KR100312056B1 - 아스코르브산의정량방법및정량용시약 - Google Patents

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Abstract

시료 중의 아스코르브산을 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 아스코르베이트 산화 효소 (이하, 본 효소를 "ASOD" 라 함)를 이용하여 정량하는 방법으로서, 수성 매체 중, ASOD 의 존재 하, 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응과 생성된 과산화수소와 색원체를 퍼옥시다아제의 존재 하에 반응시켜 색소를 생성하는 반응을 동일 반응계에서 실행시켜, 생성되는 색소를 정량하는 것을 특징으로 하는 아스코르브산의 정량 방법.
또한, 상기 수성 매체 중에 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제를 존재시켜 효소 반응을 수행하기 위한, 저농도의 총 아스코르브산을 정량할 수 있는 총 아스코르브산의 정량 방법.
또한, 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제로 상기 시료 중의 산화형 아스코르브산을 환원한 후, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물의 존재 하에 효소 반응을 실시시키는 것에 의한 총아스코르브산의 정량 방법.
상기 정량 방법에 사용하는 아스코르브산 정량용 시약 및 아스코르브산 정량용 키트.
본 발명 방법들은 임상 검사의 스크리닝에도 적용할 수 있고, 또한 다수검체를 동시에 측정할 수 있으며, 간편하다.

Description

아스코르브산의 정량 방법 및 정량용 시약 {METHODS AND REAGENTS FOR QUANTITATIVELY DETERMINING ASCORBIC ACID}
아스코르브산은 비타민 C 로도 불리며, 생체 내에서 부족하면 괴혈병 등을 일으키는 중요한 비타민이다. 또한, 근년 아스코르브산과 노화와의 관계가 주목되고 있다. 이 때문에 아스코르브산의 정량은 중요하다.
종래, 아스코르브산을 정량하는 방법으로, 화학적인 측정방법인 히드라진법 등, 기기분석방법인 고속액체 크로마토그래피법 등이 알려져 있지만, 조작이 번잡하고 정량에 많은 시간을 필요로 하는 등의 문제가 있다.
근년, 산소의 존재 하, 환원형 아스코르브산을 산화하여 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 아스코르브산 산화 효소 (이하, 본 효소를 "ASOD" 라 함) 가 발견되었다. 시료 중의 아스코르브산은 이 효소 반응에 의해 소비되는 산소량 또는 생성되는 과산화수소량을 측정함으로써, 정량할 수 있는 것이 알려져 있다 [JP-A-209770/94, JP-A-23971/96 (EP-A-68-2116)].
JP-A-209770/94 는 과산화수소의 구체적인 정량법으로서 화학적인 측정방법을 개시하고 있지만, 퍼옥시다아제를 이용하는 방법을 개시하고 있지 않다. JP-A-23971/96 (EP-A-682116) 은 과산화수소의 구체적인 측정방법으로서, 퍼옥시다아제의 존재 하에 과산화수소와 페놀 등의 수소 공여체 또는 트린다 시약 및 4-아미노안티피린 등의 커플러 등으로 이루어지는 색원체를 반응시켜 색소를 생성시켜, 생성 색소에 따라 착색한 반응액의 흡광도를 측정하는 방법을 개시하고 있다. 이 방법은 과산화수소의 생성 반응이 종료되고, 환원형 아스코르브산이 산화형 아스코르브산으로 완전히 변환된 후, 생성된 과산화수소의 정량을 실행하는 방법이다.
일반적으로, 아스코르브산이나 디티오트레이톨 등의 환원성 물질의 존재 하에서는 퍼옥시다아제를 이용하는 색소의 생성 반응은 일어나기 어렵다는 것이 알려져 있다. 이 때문에 시료 중의 환원형 아스코르브산을 ASOD 로 완전히 산화하여 과산화수소의 생성완료 후에, 색소 생성 반응을 일으킬 필요가 있다. 이 방법에서는 효소 반응을 이용하는 것과 상관없이, 화학적으로 불안정한 과산화수소를 일단 반응액 중에 축적할 필요가 있다.
생체 시료에는 요소, 카타라아제, 비릴빈, 헤모글로빈 등의 환원성 물질이 존재 하여, 생성되는 과산화수소가 환원성 물질에 의해 소비되기 때문에, 과산화수소를 축적하는 상기 방법에 의해 재현성이 있는 정확한 데이터는 얻어지지 않고, 조작이 번잡하여 측정에 많은 시간을 필요로 한다.
또한, 생채내에는 환원형 아스코르브산과 함께 산화형 아스코르브산도 존재 하고 있어, 이 환원형 아스코르브산과 산화형 아스코르브산을 합친 총 아스코르브산의 정량도 임상적으로 중요하다.
산화형 아스코르브산은 디티오트레이톨 등의 환원제에 의해 환원형 아스코르브산으로 변환된 후, 환원형 아스코르브산을 ASOD를 이용하여 총 아스코르브산을 정량할 수 있다. 그러나, 생성되는 과산화수소를 퍼옥시다아제의 존재 하에 색원체와 반응시켜 생성 색소를 정량하는 방법에서는 색원체가 공존하는 환원제의 영향을 받아 색소가 생성되기 어려워진다. 이 문제를 해소하기 위해서는 과산화수소 정량에 앞서 반응액 중에 잔존하는 환원제를 반응액으로부터 소거할 필요가 있는데, 조작이 복잡해진다.
시료 중의 성분 분석에 있어서, 이 성분을 기질로 하는 산화 효소를 이용하여 과산화수소를 생성시키며 (이하, 과산화수소 생성 반응이라 함) , 과산화수소와 색원체로부터 색소를 생성하는 반응 (이하, 색소 생성 반응이라 함)을 동일 반응계에서 실시하는 방법이 JP-A-29297/82(USP4384042) 및 JP-A-218069/85 에 개시되어 있지만, 환원형 아스코르브산을 ASOD 로 산화하여, 생성된 과산화수소와 색원체를 반응시켜 색소를 생성시키는 반응을 동일 반응계에서 정량하는 방법에 대해서는 이들의 공보는 아무 것도 개시되어 있지 않다.
상기와 같이 색소 생성 반응에 있어서 아스코르브산 등의 환원성 물질의 존재 하에서는 색소가 생성되기 어려우므로, 과산화수소 생성 반응과 색소 생성 반응을 동일 반응계에서 실시하는 것은 불가능하다고 생각되었다. 그러나 놀랍게도, 환원성 물질의 존재 하에서라도 특정의 조건하에서 영향을 받지않고 정량할 수 있는 색원체가 존재한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 아스코르브산의 정량 방법, 정량용 시약 및 정량용 키트에 관한 것이다.
