JPS5813159B2 - コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウ - Google Patents
コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウInfo
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- JPS5813159B2 JPS5813159B2 JP50082420A JP8242075A JPS5813159B2 JP S5813159 B2 JPS5813159 B2 JP S5813159B2 JP 50082420 A JP50082420 A JP 50082420A JP 8242075 A JP8242075 A JP 8242075A JP S5813159 B2 JPS5813159 B2 JP S5813159B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体試料例えば血清の如き体液中にエステル型
コレステロールを含有する場合のコレステロールの酵素
的定量法に関するものである。
コレステロールを含有する場合のコレステロールの酵素
的定量法に関するものである。
コレステロールは体液、特に血清中では遊離もしくは脂
肪酸エステルの形で存在しており、血清中の総コレステ
ロールおよびエステル型コレステロールの定量は臨床診
断学的に重要な意味を持っており、例えば、高血圧症、
動脈硬化症などの診断の目的で、近年その測定頻度が増
加してきている。
肪酸エステルの形で存在しており、血清中の総コレステ
ロールおよびエステル型コレステロールの定量は臨床診
断学的に重要な意味を持っており、例えば、高血圧症、
動脈硬化症などの診断の目的で、近年その測定頻度が増
加してきている。
最近、遊離型のコレステロールの定量法として、コレス
テロール・オキシターゼを用いた酵素法による特異的な
直接定量法が開発されているが、このコレステロール・
オキシターゼはエステル型コレステロールには作用する
ことができないので、エステル型コレステロールを測定
する場合には、まず、エステル結合を分解することによ
って、コレステロール・オキシターゼが作用できる遊離
型にする必要がある。
テロール・オキシターゼを用いた酵素法による特異的な
直接定量法が開発されているが、このコレステロール・
オキシターゼはエステル型コレステロールには作用する
ことができないので、エステル型コレステロールを測定
する場合には、まず、エステル結合を分解することによ
って、コレステロール・オキシターゼが作用できる遊離
型にする必要がある。
このためには、例えばアルコール性水酸化カリウムとの
反応によってケン化するか、または、コレステロール・
エステラーゼによってエステルを加水分解しなければな
らない。
反応によってケン化するか、または、コレステロール・
エステラーゼによってエステルを加水分解しなければな
らない。
酵素法によるコレステロールの直接定量法、特に血清甲
の総コレステロール（遊離型コレステロール＋エステル
型コレステロール）の定量法の提供は従来の例えばリー
ベルマン・ブルヒアルトの反応を応用した複雑かつ困難
な定量法に代わって特異的で、かつ容易な定量に恩恵を
与えるものであり、これはまた、直ちに自動分析への応
用を可能ならしめるものである。
の総コレステロール（遊離型コレステロール＋エステル
型コレステロール）の定量法の提供は従来の例えばリー
ベルマン・ブルヒアルトの反応を応用した複雑かつ困難
な定量法に代わって特異的で、かつ容易な定量に恩恵を
与えるものであり、これはまた、直ちに自動分析への応
用を可能ならしめるものである。
なかでも、コレステロール・エステラーゼの提供は血清
中の総コレステロールの定量における化学的ケン化の操
作を簡略化し、自動分析における直接かつ迅速なる定量
に最犬の恩恵を与えることができる。
中の総コレステロールの定量における化学的ケン化の操
作を簡略化し、自動分析における直接かつ迅速なる定量
に最犬の恩恵を与えることができる。
コレステロール・エステラーゼは脂肪酸とエステル結合
したコレステロールを加水分解して脂肪酸と遊離型コレ
ステロールを生成する酵素であり、自然界、特に高等動
物の臓器に広く存在しているといわれている。
したコレステロールを加水分解して脂肪酸と遊離型コレ
ステロールを生成する酵素であり、自然界、特に高等動
物の臓器に広く存在しているといわれている。
この酵素を調製するには、主として動物の肝臓またはす
い臓を給源として現在は調製されている。
い臓を給源として現在は調製されている。
しかしながら、動物臓器を給源とする場合は、その給源
の確保、また精製などに難点があり、安価で常時大量生
産をめざす場合には、いきおい他の給源を求めなければ
ならない。
の確保、また精製などに難点があり、安価で常時大量生
産をめざす場合には、いきおい他の給源を求めなければ
ならない。
本発明者らは酵素法によるコレステロールの定量に使用
されるコレステロール・エステラーゼの工業生産を目■
として、その給源を微生物に求め、広く自然界よりコレ
ステロール・エステラーゼの生産菌を検索中、静岡市近
郊の排水溝の汚水中から純粋分離された、シュードモナ
