JPH0577399B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、H₂O₂供給オキシダーゼによつて生
成されるH₂O₂の測色的測定を、発色系を添加し
かつ形成された色素を測定することによつて改善
する方法及び試薬に関する。 従来の技術 H₂O₂供給オキシダーゼ反応の利用は、水性中
性媒体中でのH₂O₂の簡単で正確な検出法の開発
によつて、従来から酵素的分析において著しく重
要になつた。特にこの重要性は、血清又は血漿又
は尿のような体液中に含有された、高い臨床診断
的調節値を有する物質の日常的測定についていえ
る。 最終的に測定すべき物質から、前記のような特
別のオキシダーゼ反応を用いて適当な、好ましく
は酵素的な転換反応を予め行うことによつて直接
又は間接的に形成されるH₂O₂の定量的測定のた
めには、電気化学的測定法の他に好ましくは測色
的検出法が用いられる。さらに“トリンダータイ
プ（Trinder−Typ）”の検出法が特に有用であ
ることが判明したが、同検出法の場合は、ペルオ
キシダーゼE.C.1.11.1.7の存在でフエノール又は
フエノール誘導体又は置換アニリン及び４−アミ
ノアンチピリンから、使用されたH₂O₂量と比例
関係にある量及び強さを有する赤乃至紫色の色素
が形成される。 さらにまた類似の原理に基く色素指示薬系も若
干重要になつたが、この場合には発色剤
（Kuppler）として４−アミノアンチピリンの代
りに、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒ
ドラゾン（“MBTH”）又は2′位でスルホン化さ
れた同族化合物（“MBTH−Ｓ”）が使用され、
しかも好ましくは置換アニリンと組合せて使用さ
れる（例えばClin.Chem.17、1154〜1159頁
（1971））。しかし、これらの系は好ましくは、≦７
のPH値を有する試薬中においてのみ使用されうる
ことが判明し、他の場合にはH₂O₂の不在ですで
に自動酸化による呈色が起り、これによつて発色
が比較的急速になり、ひいては即用試薬の貯蔵能
力が明らかに限定されることになる。 例えば、デヒドロゲナーゼの反応を基礎とし、
NAD(P)Ｈの形成又は使用量がUV範囲で測定さ
れる試験法と比べた前記種類の分析法の利点は、
分析試薬の安定性が大抵明らかに長くなりかつ可
視波長範囲における試料物質の固有の色又は固有
の濁りによる試験への干渉が著しく小さくなり、
部分的には無視することさえできることの他に、
特に検出反応の感度に関する若干の融通性（調節
性、作用性）にあり、従つてこれらの利点は適用
される発色反応のために原理的に適当な発色化合
物のために用いられる。 しかし前記の融通性には上の方に限界が設けら
れている。例えば、NAD(P)⁺依存デヒドロゲナー
ゼ反応の検出感度にほぼ比較できる検出感度を有
する色素指示薬系ペルオキシダーゼ／フエノー
ル／４−アミノアンチピリン〔“メソツヅ・イ
ン・エンザイマチツク・アナリシス（Methods
in Enzymatic Analysis）”、第３版（バインハイ
ム（Weinheim）在フエルラーク・ヒエミー
（Verlag Chemie）、1983年、第１巻、第2.6.1.2章
参照〕を用いて、比較的高濃度の血清成分、例え
ば全コレステリン（脂肪酸エステル化遊離コレス
テリンの総量、標準濃度約5.7ｍmol／；コレ
ステリンエステラーゼE.C.3.1.1.13及びコレステ
リンオキシダーゼE.C.1.1.3.6によつて触媒され
る、最終的にH₂O₂を形成する反応のカツプリン
グを介して検出）は、分析試薬20mlに対して僅か
20μの試料を使用する場合でさえ、高い精度
（標準濃度範囲での測定信号：546nｍ及びλ_nax＝
500nｍでの吸光度単位約0.26及び0.38）をもつて
かつ試料固有吸光度を無視して難なく測定されう
る。 これと反対に、例えば血清クレアチニンの測定
（クレアチニナーゼE.C.3.5.2.10、クレアチナーゼ
E.C.3.5.3.3及びサルコシンオキシダーゼE.