도 1 은 시약액 A-1을 이용하여 측정한 경우의 환원형 아스코르브산 농도와 흡광도의 관계를 나타낸 검량선이다.
도 2 는 시약액 A-2를 이용하여 측정한 경우의 환원형 아스코르브산 농도와 흡광도의 관계를 나타낸 검량선이다.
도 3 은 시약액 B-1을 이용하여 측정한 경우의 환원형 아스코르브산 농도와 흡광도의 관계를 나타낸 검량선이다.
본 발명의 목적은 임상 검사의 스크리닝에도 적용할 수 있고, 또한 다수의 검체를 동시에 측정할 수 있는 보다 간편한 아스코르브산의 정량 방법, 아스코르브산 정량용 시약 및 아스코르브산 정량용 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명에 의하면, 시료 중의 아스코르브산을 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 아스코르브산 산화 효소 (이하, 본 효소를 "ASOD" 라 함)를 이용하여 정량하는 방법에 있어서, 수성 매체중, ASOD 의 존재 하, 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응과 생성된 과산화수소와 색원체를 퍼옥시다아제의 존재 하에 반응시켜 색소를 생성하는 반응을 동일 반응계에서 실행시켜, 생성되는 색소를 정량함으로써, 아스코르브산을 정량할 수 있다 (이하, 정량 방법 A 라 함).
시료 중에 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제를 존재시켜 상기 정량 방법 A를 적용함으로써, 시료 중의 총 아스코르브산을 정량할 수 있다. 또한, 이 방법에서, 효소 반응에 의해 생성된 산화형 아스코르브산이 다시 환원제로 환원되어 환원형 아스코르브산으로 변환하므로 산화와 환원이 반복된다. 따라서, 비교적 저농도의 총 아스코르브산을 용이하게 정량할 수 있다 (이하, 정량 방법 B 라 함).
시료 중의 산화형 아스코르브산을 환원제로 환원한 후, 잔존하는 환원제의 환원력을 상실시킨 시료에 대하여, 상기 정량 방법 A를 적용함으로써, 시료 중의총 아스코르브산을 정량할 수 있다 (이하, 정량 방법 C 라 함).
본 발명에 의하면, ASOD, 색원체 및 퍼옥시다아제 성분의 조합으로 이루어지는 아스코르브산 정량용 시약 (이하, 정량 방법 A 라 함) 이 제공된다.
정량 시약 A 에, 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제를 더한 성분의 조합으로 이루어지는 아스코르브산 정량용 시약 (이하, 정량 시약 B 라 함) 이 제공된다.
또한 정량 시약 B 에, 환원제의 환원 능력을 상실시킬 수 있는 화합물을 더한 성분의 조합으로 이루어지는 아스코르브산 정량용 시약 (이하, 정량 시약 C 라 함) 이 제공된다.
본 명세서에서, 상기 정량 시약 A, B 또는 C 는 이들을 구성하는 성분의 임의의 2 또는 그 이상의 성분이 조성물을 구성하고 있어도 된다.
또한 본 발명에 의하면, 아스코르브산 정량에 편리한 아스코르브산 정량용 키트가 제공된다.
본 발명의 정량용 시약은 소위 일 시약계에서 이용할 수 있지만, 시약의 보존안정성, 조작성, 시약의 공급 형태 등에 따라, 다 시약으로 이루어지는 키트로 할 수 있다. 키트는 각 단일의 성분 및 임의의 2 이상의 성분의 조합으로 이루어지는 조성물에서 선택하여, 필요한 성분을 구성하는 키트를 준비하면 된다. 조성물로 하는 것이 바람직하지 않은 조합, 예를 들면 환원제와 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물의 조합 등은 피해야 한다. 키트의 예가 다음에 나와 있다.
정량 시약 A 에 대하여, 성분을 ASOD 및 퍼옥시다아제로 이루어지는 시약과색원체로 이루어지는 시약으로 이루어지는 키트로 할 수 있다 (이하, 키트 A 라 함).
정량 시약 B 에 대하여, 색원체 및 환원제로 이루어지는 시약과 ASOD 및 퍼옥시다아제로 이루어지는 시약으로 이루어지는 키트로 할 수 있다 (이하, 키트 B 라 함).
정량 시약 C 의 성분에 대하여, 색원체 및 환원제로 이루어지는 시약과 ASOD, 퍼옥시다아제 및 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물로 이루어지는 시약으로 이루어지는 키트로 할 수 있다 (이하, 키트 C 라 함).
정량용 시약 및 이들의 키트를 구성하는 각 시약은 건조품이어도 되지만, 시약조제를 생략하기 위해서는 미리 수성 매체를 첨가한 액상 시약으로 할 수도 있다.
상기 어느 정량 시약 또는 키트 중의 시약에도, 필요에 따라서 완충제, 효소의 부활제, 방부제, 안정화제 및 계면활성제 등을 적당히 추가할 수 있다. 또한, 이들의 성분을 정량할 때 반응액 중에 존재시킬 수 있다.
이하, 본 발명에 의한 환원형 아스코르브산의 구체적인 정량 방법에 대하여 설명한다.
정량 방법 A 에서는 환원형 아스코르브산을 함유하는 시료, ASOD, 색원체 및 퍼옥시다아제를 수성 매체, 예를 들면 완충액 중에 더하여, 혼합물을 20 ∼ 50 ℃에서, 1 ∼ 15 분간 반응시킨다. 생성된 색소에 의해 착색된 반응액의 흡광도의 변화를 측정하여, 미리 공지된 농도의 환원형 아스코르브산 함유액을 이용하여작성한 검량선으로부터 아스코르브산량을 구할 수 있다.
ASOD 는 산소를 기질로 하지만, 통상 수성 매체에 산소가 존재 하므로, 산소공급은 특별히 필요로 하지 않는다. 그러나 반응에 앞서, 환원형 아스코르브산, 색원체, ASOD 및 퍼옥시다아제 등을 함유하는 반응액을 진탕 또는 교반하는 것이 바람직하다.
정량 방법 B 에 있어서, 아스코르브산을 함유하는 시료에 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제가 더해진다. 이어서, 반응 혼합물에 대하여 정량 방법 A를 실행함으로써, 시료 중의 환원형 및 산화형 아스코르브산의 총량을 정량할 수 있다.
보다 간편하게, 이 방법을 실시하는데에는 아스코르브산을 함유하는 시료에 정량 시약 B 또는 키트 B를 첨가하고, 혼합물을 수성 매체 중 20 ∼ 50 ℃에서, 3 ∼ 30 분간 반응시킨다. 생성된 색소에 의해 착색된 반응액의 흡광도의 변화를 측정하여, 미리 작성한 검량선으로부터 아스코르브산량을 보다 간편하게 구할 수 있다.