ス属に属する細菌と固定された一菌株が強力なコレステ
ロール・エステラーゼ生産能を有することを認め、本菌
を液体培養し、その培養物から、抽出、精製することに
より、効率よく、高純度かつ極めて安定なコレステロー
ル・エステラーゼを製造する方法を確立し、その製造方
法に関しては特願昭５０−８２４１９号（特開昭５２−
７４８３号）に詳述されている。
されるコレステロール・エステラーゼの工業生産を目■
として、その給源を微生物に求め、広く自然界よりコレ
ステロール・エステラーゼの生産菌を検索中、静岡市近
郊の排水溝の汚水中から純粋分離された、シュードモナ
ス属に属する細菌と固定された一菌株が強力なコレステ
ロール・エステラーゼ生産能を有することを認め、本菌
を液体培養し、その培養物から、抽出、精製することに
より、効率よく、高純度かつ極めて安定なコレステロー
ル・エステラーゼを製造する方法を確立し、その製造方
法に関しては特願昭５０−８２４１９号（特開昭５２−
７４８３号）に詳述されている。
次に本発明に使用されるコレステロール・エステラーゼ
生産菌株の菌学的性質を記述する。
生産菌株の菌学的性質を記述する。
ａ）形態
（１）桿菌（対数増殖期は０．７〜０．８×２．０〜２
．８ミクロン、培養経過によりだんだん小さくなる）。
．８ミクロン、培養経過によりだんだん小さくなる）。
（２）単独または２連鎖。
（３）連動性あり、極鞭毛を有する。
（４）胞子なし。
（５）グラム染色：陰性。
（６）抗酸性：陰性。
ｂ）生育状態
（１）肉汁寒天平板培養：円形。
全縁。凸円状。表面はなめらかで黄褐色である。
（２）肉汁寒天斜面培養：糸状。
周縁はなめらかでやや光沢がある。
生育は普通。（３）肉汁液体培養：生育は普通。
界面に膜を形成する。
底には沈澱を生じる。（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生
育は普通。
育は普通。
液化は濾斗状である。
（５）リトマス・ミルク：ややアルカリ性。
液化するが、わずかに沈澱を形成する。
ｃ）生理的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性。
（２）脱窒反応：陽性。
（３）ＭＲテスト：陽性。
（４）ＶＰテスト：陰性。
（５）クンドールの生成：陰性。
（６）硫化水素の生成：陽性。
（７）デンプンの加水分解：陰性。
（８）クエン酸の利用：陽性。
（９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩とと
もに陽性。
もに陽性。
（１０）色素の生成（クリーグラーの培地）：緑黄色の
螢光性色素生産。
螢光性色素生産。
（１１）ウレアーゼ：陽性。
（１２）オキシダーゼ：陽性。
（１３）カタラーゼ：陽性。
（１４）生育ｐＨ：５〜９
（１５）生育温度：１０℃ ２０℃ ３０℃（＋）
（＋＋）（＋＋＋＋） ３７℃ ４２℃ ４７℃ （＋＋＋＋） （＋＋＋） （−） （１６）酸素に対する態度：好気性。
（＋＋）（＋＋＋＋） ３７℃ ４２℃ ４７℃ （＋＋＋＋） （＋＋＋） （−） （１６）酸素に対する態度：好気性。
（１７）Ｏ−Ｆテスト：酸化的。
（１８）糖類からのガスの生成：陰性。
（１９）糖類からの酸の生成：（＋）は陽性、（−）は
陰性。
陰性。
Ｌ−アラビノース（＋）Ｄ−キシロース（＋）Ｄ−グル
コース （＋）Ｄ−マンノース（＋）Ｄ−フラクトース
（＋）マルトース （＋）シュークロース （＋）ラ
クトース （＋）トレハロース （＋） Ｄ−ソル
ビトール（−）Ｄ−マンニトール（−） イノシトール
（−）グリセリン （−）スターチ （−）
Ｄ−ガラクトース（＋） 以上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（１９７４年
）より検索すると、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）または
シュードモナス・フルオレツセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に類似しているが、
生育温度、脱窒反応、炭素源の利用性などについて比較
すると、いずれの菌にも一致しないので、ここに新種シ
ュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０９（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．ｓｐ．Ｎｏ．１０９）と命名
した。
コース （＋）Ｄ−マンノース（＋）Ｄ−フラクトース
（＋）マルトース （＋）シュークロース （＋）ラ
クトース （＋）トレハロース （＋） Ｄ−ソル
ビトール（−）Ｄ−マンニトール（−） イノシトール
（−）グリセリン （−）スターチ （−）
Ｄ−ガラクトース（＋） 以上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（１９７４年
）より検索すると、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）または
シュードモナス・フルオレツセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に類似しているが、
生育温度、脱窒反応、炭素源の利用性などについて比較
