JPH07121901B2 - 新規な尿素誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 - Google Patents

新規な尿素誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法

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JPH07121901B2
JPH07121901B2 JP62144838A JP14483887A JPH07121901B2 JP H07121901 B2 JPH07121901 B2 JP H07121901B2 JP 62144838 A JP62144838 A JP 62144838A JP 14483887 A JP14483887 A JP 14483887A JP H07121901 B2 JPH07121901 B2 JP H07121901B2
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Description

【発明の詳細な説明】 「発明の利用分野」 本発明は、新規な尿素誘導体、及び該化合物を発色成分
として用いる酸化性物質の定量方法並びにペルオキシダ
ーゼ様物質の定量方法に関する。
「発明の背景」 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、H2O2生成酵
素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当す
るH2O2を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色
成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、そ
の呈色を比色定量することにより目的成分量を求める方
法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセライド−リポプロティンリパーゼ−グ
リセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組合
せで発生するH2O2を、ペルオキシダーゼ（POD）、被酸
化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光度
を測定することにより目的成分量を求める方法である。
この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性呈色
試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピリン
と、フェノール系化合物又は、N,N−ジ置換アニリン系
化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）とアニリン系化合物
との組合せ試薬、2,2′−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）、トリフェニ
ルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、ｏ−トリジ
ン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ｏ−フェニ
レンジアミン等が挙げられる。しかしながら、これら従
来から用いられている被酸化性呈色試薬は、大部分がそ
の呈色波長が600nm以下であり、ビリルビン、ヘモグロ
ビン等の血清成分の影響を受け易く（尿中成分測定時に
は尿中の色素体の影響を受け易い）、また、４−アミノ
アンチピリンとの組合せ試薬やトリフェニルメタン系ロ
イコ色素の一部を除いて、いずれも色原体の安定性が低
い等の問題点を有する。一方、比較的色原体の安定性が
良く、また呈色波長が比較的長波長側にある色原体とし
て染料前駆体（ロイコ色素）のジフェニルアミン誘導体
が開示されている（特開昭56−145352号公報、特開昭59
−182361号公報、特公昭60−33479号公報等）。
これらのジフェニルアミン誘導体は、いずれもその呈色
波長が700nm以上と比較的長波長側にあり感度も比較的
高いが、色原体の安定性、呈色安定性共に未だ充分満足
のいくものであるとは云えず、また、いずれも水に対す
る溶解性が悪いという欠点をも有する。
この欠点を補う為、一般的には界面活性剤や有機溶媒を
溶解補助剤として用いてこれらの色原体を可溶化し、発
色試薬の調製を行っている。しかしながら、このような
方法は、例えばグリセロリン酸オキシダーゼ、リポプロ
ティンリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、ホスホリパーゼＤ等のような、
界面活性剤により比較的失活しやすく、使用可能な界面
活性剤の種類や濃度に制限のある酵素が測定系に存在す
る場合には、甚だ問題があり、決して好ましい方法であ
るとは言えない。一方、これら既存のジフェニルアミン
