JPS62175197A - Ｌ−フコ−スの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、中性付近に至適ｐｌ（ｆもつＬ−フコース・
デヒドロゲナーゼを用いて、被検液中のＬ−フコースを
定量する方法に関する。

〔従来の技術〕

高等動物由来の複合糖鎖の非還元末端または枝分れ部分
に存在するα−Ｌ−フコシル基ハ細胞認識、免疫応答な
どに重要な役割を果している、例えばＡＢＯ式およびル
イス式血液型では抗原決定基となっており、これら血液
型物質の糖鎖構造と抗原特異性を解明する研究が最近注
目されている。また、細胞の癌化は糖脂質の糖鎖変化と
して顕著に表われており、癌関連糖脂質は癌が発生する
組織に固有の糖鎖が非還元末端で変化したものが多く、
組織の分化と密接に関係している。即ち、各種臓器癌に
それぞれ特異的なＬ−フコース含有糖脂質が蓄積される
ということである。これら癌関連糖鎖抗原は血中にも放
出されるから、血中の糖鎖抗原の構造解析による臓器癌
の診断が行われている。α−Ｌ−フコシダーゼは複合糖
質中のα−Ｌ−フコシル基に作用して、Ｌ−フコースを
遊離する酵素でこれら種々の糖鎖に含まれるＬ−フコー
スの結合位置の解析に有効であり、上記酵素の作用によ
り、または０．　Ｉ　Ｎ　）リクロロ酢酸存在下で、１
００℃、１時間処理する化学的方法によりＬ−フコース
残基を遊離させた後、Ｌ−フコースを定量すれば癌化の
程度まで診断が可能である。

また、癌の進行につれ血中Ｌ−フコース含量が減少し、
化学療法による癌の退行とともに血中Ｌ−フコース含量
が増加することから血中Ｌ−フコース含量の測定も癌化
レベルの指標となりつつある。

これらのＬ−フコースの定量法としては、試料中の遊￥
＠Ｌ−フコース画分をゲル濾過またはイオン交換法によ
って精製し、ガスクロマトグラフィーで定量する方法（
メソツズ骨イン・エンジモロジー第２８巻、第７３８頁
、１９７２年）、過ヨウ素酸酸化によって生ずるアセト
アルデヒドを定量する方法（ジャーナル・オプ・バイオ
ロジカル−ケミストリー、第２４５巻、第１６５９頁、
１９７０年）などがあるが操作が非常に繁雑であり、ま
た精度にも問題がある。

以上の化学法に比べてＬ−フコース・デヒドロゲナーゼ
を用いる酵素法では試料中のＬ−フコースを精製する必
要もなく、迅速かつ正確に定量することが可能となる。

Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼは微生物では既にブル
ラリア書プルラン（Ｐｕ１ｌｕｌａｒｉａ　ｐｕｌｌｕ
ｌａｎｓ　）に、また動物組織ではブタ肝臓やウサギ肝
臓などにその存在が報告されているが、いずれの起源の
酵素も反応至ａｐＨが１０付近にあることから、細胞に
障害を与えることなく、Ｌ−フコースを定量するために
は満足なものではない。さらに前記α−Ｌ−フコシダー
ゼは反応至適ｐＨが酸性乃至弱酸性にあり、ｐＨ１０付
近ではほとんど作用を示さない。それ故複合糖鎖中のＬ
−フコースをα−Ｌ−フコシダーゼとＬ−フコース・デ
ヒドロゲナーゼで同時に処理して定置することは反応性
の面から非常に困難であり、まず、酸性乃至弱酸性域で
試料にα−Ｌ−フコシダーゼを作用させて、遊離Ｌ−フ
コースを得たのち、アルカリ側にｐＨを調整し、これに
Ｌ−フコースφデヒドロゲナーゼを作用させ遊離Ｌ−フ
コースを定量するという繁雑な方法を用いなければなら
なかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、中性付近に反応至適ｐＨを有するＬ−
フコース・デヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−フコースの
迅速拳簡便かつ安価な定量法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、被検液中のＬ−フコースの定量法につい
て鋭意検討を重ねた結果、特定のＬ−フコース・デヒド
ロゲナーゼを用いて、迅速＠簡便かつ安価なＬ−フコー
スの定量法をここに見出した。

本発明は被検液中のＬ−フコースを定量するニ際し、α
−Ｌ−フコシダーゼの存在下または不存在下、被検液に
至適ｐＨが中性付近であるＬ−フコースーデヒドロゲナ
ーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを測定することからなるＬ−フコース
の定量法にある。

