JPS606638B2 - 生体液中の成分の測定方法 - Google Patents
生体液中の成分の測定方法Info
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- JPS606638B2 JPS606638B2 JP56144567A JP14456781A JPS606638B2 JP S606638 B2 JPS606638 B2 JP S606638B2 JP 56144567 A JP56144567 A JP 56144567A JP 14456781 A JP14456781 A JP 14456781A JP S606638 B2 JPS606638 B2 JP S606638B2
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Description
本発明は生体液中の成分、すなわち基質または酵素活性
を主としてレドックス反応を使用して測定するに当り共
存する妨害物質をｐーオキシ安息香酸およびその低級ア
ルキルェステル（以下ＲＨＢという）の特異な性質を利
用して除去する方法に関する。 さらに詳しくは生体液中の成分の測定にレドックス反応
を適用し定量的に生成する過酸化水素を、ベルオキシダ
ーゼの存在下、４ーアミノアンチピリンあるいは３ーメ
チルー２ーベンゾチアゾリノヒドラゾン（以下ＭＢＴＨ
という）とＮ−エチル−Ｎースルホプロピルーｍート＊
ルィジン（以下ＥＳＰＴという）との酸化縮合による発
色を比色定量することにより検体中の目的成分を測定す
る方法において検体中に共存する妨害物質が反応の過程
で過酸化水素を生成しその過酸化水素が目的成分の測定
結果に誤差を生じる塵のある場合、ＲＨＢの特性すなわ
ち酸化縮合の発色剤が存在しない場合ベルオキシダーゼ
の存在下過酸化水素によりＲＨＢ自身が変化すると同時
に存在する過酸化水素を消尽することしかも変化した物
質が無色であることを利用して予じめ妨害物質を除去し
た後検体中の成分を正確に測定する方法に関する。本発
明でいうレドックス反応で過酸化水素を生成する反応を
利用する最も簡単なものには酵素グルコースオキシダー
ゼを用いるグルコースの測定方法、あるいは酵素ウリカ
ーゼを用いる尿酸の測定方法がある。 また一方目的の成分に何らかの処理を施こし例えば酵素
を作用してレドックス反応の基質に導き、次いで酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成しこれを比色定量する方法
がある。この場合反応の途中に種々の中間体を経て最後
にレドツクス反応が行なわれることが多いのでそれだけ
媒体中に共存する妨害物質の影響を受け易い。例えば‘
１１トリグリセラィドの測定は次の反応により行なわれ
る。上記原理によるトリグリセラィド測定においては検
体中のグリセロールが測定値に正誤差を与えることは明
らかである。 因に人血清中には約０．１ｍｍｏｌ／そのグリセロール
が含まれておりトリオ＊レフィン換算約８雌／ｄｌに相
当するが時にには（例えば透析患者血清）さらに高くな
ることもある。また■トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、Ｏ
ＰＴ）活性測定は次の反応により行なわれる：これらの
場合検体中のピルビン酸が測定値に正誤差を与える。因
に人血清中のピルビン酸は通常約０．１のｍｏｌノそで
あるが病的にはさらに増加する・ことがある。また‘３
｝Ｑ−アミラーゼ活性測定は次の反応により行なわれる
。上記原理によるＱ−アミラーゼ活性の測定においては
検体中のマルトースおよびグルコースが正誤差を与える
ことになる。 因に人血清中のグルコースは約６のｍｏｌ／そであるが
病的には非常に増加することがあり、またマルトースに
ついてはこれを含有する輸液を用いている患者の場合血
清中のマルトースは異常に高くなる。以上の例のほかア
シルＣｏ−Ａシンセターゼ、ミオキナーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼを組合せた遊離脂肪酸の測定の場合のピル
ビン酸、あるいはホスホリパーゼーＤ、コリンオキシダ
ーゼを組合せたリン脂質測定の場合のコリン等の妨害物
質の影響を取り除くために本発明方法は有効であり、さ
らに今後開発される測定方法への適用も充分考えられる
。 従来これら妨害物質の影響を取り除くためには目的の成
分に直接反応する酵素あるいは基質を除いた条件でそれ