すると、いずれの菌にも一致しないので、ここに新種シ
ュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０９（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．ｓｐ．Ｎｏ．１０９）と命名
した。
次にその比較を一覧表として示す。なお、本菌株は工業
技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌
寄第３０２５号（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．３０２５）とし
て寄託されている。
技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌
寄第３０２５号（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．３０２５）とし
て寄託されている。
上記菌株シュードモナス・ノブ・エスビーＮｏ．１０９
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．ｓｐ．Ｎｏ．１
０９）を用いてコレステロール・エステラーゼの製造法
について上述した如く、特開昭５０−８２４１９号（特
開昭５２−７４８３号）に詳述されているが、以下に簡
単に説明すると、本菌は栄養培地で液体培養することに
より、コレステロール・エステラーゼを菌体内および菌
体外に蓄積するので、公知の方法で精製、乾燥すること
により、酵素粉末を得ることができる。
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．ｓｐ．Ｎｏ．１
０９）を用いてコレステロール・エステラーゼの製造法
について上述した如く、特開昭５０−８２４１９号（特
開昭５２−７４８３号）に詳述されているが、以下に簡
単に説明すると、本菌は栄養培地で液体培養することに
より、コレステロール・エステラーゼを菌体内および菌
体外に蓄積するので、公知の方法で精製、乾燥すること
により、酵素粉末を得ることができる。
さらに具体的に説明すると、本菌を適当な培地例えば適
当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産を高めるために
、天然油脂および有機促進物質を含む培地甲で培養し、
コレステロール・エステラーゼを蓄積せしめるのである
が、ここで糖質には、グルコース、シュークロースなど
の単・二糖類、澱粉および澱粉加水分解物が使用できる
。
当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産を高めるために
、天然油脂および有機促進物質を含む培地甲で培養し、
コレステロール・エステラーゼを蓄積せしめるのである
が、ここで糖質には、グルコース、シュークロースなど
の単・二糖類、澱粉および澱粉加水分解物が使用できる
。
窒素源には、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
無機塩類としては、鉄化アンモニウム、燐酸２カリウム
、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、食塩などが用いられ
る。
、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、食塩などが用いられ
る。
天然油脂としては動物性、植物性油脂または工業的に製
造されたる脂肪酸エステルいずれでも使用できる。
造されたる脂肪酸エステルいずれでも使用できる。
有機促進物質として、酵母エキスやペプトン、肉エキス
、コーンスチープリカーなどが良い。
、コーンスチープリカーなどが良い。
培地のｐＨは中性付近とし、通気攪拌などの好気的培養
を２８℃前後で１〜４日間行なう。
を２８℃前後で１〜４日間行なう。
上記の方法で得られたコレステロール・エステラーゼを
含む培養液を濾過、または遠心分離によって菌体を分別
し、その濾液または上澄みから、硫酸アンモニウム塩析
、あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶剤沈澱な
どの公知の方法で、酵素標品を得る。
含む培養液を濾過、または遠心分離によって菌体を分別
し、その濾液または上澄みから、硫酸アンモニウム塩析
、あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶剤沈澱な
どの公知の方法で、酵素標品を得る。
また、菌体内に蓄積されたコレステロール・エステラー
ゼを抽出するには菌体磨砕、自己消化、超音波処理など
の公知の方法によって無細胞酵素液としたのち、菌体外
の酵素と同様に精製に供することが出来る。
ゼを抽出するには菌体磨砕、自己消化、超音波処理など
の公知の方法によって無細胞酵素液としたのち、菌体外
の酵素と同様に精製に供することが出来る。
さらに高度に精製された酵素標品を得るには、イオン交
換を応用した吸着溶出法および電気泳動法などを用いれ
ば良い。
換を応用した吸着溶出法および電気泳動法などを用いれ
ば良い。
得られた酵素は、中性付近に最適のｐＨ値を示し、最適
温度は４５℃付近である。
温度は４５℃付近である。