C.1.5.3.1によつて触媒される反応を順次に行うこ
とによつて検出）の場合（PH最適値約8.0）には、
現在最も鋭敏な公知のトリンダー（Trinder）色
素指示薬系〔４−アミノアンチピリンに対する発
色剤としての２，４，６−トリヨード−及び２，
４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息香酸；
発色剤としてのフエノールよりも約５倍高い
H₂O₂検出感度−Clin.Chem.26、1062頁（1980）
及びAnn.Clin.Biochem.21、430〜433頁（1984）〕
を使用しかつ分析試薬2.0mlに対して試料100μ
のように高い用量を用いる場合ですら、546nｍ
及びλ_nax＝510での吸光度単位約0.07及び0.1を有
するクレアチニン試料濃度１mg／dl（血清中の標
準濃度の上限約88μmol／＝１mg／dl）ごとの
測定信号は、クレアチニンの測定をコレステリン
試験に比較できる十分な精度、つまり決定範囲に
おける約２％の変動係数をもつて実施しうるには
なお不十分である。 前記目的は原理的には試料／試薬の容量比を高
めることによつて達成されうるが、しかしこのよ
うな手段の場合には経験によれば、就中濁つた
（脂肪血症の、つまりトリグリセリドの豊富な）
試料の分析の場合の測定生涯又は試料物質中に潜
在的に含有されていて、発色反応にマイナスの影
響を与える他の還元性成分、すなわちアスコルビ
ン酸、ビリルビン及び特定の薬剤による測定障害
が、明らかに重要問題になることを考慮しなけれ
ばならない。 また同様なことは、低濃度の他の血清中代謝産
物、例えば尿酸（血清中の標準値140〜
400μmol／）についてもいえる。血清中の尿酸
の測定（ウリカーゼE.C.1.7.3.3を用いる）の場合
には、試料空値の併用（これは血清クレアチニン
の測定の場合には、同時に著量で存在するクレア
チンのために不可欠である）を放棄することがで
き、ひいては分析の実施を容易にするために、通
常分析試薬2.0ml当り最大50μの試料しか使用さ
れない。このような条件下ではトリヨード及びト
リブロムヒドロキシ安息香酸／４−アミノアンチ
ピリン色素指示薬系を用いると決定範囲で同様に
比較的低い吸光度値（546nｍで約0.045〜0.13及
び510nｍで0.064〜0.186）が得られる。 最後にまた、例えば前記反応図式によるクレア
チニンの測定の場合、トリンダータイプの色素指
示薬系（４−アミノアンチピリンのフエノール系
カツプリングパートナーとしてはトリブロム−又
はトリヨードヒドロキシ安息香酸又はアニリン系
カツプリングパートナーとしてはＮ−エチル−Ｎ
−β−スルホエチル−ｍ−トルイジン、“EST”）
を用いると、種々の濃度の水性クレアチニン標準
を使用する場合、生じる検量線は座標系の原点を
通らず（Ｘ軸：試料中のクレアチニンの濃度；Ｙ
軸：吸光度単位での色素測定信号）、約0.015（ト
リブロムヒドロキシ安息香酸／４−アミノアンチ
ピリン系、λ＝546nｍ）又は約0.013（EST／４−
アミノアンチピリン系、λ＝578nｍ）の大きさ
のＹ軸の負の部分を有し、これはともかく標準値
信号の約20〜33％を占め（例１及び例４参照）か
つ特に一点検量（Einpunbt−Eichung）の場合に
は、このような試験の検量を著しく狂わせること
が判明した。 発明の解決しようとする問題点 従つて本発明の課題は、H₂O₂供給オキシダー
ゼの反応の検出そのものの感度を明瞭に高めるこ
とができかつ対応する検量線を作る際の軸部分の
出現を防止し、従つてH₂O₂供給オキシダーゼの
反応の検出を著しく改善する方法を創作すること
である。 問題点を解決するための手段 前記課題は本発明により、H₂O₂供給オキシダ
ーゼによつて生成されるH₂O₂の測色的測定の感
度及び検量性を、発色系を加えかつ形成された色
素を測定することによつて改善する方法におい
て、H₂O₂生成系及びH₂O₂を測定するための発色