정량 방법 B 에 있어서는 반응 중, 산화형 아스코르브산이 환원제로 환원형 아스코르브산으로 환원되고, 이어서 효소 반응에 의해 산화형 아스코르브산으로 변환된다. 따라서 산화 반응과 환원 반응이 반복되어, 보다 고감도로 아스코르브산을 정량할 수 있다. 이 방법에 의해, 아스코르브산의 함유량이 낮은 시료의 총 아스코르브산을 정량할 수 있다.
정량 방법 C 는 아스코르브산을 함유하는 시료에 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제를 첨가하고, 20 ∼ 50 ℃에서, 1 ∼ 15 분간 반응시켜 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원한다. 이어서 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물을 첨가하고, 20 ∼ 50 ℃에서, 1 ∼ 15 분간 반응시켜 잔존하는 환원제의 환원력을 상실시킨 후, 정량 방법 A를 실행함으로써, 시료 중의 환원형 및 산화형 아스코르브산의 총량을 정량할 수 있다.
이 정량 방법을 실행할 때에, 환원제의 환원 능력을 상실시키는 반응은 정량 방법 A 의 방법에 의한 환원형 아스코르브산의 정량 반응과 동일 반응계에서 실시할 수 있다. 즉, 키트 C 의 색원체 및 환원제로 이루어지는 시약을 아스코르브산 함유 시료에 더하여 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원하고, 이어서 키트 C 의 다른 시약을 더하여 효소 반응을 일으켜, 반응액의 흡광도의 변화를 측정함으로써, 총 아스코르브산을 정량할 수 있다.
정색 반응 (呈色反應)에 의해 발생하는 색소의 정량은 예를 들면 시판하는 분광광도계를 이용하여, 400 ∼ 750 ㎚ 의 파장, 바람직하게는 이용하는 색원체의 극대 흡수파장으로 시약 블랭크를 대조로서 흡광도의 변화, 통상 흡광도의 증가를 측정함으로써, 실시된다. 공지된 농도를 함유하는 환원형 아스코르브산 용액을 이용하여, 상기와 동일하게 반응시켜, 흡광도의 변화를 측정하여, 검량선을 작성한다. 미지량의 환원형 아스코르브산 또는 환원형 아스코르브산과 산화형 아스코르브산의 총량은 이 검량선을 이용하여 정량할 수 있다.
반응액 중의 각 성분은 다음에 나와 있는 농도로 이용된다.
색원체는 반응액 중의 환원형 아스코르브산 농도와 등몰 농도 이상, 바람직하게는 1 ∼ 10,000 배 농도, 보다 바람직하게는 10 ∼ 1,000 배 농도가 되도록 조제된다. 통상 0.01 ∼ 100 mM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 mM 의 농도로 이용된다.
아스코르브산 산화 효소 (ASOD) 및 퍼옥시다아제는 각각 0.1 ∼ 100 U/㎖, 바람직하게는 0.2 ∼ 50 U/㎖ 의 농도로 이용된다.
환원제는 산화형 아스코르브산 농도와 등몰 농도 이상, 바람직하게는 1 ∼ 10,000 배, 보다 바람직하게는 10 ∼ 100 배 농도로 이용되고, 통상 0.01 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 10 mM 의 농도로 이용된다.
완충제는 1 ∼ 2000 mM, 바람직하게는 5 ∼ 1000 mM 의 농도로 이용된다. 완충액의 pH 는 효소 및 각 시약의 안정성 및 반응조건 등으로 결정되지만, pH 2 ∼ 10, 바람직하게는 pH 3 ∼ 9 이다.
환원제의 환원 능력을 상실시킬 수 있는 화합물은 산화형 아스코르브산을 환원하는데 이용한 환원제 농도의 1 ∼ 10 배, 바람직하게는 2 ∼ 5 배의 농도로 이용된다.
이들 정량용 시약 및 이들의 키트를 구성하는 각 시약 중의 각 성분의 함량 또는 농도는 각 성분의 구성 및 사용 방법에 따라 변화시킬 수 있고, 각 성분이 반응액을 조제하기 위해 수성 매체에 첨가된 시점 또는 그 자신이 반응액으로 조제된 시점에서 상기의 바람직한 농도가 되도록 조정된다.
시료 중의 산화형 아스코르브산량은 환원형 및 산화형 아스코르브산 총량에서 환원형 아스코르브산량을 빼냄으로써 구할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 색원체로서는 과산화수소의 정량 반응에서 환원성 물질의 영향을 받기 어려운 색원체라면 어느것이나 이용가능하나, 바람직한 화합물로서 하기 화학식 I 또는 화학식 II 으로 표시되는 화합물을 예시할 수 있다.
{화학식 I 및 화학식 II 중, Y 는 수소원자 또는 화학식 III :
(식 중, Z 는 산소 또는 황을 나타내고, X 는 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 모노치환아미노 또는 비치환아미노를 나타낸다)를 나타내고, R1은 히드록시, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내고, R2는 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알케닐, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내며, R3, R4,R5및 R6은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬, 알케닐, 알카노일, 알로일, 아릴, 할로겐, 니트로, 술포, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII 또는 화학식 VIII :
[화학식 IV ∼ 화학식 VIII 중, A1은 알킬렌을 나타내고, A2는 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알케닐, 지환식 알킬, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내고, B1, B2, B3, B4, B5및 B6은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬, 알케닐, 알카노일, 알로일, 아릴, 할로겐, 니트로, 술포, 카르복시, 히드록시, 알콕시 또는 히드록시 치환알킬을 나타낸다] 로 나타나는 기를 표시하거나, R3와 R4또는 R5와 R6은 일체로 되어 알케닐렌을 형성하여도 되며, J 는 산소, 황, 화학식 IX 또는 화학식 XI :
[화학식 IX 및 화학식 XI 중, R7및 R8은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬 또는 알케닐을 나타낸다] 로 나타나는 기를 나타낸다.}
상기 각 기의 정의에서 알킬 및 알콕시, 히드록시 치환 알킬에서의 알킬 부분은 직쇄 또는 측쇄의 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 이소아밀, 헥실 등을 포함한다. 히드록시 치환알킬의 히드록시치환수는 1 ∼ 2를 나타낸다.
알카노일은 탄소수 1 ∼ 6 의 알카노일, 예를 들면, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 이소발레릴, 피바로일 등을 포함한다.
지환식 알킬은 탄소수 3 ∼ 8 의 지환식 알킬, 예를 들면 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등을 포함한다. 알케닐은 직쇄 또는 측쇄의 탄소수 2 ∼ 6 의 알케닐, 예를 들면, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 포함한다. 아릴 및 알로일에서의 아릴 부분의 예는 페닐, 나프틸 등을 포함한다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬, 요오드 의 각 원자를 나타낸다.