以外は全く同じ方法で測定する所謂検体盲検値を測定し
これを全体の測定値から差引くことが一般に行なわれて
いる。 しかしこれは操作、計算が煩雑でありさらに糠度も劣る
。また他の方法としては始めに目的の成分に変化を与え
ない条件で共存する妨害物質を消尽し生成する過酸化水
素をカタラーゼを加えて除去し次いでカタラーゼ阻害剤
を加えた後目的成分の測定反応を実施する方法があるが
、この場合にはカタラーゼ阻害剤を必要とし試薬組成、
操作が複雑となるばかりでなくカタラーゼ阻害剤である
シアンナトリウムは公害上問題がありまたアジ化ナトリ
ウムは酸性条件下でアジ化水素を発生する等の障害があ
る。本発明者等はこれら従来技術の欠点を取除〈ため種
々研究し、ＲＨＢの特性すなわちＲＨＢは酸化統合の発
色剤が存在しないときはベルオキソダ−ゼの存在下、過
酸化水素を消尽してそれ自身が発色することなく変化す
る。 という知見に基づき研究を重ねた結果本発明を完成した
。本発明は生体液中の成分すなわち基質または酵素性の
測定にレドックス反応を適用し定量的に生成する過酸化
水素をベルオキシダーゼの存在下酸化縮合により発色す
る発色剤により比色定量することにより検体中の目的の
成分を測定する方法において、始めに全試薬の中、目的
の成分に直接作用する基質あるいは酵素およびＥＳＰＴ
と４ーアミノアンチピリンあるいはＭ旧ＴＨを含むもの
と、ＲＨＢ及びベルオキシダーゼを含むその他のものと
に分け、後者の試薬を用い予め検体中に共存する妨害物
質を除去することを特徴とする生体液中の成分の測定方
法を提供する。 本発明の方法により検体中の妨害物質の影響を受けない
かつ正確な生体液中の成分の測定が可能となる。次に試
験例により本発明の効果を説明する。 ・試験例 １妨害物質としての過酸化水素の除去 効果： １ 試薬 ｛１）ベルオキシダーゼ ０．０１の９′風
上ｐ−オキシ安息香酸メチル（以下ＭＨＢという）
１．０のｍ。 １／夕を含む０．１ｍｏｌ′〆リン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）（２１ ＥＳＰＴＩ．ｏｍｍｏｌ／夕と、４−アミ
ノアンチピリン０．８ｍｍｏｌ／そを含む０．１ｍｏｌ
′そりン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ 測定 ０〜１．０のｍｏｌ′夕日２Ｑ溶液の系列の夫々０．０
２泌を探りこれに試薬｛１｝１．５私を加え３７℃、５
分間加温後、試薬
を主としてレドックス反応を使用して測定するに当り共
存する妨害物質をｐーオキシ安息香酸およびその低級ア
ルキルェステル（以下ＲＨＢという）の特異な性質を利
用して除去する方法に関する。 さらに詳しくは生体液中の成分の測定にレドックス反応
を適用し定量的に生成する過酸化水素を、ベルオキシダ
ーゼの存在下、４ーアミノアンチピリンあるいは３ーメ
チルー２ーベンゾチアゾリノヒドラゾン（以下ＭＢＴＨ
という）とＮ−エチル−Ｎースルホプロピルーｍート＊
ルィジン（以下ＥＳＰＴという）との酸化縮合による発
色を比色定量することにより検体中の目的成分を測定す
る方法において検体中に共存する妨害物質が反応の過程
で過酸化水素を生成しその過酸化水素が目的成分の測定
結果に誤差を生じる塵のある場合、ＲＨＢの特性すなわ
ち酸化縮合の発色剤が存在しない場合ベルオキシダーゼ
の存在下過酸化水素によりＲＨＢ自身が変化すると同時
に存在する過酸化水素を消尽することしかも変化した物
質が無色であることを利用して予じめ妨害物質を除去し
た後検体中の成分を正確に測定する方法に関する。本発
明でいうレドックス反応で過酸化水素を生成する反応を
利用する最も簡単なものには酵素グルコースオキシダー
ゼを用いるグルコースの測定方法、あるいは酵素ウリカ
ーゼを用いる尿酸の測定方法がある。 また一方目的の成分に何らかの処理を施こし例えば酵素
を作用してレドックス反応の基質に導き、次いで酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成しこれを比色定量する方法
がある。この場合反応の途中に種々の中間体を経て最後
にレドツクス反応が行なわれることが多いのでそれだけ
媒体中に共存する妨害物質の影響を受け易い。例えば‘
１１トリグリセラィドの測定は次の反応により行なわれ
る。上記原理によるトリグリセラィド測定においては検
体中のグリセロールが測定値に正誤差を与えることは明
らかである。 因に人血清中には約０．１ｍｍｏｌ／そのグリセロール