系を含有する試薬溶液にスーパーオキシドジスム
ターゼ（Superoxiddismutase）E.C.1.15.1.1を加
えることを特徴とする前記方法によつて解決され
る。 本発明の範囲内では特にCu、Zn−スーパーオ
キシドジスムターゼが有利であると判明した。こ
の酵素は赤血球、例えば牛血液の赤血球から得ら
れる。該酵素は銅及び亜鉛約2mol及び約33000D
の分子量を有する。 しかしまたCu、Zn−スーパーオキシドジスム
ターゼは他の物質、例えば酵母の中にも見出され
る。 スーパーオキシドジスムターゼは好ましくは10
〜150μｇ／ml（試薬溶液）、特に好ましくは25〜
75μｇ／mlの量で加える。ここでスーパーオキシ
ドジスムターゼ1μｇは市販のスーパーオキシド
ジスムターゼ製剤の約4Uに相当する。この関係
は、Ｊ、Biol.Chem.244、6049頁（1969）に記載
された、スーパーオキシドジスムターゼの活性測
定法に基く。 発色系としては、本発明の範囲では原則とし
て、色素形成下にH₂O₂と反応するすべての発色
系を、それらの系がスーパーオキシドジスムター
ゼ又は場合によつて存在する他の酵素の活性を損
う成分を含有しない限り、使用することができ
る。多数のこのような発色系は当業者には公知で
あつて、ここで詳説する必要はない。トリンダー
タイプの発色系が有利である。この系は主成分と
してペルオキシダーゼ、フエノール、フエノール
誘導体又はアニリン誘導体及び４−アミノアンチ
ピリンを含有する。極めて有利なフエノール誘導
体は２，４，６−トリヨード−３−ヒドロキシ安
息香酸又は相応のトリブロム化合物である。有利
なアニリン誘導体はＮ−エチル−Ｎ−β−スルホ
エチル−ｍ−トルイジン又はＮ−エチル−Ｎ−β
−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジンである。も
う一つの有利な発色系は、ペルオキシダーゼ、ア
ニリン誘導体及びMBTH（３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノン−ヒドラゾン）又はMBTH−Ｓ
から成る。この系におけるアニリン誘導体として
は、上に挙げた２種の化合物の他に好ましくはま
たＮ，Ｎ−ジメチルアニリン及びＮ，Ｎ−ジメチ
ルアミノ安息香酸も使用される。 本発明は、サルコシンオキシダーゼ、ウリカー
ゼ及びオキサレートオキシダーゼ
（Oxalatoxidase）のようなH₂O₂供給オキシダー
ゼの場合に極めて優れた効果を示す。しかしまた
他のH₂O₂供給オキシダーゼも使用してよい。 この所見は予想できなかつたことであり、現在
でも十分には説明することができない。それとい
うのも同所見はスーパーオキシドジスムターゼ、
つまり次の反応： 2O₂ ^-＋2H⁺→H₂O₂＋O₂ の触媒の公知の酵素特性とは一致し得ないからで
ある。 理由１：サルコシンオキシダーゼ又はウリカーゼ
のようなオキシダーゼに関しては、これら酵素
がそれぞれの基質、つまりサルコシン又は尿酸
の反応の間にH₂O₂の他になお著量のO₂ ^-イオ
ン基を供給する（これによつて上記反応式によ
り追加的なH₂O₂の生成、ひいてはスーパーオ
キシドジスムターゼによるH₂O₂検出反応の改
善が説明されうる）ことは知られていない：例
えばAgric.Biol.Chem.44、1391頁（1980）に
は、シリンドロカルプム・ジジムム
（Cylindrocarpum didymum）Ｍ−１から得ら
れるサルコシンオキシダーゼがサルコシン酸化
の際に理論量でH₂O₂を生成することがはつき
り指摘されている。コネバクテリウム
（Corynebacterium）から得られるサルコシン
オキシダーゼの場合にも同様な確認がなされた
（J.Biochem.89、599頁（1981））。またウリカ
ーゼによる尿素酸化の場合にもH₂O₂の生成の
他に超酸化物（Superoxid）イオン基の生成は
検出されなかつた（Arch.Biochem.Biophys.