誘導体を色原体として組込んだ発色試薬を所謂臨床検査
試薬として商品化しようとした場合には、これらは水溶
液中では長期間にわたる安定性を有しない為、所謂凍結
乾燥品中にこれを含有させる必要があるが、凍結乾燥品
の原液中には通常使用濃度の10〜100倍量の色原体を溶
解させなければならないので、原液調製時に特殊な技術
を必要とするなど実用上甚だ問題が多い。
「発明の目的」 本発明の目的は、呈色時に極大吸収波長が650nm以上か
ら近赤外域に至る長波長側にあり、高感度で、色原体の
安定性、呈色安定性共に優れ、しかも水溶性の極めて高
い尿素誘導体の開発と、該化合物を用いる酸化性物質及
びペルオキシダーゼ様の物質の精度の高い測定法を提供
することにある。
「発明の構成」 本発明は、一般式［Ｉ］ （式中、R1，R2は夫々独立して４−ジ置換アミノアリー
ル基を示し、R1とR2のアリール基は、酸素又は硫黄原子
を介して互いに結合していてもよく、R3はカルボキシア
ルキル基、アリールスルホニル基又はスルホアリール基
を示す。）で示される尿素誘導体、及び該化合物を発色
成分として用いる酸化性物質の定量方法、並びに該化合
物を発色成分として用いるペルオキシダーゼ様物質の定
量法である。
本発明者らは、高感度発色試薬として有用なジフェニル
アミン誘導体が有する前記した如き問題点を解決すべく
鋭意研究の途上、色原体の安定性、呈色安定性に優れ、
且つ、界面活性剤や有機溶剤等の溶解補助剤を用いるこ
となしに水又は緩衝液に容易に溶解し得る前記［Ｉ］式
で示される尿素誘導体を新たに見出し、本発明を完成さ
せるに至った。
一般式［Ｉ］で示される本発明の尿素誘導体に於て、
R1，R2で示される４−ジ置換アミノアリール基に於ける
ジ置換アミノ基 の置換基R4〜R7としては、例えばアルキル基、カルボキ
シアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアル
キル基（これらアルキル基、置換アルキル基のアルキル
基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、
ブチル基、アミル基、ヘキシル基等炭素数１〜６の低級
アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）が挙
げられ、アルコキシアルキル基のアルコキシ基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基、アミルオキシ基、ヘキシルオキシ基等炭素数
１〜６の低級アルコキシ基（直鎖状、分枝状のいずれに
ても可。）が挙げられる。また、カルボキシアルキル基
はカルボキシル基の部分が、ナトリウム，カリウム，リ
チウム等のアルカリ金属塩、又はアンモニウム塩等の塩
の形になっていてもよい。）等が挙げられ、R4とR5、R6
とR7は夫々同じであっても異なっていてもよい。また、
R4とR5又は／及びR6とR7が互いに結合して、R4，R5及び
Ｎとで又は／及びR6，R7及びＮとで、例えばピペリジン
環の如き環を形成していてもよい。４−ジ置換アミノア
リール基のアリール基としてはフェニル基、置換フェニ
ル基（例えばトリル基、メトキシフェニル基等）、ナフ
チル基、置換ナフチル基（例えばメチルナフチル基、メ
トキシナフチル基等）等が挙げられる。R1とR2のアリー
ル基は、また、酸素又は硫黄原子を介して、例えば の如く互いに結合していてもよい。また、R3で示され
る、カルボキシアルキル基のアルキル基としては、例え
ばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル
基、ヘキシル基等炭素数１〜６のアルキル基（直鎖状、
分枝状のいずれにても可。）が挙げられる。アリールス
ルホニル基、スルホアリール基のアリール基としては、
例えばフェニル基、置換フェニル基（例えばトリル基、
メトキシフェニル基等）、ナフチル基、置換ナフチル基
（例えばメチルナフチル基、メトキシナフチル基等）等
が例示される。
一般式［Ｉ］で示される本発明化合物は、例えば、下記
の如くして容易に合成し得る。
即ち、例えば一般式［II］ （但し、R1，R2は前記と同じ。）で示されるジアリール
アミン誘導体と、通常これと等モルの一般式［III］ ０＝Ｃ＝Ｎ−R6 ［III］ （但し、R8はカルボキシアルキル基、アリールスルホニ
ル基、スルホアリール基又はアルコキシカルボニルアル
キル基を示す。）で示されるイソシアネート誘導体とを
適当な有機溶媒（例えばクロロホルム、ｎ−ヘキサン、
酢酸エチル、ジメチルホルムアミド等）中、室温乃至要
すれば加温下に数時間乃至数十時間反応させる。反応後
は、例えばカラムクロマトグラフィー等により生成物を
単離、精製するなど自体公知の方法に従って後処理を行
なうことにより、また、必要に応じてこれを更にアルカ
リ処理し、然る後、常法に従って後処理を行なうことに
より目的とする本発明の尿素誘導体が得られる。
本発明の尿素誘導体の製造に用いられる一般式［II］で
示されるジアリールアミン誘導体は、古くから知られて
いるインダミンの製法（例えば、Chem.Ber.,16,464（18