が含まれておりトリオ＊レフィン換算約８雌／ｄｌに相
当するが時にには（例えば透析患者血清）さらに高くな
ることもある。また■トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、Ｏ
ＰＴ）活性測定は次の反応により行なわれる：これらの
場合検体中のピルビン酸が測定値に正誤差を与える。因
に人血清中のピルビン酸は通常約０．１のｍｏｌノそで
あるが病的にはさらに増加する・ことがある。また‘３
｝Ｑ−アミラーゼ活性測定は次の反応により行なわれる
。上記原理によるＱ−アミラーゼ活性の測定においては
検体中のマルトースおよびグルコースが正誤差を与える
ことになる。 因に人血清中のグルコースは約６のｍｏｌ／そであるが
病的には非常に増加することがあり、またマルトースに
ついてはこれを含有する輸液を用いている患者の場合血
清中のマルトースは異常に高くなる。以上の例のほかア
シルＣｏ−Ａシンセターゼ、ミオキナーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼを組合せた遊離脂肪酸の測定の場合のピル
ビン酸、あるいはホスホリパーゼーＤ、コリンオキシダ
ーゼを組合せたリン脂質測定の場合のコリン等の妨害物
質の影響を取り除くために本発明方法は有効であり、さ
らに今後開発される測定方法への適用も充分考えられる
。 従来これら妨害物質の影響を取り除くためには目的の成
分に直接反応する酵素あるいは基質を除いた条件でそれ
以外は全く同じ方法で測定する所謂検体盲検値を測定し
これを全体の測定値から差引くことが一般に行なわれて
いる。 しかしこれは操作、計算が煩雑でありさらに糠度も劣る
。また他の方法としては始めに目的の成分に変化を与え
ない条件で共存する妨害物質を消尽し生成する過酸化水
素をカタラーゼを加えて除去し次いでカタラーゼ阻害剤
を加えた後目的成分の測定反応を実施する方法があるが
、この場合にはカタラーゼ阻害剤を必要とし試薬組成、
操作が複雑となるばかりでなくカタラーゼ阻害剤である
シアンナトリウムは公害上問題がありまたアジ化ナトリ
ウムは酸性条件下でアジ化水素を発生する等の障害があ
る。本発明者等はこれら従来技術の欠点を取除〈ため種
々研究し、ＲＨＢの特性すなわちＲＨＢは酸化統合の発
色剤が存在しないときはベルオキソダ−ゼの存在下、過
酸化水素を消尽してそれ自身が発色することなく変化す
る。 という知見に基づき研究を重ねた結果本発明を完成した
。本発明は生体液中の成分すなわち基質または酵素性の
測定にレドックス反応を適用し定量的に生成する過酸化
水素をベルオキシダーゼの存在下酸化縮合により発色す
る発色剤により比色定量することにより検体中の目的の
成分を測定する方法において、始めに全試薬の中、目的
の成分に直接作用する基質あるいは酵素およびＥＳＰＴ
と４ーアミノアンチピリンあるいはＭ旧ＴＨを含むもの
と、ＲＨＢ及びベルオキシダーゼを含むその他のものと
に分け、後者の試薬を用い予め検体中に共存する妨害物
質を除去することを特徴とする生体液中の成分の測定方
法を提供する。 本発明の方法により検体中の妨害物質の影響を受けない
かつ正確な生体液中の成分の測定が可能となる。次に試
験例により本発明の効果を説明する。 ・試験例 １妨害物質としての過酸化水素の除去 効果： １ 試薬 ｛１）ベルオキシダーゼ ０．０１の９′風
上ｐ−オキシ安息香酸メチル（以下ＭＨＢという）
１．０のｍ。 １／夕を含む０．１ｍｏｌ′〆リン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）（２１ ＥＳＰＴＩ．ｏｍｍｏｌ／夕と、４−アミ
ノアンチピリン０．８ｍｍｏｌ／そを含む０．１ｍｏｌ
′そりン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ 測定 ０〜１．０のｍｏｌ′夕日２Ｑ溶液の系列の夫々０．０
２泌を探りこれに試薬｛１｝１．５私を加え３７℃、５
分間加温後、試薬
【２｝１．５の‘を加えこれにさらに
０〜１．０ｍｍｏｌ′〆日２０２溶液の系列を夫々０．
０２の【加え５分間放置後波長５５ｍｍで吸光度を測定
する。 その結果を表１に示す。数値は吸光度を表わす。表１上
表から発色剤であるＥＳＰＴと４−アミノアンチピリン
を加える前に存在した過酸化水素はベルオキ・シダーゼ
、ＭＨＢにより完全に除去され、後の過酸化水素の測定
に全く影響を与えていないことが明らかである。 試験例 ２． 妨害物質としてのグルコースの除去 効果： １ 試薬 ｛１｝ ムタロターゼ １０Ｕ′