163、359頁（1974））。 理由２：スーパーオキシドジスムターゼを使用す
る場合、部分的にはスーパーオシドジスムター
ゼのしのぎさえする、抜群のO₂ ^-−不均化効果
を有する銅錯体、例えばCu（アセチルサリチレ
ート）₂、Cu（リシン）₂又はCu₂（インドメタシ
ン）₄〔Bull.europ.Physiopath.resp.17（suppl.），
73（1981）〕によつて、オキシダーゼ試薬中の
100μmol／までの濃度（以下の例中で使用さ
れるスーパーオキシドジスムターゼの最高濃度
でも3.8μmol／にすぎない！）でさえH₂O₂の
検出は改善されないという所見も、前記反応式
によるスーパーオキシドジスムターゼの効果と
矛盾する。 さらにスーパーオキシジスムターゼの効果
は、軸部分の除去に関しても、前記反応式によ
り説明することはできない、それというのもた
とえ前記オキシダーゼによる若干のO₂ ^-の生成
が文献記載に反してあつたとしても、O₂ ^-の生
成は基質反応がほぼ零になれば同様にほぼ零に
なるにちがいないからである。 最後に、H₂O₂供給オキシダーゼの反応の検
出を改善する、スーパーオキシドジスムーダの
添加の効果は、燐酸塩含まない試薬（例えば
TES100ｍmol／によつて緩衝）中でも、燐
酸塩（試薬100〜150ｍmol／の中の濃度）で
緩衝した溶液中と同様に顕著である。しかし文
献には牛赤血球起源の極めて優れたスーパーオ
キシドジスムターゼの場合には、その酵素活性
は燐酸塩によつて著しく阻害され、詳しくはわ
ずか10ｍmol／の燐酸塩濃度の場合にすでに
約50％まで阻害されることが記載されている
〔Biochemistry23、2079頁（1984）〕。 本発明の他の対象は、H₂O₂供給オキシダーゼ、
発色系、緩衝剤及び場合によつては補酵素を含有
するH₂O₂の側色的測定の感度及び検量性を改善
するための試薬において、このものがスーパーオ
キシドジスムターゼを含有することを特徴とする
前記試薬である。 方法に関して上になされた記載は該試薬の組成
についても同様に適用される。血清成分の分析の
場合には、本発明による試薬に、さらに、脂肪血
症試料をバツクグラウンドの濁りによる妨害なし
に測定できるように、例えば非イオン界面活性
剤、Na−コレート（Cholat）のような胆汁酸の
塩及びリパーゼE.C.3.1.1.3の混合物の形の明化剤
を加えるのが有利である。最後に該試薬は好まし
くはNa−アジドのような防腐剤、アスコルビン
酸及びビリルビンを含有する試料によつて惹起さ
れるH₂O₂の検出反応の妨害を除去するための薬
剤すなわちアスコルベートオキシダーゼ及びカリ
ウムフエロキシアニド、ならびに少量のEDTA
のような重金属錯形成剤も含有することができ
る。これらの物質、発色系の成分及び緩衝剤の量
割合及び濃度は公知試薬の量割合及び濃度に等し
いので、ここではさらに詳述する必要はない。 また本発明による試薬は、不活性の、場合によ
り多層の固体支持体物質上に存在してもよい。有
利にはテスト紙上に含浸されて存在しており、所
謂“乾式化学的”分析を許す。 本発明による添加物によつて、H₂O₂の検出感
度は、特に有利な、トリンダータイプの発色系の
場合には、約22〜34％増大させることができ（使
用されるオキシダーゼ反応及び当該分析試薬の種
類に応じる）、同時に検量線をつくる際の軸部分
の出現（トリンダータイプの指示薬及びカツプリ
ングパートナーとしてMBTH又はMBTH−Ｓな
らびにアリニン誘導体を含む指示薬系の場合）
は、回避することができるか又は少なくとも分析
的にもはや問題にならない程度にまで減少させる
ことができる。 次に本発明を、実施例により詳述する（図面参
照）。 実施例 例 １ クレアチニンの完全酵素的測定の際のH₂O₂検
出の改善 (a) 発色試薬： TES・KOH（PH7.9） 100ｍmol／ NaCl 150 〃 ４−アミノアンチピリン 0.75 〃 ２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息
香酸 8.6 〃 カリウムフエロシアニド 10μmol／ EDAT 50 〃 クレアチニナーゼE.C.3.5.2.10 20U／ クレアチナーゼE.C.3.5.3.3 10U／ml サルコシン−ゴキシダーゼE.C.1.5.3.1
6.5 〃 ペルオキシダーゼE.C.1.11.1.7 2U／ml スーパーオキシドジスムターゼ