熱安定性に関しては５５℃までは安定であるが、それ以
上になると次第に活性を失う。
上になると次第に活性を失う。
コレステロール・エステラーゼの酵素活性は例えば、血
清と反応によって生成した遊離コレステロール質を定量
することによって測定できる。
清と反応によって生成した遊離コレステロール質を定量
することによって測定できる。
また、遊離型コレステロールは、コレステロール・オキ
シターゼの作用によって、酸化され△４−コレステノン
と過酸化水素に分解されるので、最終的に生成した△４
−コレステノンまたは過酸化水素を定量することによっ
て測定することができる。
シターゼの作用によって、酸化され△４−コレステノン
と過酸化水素に分解されるので、最終的に生成した△４
−コレステノンまたは過酸化水素を定量することによっ
て測定することができる。
△４ーコレステノンはその２４５ｍμの紫外部特異吸光
を測定することによって求めることができる。
を測定することによって求めることができる。
また、過駿化水素の量は例えばパーオキシダーゼと色原
体例えば４−アミノフエナゾンとフェノールを組み合わ
せた試薬と反応させることによって、呈色度を５０５ｍ
μのＯ．Ｄ．を測定することによって求めることができ
る。
体例えば４−アミノフエナゾンとフェノールを組み合わ
せた試薬と反応させることによって、呈色度を５０５ｍ
μのＯ．Ｄ．を測定することによって求めることができ
る。
たぞし、この場合は、血清中にすでに遊離型の状態で存
在するコレステロールの量を差し引くことにより、正味
のコレステロール・エステラーゼの酵素活性を求めるよ
うにしなければならない。
在するコレステロールの量を差し引くことにより、正味
のコレステロール・エステラーゼの酵素活性を求めるよ
うにしなければならない。
本発明で使用するコレステロール・エステラーゼの活性
の表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１
単位は血清を基質として、ｐＨ７．０、３７℃の条件で
、１分間に１マイクロモルの遊離コレステロールを生成
するに要する酵素量とした。
の表示を説明すると、コレステロール・エステラーゼ１
単位は血清を基質として、ｐＨ７．０、３７℃の条件で
、１分間に１マイクロモルの遊離コレステロールを生成
するに要する酵素量とした。
上記の如くに、シュードモナス・ノブ・エスピーＮ０．
１０９を培養して得られたコレステロール・エステラー
ゼはエステル型コレステロールの酵素的測定に利用でき
る。
１０９を培養して得られたコレステロール・エステラー
ゼはエステル型コレステロールの酵素的測定に利用でき
る。
更に遊離型コレステロールに作用するコレステロール・
オキシダーゼと組み合わせることにより、例えば、公知
の酵素消費量、生成する過酸化水素量、または△４−コ
レステノン量を測定することにより、エステル型コレス
テロールの測定、ひいては総コレステロールの測定に供
することができる。
オキシダーゼと組み合わせることにより、例えば、公知
の酵素消費量、生成する過酸化水素量、または△４−コ
レステノン量を測定することにより、エステル型コレス
テロールの測定、ひいては総コレステロールの測定に供
することができる。
ここで使用される・コレステロール・オキシダーゼはア
ルスロバクター属のもの（特許出願第１４２１７１号）
およびミコバクテリウム属、ノカルジア属、ブレビバク
テリウム属等の公知のコレステロール・オキシダーゼも
充分使用することができる。
ルスロバクター属のもの（特許出願第１４２１７１号）
およびミコバクテリウム属、ノカルジア属、ブレビバク
テリウム属等の公知のコレステロール・オキシダーゼも
充分使用することができる。
本発明を以下の実施例によって詳説するか、しかしこれ
によって本発明は限定されるものではない。
によって本発明は限定されるものではない。
参考例 １
本参考例はシュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０
９を培養してなるコレステロール・エステラーゼの製造
に関するものである。
９を培養してなるコレステロール・エステラーゼの製造
に関するものである。
ポリペプトン１．０％、酵母０．５％、肉エキス０．１
％、燐酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０
５％、牛脂１．０％、ｐＨ７．０からなる培地１５ｌを
含む３０ｌ容ジャーファーメンター（３００ｒ・ｐ・ｍ
）に本発明による菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．Ｎｏ．１０９を植菌
し、２８℃、７２時間、通気攪拌培養後．培養液を遠心
分離によって、菌外を分別し、上澄みに６０％（ｗ／ｖ
）の硫安塩析を行ない、塩析物を濾別後、限外濾過法に
よって脱塩後、凍結乾燥した結果、２４０単位／ｇのコ
レステロール・エステラーゼの粉末１４ｇを得た。
％、燐酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０
５％、牛脂１．０％、ｐＨ７．０からなる培地１５ｌを
含む３０ｌ容ジャーファーメンター（３００ｒ・ｐ・ｍ
）に本発明による菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｖ．Ｎｏ．１０９を植菌
