JPS61225000A - ３α―ヒドロキシステロイドの定量法及びこれに用いる試薬 - Google Patents
３α―ヒドロキシステロイドの定量法及びこれに用いる試薬Info
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- JPS61225000A JPS61225000A JP60064547A JP6454785A JPS61225000A JP S61225000 A JPS61225000 A JP S61225000A JP 60064547 A JP60064547 A JP 60064547A JP 6454785 A JP6454785 A JP 6454785A JP S61225000 A JPS61225000 A JP S61225000A
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- dehydrogenase
- oxosteroid
- hydroxysteroid
- electron carrier
- 3alpha
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は共役酵素法を利用する３α−ヒドロキシステロ
イドの定量方法に関する。
イドの定量方法に関する。
生体中の３０−ヒドロキシステロイドには、胆汁酸類の
ほか、アンド四ステロンなどのステロイドホルモンがあ
るが、特に臨床診断上重要な意義を有しているのは胆汁
酸である。胆汁酸は主にグルココール酸、タウ四コール
酸、グルコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシ
コール酸、グルコデオキシコール酸、タウロデオキシコ
ール酸等よシなシ、肝臓でコレステロールよυ合成すれ
た後、いわゆる腸肝循環系という極めて閉鎖的な回路を
循環するため、正常人の末梢血中にはごく微量しか存在
しない。しかし、肝・胆道系疾患においては、これらの
回路に破綻が生じ、血中胆汁酸量が上昇する。従って胆
汁酸の血中濃度の上昇を指標として肝・胆道系疾患の存
否を判定することができると同時に、ある程度の重症度
を判定することも可能となる。これらのことから生体中
、４１に血清中′の３α−ヒドロキシステロイドの一成
分である胆汁酸の測定が肝・胆道系疾患の診断にとって
重要なものとなっている。
ほか、アンド四ステロンなどのステロイドホルモンがあ
るが、特に臨床診断上重要な意義を有しているのは胆汁
酸である。胆汁酸は主にグルココール酸、タウ四コール
酸、グルコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシ
コール酸、グルコデオキシコール酸、タウロデオキシコ
ール酸等よシなシ、肝臓でコレステロールよυ合成すれ
た後、いわゆる腸肝循環系という極めて閉鎖的な回路を
循環するため、正常人の末梢血中にはごく微量しか存在
しない。しかし、肝・胆道系疾患においては、これらの
回路に破綻が生じ、血中胆汁酸量が上昇する。従って胆
汁酸の血中濃度の上昇を指標として肝・胆道系疾患の存
否を判定することができると同時に、ある程度の重症度
を判定することも可能となる。これらのことから生体中
、４１に血清中′の３α−ヒドロキシステロイドの一成
分である胆汁酸の測定が肝・胆道系疾患の診断にとって
重要なものとなっている。
従来報告されている３ａ−ヒドロキシ１ステロイドの定
量分析としては、クロマトグラフィー法、酵素法、免疫
学的測定法等があるが、′日常の臨床検査の分野では簡
便な酵素法が主流となっている。
量分析としては、クロマトグラフィー法、酵素法、免疫
学的測定法等があるが、′日常の臨床検査の分野では簡
便な酵素法が主流となっている。
即ち、胆汁酸（３Ｇ−ヒドロキシ１テロイド）にニコチ
ンア之ドアデニンジヌクレオチドｃ以下ＮＡＤと略す）
の存在下、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼｃ以下３Ｑ−Ｈ８Ｄと略す）を作用させ、ＮＡＤを還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎム
’ＤＨと略す）とした後、次の様な方法によシ分析がお
こなわれている。
ンア之ドアデニンジヌクレオチドｃ以下ＮＡＤと略す）
の存在下、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼｃ以下３Ｑ−Ｈ８Ｄと略す）を作用させ、ＮＡＤを還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎム
’ＤＨと略す）とした後、次の様な方法によシ分析がお
こなわれている。
■ 生成されたＮＡＤＨの螢光を測定する法。
■ 生成されたＮＡＤＨをジアホラーゼの作用によｆｉ
ＮＡＤとし、同時に共存させたレサズリンをレゾルフィ
ンに変換し、その螢光を測定する方法。
ＮＡＤとし、同時に共存させたレサズリンをレゾルフィ
ンに変換し、その螢光を測定する方法。
■ 生成されたＮＡＤＨをジアホラーゼの作用によ、り