の‘グルコースオキシダーゼ ２×１ぴＵ／私ベル
オキシダーゼ ２×１ぴＵ′のＭＨＢ
１，０のｍ。 Ｉ′夕を含むホウ酸緩衝液 （ｐＨ６．８）｛２） Ｅ
ＳＰＴ Ｉ．０ｍｍｏｌ′そ４−ア
ミノアンチピリン ０．８ｍｍｏｌ′〆を含むホウ
酸緩衝液 （ＦＨ６．８）２ 測定 上記試薬を用いて次の三つの試験を行なった。 （１ー グルコース標準液０〜４００爪９′のの系列お
よび３例の血清の夫々２０仏そを探り試薬１｝２の‘を
加え３７０、５分間放置後、試薬■２の‘を加えさらに
３７ｏ０、１０分間放置後波長５５仇仇で吸光度を測定
する。 （２｝ 上記グルコース標準液系列および血清の夫々２
０仏夕を探り試薬‘１｝２の‘および試薬■２地を同時
に加え混合し３７Ｑ０、１０分間放置後波長５５仇肌で
吸光度を測定する。 糊 グルコース標準液１００の９／ｄ‘２０仏そを採り
これに試薬ｍ２の‘を加え３７０、５分間放置後試薬■
２の‘を加えさらに上記グルコース標準液系列および血
清の夫々２０仏〆を加え３７００、１０分間放置後波長
５５０ｎｍで吸光度を測定する上記三つの測定結果を次
の表２に示す。 数値は吸光度を表わす。 表 ２ 上表から次のことがいえる。 測定ｍからグルコースは濃度の如何に拘らず試薬ｍで処
理することにより除去できることが、また測定‘２ーか
らは試薬‘１’、試薬■を混合して用いることによりグ
ルコースの種々の濃度における測定が可能であることが
、また測定｛３’からは試薬（１｝で最初存在するグル
コースを予め除去した後同じ反応液に試薬（２）を用い
て種々の濃度のグルコースの測定が可能であることが明
らかである。 しかも測定■と測定（３｝の結果が測定誤差範囲で一致
していることは最初に存在する妨害物質としてのグルコ
ースを本発明の方法で除去しても後のグルコースの測定
に何ら影響を与えないことが判明した。試験例 ３妨害
物質としてのピルビン酸の除去 効果 １ 試薬 （１１チアミンピロホスフエート ０．８肌ｍｏ】′そ
Ｎａ２ＨＰ０４ １０肌ｍｏｌ／
〆ＭｇＣ１２ ３０のｍ。 １′そＭＨＢ Ｉ．０肌ｍｏ
ｌ／そベルオキシダーゼ ０．０１雌ノ机
【ピルビン酸オキシダーゼ ７Ｕ／地を含む０
．１ｍｏｌ／そジメチルグルタレート緩衝液（ｐＨ７．
２）【２１ ＥＳＰＴ Ｉ．○の
ｍ。 １′夕４−アミノアンチピリン ０．８のｍｏＶ
〆を含む０．１ｍｏｌ／〆ジメチルグルタレート緩衝液
（ｐＨ７．２）２ 測定 上記試薬を用いて二つの試験を行なった。 ｛１） ピルビン酸標準液０．１ｍｍｏｌ／〆、１．０
ｍｍｏｌ／〆および１５例の血清の夫々２０仏〆を採り
試薬ｍ１．５肌を加え３７０、５分間放置後試薬■１．
５の‘を加えさらに３７０、１び分間放置後試薬ブラン
クを対照に波長５５ｏｎｍで吸光度を測定する。 ■ 上記ピルビン酸標準液および血清の夫々２０仏夕に
試薬ｍ１．５の｛と試薬（２｝１．５羽を同時に加え混
合し３７００、１び分間放置後試薬ブランクを対照に波
長５５０ｎので吸光度を測定する。 上記二つの測定結果を次の表３に示す。数値は吸光度を
表わす。 表３ 上表からピルビン酸についても試験例１、２と同様本発
明が有効であることが明らかである。 試験例 ４妨害物質としてのグリセロールの除去 効果： １ 試薬 ○｝ グルセロールキナーゼ １３Ｕ′そＬ
ーグリセロールー３ーリン酸酸化酵素１３００Ｕ′そ ベルオキシダーゼ ３×１びＵ／そアデノシン
トリフオスフエート０．４ｍｍｏｌ／クＭＨＢ
Ｉ．０机ｍｏｌ／そＭｇＣ１２
２のｍｏｌ′そトリトンＸ−１０
０ １夕／夕を含む１００肌ｍｏｌ／ぞ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）（２） ４−アミノ
アンチピリン ０．８のｍｏｌ′とＥＳＰＴ
Ｉ．０肌ｍｏｌ′そトリトンＸ−１０
０ １夕／そを含む１００ｍｎｌｏＶど
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）２ 測定上記試薬を
用いて次の三つの試験を行なった。 ｍ グリセロール標準液０〜１０００の９′の（トリグ
リセラィド換算）の系列の夫々２０山夕を探り、試薬川
１．５の‘を加え３７ｏ０、５分間放置後、試薬２｝１
．５叫を加えさらに３７℃、１雌ご間放置後波長５５０
ｎので吸光度を測定する。 ■ 上言己グリセロール標準液系列の夫々２０仏そを採
り、試薬｛１｝１．５の上および試薬■１．５の‘を同
時に加え混合し、３７００、１び分間放置後波長５５０
ｎので吸光度を測定する。（３｝ グリセロール標準液