部ち本発明はＬ−フコースの定量法に関するものであっ
て、その特徴とするところは、被検液中のＬ−フコース
を定量するに当り為中性付近に至適ｐＨを有する特定の
Ｌ−７フース・デヒドロゲナーゼを用いて定量すること
である。さらに上記酵素を用いるＬ−フコースの定量が
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ　）の
存在下で行われ、生成する還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の紫外部の吸収の増加を
測定すること、およびＬ−フコースの定量が、ＮＡＤ、
テトラゾリウム塩（酸化型）およびジアホラーゼまたは
７エナジンメトサルフエイト（酸化型〕の存在下で行わ
れ、生成するホルマザン色素を定量することを特徴とす
る〇また、本発明に供される被検液としては、遊離Ｌ−
フコースおよび／または生体成分に結合したＬ−フコー
スを含有する被検液がある。

次に、本発明に用いられるＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼは、中性付近に至適ｐＨを有するという点で、コリ
ネバクテリウム属より選ばれたＬ−フコースやデヒドロ
ゲナ−（’生Ｎｉｌ　（：ｆｆリネバクテリウムｓｐ、
　ｙｓ−００７）より取得される酵素（このＬ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼについては本願出願人により昭和
６０年１２月２６日付で発明の名称「Ｌ−フコース・デ
ヒドロゲナーゼの製造法」として特許出願済である）を
使用するのが有利である。

まず、本発明で使用されるＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼの各性質を示す。

Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼの酵素化学的および理
化学的性質； （１）作用： 本酵素は下記反応式のごとく、Ｌ−フコースを酸化して
一−フコノーδ−ラクトンを生成する。

Ｌ−フコース＋ＮＡＤ＋→Ｌ−フコノーδ−ラクトン十
ＮＡＤＨ＋　Ｈ＋（２）基質特異性： 本酵素はＬ−フコースに最も特異性が高いが、Ｌ−ガラ
クトース、Ｄ−アラビノースなどにも作用する（第１表
）。

第　　１　　表 Ｌ−フコース　　　　　　　　　　　　　　　　１００
Ｌ−ガラクトース　　　　　　　　　　　　　　　７４
Ｄ−アラビノース　　　　　　　　　　　　　　　３７
フラクトース また、本酵素は補酵素としてＮＡＤを要求し、ＮＡＤＰ
には全く作用を示さない。

（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは７５〜８０付近にある。

また、本酵素を３０℃において、それぞれのｐＨで６０
分間処理したときはｐＨ６，０・”Ｉ　Ｏ，５まで安定
であった。

（４）至適温度および熱安定性： 本酵素は４３℃に至適温度を有している。また、本酵素
をｐＨ８，０においてそれぞれの温度で１０分間処理し
たとき４０℃まで安定であったが、６０℃では完全に失
活した。

（５）分子量： 本酵素の分子量はセファクリルＳ−２００（ファルマシ
ア製）によるゲル沖適法では約２６０００であった。

（６）等電点： ファルマイ）（ｐＨ５〜８、ファルマシア製）を用いた
等電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は５８５
であった。

（７）金属イオンの影疑： 本酵素は第２表に示すように、Ｈ７およびＡ、＋により
強力に阻害された。

第２表 無添加　　　　　　　　　　　　　１００ＨＰ”　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＱＡ、＋５ と＋ Ｏｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２３（８）　Ｋｍ値： ラインライバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂ
ｕｒｋ　）プロットにより本醇素のＬ−フコースに対す
るＫｍ値を求めたところ、１．３Ｘ１０−３Ｍであった
。

（９）酵素活性測定法： Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ活性の測定は次のよう
にして求めた。即ち、３０ｍＭＬ−フコース１．Ｏ献、
２００　ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，０）　１．８ｉ、１５　ｍＭＮＡＤ　Ｏ，ｌ　ｍｅ
および適当に希釈した酵素液０．１　ｄ。

反応液値３．０−で３７℃、１０分間反応させたのち、
３４０℃ｍ　　における吸光度を、測定する（　０：０
ｆｙ、Ａ、）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水
０．１−を加え、同様の操作によって吸光度を測定しく
ＯＤ）、△０Ｄｓ４ｏ　（ＣＤｔｙｙ’ヤーブランク ＯＤｆ、ｙｐ　）を求めた。Ｌ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ活性は下記の計算式によって求められる。

６．２２Ｘ１０（分）Ｘｏ、１＊＋（’Ｘａ〔作用〕 被検液中の一−フコースはＮＡＤの存在下、Ｌ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼの作用により、Ｌ−フコノーδ−
ラクトンとＮＡＤＨを生成する。