０〜150μｇ／ml （＝＾０〜600U／ml (b) 試験：Ｔ（温度）＝25℃、λ＝546nｍ、ｄ＝
1.0cm 【表】 第１図のグラフ（実線）は、発色試薬中に含有
されたスーパーオキシドジスムターゼの活性
（０、２、５、10、50、100、200及び500U／ml）
に対する検量線の勾配の依存関係を示す。グラフ
から判るように、スーパーオキシドジスムターゼ
を含まない試薬に対して試薬中のスーパーオキシ
ドジスムターゼの濃度約50U／mlから、約31％の
H₂O₂検出感度勾配を有する平坦域が得られる。
成程150μｇ／mlを越えるスーパーオキシドジス
ムターゼ濃度を増大させることは容易に可能であ
るが、達成できる最大感度勾配に関する改善はな
く、従つて経済的観点から見て好ましくない。ス
ーパーオキシドジスムターゼを添加しない試薬に
関するＹ軸の負の部分（検量線）は0.015吸光度
単位であつたが、50〜500U／mlのスーパーオキ
シドジスムターゼ活性を有する試薬の場合には
0.002吸光度単位にすぎなかつた。 発色剤として２，４，６−トリブロム−３−ヒ
ドロキシ安息香酸の代りに相応のトリヨード化合
物を使用する場合にも、結果は変らない。 前記の発色試薬においてクレアチニナーゼのみ
又はクレアチニナーゼ及びクレアチナーゼを省略
する場合にも、スーパーオキシドジスムターゼの
添加による本発明による効果が失われずに、クレ
アチン及びサルコシンの測定が可能である。 例 ２ クレアチニンの酵素的測定の際のH₂O₂検出の
改善 (a) 発色試薬： 例１から得られる試薬と同様。 さらに明化剤として0.25％ｎ−デカノール−
ポリグリコールエーテル〔ルテンゾール
（Lutensol ）ON50〕、Na−コレート５ｍ
mol／及びリパーゼ〔カンジダ・シリンドラ
シア（Candida cylindracea）起源〕2U／mlを
加えた。 (b) 試験： 例１、(b)と同様の試験及び測定の評価。測定
結果は第１図（断面− −、三角形としての測
定点）に図示してある。 例 ３ クレアチニンの酵素的測定の際のH₂O₂検出の
改善 (a) 発色試薬： 例２から得られる試薬(a)と同様。 TES緩衝剤の代りに燐酸カルシウム（PH7.8）
150ｍmol／を使用しかつNaClの添加を省略
した。 (b) 試験： 例１、(b)による試験及び測定評価。測定結果
は第１図（断線〓、十字としての測定点）に図
示してある。 例 ４ クレアチニンの酵素的測定の際のH₂O₂検出の
改善 (a) 発色試薬： 例３から得られる試薬(a)と同様。しかし４−
アミノアンチピリンの発色剤としてトリブロム
ヒドロキシ安息香酸の代りにＮ−エチル−Ｎ−
β−スルホエチル−ｍ−トルイジン（8.6ｍ
mol／）を使用した。試薬中のスーパーオキ
シドジスムターゼの活性は０及び200U／mlで
あつた。 (b) 試験： 例１、(b)により行つた、但しλ＝546nｍで
はなく、578nｍである。結果（検量線）は第
２図に図示してある。この色素指示薬系の感度
は成程、例１〜３の系の感度よりも低いけれど
も、この場合には、スーパーオキシドジスムタ
ーゼの添加はH₂O₂検出感度の明らかな増大を
もたらし（約17.3％）、かつスーパーオキシド
ジスムターゼを添加しない試薬で測定した、検
量線のＹ軸部分（−0.013吸光度単位）を事実
上完全に消滅させる。 例 ５ 尿素の酵素的測定の際のH₂O₂検出の改善 (a) 発色試薬： 燐酸カリウム（PH8.0） 100ｍmol／ ２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息
香酸 7.5 〃 ４−アミノアンチピリン 0.2 〃 カリウムフエロシアニド 50μmol／ EDTA １ｍmol／ ｎ−デカノールポリグリコールエーテル（ルテ
ンゾール ON50） ５ｇ／ Na−コレート ７ｍmol／ ウリカーゼE.C.1.7.3.3 1U／ml ペルオキシダーゼE.C.1.11.1.7 ３ 〃 リパーゼ（C.シリンドラシア起源）E.C.3.1.1.3
２ 〃 スーパーオキシドジスムターゼ
０〜500 〃 (b) 試験 Ｔ＝25℃、λ＝546nｍ、ｄ＝1.0cm 【表】 第３図は、発色試薬中で使用されたスーパーオ
キシドジスムターゼの量（０、２、５、10、50、
100、200及び500U／ml）に対する前記勾配（△
Ｅ／１mg／dl尿酸）の依存関係を示す。 例１〜４の場合と同様に、尿酸の発色試薬中で