알킬렌은 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬렌, 예를 들면 메틸렌, 에틸렌, 메틸메틸렌, 프로필렌, 메틸에틸렌, 에틸메틸렌, 부틸렌, 1-메틸프로필렌, 2-메틸프로필렌, 에틸에틸렌프로필메틸렌, 펜틸렌, 메틸부틸렌, 에틸부틸렌, 부틸메틸렌, 헥실렌 등을 포함한다.
알케닐렌은 탄소수 3 ∼ 4 의 알케닐렌, 예를 들면 -CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH- 등을 포함한다.
R1, R2및 A2의 정의 중의 모노 또는 디치환아미노의 치환기의 예는 치환 또는 비치환 알킬, 아릴, 지환식 알킬, 알카노일, 알로일, 알케닐, 알콕시카르보닐, 알콕시, 알콕시술포닐, 카르바모일 등을 포함한다.
알킬, 알카노일, 알콕시, 아릴, 알로일, 지환식 알킬 및 알케닐은 상기와 동일 의미이다. 알콕시카르보닐 및 알콕시술포닐의 알킬 부분은 상기의 알킬과 동일 의미이다.
치환 알킬은 동일하거나 상이한 1 ∼ 3 의 치환기를 갖고, 상기 치환기의 예는 히드록시, 술포, 아릴, 알카노일, 알로일 등을 포함한다.
아릴, 알카노일, 알로일은 상기와 동일 의미이다.
X 의 정의 중의 모노치환 아미노의 치환기의 예는 지환식 알킬, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴 등을 포함한다. 지환식 알킬, 알킬, 아릴은 상기와 동일 의미이다.
치환알킬은 동일하거나 상이한 1 ∼ 2 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐아미노, 알콕시카르보닐아미노페닐, 알콕시카르보닐아미노알킬페닐 등을 포함한다. 상기 치환기에서의 알콕시의 알킬 부분은 상기와 동일 의미로, 알콕시카르보닐아미노알킬페닐의 알킬 부분은 상기의 알킬렌과 동일 의미이다.
치환 아릴은 동일하거나 상이한 1 ∼ 2 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 할로겐, 아미노, 술포, 알킬, 알콕시, 알카노일, 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐아미노, 알콕시카르보닐아미노알킬 등을 포함한다. 알킬, 알콕시, 알카노일,알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐아미노, 알콕시카르보닐아미노알킬 및 할로겐은 상기와 동일 의미이다.
화학식 I 및 화학식 II 로 표시되는 화합물의 구체예는 예를 들면 JP-A-29297/82 (USP4384042), JP-A-218069/85 및 JP-A-128799/89, JP-A-145352/81 (USP4851353), JP-A-182361/84 (USP4916058) 에 기재되어 있는 화합물을 포함한다.
화학식 I 및 화학식 II 로 표시되는 화합물 중에서 특히 바람직한 화합물은 화학식 I 에 포함되는 화합물, 예를 들면 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (이하, CCAP 라고 약칭함), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (이하, MCDP 라고 약칭함) 등, 화학식 II 에 포함되는 화합물, 예를 들면 N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (이하, DA-64 라고 약칭함), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (이하, BCMA 라고 약칭함) 등을 포함한다. 이들의 색원체는 예를 들면 JP-A-57-29297 (USP4384042) 에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있다.
ASOD 는 예를 들면 유페니실륨 (Eupenicillium) 속 (JP-A-23971/96 호 공보), 트리코데르마 (Trichoderma) 속 또는 모르티에렐라 (Mortierella) 속 (JP-A-209770/94 호 공보), 프로우로타스 (Pleurotus) 속 [저널·오브·바이올로지컬·케미스트리 (J.Biol.Chem),271, 3105 (1996)] 등의 미생물유래의 아스코르브산 산화 효소, 식물유래 또는 유전자 재조합균 유래의 것 등을 사용할 수 있다. 또한, 시판품 [예를 들면, 텐노제약(주)제]을 입수할 수 있다.
퍼옥시다아제는 미생물, 동물, 식물에서 추출하여 이용할 수 있는데, 시판품을 이용할 수 있다.
산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제는 SH 기 함유 화합물, 포스핀류, 디포스판류, 아황산염, 아2티온산염, 2가철염, 수소화붕소염 등을 포함한다.
SH 기 함유 화합물은 예를 들면, N- 아세틸시스테인, 환원형시스테인, 환원형 글루타티온 등의 아미노산 또는 펩티드류, 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리스리톨, 메르캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 알코올류, 티오글리콜산 등의 카르복실산류, 티오글루코스 등의 당류, 브롬화-2-아미노에틸이소티오우로늄 등의 티오우로늄염류를 함유한다.
포스핀류는 치환 또는 비치환의 포스핀을 포함한다. 비치환 포스핀은 PH3(포스핀)을 의미한다.
치환 포스핀은 동일하거나 상이한 1 ∼ 3 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환 아미노, 치환 또는 비치환 카르바모일, 치환 또는 비치환 알콕시, 치환 또는 비치환 알카노일, 치환 또는 비치환 알로일, 치환 또는 비치환 술포 등을 포함한다.
치환수 1 의 것을 제 1 포스핀류, 치환수 2 의 것을 제 2 포스핀류, 치환수 3 의 것을 제 3 포스핀류라 한다.
디포스판류의 예는 치환 또는 비치환의 디포스판을 포함한다. 비치환 포스판은 P2H4(디포스판)을 의미한다.
치환디포스판은 동일하거나 상이한 1 ∼ 4 의 치환기를 갖고, 상기 치환기의 예는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 방향족 복소환기, 치환 또는 비치환 아미노, 치환 또는 비치환 카르바모일, 치환 또는 비치환 알콕시, 치환 또는 비치환 알카노일, 치환 또는 비치환 알로일, 치환 또는 비치환 술포 등을 포함한다.
포스핀류 및 포스판류의 치환기로서의, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 알콕시 및, 치환 또는 비치환 알카노일의 알킬 부분 및 치환 또는 비치환아릴 및 치환 또는 비치환 알로일의 아릴 부분은 상기의 알킬 및 아릴과 동일 의미이다.
포스핀류 및 디포스판류의 치환기로서의, 치환 또는 비치환 방향족 복소환기의 방향족 복소환기의 예는 피리딜, 피리미디닐, 나프티리디닐, 푸릴, 티에닐, 피라졸리닐, 이미다졸릴, 벤조푸릴, 디벤조푸릴 등을 포함한다.
치환알킬은 동일하거나 상이한 1 ∼ 3 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 아릴, 방향족 복소환기, 알콕시, 알카노일, 알로일, 아미노, 히드록시, 카르복시, 술포, 포스포, 시아노, 할로겐 등을 포함한다. 아릴, 방향족 복소환기, 알콕시, 알카노일, 알로일 및 할로겐은 각각 상기와 동일 의미를 나타낸다.