ＮＡＤとし、同時に共存させたニトロブルーテトラゾリ
ウムをジホルｉインに変換し、これを比色定量する方法
。
ＮＡＤとし、同時に共存させたニトロブルーテトラゾリ
ウムをジホルｉインに変換し、これを比色定量する方法
。
しかし、上記ωおよび■の方法は螢光測定法であシ操作
法が繁雑な上、高価な機器を必要とし、日常検査ではほ
とんど利用されていないのが現状である。また、＠の方
法は感度が悪く、その上血中胆汁酸濃度が極めて低いた
めに試料を多量に必要とし、試料成分による妨害を受は
易く、必ずしも満足いくものではない。したがって、酵
素法による３ａ−ヒドロキシステロイドの有利な測定法
の開発が望まれていた。
法が繁雑な上、高価な機器を必要とし、日常検査ではほ
とんど利用されていないのが現状である。また、＠の方
法は感度が悪く、その上血中胆汁酸濃度が極めて低いた
めに試料を多量に必要とし、試料成分による妨害を受は
易く、必ずしも満足いくものではない。したがって、酵
素法による３ａ−ヒドロキシステロイドの有利な測定法
の開発が望まれていた。
本発明者らは酵素法において利用される共役反応系及び
その反応生成物について検討していたとζろ、３ａ−ヒ
ドロキシステロイドの酸化生成物である３−オキンステ
ロイドを３−オキソステロイド−Δ４（又はΔ１）−デ
ヒドロゲナーゼによって更に酸化する酵素共役系を見出
し、これを利用すれば感度の良い測定法が得られること
を見出して本発明を完成した。
その反応生成物について検討していたとζろ、３ａ−ヒ
ドロキシステロイドの酸化生成物である３−オキンステ
ロイドを３−オキソステロイド−Δ４（又はΔ１）−デ
ヒドロゲナーゼによって更に酸化する酵素共役系を見出
し、これを利用すれば感度の良い測定法が得られること
を見出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は被検体に＝コテンアミドアデ二ンジ
ヌクレオチドの存在下３ａ−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼを作用せしめ、次いで得られた反応生成物
にテトラゾリウム若しくはその塩、電子キャリヤー物質
並びに３−オキソステロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼ
又は／及び３−オキソステロイド−１４−デヒドロゲナ
ーゼを作用せしめ、生成したホルマザン類を測定するこ
とを特徴とする３α−ヒドロキシステロイドの定量法及
びこれに用いる試薬を提供するものである。
ヌクレオチドの存在下３ａ−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼを作用せしめ、次いで得られた反応生成物
にテトラゾリウム若しくはその塩、電子キャリヤー物質
並びに３−オキソステロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼ
又は／及び３−オキソステロイド−１４−デヒドロゲナ
ーゼを作用せしめ、生成したホルマザン類を測定するこ
とを特徴とする３α−ヒドロキシステロイドの定量法及
びこれに用いる試薬を提供するものである。
本発明法の反応機構は次式のようＫまとめられる。
キンステロイドが３−オキンーΔ４（又は／及びｊｌ）
−ステロイドとなる反応をも利用してテトラシリ ゛ラ
ムまたはその塩からホルマザン類を生成せしめ、これを
測定し、３Ｑ−ヒドロキシステロイドラ定量する方法で
ある。
−ステロイドとなる反応をも利用してテトラシリ ゛ラ
ムまたはその塩からホルマザン類を生成せしめ、これを
測定し、３Ｑ−ヒドロキシステロイドラ定量する方法で
ある。
本発明法を実施するためには、緩衝液中に被検体並びに
ＮＡＤ、テトラゾリウム若しくはその塩類、電子キャリ
ヤー物質、３α−Ｈ８Ｄ及び３−オキソステロイド−Δ
４−デヒドロゲナーゼ若しくは３−オキソステロイド−
Δ１−デヒドロゲナーゼのいずれか一方か、あるいはこ
の両方を任意の順序で加え反応させれば良い。なお、試
薬としては、ＮＡＤ、テトラゾリウムまたはその塩類、
電子キャリヤー物質、３Ｑ−ＨＡＤそして３−オキソス
テロイド−Δ４−デヒドロゲナーゼまたは３−オキソス
テロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼのいずれか一方か、
あるいはこの両方をあらかじめ緩衝液に加えておいて使
用しても良く、また酵素類、ＮＡＤ 。
ＮＡＤ、テトラゾリウム若しくはその塩類、電子キャリ
ヤー物質、３α−Ｈ８Ｄ及び３−オキソステロイド−Δ
４−デヒドロゲナーゼ若しくは３−オキソステロイド−
Δ１−デヒドロゲナーゼのいずれか一方か、あるいはこ
の両方を任意の順序で加え反応させれば良い。なお、試
薬としては、ＮＡＤ、テトラゾリウムまたはその塩類、
電子キャリヤー物質、３Ｑ−ＨＡＤそして３−オキソス
テロイド−Δ４−デヒドロゲナーゼまたは３−オキソス
テロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼのいずれか一方か、