83）等）に準じて、例えばアニリン誘導体とフェニレン
ジアミン誘導体とを過ヨウ素酸等で酸化縮合して色素を
合成した後、これを還元することにより容易に得られる
から、このようにして得られたものを用いることで足り
る。また、本発明の尿素誘導体の製造に用いられる、一
般式［III］で示されるイソシアネート誘導体も、公知
文献（例えば、大有機化学、第５巻、452-453頁、朝倉
書店、昭和42年第６版等）に記載のイソシアネートの製
法に準じて容易に合成し得るので、このようにして得ら
れたものを用いることで足りる。
本発明化合物は、水或は界面活性剤の溶存する水溶液中
で極めて安定で、所謂ブランク値が低い。一方、これを
酸化剤、例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化水素に
より酸化すると、650nmから近赤外領域に極大吸収を有
する呈色安定性に優れた色素を定量的に形成する。ま
た、本発明化合物は親水性官能基又は極性の高い構造を
有しているので、水或は界面活性剤の溶存する水溶液に
対する溶解性が非常に良好なため、発色試薬等の調製に
於て極めて有利であり、好ましい。
表１（Ｉ）及び（２）に、本発明化合物の具体例13例に
ついて、そのロイコ体溶液の安定性、呈色後の安定性、
極大吸収波長（λmax）、感度（ε）及び水に対する溶
解性を示すが、本発明化合物はこれら具体例に限定され
るものではない。
表１（Ｉ）及び（２）中のロイコ体溶液の安定性と呈色
溶液の安定性に於て、Ａは安定、Ｂはやや不安定を意味
する。水に対する溶解性に於ては、◎は極めて易溶、○
は可溶、×は難溶であることを意味する。
本発明の尿素誘導体は、酸化性物質の定量やペルオキシ
ダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として有効に用い
えるが、とりわけ酵素反応により生成した過酸化水素を
ペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、その呈色を比
色定量することにより行なう生体試料中の微量成分の定
量に於ける発色成分として特に有効に使用し得る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量法は、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行なう生体試料中の
基質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂
質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コ
リンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定され
るものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を
定量することによって測定が可能な生体成分は全て定量
可能である。
本発明の測定法は、発色剤（被酸化性呈色試薬）として
本発明の尿素誘導体を用いる以外は自体公知の酵素法
（H2O2生成酵素を用いる）により測定法に準じてこれを
行えば足りる。
使用される発色剤の濃度は、特に限定されないが、通常
数μmol/1以上、好ましくは50μmol/1〜100μmol/1の濃
度が用いられる。
本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に
特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要
すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使用量は
目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常、pH4.0〜1
0.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で実施される。用いら
れる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グット（Good′ｓ）緩衝液
などが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
本発明の尿素誘導体は、過酸化水素等酸化性物質の定量
に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素とを組み合
せることによりペルオキシダーゼ様物質の定量を行なう
ことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質としては、
ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンその他の
ヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明の尿素誘導体は、例えば、ペルオキシダー
ゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応用可能で
あり、又、血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しくは
過硼素酸ナトリウムのような酸化性物質を用いて測定す
る場合などにも有効に使用し得る。
以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何等制約を受けるものではない。
［実施例］ 実施例 1.N,N-ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
Ｎ′−カルボキシメチル尿素、Na塩〔本発明化合物
（１）〕の合成 〔反応式〕 ビンドシェドラーグリーン，ロイコ体 〔Bindshedler′s Green,Leuco Base（4,4′−ビス（ジ
メチルアミノ）ジフェニルアミン）；同仁化学研究所
製、以下BGと略記する。〕2.5gをクロロホルム 100ml
に溶解し、イソシアネート酢酸エチル（関東化学（株）
製）1.3gを徐々に加え20℃で20時間反応させた。反応混
合物を、100〜200メッシュのシリカゲルを充填したカラ
ム（溶媒：クロロホルム）に流し、クロロホルムとメタ
ノールの混合溶媒で溶出し、目的画分を得た。次に、こ
れからクロロホルム、メタノールを留去した後、メタノ
ール300mlと1NNaOH10mlとを加え、更に20℃で10時間反
応させた後、濃縮、凍結乾燥し無色結晶2.1gを得た。
TLC（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝9:1）:R
f＝0.4。
MS:M+＝378。
IR:νNH＝3400cm-1，νCH＝2930cm-1，νＣ＝０＝1650c
m-1，νＣ−０＝1100cm-1。
実施例2.N,N-ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
Ｎ′‐（４−スルホフェニル）尿素,Na塩〔本派化合物
（２）〕の合成 〔反応式〕 BG0.5gと4-スルホフェニルイソシアネート,Na塩（アル
ドリッチ社製）2.55gをジメチルスルホキシド（DMSO）1
00mlに溶解し、80℃で20時間反応させた。反応混合物
を、100〜200メッシュのシリカゲルを充填したカラム
（溶媒：クロロホルム）に流し、クロロホルムとメタノ
ールの混合溶媒で溶出し、目的画分を濃縮乾固して無色
結晶150mgを得た。
TLC（シリカゲル、メタノール）:Rf＝0.1。
実施例3.N-（４−ジメチルアミノ−２−メチルフェニル
−N-（４′−ジエチルアミノ‐２′‐メチルフェニル）
‐Ｎ′‐（4-メチルフェニルスルホニル）尿素〔本発明
化合物（７）〕の合成 N,N-ジエチルトリレンジアミン１塩酸塩2.1gとN,N-メエ
チル−ｍ−トルイジン2.4gをメタノール100mlに溶解
し、過沃素酸3gを加えて室温で１時間反応させた。これ
に更に亜鉛末6gと6N塩酸5mlを投入して反応させ、反応
後クロロホルムで抽出した。油層を無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥した後、これにｐ−トルエンスルホニルイソシ
アネート（和光純薬工業（株）製）9gを加えて、室温で
２時間反応させた。反応混合物を、100〜200メッシュの
シリカゲルを充填したカラム（溶媒：クロロホルム，ヘ
キサン）に流し、クロロホルムとヘキサンの混合溶媒で
溶出し、目的画分を濃縮乾固して無色結晶50mgを得た。
TLC（シリカゲル、クロロホルム：ヘキサン＝1:1）:Rf
＝0.55。
MS:M+＝508。
実施例 4.10−（カルボキシメチルアミノカルボニル）
−3,7-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン,Na塩
〔本発明化合物（９）〕の合成 〔反応式〕 メチレンブルー（和光純薬工業（株）製）3.0gを蒸留水
300mlに溶解し、亜鉛粉末3gと1N塩酸10mlを用いて還元
した。亜鉛を除去した後、酢酸エチルで塩基性下で抽出
し、油層を硫酸マグネシウムに通して脱水した。直ちに
イソシアネート酢酸エチル（関東化学（株）製）2.7gを
加えて、室温で20時間反応させた。反応液を濃縮後、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル:100〜20
0メッシュ，溶出溶媒：クロロホルム）で精製し目的画
分を得た。この画分からクロロホルムを留去し、メタノ
ール500mlと、1NNaOH10mlを加えて20℃で10時間反応さ
せ、その後濃縮、凍結乾燥して無色結晶980mgを得た。
TLC（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝9:1）:R
f＝0.5。
MS:M+＝408。
IR:νNH＝3400cm-1，νCH＝2930cm-1，νＣ＝０＝1650c
m-1，ν０−Ｃ＝1100cm-1。
実施例5.10-（カルボキシメチルアミノカルボニル）‐