치환 아릴은 동일하거나 상이한 1 ∼ 5 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 알킬, 알콕시, 알카노일, 알로일, 카르복시, 알콕시카르보닐, 시아노, 아미노, 술포, 포스포, 할로겐 등을 포함한다. 알킬, 알콕시, 알카노일, 알로일, 알콕시카르보닐 및 할로겐은 각각 상기와 동일 의미이다. 치환 방향족 복소환기는 동일하거나 상이한 치환수 1 ∼ 3 의 치환기를 갖고, 상기 치환기는 상기의 치환아릴과 동일한 치환기를 함유한다.
치환아미노 또는 치환 카르바모일은 동일하거나 상이한 1 ∼ 2 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 상기한 바와 동일한 치환 또는 비치환의 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴 및 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기, 알카노일, 알로일, 알콕시카르보닐 등을 포함한다.
치환알콕시는 동일하거나 상이한 1 ∼ 2 의 치환기를 갖고, 이 치환기의 예는 아미노, 히드록시, 술포, 포스포, 시아노, 상기의 할로겐 등을 포함한다.
치환술포의 치환기의 예는 상기한 바와 동일한 치환 또는 비치환의 알킬, 치환 또는 비치환의 아릴, 치환 또는 비치환의 방향족 복소환기 등을 포함한다.
제 1 포스핀류의 예는 메틸포스핀, 에틸포스핀, 프로필포스핀, 이소부틸포스핀, 페닐포스핀, 2-나프틸포스핀, 2-벤조푸라닐포스핀, 2-포스피노에틸아민, 4-(포스피노메틸)이미다졸, 1,2,4-부탄트리일트리스(포스핀), (페닐술포닐)포스핀, 카르바모일포스핀 등을 포함한다.
제 2 포스핀류의 예는 디메틸포스핀, 디에틸포스핀, 디이소프로필포스핀, 디이소아밀포스핀, 디페닐포스핀, 3,3'-포스핀디일디프로피온산, 4,4'-포스핀디일디벤조산 등을 포함한다.
제 3 포스핀류의 예는 트리메틸포스핀, 트리에틸포스핀, 트리-n-부틸포스핀, 트리-n-헥실포스핀, 트리페닐포스핀, 메틸디페닐포스핀, 디메틸페닐포스핀, 포스핀트리일트리디메틸아민, 포스핀트리일트리디에틸아민, 트리스(2-메틸페닐)포스핀, 트리스(3-메틸페닐)포스핀, 트리스(4-메틸페닐)포스핀, 트리스(4-메톡시페닐)포스핀, 포스핀트리일트리아세트산, 3,3',3"-포스핀트리일트리프로피온산, 4,4',4"-포스핀트리일트리벤조산, 트리스(히드록시메틸)포스핀, 2,2',2"-포스핀트리일트리에틸아니드, 에틸(페닐)프로필포스핀아세틸디에틸포스핀 등을 포함한다.
아황산염, 아2티온산염의 염은 리튬, 칼륨, 나트륨 등의 알칼리금속염, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리토금속염 등을 포함한다.
2가철염은 할로겐화철, 황산철, 질산철 등을 포함한다. 할로겐은 상기와 동일 의미이다.
이들 환원제 중에서, SH 기 함유 화합물이 바람직하다.
환원제의 환원 능력을 상실시킬 수 있는 화합물로서, SH 시약, 산화물 등을 이용할 수 있는데, 이용하는 환원제의 종류에 따라 선택된다. 환원제로서 SH기 함유 화합물을 이용하는 경우는 예를 들면 산화제, 메르캅토형성제, 알킬화제 등의 SH 시약이 바람직하게 이용되고, 알킬화제가 특히 바람직하다.
산화제의 예는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 2,2'-디피리딜디술피드, 4티오산, 2,6-디클로로페놀인드페놀, 산화형 글루타치온 등을 포함하고, 메르캅토 형성제의 예는 p-메르크리벤조산, p-메리크리벤젠술폰산 등을 포함하며, 알킬화제의 예는 요오드아세트산, 요오드아세트아미드, N-에틸말레이미드 등을 포함한다. 산화물의 예는 요오드산칼륨 등의 요오드산염 등을 포함한다.
완충제의 예는 젖산염, 구연산염, 아세트산염, 숙신산염, 글리신염, 3,3-디메틸글루탈산염, 프탈산염, 인산염, 트리에탄올아민염, 디에탄올아민염, 붕산염, 발비틀염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염, 이미다졸-아세트산염, 말산염, 옥살산염, 탄산염, 굿(GOOD) 완충제 등을 포함한다.
효소의 부활제의 예는 디히드로아세트산을 포함한다. 방부제의 예는 아디화나트륨, 황산스트렙토마이신을 포함한다. 안정화제의 예는 에틸렌디아민사아세트산 (이하, EDTA 라고 약칭함) 등의 금속킬레이트제를 함유하고, 그 외 효소의 안정화제의 예는 가용성 전분 등의 다당류 및 그 유도체, 알부민, 글로불린 등의 단백질, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 고분자 화합물을 포함한다. 계면활성제의 예는 트리톤X-100 등을 포함한다.
수성 매체로서는 완충액, 생리식염수, 증류수 등 물을 함유하는 액체를 예시할 수 있지만 완충액이 바람직하다.
상기에 나타낸 화합물 또는 효소는 예를 들면 도꾜카세이(주), (주)도우닝(同仁) 카가꾸겡뀨쇼, 다이도(大同)카가꾸(주), 와꼬쥰야꾸(和光純藥)고교(주), 세이싱(盛進)(주), 나카라이(주), 알드리치(Aldrich)사, 피아스(Pierce) 사 등의 시약 카다로그에 게재되어 있어, 시판품을 입수할 수 있다.
이하에 시험예를 서술한다.
시험예 1( 반응액의 발색에서의 환원형 아스코르브산의 영향)
트린더형 시약으로서, N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린나트륨(이하, HSDA 라고 약칭함) 과 4-아미노안티피린 (이하, 4-AA 라고 약칭함) 및 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-사크시닐에틸렌디아민 (이하, EMSE 라 약기함) 과 4-AA 및로이코형 색원체로서, CCAP 및 BCMA를 시험에 이용하였다.
표 1 에 나타내는 농도의 환원형 아스코르브산, 6.25 U/㎖ 의 퍼옥시다아제 및 0.086 mM 의 상기 각 색원체를 함유하는 10.0 mM 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (이하, PIPES 라 약기함) 완충액 (pH6.0)을 37 ℃에서 5 분간 가온한 후, 각각에 과산화수소가 25 μM 이 되도록 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응이 평형에 이른 후, 각 색원체의 최대 흡수파장에서의 반응액의 흡광도를 측정하였다. 반응 전후의 흡광도의 변화를 표 1 에 나타냈다.