し、２８℃、７２時間、通気攪拌培養後．培養液を遠心
分離によって、菌外を分別し、上澄みに６０％（ｗ／ｖ
）の硫安塩析を行ない、塩析物を濾別後、限外濾過法に
よって脱塩後、凍結乾燥した結果、２４０単位／ｇのコ
レステロール・エステラーゼの粉末１４ｇを得た。
参考例 ２
参考例１における培養後分別されたる菌体湿物６００ｇ
を超音波処理にてコレステロール・エステラーゼを抽出
し、遠心分離によって不溶物を除去し、上澄みに６０％
（ｗ／ｖ）の硫安塩析を行ない、得られた塩析物を濾別
後真空乾燥した結果１２４ 単位／ｇのコレステロール
・エステラーゼの粉末５０ｇを得た。
を超音波処理にてコレステロール・エステラーゼを抽出
し、遠心分離によって不溶物を除去し、上澄みに６０％
（ｗ／ｖ）の硫安塩析を行ない、得られた塩析物を濾別
後真空乾燥した結果１２４ 単位／ｇのコレステロール
・エステラーゼの粉末５０ｇを得た。
実施例 １
本実施例は酸素消費量の測定による、血清中の総コレス
テロールの定量に関するものである。
テロールの定量に関するものである。
溶剤酸素測定装置において内室に参考例１で得たコレス
テロール・エステラーゼ０．１２４単位、コレステロー
ル・オキシダーゼ２単位、ヨウ化カリウム１８ｍＭ、ヘ
プタモリブデン酸アンモニウム７．５ｍＭ、塩化ナトリ
ウム８００ｍＭを含有する０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）の１．８ｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ
／１００ｍｌの範囲のコレステロール含有液２０μｌを
添加し、反応を開始し、溶液中の酸素濃度の減少を測定
し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求めた。
テロール・エステラーゼ０．１２４単位、コレステロー
ル・オキシダーゼ２単位、ヨウ化カリウム１８ｍＭ、ヘ
プタモリブデン酸アンモニウム７．５ｍＭ、塩化ナトリ
ウム８００ｍＭを含有する０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）の１．８ｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ
／１００ｍｌの範囲のコレステロール含有液２０μｌを
添加し、反応を開始し、溶液中の酸素濃度の減少を測定
し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求めた。
次に検体として総コレステロールの表示値が２００ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より総コレステロール濃度を求めると２０９ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より総コレステロール濃度を求めると２０９ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
実施例 ３
本実施例は過酸化水素量の測定による、血清中の総コレ
ステロールの定量に関するものである。
ステロールの定量に関するものである。
参考例２で得たコレステロール・エステラーゼ０．０１
２４単位、コレステロール・オキシダーゼ０．２５単位
、パーオキシダーセ０．６単位、４−アミノアンチピリ
ン０．２ｍｇ、フェノール０．５ｍｇ、トリトンＸ−１
００ ０．０５％を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）の５．０ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５０
０ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロール含有液５０
μｌを添加し、３７℃の恒温槽中で３０分間インキュベ
ートし、その後呈色度を５１０ｍｍμでＯ．Ｄ．を測定
し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求めた。
２４単位、コレステロール・オキシダーゼ０．２５単位
、パーオキシダーセ０．６単位、４−アミノアンチピリ
ン０．２ｍｇ、フェノール０．５ｍｇ、トリトンＸ−１
００ ０．０５％を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）の５．０ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５０
０ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロール含有液５０
μｌを添加し、３７℃の恒温槽中で３０分間インキュベ
ートし、その後呈色度を５１０ｍｍμでＯ．Ｄ．を測定
し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求めた。
次に検体として総コレステロールの表示値が２００ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より総コレステロール濃度を求めると２０５ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より総コレステロール濃度を求めると２０５ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