あるいはこの両方をあらかじめ緩衝液に加えておいて使
用しても良く、また酵素類、ＮＡＤ 。
テトラゾリウムまたはその塩類のいずれかを除いたもの
を緩衝液に加えておき、使用時にこれらを加え調製し使
用することも可能である。
を緩衝液に加えておき、使用時にこれらを加え調製し使
用することも可能である。
本発明法に使用できる緩衝液としてはｐＨ６〜１０のリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グツド緩衝液等通常使用さ
れるものであればいずれも使用可能である。
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グツド緩衝液等通常使用さ
れるものであればいずれも使用可能である。
また、テトラゾリウムまたはその塩類としては □ニ
トロブルーテトラゾリウムｃ以下ＮＴＢと略す）、３−
（ｐ−インドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−７エエルー２Ｈテトラゾリウムクロライド（以下
ＩＮＴと略す）、３− （４、５−ジメチル−２−チア
ゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムプ
ロｉイド（以下ＭＴＴと略す）、１．１’−（３，３’
−ジメトキシ−４゜４′−ビフェニレン）−ビス（５−
（４−二トロフェニル）−３−（４−（２−ヒドロキシ
−３−（２−ヒドロキシエチルジエチルアミノ）プロポ
キシ）７エエル））−２Ｈテトラゾリウムクロライドｃ
以下Ｗ、Ｓ、ＮＴＢと略す）等が使用でき、その濃度は
５０〜２０００μｍｏＡｅ／ｌの範囲であるが、好まし
くは１００−５００ ｐｒｎｏＬｅ／Ｌの範囲である。
トロブルーテトラゾリウムｃ以下ＮＴＢと略す）、３−
（ｐ−インドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−７エエルー２Ｈテトラゾリウムクロライド（以下
ＩＮＴと略す）、３− （４、５−ジメチル−２−チア
ゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムプ
ロｉイド（以下ＭＴＴと略す）、１．１’−（３，３’
−ジメトキシ−４゜４′−ビフェニレン）−ビス（５−
（４−二トロフェニル）−３−（４−（２−ヒドロキシ
−３−（２−ヒドロキシエチルジエチルアミノ）プロポ
キシ）７エエル））−２Ｈテトラゾリウムクロライドｃ
以下Ｗ、Ｓ、ＮＴＢと略す）等が使用でき、その濃度は
５０〜２０００μｍｏＡｅ／ｌの範囲であるが、好まし
くは１００−５００ ｐｒｎｏＬｅ／Ｌの範囲である。
ＮＡＤ濃度としては５ Ｇ ＝ ２０００ ）ｔｎｏＬ
ｅ／Ｌ。
ｅ／Ｌ。
好ましくは１００〜５００μｍｏｌｅ／Ｌの範囲で使用
するのが良い。
するのが良い。
また、３ａ−１８０１１度は１０−５０００単位／１０
０れば充分であるが、好ましくは２００〜５００単位／
Ｌの範囲で使用するのが良い。
０れば充分であるが、好ましくは２００〜５００単位／
Ｌの範囲で使用するのが良い。
電子キャリヤー物質としてはジアホラーゼ、１−メトキ
シ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェ−ト（以
下１−メトキシ−ＰＭ８と略す）、フェナジンメトサル
フェートｃ以下ＰＭ８と略す）または９−ジメチルアミ
ノベンゾ−α−７エナゾキソエウムクロライド（以下メ
ルトラブル−と略す）等が挙げられ、その濃度範囲はジ
アホラーゼでは１０〜５０００単位７ｔ、好ましくは１
００〜５００単位／ｌでｓｂ、その他のものでは０．１
＝ １０００７ａｍｏＬｅμ、好ましくは１−２００゜
μｒｎｏＬｅ／ｌの範囲である。
シ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェ−ト（以
下１−メトキシ−ＰＭ８と略す）、フェナジンメトサル
フェートｃ以下ＰＭ８と略す）または９−ジメチルアミ
ノベンゾ−α−７エナゾキソエウムクロライド（以下メ
ルトラブル−と略す）等が挙げられ、その濃度範囲はジ
アホラーゼでは１０〜５０００単位７ｔ、好ましくは１
００〜５００単位／ｌでｓｂ、その他のものでは０．１
＝ １０００７ａｍｏＬｅμ、好ましくは１−２００゜
μｒｎｏＬｅ／ｌの範囲である。
更に１本発明で用いる３−オキソステロイド−Δ４−デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，３，９９，５、ＥＣ。
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，３，９９，５、ＥＣ。
１、３．９９．６ ） または３−オキソステロイド
−Δ１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，３，９９，４）
はシュードモナス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属〔ジ
ャーナルオブザケミカルンサエテイ：ケミカルコミュニ