3,7-ビス（ジメチルアミノ）フェノキサジン,Na塩〔本
発明化合物（10）〕の合成 〔反応式〕 カプリブル−〔3,7-ビス（ジメチルアミノ）フェノキサ
ゾニウムクロライド（東京化成（株）製）〕2.7gを蒸留
水300mlに溶解し、亜鉛粉末3gと1N塩酸10mlを用いて還
元した。亜鉛を除去した後、酢酸エチルで塩基性下で抽
出し、油層を硫酸マグネシウムに通して脱水した。直ち
にイソシアネート酢酸エチル（関東化学（株）製）2.7g
を加えて、室温で20時間反応させた。反応液を濃縮後、
シリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル:100〜
200メッシュ，溶出溶媒：クロロホルム）で精製し目的
画分を得た。この画分からクロロホルムを留去し、メタ
ノール500mlと、1NNaOH10mlを加えて20℃で10時間反応
させ、その後濃縮、凍結乾燥して無色結晶980mgを得
た。
TLC（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝9:1）:R
f＝0.5。
MS:M+＝392。
IR:νNH＝3400cm-1，νCH＝2930cm-1，νＣ＝０＝1650c
m-1，ν０−Ｃ＝1100cm-1。
実施例6.過酸化水素の定量 〔測定試液〕 本発明化合物（１）0.05m mol/l、ペルオキシダーゼ10U
/mlの濃度になるように、50mM PIPES〔ピペラジン−N,
N′‐ビス（２−エタンスルホン酸）〕−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH7.0）に溶解した。
〔試料液〕
市販過酸化水素水をイオン交換水で0.5,1.0,1.5,2.0,4.
0m mol/1の濃度になるように希釈した。
〔測定方法〕 測定試液3mlに試料液20μｌを加え、37℃で５分間加温
後、730nmに於ける吸光度（OD730）を測定した。
〔結果〕
第１図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。第１
図により明らかな如く、各過酸化水素濃度（m mol/l）
に対してプロットした吸光度（OD730）を結ぶ検量線は
良好な定量性を示している。
実施例7.正常人血清共存下での過酸化水素の定量 〔測定試液〕 実施例6.に同じ。
〔試料液〕
実施例6.に同じ。
〔測定方法〕 測定試液3mlに正常人血清あるいはイオン交換水50μｌ
を加えた後、試料液20μｌを加え、37℃で５分間加温
後、730nmに於ける吸光度（OD730）を測定した。
〔結果〕
表２に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。
表２より明らかな如く、本発明化合物を発色成分とする
過酸化水素の定量法は、人血清の存在によりその測定値
に何ら影響を受けないことが判る。
実施例8.尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明の化合物（１）0.05m mol/l、ペルオキシダーゼ1
0U/ml、ウリカーゼ2U/ml、アスコルビン酸オキシダーゼ
2U/mlの濃度になるように50mMPIPES-水酸化ナトリウム
緩衝液（pH6.4）に溶解した。
〔試料液〕
10mg/dlの尿酸を含有する標準液及び人血清13検体を試
料とした。
〔測定方法〕
測定試液3mlに試料20μｌを添加し、37℃で５分間加温
後、730nmに於ける吸光度（OD730）を測定した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例1.尿酸の定量 実施例８と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット
〔尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業（株）製〕を使
用して、尿酸濃度を測定した。
実施例８及び参考例１の測定結果を表３に併せて示す。
表３から明らかな如く、本発明化合物を発色剤として用
いた実施例８の測定法により得られた尿酸の測定値は、
市販キットを用いた従来法のそれとよい相関を示してい
る。
実施例9.尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明化合物（10）0.025m mol/l、ペルオキシダーゼ10
U/ml、ウリカーゼ2U/ml、アスコルビン酸オキシダーゼ2
U/mlの濃度になるように50mMPIPES−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH6.4）に溶解した。
〔試料液〕
10mg/dlの尿酸を含有する標準液及び人血清10検体を試
料とした。
〔測定方法〕
測定試液3mlに試料20μｌを添加し、37℃で５分間加温
後、666nmに於ける吸光度（OD666）を測定した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例2.尿酸の定量 実施例９と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット
〔尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業（株）製〕を使
用して、尿酸濃度を測定した。
実施例９及び参考例２の測定結果を表４に併せて示す。
表４から明らかな如く、本発明化合物を発色剤として用
いた実施例９の測定法により得られた尿酸の測定値は、
市販キットを用いた従来法のそれとよい相関を示してい
る。
実施例10.尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明化合物（７）0.05m mol/l、ペルオキシダーゼ10U
/ml、ウリカーゼ2U/ml、アスコルビン酸オキシダーゼ2U
/mlの濃度になるように50mMPIPES−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH6.4）に溶解した。
〔試料液〕
10mg/dlの尿酸を含有する標準液及び人血清13検体を試
料とした。
〔測定方法〕
測定試液3mlに試料15μｌを添加し、37℃で５分間加温
後、740nmに於ける吸光度（OD740）を測定した。
次式に従い人血清中の尿酸濃度を算出した。
参考例3.尿酸の定量 実施例10と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット
〔尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業（株）製〕を使
用して、尿酸濃度を測定した。
実施例10及び参考例３の測定結果を表５に併せて示す。
表５から明らかな如く、本発明化合物を発色剤として用
いた実施例10の測定法により得られた尿酸の測定値は、
市販キットを用いた従来法のそれとよい相関を示してい
る。
実施例11.遊離脂肪酸（NEFA）の測定 〔測定試液〕 本発明化合物（９）0.05m mol/l、ペルオキシダーゼ5U/
ml、アシルコエンザイムＡシンセターゼ（ACS）0.1U/m
l、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ（ACOD）3U/ml、
コエンザイムＡ（CoA）0.5mg/ml、塩化マグネシウム2m
M,エマルゲン913（ポリオキシエチレンノニルフェノー
ルエーテル、花王（株）製〕0.2％を含む50mMPIPES−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH6.9）を調製し、測定試液と
した。
〔試料〕
10mEq/lのオレイン酸を含有する基準液及び人血清15検
体を試料とした。
〔操作法〕
測定試液3mlに試料20μｌを加え、37℃で10分間加温
後、666nmに於ける吸光度（OD666）を測定した。
次式に従い人血清中のNEFA濃度を算出した。
参考例4. 実施例11と同じ試料を用い、NEFA測定用の市販キット
〔NEFA C−テストワコー、和光純薬工業（株）製;CoAの
呈色反応への影響を防止する為に第２測定試液中にSH試
薬としてＮ−エチルマレイミドを含有する）を用いてNE
FA濃度を測定した。
実施例11及び参考例４で得られた血清中NEFA濃度測定値
を表６に示す。
表６より明らかな如く、本発明化合物を発色剤として用
いた実施例11の測定法により得られたNEFAの測定値は、
市販キットを用いた従来法のそれとよい相関性を示し
た。この結果から、本発明の化合物（９）を発色剤とし
て用いてNEFAの測定を行えば、従来法では必要とされて
いたSH試薬を用いることなく測定が可能であり、その為
従来法では成し得なかった１液法での測定も可能となる
ことが判った。
実施例12.ペルオキシダーゼの定量（本発明化合物
（１）を用いた例） 〔測定試液〕 本発明化合物（１）0.1m mol/l、過酸化水素0.001％の
濃度になるように、50mMクエン酸緩衝液（pH4.8）に溶
解し、測定試液とした。
〔試料液〕
ペルオキシダーゼを50mMクエン酸緩衝液（pH4.8）で各
種濃度に希釈して用いた。
〔測定方法〕
測定試液2mlに各種濃度の試料液20μｌを加え、37℃で
５分間加熱後、730nmに於ける吸光度（OD730）を測定し
た。
〔結果〕
第２図にペルオキシダーゼ最終濃度と吸光度との関係を
示す。第２図より明らかな如く、各ペルオキシダーゼ最
終濃度（unit/ml）に対してプロットした吸光度（O
D730）を結ぶ検量線は良好な定量性を示している。
参考例5.ペルオキシダーゼの定量（ｏ−フェニレンジア
ミンを用いた例） 〔測定試液〕 ｏ−フェニレンジアミン8m mol/l、過酸化水素0.001％
の濃度になるように50mMクエン酸緩衝液（pH4.8）に溶
解し、測定試液とした。
〔試料液〕
実施例12と同様のものを用いた。
〔測定方法〕
測定試液2mlに各種濃度の試料液20μｌを加え、37℃で
５分間加熱後、450nmに於ける吸光度（OD450）を測定し
た。
〔結果〕
第３図にペルオキシダーゼ最終濃度と吸光度との関係を