１００の９／の（トリグリセラィド換算）２０仏そを探
りこれに試薬ｍＬ５私を加え３７０、５分間放置後試薬
【２｝１．５柵を加えさらに上記グリセロール標準液系
列を加え３７℃、１粉ご間放置後波長５５ｍＭで吸光度
を測定する。 上記三つの測定結果を第１図に示す。 第１図から次のことがいえる。 測定（１｝からグリセロールは濃度の如何に拘らず試薬
｛１｝で処理することにより除去できることが、また測
定■からは試薬｛１）、試薬【２｝を混合して用いるこ
とによりグリセロールの種々の濃度における測定が可能
であることが、また測定‘８１からは試薬【１｝で最初
に存在するグリセロールを予め除去した後同じ反応液に
試薬【２｝を用いて種々の濃度のグリセロールの測定が
可能であることが明らかである。 しかも測定【２｝と測定（３｝の結果が測定誤差範囲で
一致していることは最初に存在する妨害物質としてのグ
リセロールを本発明の方法で除去しても後のグリセロー
ルの測定に何ら影響を与えないことが判明した。次に実
施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例 １ 血清中のトリグリセラィドの測定 １ 試薬 ○）グリセ。 ールキナーゼ １３Ｕ／そＬーグｌｊセロー
ルー３ーリン酸酸化酵素１３００Ｕ′〆 ベルオキシダーゼ ３×１ぴＵ／そアデノシン
トリフオスフエート０．４ｍｍｏＩ／〆ＭＨＢ
１，０のｍ。 Ｉ／そＭｇＣ１２ ２のｍ。１
′そトリトンＸ−１００ １夕／夕を含
む１００ｍｍｏｌ′タイミダゾール緩衝液（ｐＨ７‐〇
）■ リパーゼ（リポプロティンリパーゼ作用を有する
） ５×１びＵ／夕４−アミノアンチ
ピリン ０．８ｍｍｏｌ／クＥＳＰＴ
Ｉ．０ｍｍｏｌ′そトリトンＸ−１００
１タ′夕を含む１００ｍｍｏｌ／クトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）２ 測定 検体血清２０ｖ夕に試薬‘１’１．５の‘を加え３７℃
、５分間力ｏ溢し血清中に存在する妨害成分である遊離
グリセロールを消去する。 この場合妨害物質の大部分は遊離グリセロールであるが
その他グリセロールキナーゼ以下の反応に関与する総て
の血清副反応も消去される。次に試薬（２｝１．５叫を
加え混合し３７０、１び分間放置後波長５５仇ので吸光
度を測定する。この方法では血清中に通常存在する遊離
グリセロールの少くとも２“音量すなわち２ｍｍｏｌ′
夕（トリグリセラィド１８００ｍ９／の相当）まで消去
できるので日常の臨床検査では特別の操作を加えること
なく血清中のトリグリセラィドの定量が可能である。透
析患者血清３５例を用い｛１）本発明方法（前処理を行
ない遊離グリセロールを消去して中性脂肪を測定する方
法）｛２｝無処理の方法（前処理を行なわないで遊離グ
リセロールと中性脂肪を測定する方法）細 別処理方法
（〔２）無処理の方法から遊離グリセロールを別に測定
して差し引く方法）とを比較した結果は第２図及び第３
図の通りである。 無処理の方法は、検体２０仏そを採り、試薬ｍ１．５の
‘と試薬（２）１．５の【を同時に混合し、３７℃、１
０分間放置後波長５５瓜肌で吸光度を測定する。 遊離グリセロールのみを測定する方法は試薬｛１）１．
５の上と試薬（２）からリパーゼのみを除いた試薬１．
５の‘を同時に混合し、３７℃、１０分間放置後波長５
５仇ので測定する。 以上のことから、本発明法は、無処理とは第２図のよう
に一致しないが、別処理の方法とは第３図のように、非
常によく一致することが明らかである。 以上述べた通り本発明方法は血清中の目的成分の測定に
本来必要な試薬のみを用いて予じめ妨害物質を除去する
ことができ、それ以外の特別の試薬あるいは特別の操作
によって共存する妨害物質を除去することなく、また検
体ブランクを求めて妨害物質の影響を除去する等の余分
の操作も行なわずに簡単かつ精度よく目的成分を測定す
ることができるもので日常の臨床検査に当って極めて有
用である。
０〜１．０ｍｍｏｌ′〆日２０２溶液の系列を夫々０．
０２の【加え５分間放置後波長５５ｍｍで吸光度を測定
する。 その結果を表１に示す。数値は吸光度を表わす。表１上
表から発色剤であるＥＳＰＴと４−アミノアンチピリン
を加える前に存在した過酸化水素はベルオキ・シダーゼ
、ＭＨＢにより完全に除去され、後の過酸化水素の測定
に全く影響を与えていないことが明らかである。 試験例 ２． 妨害物質としてのグルコースの除去 効果： １ 試薬 ｛１｝ ムタロターゼ １０Ｕ′