ケーシ”１ンズ（Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 ８ｏｃ、 ； Ｃ
ｈｅｍ、 Ｃｏｍｍ ） ３巻１１５頁１９７４年、ジ
ャーナルオブパイオロジカルケミストリ−（Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２１８巻 ６７５頁１９５６
年、同２３４巻２０１４頁１９５９年バイオケ電力パイ
オフイジカアクタ（Ｂｌｏｃｈｅｍ。
−Δ１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，３，９９，４）
はシュードモナス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）属〔ジ
ャーナルオブザケミカルンサエテイ：ケミカルコミュニ
ケーシ”１ンズ（Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 ８ｏｃ、 ； Ｃ
ｈｅｍ、 Ｃｏｍｍ ） ３巻１１５頁１９７４年、ジ
ャーナルオブパイオロジカルケミストリ−（Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２１８巻 ６７５頁１９５６
年、同２３４巻２０１４頁１９５９年バイオケ電力パイ
オフイジカアクタ（Ｂｌｏｃｈｅｍ。
Ｂｌｏｐｈｙ、 Ａｃｔａ ） ５６巻５８４頁１９６
２年〕；アースロパクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ
）属〔ヨーロピアンジャーナルオブバイオケンストリ
ー□Ｃｕｒ。
２年〕；アースロパクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ
）属〔ヨーロピアンジャーナルオブバイオケンストリ
ー□Ｃｕｒ。
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ） ４７巻“５５５頁１９７
４年〕：ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｌａ ）属〔ケミ
カルアンドファーマシューテイカルブリテン（Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ ） ２１巻２７９４頁１９７３年、同２
３巻２１６４頁１９７５年、ジサーテーシ８７アブスト
ラクト（ＤｉｓｓｅｒｔａｔｌｏｎＡｂｓｔｒｕｃｔｓ
） ３５巻３８３９頁１９７５年〕；コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ ）属（米国特
許第３６３９２１２号）などの微生物に広く存在するこ
とが知られている。
４年〕：ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｌａ ）属〔ケミ
カルアンドファーマシューテイカルブリテン（Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ ） ２１巻２７９４頁１９７３年、同２
３巻２１６４頁１９７５年、ジサーテーシ８７アブスト
ラクト（ＤｉｓｓｅｒｔａｔｌｏｎＡｂｓｔｒｕｃｔｓ
） ３５巻３８３９頁１９７５年〕；コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ ）属（米国特
許第３６３９２１２号）などの微生物に広く存在するこ
とが知られている。
本発明者らは前記記載のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２３４巻 ２０１４頁 １９５９年のレビー（Ｌｅｖ
ｙ ）らの方法に従ってシュードモナステストステロニ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
）を培養し、その菌体よシ３−オキソステロイド−Δ
４−デヒドロゲナーゼおよび３−オキソステロイド−Δ
！−デヒド四ゲナーゼを精製しそれを使用した。これら
の酵素を本発明に使用する場合５０〜１ｏｏｏｏ単位／
ｌの濃度があれば充分であるが、特に３００〜３０００
単位／ｌの範囲で使用するのが好ましい。
２３４巻 ２０１４頁 １９５９年のレビー（Ｌｅｖ
ｙ ）らの方法に従ってシュードモナステストステロニ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
）を培養し、その菌体よシ３−オキソステロイド−Δ
４−デヒドロゲナーゼおよび３−オキソステロイド−Δ
！−デヒド四ゲナーゼを精製しそれを使用した。これら
の酵素を本発明に使用する場合５０〜１ｏｏｏｏ単位／
ｌの濃度があれば充分であるが、特に３００〜３０００
単位／ｌの範囲で使用するのが好ましい。
本発明方法は、３ａ−ヒドロキシステロイドを含む試料
について適用することができ、該試料としては、例えば
血清、血漿あるいは尿等が挙げられる。
について適用することができ、該試料としては、例えば
血清、血漿あるいは尿等が挙げられる。
本発明方法による３α−ヒドロキシステロイドの定量は