색원체 환원형 아스코르브산(μM)
0 10 19 38 95
HSDA 4-AA 0.152 0.141 0.130 0.117 0.089
EMSE 4-AA 0.286 0.266 0.240 0.212 0.160
CCAP 0.804 0.755 0.691 0.624 0.473
BCMA 0.329 0.309 0.281 0.256 0.193
표 1 에 나타낸 바와 같이, 트린더 시약인 EMSE 와 4-AA 및 HSDA 와 4-AA 및 로이코형 색원체인 CCAP 및 BCMA 의 어느 하나를 이용한 정색 반응도 환원형 아스코르브산의 존재에 의해 저해된다.
시험예 2( 반응액의 발색에서의 디티오트레이톨의 영향)
시험예 1 의 환원형 아스코르브산 대신에, 디티오트레이톨을 이용하는 것 외에는 시험예 1 과 동일한 시험을 실시하였다.
반응 전후의 흡광도의 변화를 표 2 에 나타냈다.
색원체 디티오트레이톨 농도 (mM)
0 1.1 2.2 4.4 8.8
HSDA 4-AA 0.152 0 0 0 0
EMSE 4-AA 0.286 0 0 0 0
CCAP 0.804 0.800 0.802 0.613 0.455
BCMA 0.329 0.343 0.326 0.251 0.186
표 2 에 나타나는 바와 같이, 트린더 시약인 EMSE 와 4-AA 및 HSDA 와 4-AA 및 로이코형 색원체인 CCAP 및 BCMA 의 어느 하나를 이용한 정색 반응도 디티오트레이톨의 존재에 의해 저해된다.
시험예 3
6.25 U/㎖ 퍼옥시다아제 및 0.086 mM 의 표 3 에 나타나는 각 색원체를 함유하는 10.0 mM PIPES 완충액 (pH6.0)을 37 ℃에서 5 분간 예비가온한 후, 과산화수소가 15 μM 이 되도록 첨가하여 반응을 개시하였다 (반응계 1).
한편, 2.76 U/㎖ ASOD (아스코르브산 산화수소, 텐노제약제, 타입III), 6.25 U/㎖ 퍼옥시다아제 및 0.086 mM 의 각 색원체를 함유하는 10.0 mM PIPES 완충액 (pH 6.0)을 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후, 환원형 아스코르브산이 15 μM 이 되도록 첨가하여 반응을 개시하였다 ( 반응계 2).
각각의 반응계에서, 반응개시 시 및 반응이 평형에 이른 후, 반응액의 흡광도를 각 색원체의 최대 흡수파장으로 측정하였다. 각각의 반응계의 반응 전후의 흡광도의 변화를 표 3 에 나타낸다.
색원체 반응계 흡광도
HSDA 4-AA 반응계 1 0.091
HSDA 4-AA 반응계 2 0.0
EMSE 4-AA 반응계 1 0.171
EMSE 4-AA 반응계 2 0.0
CCAP 반응계 1 0.487
CCAP 반응계 2 0.488
BCMA 반응계 1 0.319
BCMA 반응계 2 0.315
표 3 에 나타나는 바와 같이, EMSE 와 4-AA 및 HSDA 와 4-AA를 색원체로 한 경우에는 ASOD 에 의한 효소 반응에서 발생하는 과산화수소와 이 색원체와의 반응에 의한 반응액의 착색을 거의 검출할 수 없다. 한편, 로이코형 색원체 CCAP 및 BCMA를 이용한 경우에는 효소 반응에서 발생하는 과산화수소와 상기 색원체와의 반응에 의한 색소의 생성이 양호하여, 본 반응계에 의해 환원형 아스코르브산의 정량이 가능한 것이 나타난다.
시험예 4
2.76 U/㎖ 의 ASOD (아스코르브산 산화수소, 텐노제약제, 타입III), 6.25 U/㎖ 퍼옥시다아제 및 0.086 mM CCAP 를 함유하는 10.0 mM PIPES 완충액 (pH 6.0)을 37 ℃에서 5 분간 가온한 후, 환원형 아스코르브산이 7.5 μM 이 되도록 첨가하여 반응을 개시하였다 (DTT 무첨가구).
한편, 2.75 U/㎖ ASOD, 6.25 U/㎖ 퍼옥시다아제 및 0.086 mM CCAP 및 2.16 ㎎/㎗ 디티오트레이톨을 함유하는 10.0 mM PIPES 완충액 (pH6.0)을 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후, 아스코르브산이 7.5 μM 이 되도록 첨가하여 반응을 개시하였다 (DTT 첨가구).
각각의 반응계에서, 반응개시시 및 반응이 평형에 이른 후, 반응액의 흡광도를 660 ㎚ 으로 측정하였다. 각각의 반응계의 반응 전후의 흡광도의 변화를 표 4 에 나타낸다.
아스코르브산농도(μM) 흡광도
DTT 무첨가 DTT 첨가
7.5 0.240 1.686
DTT 첨가 : 2.2 mM
표 4 에 나타나는 바와 같이 디티오트레이톨의 첨가에 의해 본 반응의 발색의 정도가 크게 높아지므로, 본 방법에 의해 환원형 아스코르브산의 고감도 측정의 가능성이 나타난다.
이하에 본 발명의 양태를 실시예에 의해 설명한다.
실시예에 있어서, 하기 시약액을 조제하여 이용하였다.
*환원형 아스코르브산 정량용 시약
시약액 A-1
CCAP O.089 mM
인산칼륨완충액(pH6.0) 97.4 mM
퍼옥시다아제 6.5 U/㎖
ASOD 3.1 U/㎖
시약액 A-2
BCMA O.125 mM
인산칼륨완충액(pH6.0) 97.4 mM
퍼옥시다아제 6.5 U/㎖
ASOD 3.1 U/㎖
시약액 A-3
MCDP O.115 mM
인산칼륨완충액(pH6.0) 97.4 mM
퍼옥시다아제 6.5 U/㎖
ASOD 3.1 U/㎖
* 총 아스코르브산의 정량용 시약액
시약액 B-1
CCAP O.089 mM
인산칼륨완충액(pH6.0) 97.4 mM
퍼옥시다아제 6.5 U/㎖
ASOD 3.1 U/㎖
디티오트레이톨 2.16 mM
시약액 B-2
BCMA 0.125 mM
인산칼륨완충액(pH6.0) 97.4 mM
퍼옥시다아제 6.5 U/㎖
ASOD 3.1 U/㎖
디티오트레이톨 2.16 mM
* 환원형 아스코르브산 정량용 시약액의 키트
키트 A-4
시약액 A-4a
인산칼륨완충액(pH6.0) 9.5 mM
CCAP O.115 mM
시약액 A-4b
인산칼륨완충액(pH6.0) 86.7 mM
퍼옥시다아제 25.0 U/㎖
ASOD 12.0 U/㎖
* 총 아스코르브산의 정량용 시약액의 키트
키트 C-1
시약액 C-1a
인산칼륨완충액(pH6.0) 9.5 mM
디티오슬리에톨 0.58 mM
CCAP O.115 mM
시약액 C-1b
인산칼륨완충액(pH6.0) 86.7 mM
N-에틸말레이미드 4.27 mM
퍼옥시다아제 25.0 U/㎖
ASOD 12.0 U/㎖
실시예 1
표준액으로서 여러 가지 농도의 환원형 아스코르브산을 함유하는 10 mM 글리신-염산 완충액 (pH3.0)을 작성하였다.