の‘グルコースオキシダーゼ ２×１ぴＵ／私ベル
オキシダーゼ ２×１ぴＵ′のＭＨＢ
１，０のｍ。 Ｉ′夕を含むホウ酸緩衝液 （ｐＨ６．８）｛２） Ｅ
ＳＰＴ Ｉ．０ｍｍｏｌ′そ４−ア
ミノアンチピリン ０．８ｍｍｏｌ′〆を含むホウ
酸緩衝液 （ＦＨ６．８）２ 測定 上記試薬を用いて次の三つの試験を行なった。 （１ー グルコース標準液０〜４００爪９′のの系列お
よび３例の血清の夫々２０仏そを探り試薬１｝２の‘を
加え３７０、５分間放置後、試薬■２の‘を加えさらに
３７ｏ０、１０分間放置後波長５５仇仇で吸光度を測定
する。 （２｝ 上記グルコース標準液系列および血清の夫々２
０仏夕を探り試薬‘１｝２の‘および試薬■２地を同時
に加え混合し３７Ｑ０、１０分間放置後波長５５仇肌で
吸光度を測定する。 糊 グルコース標準液１００の９／ｄ‘２０仏そを採り
これに試薬ｍ２の‘を加え３７０、５分間放置後試薬■
２の‘を加えさらに上記グルコース標準液系列および血
清の夫々２０仏〆を加え３７００、１０分間放置後波長
５５０ｎｍで吸光度を測定する上記三つの測定結果を次
の表２に示す。 数値は吸光度を表わす。 表 ２ 上表から次のことがいえる。 測定ｍからグルコースは濃度の如何に拘らず試薬ｍで処
理することにより除去できることが、また測定‘２ーか
らは試薬‘１’、試薬■を混合して用いることによりグ
ルコースの種々の濃度における測定が可能であることが
、また測定｛３’からは試薬（１｝で最初存在するグル
コースを予め除去した後同じ反応液に試薬（２）を用い
て種々の濃度のグルコースの測定が可能であることが明
らかである。 しかも測定■と測定（３｝の結果が測定誤差範囲で一致
していることは最初に存在する妨害物質としてのグルコ
ースを本発明の方法で除去しても後のグルコースの測定
に何ら影響を与えないことが判明した。試験例 ３妨害
物質としてのピルビン酸の除去 効果 １ 試薬 （１１チアミンピロホスフエート ０．８肌ｍｏ】′そ
Ｎａ２ＨＰ０４ １０肌ｍｏｌ／
〆ＭｇＣ１２ ３０のｍ。 １′そＭＨＢ Ｉ．０肌ｍｏ
ｌ／そベルオキシダーゼ ０．０１雌ノ机
【ピルビン酸オキシダーゼ ７Ｕ／地を含む０
．１ｍｏｌ／そジメチルグルタレート緩衝液（ｐＨ７．
２）【２１ ＥＳＰＴ Ｉ．○の
ｍ。 １′夕４−アミノアンチピリン ０．８のｍｏＶ
〆を含む０．１ｍｏｌ／〆ジメチルグルタレート緩衝液
（ｐＨ７．２）２ 測定 上記試薬を用いて二つの試験を行なった。 ｛１） ピルビン酸標準液０．１ｍｍｏｌ／〆、１．０
ｍｍｏｌ／〆および１５例の血清の夫々２０仏〆を採り
試薬ｍ１．５肌を加え３７０、５分間放置後試薬■１．
５の‘を加えさらに３７０、１び分間放置後試薬ブラン
クを対照に波長５５ｏｎｍで吸光度を測定する。 ■ 上記ピルビン酸標準液および血清の夫々２０仏夕に
試薬ｍ１．５の｛と試薬（２｝１．５羽を同時に加え混
合し３７００、１び分間放置後試薬ブランクを対照に波
長５５０ｎので吸光度を測定する。 上記二つの測定結果を次の表３に示す。数値は吸光度を
表わす。 表３ 上表からピルビン酸についても試験例１、２と同様本発
明が有効であることが明らかである。 試験例 ４妨害物質としてのグリセロールの除去 効果： １ 試薬 ○｝ グルセロールキナーゼ １３Ｕ′そＬ
ーグリセロールー３ーリン酸酸化酵素１３００Ｕ′そ ベルオキシダーゼ ３×１びＵ／そアデノシン
トリフオスフエート０．４ｍｍｏｌ／クＭＨＢ
Ｉ．０机ｍｏｌ／そＭｇＣ１２
２のｍｏｌ′そトリトンＸ−１０
０ １夕／夕を含む１００肌ｍｏｌ／ぞ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）（２） ４−アミノ
アンチピリン ０．８のｍｏｌ′とＥＳＰＴ
Ｉ．０肌ｍｏｌ′そトリトンＸ−１０
０ １夕／そを含む１００ｍｎｌｏＶど
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）２ 測定上記試薬を
用いて次の三つの試験を行なった。 ｍ グリセロール標準液０〜１０００の９′の（トリグ
リセラィド換算）の系列の夫々２０山夕を探り、試薬川
１．５の‘を加え３７ｏ０、５分間放置後、試薬２｝１
．５叫を加えさらに３７℃、１雌ご間放置後波長５５０
ｎので吸光度を測定する。 ■ 上言己グリセロール標準液系列の夫々２０仏そを採
り、試薬｛１｝１．５の上および試薬■１．５の‘を同
時に加え混合し、３７００、１び分間放置後波長５５０
ｎので吸光度を測定する。（３｝ グリセロール標準液