、上記の如くして反応せしめた後、反応液中に停止液を
加えて反応を停止し、反応液中に存在するホルマザン類
の吸光度を測定しても良いし、また、一定時間範囲内に
おける反応液中のホルマザン類の増加を吸光度で測定し
ても良い。なお、停止液には塩酸、硫酸、リン酸等の無
機酸類もしくはクエン酸、酢酸等の有機酸を使用するこ
とができる。
、上記の如くして反応せしめた後、反応液中に停止液を
加えて反応を停止し、反応液中に存在するホルマザン類
の吸光度を測定しても良いし、また、一定時間範囲内に
おける反応液中のホルマザン類の増加を吸光度で測定し
ても良い。なお、停止液には塩酸、硫酸、リン酸等の無
機酸類もしくはクエン酸、酢酸等の有機酸を使用するこ
とができる。
本発明法は前記反応機構で示したように、ホルマザン類
（１）およびホルマザン類■を生成せしめ、その吸光度
を測定するものである。つまシネ発明法はホルマザン類
ωおよびホルマザン類■の両方を利用し測定するため高
感度の測定が可能となったものである。
（１）およびホルマザン類■を生成せしめ、その吸光度
を測定するものである。つまシネ発明法はホルマザン類
ωおよびホルマザン類■の両方を利用し測定するため高
感度の測定が可能となったものである。
以上のように本発明方法は、従来より用いられていた酵
素共役系からのホルマザン類住）と本発明者らが見出し
た酵素共役系からのホルマザン類■の両者を利用するも
のであるため、被検体の加熱処理、除蛋白、抽出等の操
作を要せず、従来法では１００〜１０００μを必要であ
った血清または血漿を５０μを程度にまで減らすことの
できる感度の良いものである。
素共役系からのホルマザン類住）と本発明者らが見出し
た酵素共役系からのホルマザン類■の両者を利用するも
のであるため、被検体の加熱処理、除蛋白、抽出等の操
作を要せず、従来法では１００〜１０００μを必要であ
った血清または血漿を５０μを程度にまで減らすことの
できる感度の良いものである。
次に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。
実施例１
４００ ｐｍｏｔ７ｔのＮＡＤ、２００μｍａｔ／ｌの
ＮＢＴ、５ＱＱ単位／ｌのジアホラーゼ、２００単位／
１０３Ｑ−Ｈ８Ｄ、５００単位／ｌの３−オキソステロ
イド−Δ４−デヒドロゲナーゼを含む５９ ｍｍｏｊ／
ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）（以下測定試液という） ０
．５ ｍに被検体５０μＬを加えて３７℃で１０分間正
確に反応させ、次に反応停止液（０，Ｉ Ｎ−ＨＣ／、
） ０．ｌｄを加える。５分間放置後波長５４０ ｆｌ
ｍで吸光度を測定する。また同−試１料について３Ｑ−
Ｈ８Ｄを除いた測定試液で同様な操作を行ない検体ブラ
ンク（盲検）とする。なお、被検体としてはグルココー
ル酸（以下ＧＣと略す）を添加した血清を無添加血清で
糧々の、濃度に希釈したものを使用した。この結果を第
１表Ｋ、また、この結果に基いて作成した検量線を第１
図に示す。
ＮＢＴ、５ＱＱ単位／ｌのジアホラーゼ、２００単位／
１０３Ｑ−Ｈ８Ｄ、５００単位／ｌの３−オキソステロ
イド−Δ４−デヒドロゲナーゼを含む５９ ｍｍｏｊ／
ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）（以下測定試液という） ０
．５ ｍに被検体５０μＬを加えて３７℃で１０分間正
確に反応させ、次に反応停止液（０，Ｉ Ｎ−ＨＣ／、
） ０．ｌｄを加える。５分間放置後波長５４０ ｆｌ
ｍで吸光度を測定する。また同−試１料について３Ｑ−
Ｈ８Ｄを除いた測定試液で同様な操作を行ない検体ブラ
ンク（盲検）とする。なお、被検体としてはグルココー
ル酸（以下ＧＣと略す）を添加した血清を無添加血清で
糧々の、濃度に希釈したものを使用した。この結果を第
１表Ｋ、また、この結果に基いて作成した検量線を第１
図に示す。
以下余白
結果 第１表
実施例２
血清１０検体を各々５０μを使用し、実施例１と同様に
操作して各血清の吸光度を求め、検量線の回帰式（Ｙ＝
１．４７４Ｘ＋２．１１８、ｙ：ｍ−Ａｂｓ ％ｘ ：
ｐｒｎｏｔｅ／Ｌ ）よＦ）３Ｑ−ヒドロキシステロ
イド量を算出した。この結果を第２表に示す。
操作して各血清の吸光度を求め、検量線の回帰式（Ｙ＝
１．４７４Ｘ＋２．１１８、ｙ：ｍ−Ａｂｓ ％ｘ ：
ｐｒｎｏｔｅ／Ｌ ）よＦ）３Ｑ−ヒドロキシステロ
イド量を算出した。この結果を第２表に示す。
以下余白
第２表
実施例３
実施例１の測定試液に５Ｑ０単位／ｌの３−オキソステ
ロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼを加えて実施例１と全
く同様に操作を行ない、検量線を求めた。
ロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼを加えて実施例１と全
く同様に操作を行ない、検量線を求めた。
結果 第３表
実施例４
実施例１の測定試液のジアホラーゼの代わシに１５０
ｐｍｏｌ、／ｌ Ｏ１−メトキシ−ＰＭＳを使用して実