生成したＮＡＤＨの定量には公知の方法を用いることが
できる。例えば、ＮＡＤＨそのものの３４０℃ｍにおけ
る分子吸光係数から定量するかＮＡＤＨにニトロブルー
テトラゾリウムあるいはインドニトロテトラゾリウムな
どのテトラゾリウム塩（酸化型）およびジアホラーゼま
たはフエナジンメトサルフエイト（酸化型）を作用させ
て、生成するホルマザン色素の可視部の吸収（例えばニ
トロブルーテトラゾリウム（酸化型）の場合、５４０〜
５８０ｎｍ）を測定することによって定Ｍ１することが
できる。

また、被検液中のＬ−フコースが生体成分に結合したＬ
−フコースである場合には、被検液にα−Ｌ−フコシダ
ーゼを作用させて、あるいは化学的方法により、例えば
０．　Ｉ　Ｎ　）リクロロ酢醗存在下で、１００℃、１
時間処理することにより、Ｌ−フコースを遊離させ、こ
れにＮＡＤの存在下、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ
を作用させ、生成したＮＡＤＨを上記の方法で定量すれ
ばよい。

α−Ｌ−フコシダーゼとしてはアスペルギルス属、り四
ストリゾイウム属、フサリウム属などの微生物起源およ
びサザエ、ボウシュウボラの如き魚貝類の酵素が使用可
能であるが、これらの酵素はいずれも至適ｐＨが酸性乃
至弱酸性にあることから、中性付近に至適ｐＨを有する
コリネバクテリウム属由来の酵素（このα−Ｌ−フコシ
ダーゼについては本願出願人により昭和６０年１２月２
６日付で発明の名称「α−Ｌ−フコシダーゼの製造法」
として日本特許出願法である）を用いるのが有利である
。

反応に用いられる緩衝液は、特に限定されず、リン酸緩
衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、グツドの緩衝液
などが好適であり、ｐＨ６〜１０、好ましくはＩ）Ｈ７
，５〜８．５の緩衝液が用いられる。

Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼは通常０．２〜２０単
位、好ましくは１〜５単位、ジアホラーゼは０．５〜２
０単位、好ましくは１〜５単位が望ましい。本発明方法
によりＬ−フコースを定量する場合はテトラゾリウム塩
（酸化型）およびＮＡＤは少なくとも被検液中のＬ−フ
コースのモル量以上用いればよい。また、Ｌ−フコース
が生体成分に結合した被検液で、α−Ｌ−フコシダーゼ
を用いる場合には、通常１〜５０単位、好ましくは５単
位加えて、Ｌ−フコースを遊離させる必要がある。反応
湿度は２０〜４０℃、反応時間は２〜２０分間が望まし
い。また、Ｌ−フコースーデヒドロゲナーゼ、テトラゾ
リウム塩（酸化型）およびジアホラーゼあるいはフエナ
ジンメトサルフエイト（酸化型）は検液中に同時に存在
させてもよい。

上記の定量方法は次の反応式によって要約される。

（ａ） １、Ｌ−フコースα１　→Ｒ＋ＨｚＯ−＋Ｉ＋−７：ｌ
−ス＋ＲＯＭ２、　Ｌ〜フコース＋ＮＡＤ＋九Ｌ−フコ
ノーδ−ラクトン＋　ＮＡＤＨ＋　Ｈ＋ ３、　Ａ、　ＮＡＤＨ十１＋テトラゾリウム塩（酸化型
）−（Ｑ） −）ＮＡＤ　　＋ポルマザ２色素 Ｂ、　ＮＡＤＨ−１−Ｈ＋フエナジンメトサルフエイト
（酸化型）−一−→ＮＡＤ＋＋フエナジンメトサルフエ
イト（還元型）フエナジンメトサルフエイト（還元型）
＋テトラゾリウム塩（酸化型）−−−−→フエナジンメ
トサルフエイト（酸化型）＋ポルマザ２色素（Ｃｔ）ジ
アホラーゼ 以上のことより、本発明は非常に亀便であり、高感度か
つ特異的であること、比色定量が可能であること、優れ
た性質をもつＬ−フコース・デヒドロゲナーゼが微生物
より安価かつ大量に調製可能であることなどの特徴を有
しており、臨床検査分野に有利なＬ−フコースの定量法
を提供する。

〔実施例〕

以下に本発明を、実施例をもって説明するが本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例　Ｉ　Ｌ−フコースの定量 グリシン−水酸化ナトリウム　　０．８ｒｎＩ！２°０
ｍＭＭ％Ｈ（ｐＨ８，５） １５ｍＭ　　　　　ＮＡ、Ｄ＋Ｏ，１ｍｅ１．２ｍＭ　
　　　　−”）ロブルーテトラゾ・功ム　　０．１−（
酸化型） 水　　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍ１上記混
合溶液１，４ｄに０　、０．０２５　、０．０５゜０．
０７５　、０．１　、０．１２５および０．１５ｒｎＭ
のＬ−フコース溶液Ｑ、１ｍＪ’Ｑそれぞれ添加し、３
７℃で１０分間反応させた後、５６０ｎｍにおける吸光
度を測定をした。その結果は第１図に示すように添加し
たＬ−フコース量と５６０ηｍの吸光度の増加量には良
好な直線関係が得られた。