実施例 ３
本実施例は△４−コレステノン量の測定による血清甲の
総コレステロールの定量に関するものである。
総コレステロールの定量に関するものである。
参考例１で得たコレステロール・エステラーゼ０．０１
２４単位、コレステロール・オキシターゼ０．２５単位
、トリトンＸ−１０００．０５％を含有する０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５．０ｍｌに０ｍｇ／１０
０ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロー
ル含有液５０μｌを添加し、３７℃の恒温槽中で３０分
間インキユベートし、その後△４−コレステノンの特異
吸光を２４５ｍμでＯ．Ｄ．を測定し、測定値とコレス
テロール濃度間の検量線を求めた。
２４単位、コレステロール・オキシターゼ０．２５単位
、トリトンＸ−１０００．０５％を含有する０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５．０ｍｌに０ｍｇ／１０
０ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロー
ル含有液５０μｌを添加し、３７℃の恒温槽中で３０分
間インキユベートし、その後△４−コレステノンの特異
吸光を２４５ｍμでＯ．Ｄ．を測定し、測定値とコレス
テロール濃度間の検量線を求めた。
次に検体として総コレステロールの表示値が２００ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より総コレステロール濃度を求めると２０２ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より総コレステロール濃度を求めると２０２ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
Claims (1)
- １ 液体試料中のエステル型コレステロールをシュード
モナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０９を培養して得られ
るコレステロール・エステラーゼ活性を有する酵素製剤
を用いて分解して遊離型のコレステロールとし、液体試
料甲の総コレステロールを公知のコレステロールオキシ
ダーゼを用いて定量することを特徴とする液体試料のコ
レステロールの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50082420A JPS5813159B2 (ja) | 1975-07-03 | 1975-07-03 | コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50082420A JPS5813159B2 (ja) | 1975-07-03 | 1975-07-03 | コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS526593A JPS526593A (en) | 1977-01-19 |
| JPS5813159B2 true JPS5813159B2 (ja) | 1983-03-11 |
Family
ID=13774084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50082420A Expired JPS5813159B2 (ja) | 1975-07-03 | 1975-07-03 | コレステロ−ル エステラ−ゼオモチイルコレステロ−ルノ テイリヨウホウ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5813159B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5078156U (ja) * | 1973-11-20 | 1975-07-07 | ||
| CA1104041A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-30 | Charles T. Goodhue | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50150496A (ja) * | 1974-05-22 | 1975-12-02 |
-
1975
- 1975-07-03 JP JP50082420A patent/JPS5813159B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50150496A (ja) * | 1974-05-22 | 1975-12-02 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS526593A (en) | 1977-01-19 |
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