は、４−アミノアンチピリンの発色剤としてトリ
ブロムヒドロキシ安息香酸の代りに相応のトリヨ
ード化合物又はＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチ
ル−ｍ−トルイジンのようなアニリンを使用して
も、スーパーオキシドジスムターゼの添加による
H₂O₂検出の改善が失われない。 例 ６ シユウ酸の酵素的測定の際色素指示薬系として
オキサレートオキシダーゼE.C.1.2.3.4及びペルオ
キシダーゼ／MBTH−Ｓ／Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン混合物を用いてH₂O₂検出を改善すること。 (a) 試薬： １ コハク酸緩衝液（0.5ｍmol／；PH＝
3.8）：コハク酸二ナトリウム塩（６水和物）
6.75ｇを蒸留水400ml中に溶かし、2NHClで
PH3.8（25℃）に調節しかつ補充して500mlに
する。 ２ MBTH−Ｓ ３ Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（0.21mol／
）：0.5N HCl3.9ml中にジメチルアニリン
100μを溶解する。 ３ ペルオキシダーゼ； 蒸留水１ml中に１mg（＝約100U）を溶か
す。 ４ オキサレートオキシダーゼ： 蒸留水１ml中に0.3U／mgを有する酵素3.33
mgを溶かす。 ５ 牛赤血球からのスーパーオキシドジスムタ
ーゼ（純粋酵素）： 蒸留水１ml中に12.5mgを溶かし、これから
蒸留水１ml当り酵素0.125、0.250、2.50及び
5.00mgに稀釈したものを製造する。 ６ オキサレート溶液： シユウ酸を水に溶かして１、２、３、４、
５及び６mg／dl（100％遊離に対して）の濃
度にする。 (b) 発色基礎試薬： (a)１のコハク酸緩衝剤100ml中にMBTH−
S2.3ｇを溶かし、次に(a)３のジメチルアニリン
溶液4μを加えて、十分に混合する。この混
合物の各10mlにH₂O0.10ml又は(a)５のスーパー
オキシドジスムターゼ溶液を加え（最終濃度：
スーパーオキシドジスムターゼ1.25、2.50、
25.0、50.0及び125.0μｇ／ml基礎試薬）、混合す
る。 (c) 試験： Ｔ＝37℃、λ＝578nｍ、ｄ＝1.0cm 【表】 種々の量のスーパーオキシドジスムターゼを
加えた発色基礎試薬を用いて得られた検量線の
評価によつて、Ｙ軸部分（Ｙ軸：吸光度単位、
Ｘ軸：シユウ酸試料濃度）の除去に対するスー
パーオキシドジスムターゼの明瞭な正の影響が
明らかになつた。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は例１〜３に関するスーパーオキシドジ
スムターゼの活性とH₂O₂検出感度との関係を示
すグラフ、第２図は例４による発色系の感度を示
すグラフ、第３図は例５に関する第１図と同様な
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ H₂O₂供給オキシダーゼによつて生成される
   H₂O₂の測色的測定の感度及び検量性を、発色系
   を加えかつ形成された色素を測定することによつ
   て改善する方法において、H₂O₂生成系及びH₂O₂
   を測定するための発色系を含有する試薬溶液にス
   ーパーオキシドジスムターゼE.C.1.15.1.1を加え
   ることを特徴とする前記方法。 ２ スーパーオキシドジスムターゼ10〜150μ
   ｇ／ml試薬溶液を加える特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３ スーパーオキシドジスムターゼ25〜75μｇ／
   ml試薬溶液を加える特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４ CU−、Zn−スーパーオキシドジスムターゼ
   を使用する特許請求の範囲第１項から第３項まで
   のいづれか１項記載の方法。 ５ 発色系として、ペルオキシダーゼ、フエノー
   ル又はフエノール−又はアニリン誘導体及び４−
   アミノアンチピリンを含有するトリンダータイプ
   の発色系を使用する特許請求の範囲第１項から第
   ４項までのいづれか１項記載の方法。 ６ ペルオキシダーゼ、アニリン誘導体及び