実施例　２　Ｌ−フコースの定量 １０　ＱｍＭ　　　　リン酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　
　　　１．０ｄ１５ｍＭ　　　ＮＡＤ＋０．１　ｍｅ ２０単位／ｍｅ　　Ｌ−７−ｙ−ス＊デヒドロゲナ　　
０．１　ｄ−ゼ ３０μＭ　　　フエナジンメトサルフエイト　　０．１
　ｍｆ上記混合溶液１．４　ｍｅに０　、０．０２５　
、０．０５゜０、　Ｏ７６、０，１、０，１２５および
０．１５ｍＭのＬ−フコース溶液０．１　ｒｎＩ！をそ
れぞれ添加し、３７℃で１０分間反応した。第２図に示
すように添加したＬ−フコース量と５６０ｎｍの吸光度
の増実ｍ例３　２’−フコシルラクトース中のＬ−フコ
ースの走用 １００ｍＭ　　　　リン酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　　
　　１．１ｒｎｅ１５ｍＭ　　　　ＮＡ、Ｄ＋０．１　
ｍ１２０単位／ｍｅ　　Ｌ−フコース・デヒドロゲナ　
　０．１　ｍｌ？−ゼ 上記混合溶液１．４　ｄに０　、０．０５　、０．１　
、０．２゜０．３，０．４およびＱ、５ｍＭの人乳由来
の２１−フコシルラクトース溶液０１−をそれぞれ添加
し、３７℃で１０分間反応した。第３図に示すように添
加した２１−７コシルラクトース量と３４０ｎｍの吸光
度の増加量には良好な直線関係が得られた。

実ｍ例４　２’−７コシルラクトース中のＬ−フコース
の定量 １００ｍＭ　　　　リン酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　　
　　０．９ｍｌ！１５ｍＭ　　　　ＮＡＤ＋Ｑ、　１　
ｍｅ上記混合溶液１．４−に０　、０．０５　、０．１
．０．２゜０．３，０．４および０．５ｍＭの人乳由来
（７）２’−７＝＋シルラクトース溶液０．１　ｄをそ
れぞれ添加し、３７℃で１０分間反応した。第４図に示
すように添加した２１−フコシルラクトース量と５．　
’（、ｏ。

ｍｍの吸光度の増加量には良好な直線関係カミ得られた
。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の定量法によれば従
来法と比べＬ−フコースを迅速・簡便かつ安価に定量す
ることが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を
有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における検量線をＬ−フコース量と５
６０ｍｍの吸光度差との関係で示したグラフであり、第
２図は実施例２における検量線をＬ−フコース量と５６
Ｑｎｍの吸光度差との関係で示したグラフであり、第３
図は実施例３における検量線を２′−フコシルラクトー
ス量ト３４０ｎｍの吸光度差との関係で示したグラフで
あり、第４図は実施例４における検量線を２＋−フコシ
ルラクトース量と５６０ｍｍの吸光度差との関係で示し
たグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検液中のＬ−フコースを定量するに際し、α−Ｌ
   −フコシダーゼの存在下または不存在下、被検液に至適
   ｐＨが中性付近であるＬ−フコース・デヒドロゲナーゼ
   を作用させ、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドを測定することを特徴とするＬ−フコース
   の定量方法。 ２、被検液中のＬ−フコースが遊離Ｌ−フコースおよび
   ／または生体成分に結合したＬ−フコースである特許請
   求の範囲第１項記載の定量方法。 ３、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼがコリネバクテリ
   ウム属細菌由来である特許請求の範囲第１項記載の定量
   方法。 ４、α−Ｌ−フコシダーゼがコリネバクテリウム属細菌
   由来である特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 ５、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを用いるＬ−フコ
   ースの定量が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドの紫外部の吸収を測定することによつて行われる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを用いるＬ−フコ
   ースの定量が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド、テトラゾリウム塩（酸化型）、ジアホラーゼま
   たはフエナジンメトサルフエイト（酸化型）の存在下で
   行われ、生成するホルマザン色素を測定することによつ
   て行われる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の各成
   分：（Ａ）至適ｐＨが中性付近であるＬ−フコース・デ
   ヒドロゲナーゼ （Ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｃ）テ
   トラゾリウム塩（酸化型） （Ｄ）ジアホラーゼまたはフエナジンメトサルフエイト
   （酸化型） を含有することを特徴とするＬ−フコース定量用組成物
   。