施例１と全く同様に操作を行ない検量線を求めた。
ｐｍｏｌ、／ｌ Ｏ１−メトキシ−ＰＭＳを使用して実
施例１と全く同様に操作を行ない検量線を求めた。
結果 第４表
実施例５
４００ ｐｍｏＬ／ｌＯＮ Ａ Ｄ 、 ２００ ｆｉ
ｍｏｔ／ＬのＷ。
ｍｏｔ／ＬのＷ。
Ｓ、ＮＴＢ、５Ｑ０単位／Ｌのジアホラーゼ、２Ｑ０単
位／Ｌの３Ｑ−Ｈ８Ｄ、５Ｑ０単位／１ｆ）３−オキソ
ステロイド−Δ４−デヒドロゲナーゼを含む５０ ｍｍ
ｏＬ／ｌ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）（以下測定
試薬という） ０．５ ｍに被検体５０μＬを加えて、
３７℃で１０分間正確に反応させ、次に反応停止液（０
，Ｉ Ｎ −Ｈｃｔ） ０．５ ｍを加える。５分間放
置後、波長６００ ａｍで吸光度を測定する。また、同
一試料について３α−Ｈ８Ｄを除いた測定試薬で同様な
操作を行ない検体ブランクＣ盲検）とする。なお、被検
体としてはＧＣを添加した血清を無添加血清で種々の濃
度に希釈して使用し、検量線を求めた。
位／Ｌの３Ｑ−Ｈ８Ｄ、５Ｑ０単位／１ｆ）３−オキソ
ステロイド−Δ４−デヒドロゲナーゼを含む５０ ｍｍ
ｏＬ／ｌ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）（以下測定
試薬という） ０．５ ｍに被検体５０μＬを加えて、
３７℃で１０分間正確に反応させ、次に反応停止液（０
，Ｉ Ｎ −Ｈｃｔ） ０．５ ｍを加える。５分間放
置後、波長６００ ａｍで吸光度を測定する。また、同
一試料について３α−Ｈ８Ｄを除いた測定試薬で同様な
操作を行ない検体ブランクＣ盲検）とする。なお、被検
体としてはＧＣを添加した血清を無添加血清で種々の濃
度に希釈して使用し、検量線を求めた。
結果 第５表
実施例６
実施例５の測定試薬のＷ、 Ｓ、 Ｎ Ｔ Ｂの代わり
に２００ ｐｍｏＬ／Ｌ ＯＮ Ｔ Ｂを、またジアホ
ラーゼの代わりに２５μｍＯＬ／Ｌのメルトラブル−を
使用して実施例５と全く同様に操作を行ない検量線をも
とめた。
に２００ ｐｍｏＬ／Ｌ ＯＮ Ｔ Ｂを、またジアホ
ラーゼの代わりに２５μｍＯＬ／Ｌのメルトラブル−を
使用して実施例５と全く同様に操作を行ない検量線をも
とめた。
結果 第６表
第１図は、実施例１により得られた検量線を示す図面で
ある。縦軸は吸光度、横軸はＧＣ添加濃度（μｍａｔｅ
μ）である。 以上 ；“−“・’Ｊ ／ｉ 二′−’２−ノ
ある。縦軸は吸光度、横軸はＧＣ添加濃度（μｍａｔｅ
μ）である。 以上 ；“−“・’Ｊ ／ｉ 二′−’２−ノ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、被検体にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
存在下３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを
作用せしめ、次いで得られた反応生成物にテトラゾリウ
ム若しくはその塩、電子キャリヤー物質並びに３−オキ
ソステロイド−Δ＾１−デヒドロゲナーゼ又は／及び３
−オキソステロイド−Δ＾４−デヒドロゲナーゼを作用
せしめ、生成したホルマザン類を測定することを特徴と
する３α−ヒドロキシステロイドの定量法。 ２、電子キャリヤー物質がジアホラーゼ、１−メトキシ
−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェ−トまたは
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムク
ロライドのいずれかである特許請求の範囲第１項記載の
定量法。 ３、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、３α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム
またはその塩類、電子キャリヤー物質および３−オキソ
ステロイド−Δ＾４−デヒドロゲナーゼまたは／および
３−オキソステロイド−Δ＾１−デヒドロゲナーゼを含
有する３α−ヒドロキシステロイド定量用試薬。 ４、電子キャリヤー物質がジアホラーゼ、１−メトキシ
−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェートまたは
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムク
ロライドのいずれかである特許請求の範囲第３項記載の
定量用試薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60064547A JPS61225000A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | ３α―ヒドロキシステロイドの定量法及びこれに用いる試薬 |
| US06/861,725 US4816394A (en) | 1985-03-28 | 1986-05-12 | Quantitative analysis of 3α-hydroxysteroid and reagent useful therefor |