   MBTH又はMBTH−Ｓから成る発色系を使用す
   る特許請求の範囲第１項から第４項までのいづれ
   か１項記載の方法。 ７ フエノール誘導体として、２，４，６−トリ
   ヨード−３−ヒドロキシ安息香酸又は相応のトリ
   ブロム化合物を使用する特許請求の範囲第５項記
   載の方法。 ８ アニリン誘導体としてＮ−エチル−Ｎ−β−
   スルホエチル−ｍ−トリイジン又はＮ−エチル−
   Ｎ−β−β−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン
   を使用する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９ アニリン誘導体として、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
   ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸、Ｎ−
   エチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｍ−トルイジン
   又はＮ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−ｍ
   −トルイジンを使用する特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 １０ H₂O₂供給オキダーゼとして、サルコシン
   オキシダーゼ、ウリカーゼ又はオキサレートオキ
   シダーゼを使用する特許請求の範囲第１項から第
   ９項までのいづれか１項記載の方法。 １１ H₂O₂供給オキシダーゼ、発色系、緩衝剤
   及び場合により補酵素を含有する、H₂O₂の測色
   的測定の感度及び検量性を改善するための試薬に
   おいて、該試薬がスーパーオキシドジスムターゼ
   を含有することを特徴とする前記試薬。 １２ CU−、Zn−スーパーオキシドジスムター
   ゼを含有する特許請求の範囲第１１項記載の試
   薬。 １３ 発色系がトリンダータイプであつて、ペル
   オキシダーゼ、フエノール又はフエノール−又は
   アニリン誘導体及び４−アミノアンチピリンを含
   有する特許請求の範囲第１１項又は第１２項記載
   の試薬。 １４ 発色系がペルオキシダーゼ、アニリン誘導
   体及びMBTH又はMBTH−Ｓを含有する特許請
   求の範囲第１１項又は第１２項記載の試薬。 １５ フエノール誘導体として、２，４，６−ト
   リヨード−３−ヒドロキシ安息香酸又は相応のト
   リブロム化合物を含有する特許請求の範囲第１３
   項記載の試薬。 １６ アニリン誘導体として、Ｎ−エチル−Ｎ−
   β−スルホエチル−ｍ−トルイジン又はＮ−エチ
   ル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン
   を含有する特許請求の範囲第１３項記載の試薬。 １７ アニリン誘導体として、Ｎ，Ｎ−ジメチル
   アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸、Ｎ
   −エチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｍ−トルイジ
   ン又はＮ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−
   ｍ−トルイジンを含有する特許請求の範囲第１４
   項記載の試薬。 １８ H₂O供給オキシダーゼとして、サルコシ
   ンオキシダーゼ、ウリカーゼ又はオキサレートオ
   キシダーゼを含有する特許請求の範囲第１１項か
   ら第１７項までのいづれか１項記載の試薬。 １９ スーパーオキシドジスムターゼ10〜150μ
   ｇ／mlを含有する特許請求の範囲第１１項から第
   １７項までのいづれか１項記載の試薬。 ２０ さらに、明化剤、防腐剤、アスコルビン酸
   又はビリルビンによる妨害を除去するための薬剤
   及び重金属錯形成体の群からの１種以上の物質を
   含有する特許請求の範囲第１１項から第１４項ま
   でのいづれか１項記載の試薬。 ２１ 該試薬が不活性の、場合により多層の固体
   支持物質上に存在する特許請求の範囲第１１項か
   ら第２０項までのいづれか１項記載の試薬。