시약액 A-1 의 2.9 ㎖를 37 ℃에서 5 분간 가온한 후 아스코르브산 표준액 0.1 ㎖을 첨가하여 37 ℃에서 5 분간 반응시켰다. 반응 종료후, 반응액의 흡광도의 증가를 660 ㎚ 으로 측정하였다.
도 1 에 환원형 아스코르브산과 흡광도값의 관계를 나타냈다. 가로축에 첨가한 환원형 아스코르브산 용액의 농도 (㎎/㎗)을, 세로축에 660 ㎚ 에서의 흡광도값을 나타냈다. 본 도면에서 피검액의 환원형 아스코르브산 함유량과 흡광도의 비교관계를 이용하여 피검액 중의 환원형 아스코르브산량을 양호하게 측정할 수 있는 것이 명확하다. 환원형 아스코르브산은 0.2 ㎎/㎗ 정도까지 충분히 측정가능하다.
실시예 2
시약액 A-1 대신에 시약액 A-2를 이용하는 것 외에는 실시예 1 과 동일하게 반응을 실행시켜, 반응액의 흡광도의 증가를 755 ㎚ 으로 측정하였다. 결과를 도 2 에 나타냈다.
본 도면에서 피검액의 환원형 아스코르브산 함유량과 흡광도의 비교관계를 이용하여 피검액 중의 환원형 아스코르브산량을 양호하게 측정할 수 있는 것이 명확하다. 환원형 아스코르브산은 0.2 ㎎/㎗ 정도까지 충분히 측정가능하다.
실시예 3
실시예 1 에 준하여 신선한 혈청 시료 1 ∼ 3 중의 환원형 아스코르브산 농도를 시약액 A-1, A-2, A-3을 이용하여 측정하였다. 반응액의 흡광도는 이용한 색원체의 극대 흡수파장으로 측정되었다.
또한, 비교대상으로서 상기 혈청 시료를 아스코르브산용 정량 키트 (베링거만하임사제품, F-키트 L-아스코르브산 제품번호 409677)를 이용하여 정량하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
이용한 시약 아스코르브산 농도 (㎎/㎗)
혈청 시료1 혈청 시료2 혈청 시료3
A-1 0.620 1.114 0.224
A-2 0.622 1.115 0.236
A-3 0.620 1.091 0.220
F-키트 0.630 1.150 측정할수없음
표 5 에 나타나는 바와 같이, 본 발명 정량 방법의 결과는 F-키트와 거의 동일한 값을 얻었다. 혈청 시료 3 에 대하여 F-키트를 이용하면 흡광도가 낮아 측정할 수 없었지만, 본 발명의 정량 방법에서는 측정이 가능하였다.
실시예 4
키트 A-4 및 키트 C-1을 이용하여 환원형 아스코르브산과 산화형 아스코르브산의 총량을 정량하였다.
환원형 아스코르브산과 산화형 아스코르브산을 표 6 에 나타내는 바와 같이 총량이 2.5 ㎎/㎗ 이 되도록 10 mM 인산칼륨완충액 (pH 6.0) 에 용해하여 시료액을 조제하였다.
시료액 A-4a 및 시료액 C-1a 의 2.2 ㎖ 에 각각 시료액 50 ㎕을 첨가하고, 37 ℃에서 5 분간 가온한 후 각각 시약액 A-4b 및 시약액 C-1b 의 0.75 ㎖을 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켰다. 반응후, 반응액의 흡광도의 증가를 660 ㎚ 으로 측정하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
아스코르브산 농도(㎎/㎗) 흡광도
환원형 산화형 키트A-4 키트C-1
0.0 2.500 0.006 0.285
0.625 1.875 0.032 0.284
1.25 1.25 0.058 0.290
1.875 0.625 0.094 0.286
2.500 0.0 0.220 0.283
표 6 에 나타낸 바와 같이, 키트 A-4를 이용하는 방법에 의해, 환원형 아스코르브산량에 비례한 흡광도가 얻어지고, 키트 C-1을 이용하는 방법에 의해, 환원형 아스코르브산 및 산화형 아스코르브산의 총량에 대응하는 흡광도가 측정되었다.
실시예 5
실시예 3 의 혈청 시료 1 및 이 혈청 시료 1을 실온하에 6 시간 방치한 시료의 각 50 ㎕ 에 대하여 키트 C-1을 이용하여 실시예 4 의 방법으로 측정하였다. 이 때 동일하게 F-키트를 이용하여 동일한 시료에 대하여 각각 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
이용한 시약 아스코르브산 농도 (㎎/㎗)
신선 혈액 보존 혈액
키트 C-1 0.652 0.602
F-키트 0.630 측정되지 않음
보존 혈액에 대해서는 환원형 아스코르브산을 정량하는 F-키트에 따라서는 흡광도를 측정할 수 없었던 것으로부터 환원형 아스코르브산은 산화형 아스코르브산으로 산화되어 있는 것을 알 수 있다.
장시간의 방치에 의해 환원형 아스코르브산이 산화되어 산화형 아스코르브산으로 변화되고 있는 시료의 경우에서도 방치전의 환원형 아스코르브산 및 산화형아스코르브산 총량과 동일한 값이 얻어졌다. 또한, 보존 혈액 시료 중의 환원형 아스코르브산 및 산화형 아스코르브산 총량이 신선한 경우에 비하여 낮은 것은 보존에 의해 산화형 아스코르브산이 2,3-디케토글론산으로 불가역적으로 분해된 것에 의한 것으로 생각된다. 또한, 실시예 3 에 비하여 본 법으로 얻어지는 신선 혈액의 값이 높은 것은 혈액에 미리 함유되어 있던 산화형 아스코르브산을 합하여 측정하고 있기 때문이다.