１００の９／の（トリグリセラィド換算）２０仏そを探
りこれに試薬ｍＬ５私を加え３７０、５分間放置後試薬
【２｝１．５柵を加えさらに上記グリセロール標準液系
列を加え３７℃、１粉ご間放置後波長５５ｍＭで吸光度
を測定する。 上記三つの測定結果を第１図に示す。 第１図から次のことがいえる。 測定（１｝からグリセロールは濃度の如何に拘らず試薬
｛１｝で処理することにより除去できることが、また測
定■からは試薬｛１）、試薬【２｝を混合して用いるこ
とによりグリセロールの種々の濃度における測定が可能
であることが、また測定‘８１からは試薬【１｝で最初
に存在するグリセロールを予め除去した後同じ反応液に
試薬【２｝を用いて種々の濃度のグリセロールの測定が
可能であることが明らかである。 しかも測定【２｝と測定（３｝の結果が測定誤差範囲で
一致していることは最初に存在する妨害物質としてのグ
リセロールを本発明の方法で除去しても後のグリセロー
ルの測定に何ら影響を与えないことが判明した。次に実
施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例 １ 血清中のトリグリセラィドの測定 １ 試薬 ○）グリセ。 ールキナーゼ １３Ｕ／そＬーグｌｊセロー
ルー３ーリン酸酸化酵素１３００Ｕ′〆 ベルオキシダーゼ ３×１ぴＵ／そアデノシン
トリフオスフエート０．４ｍｍｏＩ／〆ＭＨＢ
１，０のｍ。 Ｉ／そＭｇＣ１２ ２のｍ。１
′そトリトンＸ−１００ １夕／夕を含
む１００ｍｍｏｌ′タイミダゾール緩衝液（ｐＨ７‐〇
）■ リパーゼ（リポプロティンリパーゼ作用を有する
） ５×１びＵ／夕４−アミノアンチ
ピリン ０．８ｍｍｏｌ／クＥＳＰＴ
Ｉ．０ｍｍｏｌ′そトリトンＸ−１００
１タ′夕を含む１００ｍｍｏｌ／クトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７‐〇）２ 測定 検体血清２０ｖ夕に試薬‘１’１．５の‘を加え３７℃
、５分間力ｏ溢し血清中に存在する妨害成分である遊離
グリセロールを消去する。 この場合妨害物質の大部分は遊離グリセロールであるが
その他グリセロールキナーゼ以下の反応に関与する総て
の血清副反応も消去される。次に試薬（２｝１．５叫を
加え混合し３７０、１び分間放置後波長５５仇ので吸光
度を測定する。この方法では血清中に通常存在する遊離
グリセロールの少くとも２“音量すなわち２ｍｍｏｌ′
夕（トリグリセラィド１８００ｍ９／の相当）まで消去
できるので日常の臨床検査では特別の操作を加えること
なく血清中のトリグリセラィドの定量が可能である。透
析患者血清３５例を用い｛１）本発明方法（前処理を行
ない遊離グリセロールを消去して中性脂肪を測定する方
法）｛２｝無処理の方法（前処理を行なわないで遊離グ
リセロールと中性脂肪を測定する方法）細 別処理方法
（〔２）無処理の方法から遊離グリセロールを別に測定
して差し引く方法）とを比較した結果は第２図及び第３
図の通りである。 無処理の方法は、検体２０仏そを採り、試薬ｍ１．５の
‘と試薬（２）１．５の【を同時に混合し、３７℃、１
０分間放置後波長５５瓜肌で吸光度を測定する。 遊離グリセロールのみを測定する方法は試薬｛１）１．
５の上と試薬（２）からリパーゼのみを除いた試薬１．
５の‘を同時に混合し、３７℃、１０分間放置後波長５
５仇ので測定する。 以上のことから、本発明法は、無処理とは第２図のよう
に一致しないが、別処理の方法とは第３図のように、非
常によく一致することが明らかである。 以上述べた通り本発明方法は血清中の目的成分の測定に
本来必要な試薬のみを用いて予じめ妨害物質を除去する
ことができ、それ以外の特別の試薬あるいは特別の操作
によって共存する妨害物質を除去することなく、また検
体ブランクを求めて妨害物質の影響を除去する等の余分
の操作も行なわずに簡単かつ精度よく目的成分を測定す
ることができるもので日常の臨床検査に当って極めて有
用である。
第１図はグリセロール標準液と吸光度との関係を示すグ
ラフであり、第２図は無処理の方法によるトリグリセラ
ィド測定と別処理方法によるトリグリセラィド測定との
相関を示すグラフであり、第３図は別処理方法によるト
リグリセラィド測定と本発明の方法によるトリグリリセ
ラィド測定との相関を示すグラフである。 第３図 第１図 第２図
ラフであり、第２図は無処理の方法によるトリグリセラ
ィド測定と別処理方法によるトリグリセラィド測定との
相関を示すグラフであり、第３図は別処理方法によるト
リグリセラィド測定と本発明の方法によるトリグリリセ
