用及び基質特異性Ｌ−フコースから水素を奪ってＬ−フコノラクトンにす
ると共に補酵素ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する。（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、至適ｐＨは９．０〜１０．０であり、安定ｐＨ範
囲は８．０〜１０．５である。３）シュードモナス属に属しＮＡＤＰを補酵素とするＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養し、培養物より該Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
を採取することを特徴とするＬ−フコースデヒドロゲナ
ーゼの製造法。４）Ｌ−フコース含有試料にＮＡＤＰを補酵素とするＬ
−フコースデヒドロゲナーゼを作用させ、生成するＮＡ
ＤＰＨを測定することを特徴とするＬ−フコースの定量
方法。５）Ｌ−フコース含有試料にα−Ｌ−フコシダーゼ及び
ＮＡＤＰを補酵素とするＬ−フコースデヒドロゲナーゼ
を順次若しくは同時に作用させ生成するＮＡＤＰＨを測
定することを特徴とするＬ−フコースの定量方法。６）Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ及び緩衝
液を含むＬ−フコース定量用キット。