示す。
第２図及び第３図より明らかな如く、実施例12の本発明
化合物（１）を用いた場合、参考例５の従来の発色基質
であるｏ−フェニレンジアミンを用いた場合の、約10倍
の感度を有する。」 「発明の効果」 以上述べた如く、本発明の新規尿素誘導体は、いずれも
その呈色時の極大吸収波長が650nm以上と長波長側にあ
る為、例えば血清、尿等生体試料中の微量成分の定量に
於ける発色成分としてこれを用いた場合には、試料中に
共存する有色の妨害物質の影響を全く受けずに測定を行
うことができるという点、並びに、本発明の新規尿素誘
導体は水、或は界面活性剤の溶存する水溶液に対する溶
解性が極めて良好で且つ色原体の安定性、呈色安定性共
に著しく優れているという点に顕著な効果を奏するもの
であり、斯業に貢献すること大なるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例６に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（m mol/l）について得られた吸
光度（OD730）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 第２図は実施例12に於て得られた検量線を表わし、横軸
の各ペルオキシダーゼ最終濃度（unit/ml）について得
られた吸光度（OD730）を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。 第３図は参考例５に於て得られた検量線を表わし、横軸
の各ペルオキシダーゼ最終濃度（unit/ml）について得
られた吸光度（OD450）を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 向井 豊治 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内 (72)発明者 木田 正章 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式［Ｉ］ （式中、R1，R2は夫々独立して４−ジ置換アミノアリー
    ル基を示し、R1とR2のアリール基は、酸素又は硫黄原子
    を介して互いに結合していてもよく、R3はカルボキシア
    ルキル基、アリールスルホニル基又はスルホアリール基
    を示す。）で示される尿素誘導体。
  2. 【請求項２】一般式［Ｉ］ （式中、R1，R2は夫々独立して４−ジ置換アミノアリー
    ル基を示し、R1とR2のアリール基は、酸素又は硫黄原子
    を介して互いに結合していてもよく、R3はカルボキシア
    ルキル基、アリールスルホニル基又はスルホアリール基
    を示す。）で示される尿素誘導体を発色成分として用い
    ることを特徴とする酸化性物質の定量法。
  3. 【請求項３】酸化性物質が過酸化水素である、特許請求
    の範囲第２項記載の定量法。
  4. 【請求項４】ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸
    化発色させてその呈色を比色定量する、特許請求の範囲
    第３項記載の定量法。
  5. 【請求項５】過酸化水素が、酵素反応により生成する過
    酸化水素である、特許請求の範囲第３項又は第４項記載
    の定量法。
  6. 【請求項６】過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定
    量に於て酵素反応により生成する過酸化水素である、特
    許請求の範囲第５項記載の定量法。
  7. 【請求項７】生体試料中の微量成分の定量が、基質又は
    酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成
    する過酸化水素を定量することにより行なう生体試料中
    の基質又は酵素活性の定量である、特許請求の範囲第６
    項記載の定量法。
  8. 【請求項８】一般式［Ｉ］ （式中、R1，R2は夫々独立して４−ジ置換アミノアリー
    ル基を示し、R1とR2のアリール基は、酸素又は硫黄原子
    を介して互いに結合していてもよく、R3はカルボキシア
    ルキル基、アリールスルホニル基又はスルホアリール基
    を示す。）で示される尿素誘導体を発色成分として用い
    ることを特徴とする、ペルオキシダーゼ様物質の定量
    法。
  9. 【請求項９】ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダー
    ゼである、特許請求の範囲第８項記載の定量法。
  10. 【請求項１０】ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン
    又はその他のヘム化合物である、特許請求の範囲第８項
    記載の定量法。
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