ラィド測定との相関を示すグラフである。 第３図 第１図 第２図
Claims (1)
- １ 生体液中の成分の測定にレドツクス反応を適用し生
成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化縮
合により発色する発色剤により比色定量することにより
目的成分を測定する方法において全試薬を目的成分に直
接作用する基質又は酵素とＮ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−トルイジンおよび４−アミノアンチピリンあ
るいは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン
を含むものと、ｐ−オキシ安息香酸またはその低級アル
キルエステル及びペルオキシダーゼを含むその他のもの
とに分け、後者の試薬を用い予め検体中に共存する妨害
物質を除去することを特徴とする生体液中の成分の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56144567A JPS606638B2 (ja) | 1981-09-16 | 1981-09-16 | 生体液中の成分の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56144567A JPS606638B2 (ja) | 1981-09-16 | 1981-09-16 | 生体液中の成分の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5847498A JPS5847498A (ja) | 1983-03-19 |
| JPS606638B2 true JPS606638B2 (ja) | 1985-02-19 |
Family
ID=15365222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56144567A Expired JPS606638B2 (ja) | 1981-09-16 | 1981-09-16 | 生体液中の成分の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS606638B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0355150B2 (ja) * | 1983-10-24 | 1991-08-22 | ||
| JPH0545553Y2 (ja) * | 1989-01-30 | 1993-11-22 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0614879B2 (ja) * | 1984-04-27 | 1994-03-02 | 株式会社ヤトロン | ビリルビンの干渉を回避して行なう生体成分の測定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
| JPS57163497A (en) * | 1981-04-02 | 1982-10-07 | Toyobo Co Ltd | Determination of substrate or enzyme activity |
-
1981
- 1981-09-16 JP JP56144567A patent/JPS606638B2/ja not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
| JPS57163497A (en) * | 1981-04-02 | 1982-10-07 | Toyobo Co Ltd | Determination of substrate or enzyme activity |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0355150B2 (ja) * | 1983-10-24 | 1991-08-22 | ||
| JPH0545553Y2 (ja) * | 1989-01-30 | 1993-11-22 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5847498A (ja) | 1983-03-19 |
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