실시예 6
표준액으로서 여러 가지 농도의 환원형 아스코르브산을 함유하는 10 mM 글리신-염산 완충액 (pH3.0)을 작성하였다.
시약액 B-1 의 2.9 ㎖를 37 ℃에서 5 분간 가온한 후, 환원형 아스코르브산 표준액 0.1 ㎖를 첨가하여 37 ℃에서 20 분 반응시켰다. 반응 종료후, 반응액의 흡광도의 증가를 660 ㎚ 으로 측정하였다.
도 3 에 환원형 아스코르브산 농도와 흡광도값의 관계를 나타냈다. 가로축에 첨가한 환원형 아스코르브산 농도 (㎎/㎗)를, 세로축에 660 ㎚ 에서의 흡광도값을 나타냈다. 본 도면에서 환원형 아스코르브산의 고감도 시약액 B-1을 이용하여 피검액의 환원형 함유량과 흡광도의 비교관계를 이용하여 피검액 중의 미량인 환원형 아스코르브산을 양호하게 정량할 수 있는 것이 명확하다. 환원형 아스코르브산은 0.05 ㎎/㎗ 정도까지 충분히 측정가능하다.
본 발명에 의하면, 진단약의 분야에서 유용한 아스코르브산의 정량 방법, 정량용 시약, 정량용 키트를 제공할 수 있다.

Claims (27)

  1. 시료 중의 아스코르브산을 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 아스코르브산 산화 효소 (이하, 본 효소를 "ASOD" 라 함)를 이용하여 정량하는 방법에 있어서, 수성 매체중, ASOD 의 존재 하, 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응, 및 생성된 과산화수소와 색원체를 퍼옥시다아제의 존재 하에 반응시켜 색소를 생성하는 반응을 동일 반응계에서 실행시켜, 생성되는 색소를 정량하는 것을 특징으로 하는 아스코르브산의 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 수성 매체 중에 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제가 존재하고 있는 정량 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제로 상기 시료중의 산화형 아스코르브산을 환원한 후, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물의 존재 하에 반응이 실행되는 정량 방법.
  4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 색소의 정량이 색소에 의해 착색된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 실시되는 정량 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 색원체가 하기 화학식 I 또는 화학식 II 로 나타나는 화합물인 정량 방법 :
    [화학식 I]
    [화학식 II]
    {화학식 I 및 화학식 II 중, Y 는 수소원자 또는 화학식 III :
    [화학식 III]
    (식 중, Z 는 산소 또는 황을 나타내고, X 는 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 모노치환아미노 또는 비치환아미노를 나타낸다)를 나타내고, R1은 히드록시, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내고, R2는 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알케닐, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내며, R3, R4, R5및 R6은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬, 알케닐, 알카노일, 알로일, 아릴, 할로겐, 니트로, 술포, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식VI, 화학식 VII 또는 화학식 VIII :
    [화학식 IV]
    [화학식 V]
    [화학식 VI]
    [화학식 VII]
    [화학식 VIII]
    [화학식 IV ∼ 화학식 VIII 중, A1은 알킬렌을 나타내고, A2는 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알케닐, 지환식 알킬, 모노 또는 디치환아미노 또는 비치환아미노를 나타내고, B1, B2, B3, B4, B5및 B6은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬, 알케닐, 알카노일, 알로일, 아릴, 할로겐, 니트로, 술포, 카르복시, 히드록시, 알콕시 또는 히드록시 치환알킬을 나타낸다] 로 나타나는 기를 표시하거나, R3와 R4또는 R5와 R6은 일체로 되어 알케닐렌을 형성하여도 되며, J 는 산소, 황, 화학식 IX 또는 화학식 XI :
    [화학식 IX]
    [화학식 XI]
    [화학식 IX 및 화학식 XI 중, R7및 R8은 동일하거나 상이하며, 수소, 알킬 또는 알케닐을 나타낸다] 로 나타나는 기를 나타낸다.}
  6. 제 5 항에 있어서, 색원체가 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H -페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA)에서 선택되는 정량 방법.
  7. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 환원제가 SH 기 함유 화합물, 포스핀류, 디포스판류, 아황산염, 아2티온산염, 2가철염 및 수소화붕소염에서 선택된 1 종인 정량 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨인 정량 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물이 SH 시약인 정량 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, SH 시약이 N-에틸말레이미드인 정량 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨이고, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물이 N-에틸말레이미드인 정량 방법.
  12. 환원형 아스코르브산과 산소로부터 산화형 아스코르브산과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 아스코르브산 산화 효소, 색원체 및 퍼옥시다아제를 함유하는 아스코르브산 정량용 시약.
  13. 제 12 항에 있어서, 아스코르브산 정량용 시약에 더하여, 산화형 아스코르브산을 환원형 아스코르브산으로 환원시킬 수 있는 환원제를 함유하는 아스코르브산 정량용 시약.
  14. 제 13 항에 있어서, 아스코르브산 정량용 시약에 더하여, 이 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물을 함유하는 아스코르브산 정량용 시약.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항의 어느 한 항에 있어서, 색원체가 제 5 항의 화학식 I 또는 화학식 II 로 표시되는 화합물인 아스코르브산 정량용 시약.
  16. 제 15 항에 있어서, 색원체가 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA)에서 선택되는 아스코르브산 정량용 시약.
  17. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 환원제가 디티오트레이톨인 아스코르브산 정량용 시약.
  18. 제 14 항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨이고, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물이 N-에틸말레이미드인 아스코르브산 정량용 시약.
  19. ASOD 및 퍼옥시다아제을 함유하는 시약과 색원체를 함유하는 시약으로 이루어지는 환원형 아스코르브산 정량용 키트.
  20. 색원체 및 환원제를 함유하는 시약과 ASOD 및 퍼옥시다아제를 함유하는 시약으로 이루어지는 아스코르브산 정량용 키트.
  21. 색원체 및 환원제를 함유하는 시약과 ASOD, 퍼옥시다아제 및 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물을 함유하는 시약으로 이루어지는 아스코르브산 정량용 키트.
  22. 제 19 항에 있어서, 색원체가 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA)에서 선택되는 아스코르브산 정량용 키트.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 환원제가 디티오트레이톨인 아스코르브산 정량용 키트.
  24. 제 21 항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨이고, 환원제의 환원력을 상실시킬 수 있는 화합물이 N-에틸말레이미드인 아스코르브산 정량용 키트.
  25. 제 20 항에 있어서, 색원체가 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA)에서 선택되는 아스코르브산 정량용 키트.
  26. 제 21 항에 있어서, 색원체가 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA)에서 선택되는 아스코르브산 정량용 키트.
  27. 제 21 항에 있어서, 상기 환원제가 디티오트레이톨인 아스코르브산 정량용 키트.
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