| EP19860106409 EP0245528B1 (en) | 1985-03-28 | 1986-05-12 | Quantitative analysis of 3 alpha-hydroxysteroid and reagent useful therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60064547A JPS61225000A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | ３α―ヒドロキシステロイドの定量法及びこれに用いる試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61225000A true JPS61225000A (ja) | 1986-10-06 |
Family
ID=13261353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60064547A Expired - Lifetime JPS61225000A (ja) | 1985-03-28 | 1985-03-28 | ３α―ヒドロキシステロイドの定量法及びこれに用いる試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4816394A (ja) |
| JP (1) | JPS61225000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025589A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-06-25 | 重庆第二师范学院 | 3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2534044B2 (ja) * | 1986-11-11 | 1996-09-11 | 第一化学薬品株式会社 | ３−オキソ−５β−ステロイドの定量法及びその定量用試薬 |
| JP2811319B2 (ja) * | 1989-04-18 | 1998-10-15 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物 |
| ATE272836T1 (de) | 1999-03-19 | 2004-08-15 | Sapporo Immuno Diagnostic Lab | Verfahren zur bestimmung eines substrates, und biosensor |
| EP1314786A4 (en) * | 2000-08-28 | 2005-01-19 | Sapporo Immuno Diagnostic Lab | METHOD AND DEVICE FOR EXAMINING DISEASES WITH SPECIFIED METABOLISM DISORDERS |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1163907A (en) * | 1980-04-09 | 1984-03-20 | Manabu Yamanaka | Method for the estimation of hydroxysteroids and reagent system therefor |
| DE3048662A1 (de) * | 1980-12-23 | 1982-07-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisierte zubereitung von tetrazoliumsalzen |
-
1985
- 1985-03-28 JP JP60064547A patent/JPS61225000A/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-05-12 US US06/861,725 patent/US4816394A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113025589A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-06-25 | 重庆第二师范学院 | 3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用 |
| CN113025589B (zh) * | 2021-04-21 | 2023-04-07 | 重庆第二师范学院 | 3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4816394A (en) | 1989-03-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |