JPH0223888A - リゾチーム活性の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリゾチーム活性の定量法及び定量用組成物に関
する。体液中のリゾチーム活性の定量は胃疾患のスクリ
ーニング及び急性白血病の臨床診断に利用される。

従来の技術 リゾチーム活性の定量法としては、キトペンタオースを
基質とし、Ｎ−アセチルヘキソサミンオキシダーゼ（以
下、ＮＡＨＯＤと称す）を用い、生成する過酸化水素を
定量する方法（特開昭６１−１２４３９４号公報）、ｐ
−ニトロフェニルーペンタ−Ｎ−アセチル−β−キトペ
ンタオキシドを基質とし、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミニダーゼ（ＥＣ３，２，１，３０、以下ＮＡＧと
称す）を用い、生成するｐ−ニトロフェノールを定量す
る方法（特開昭６２−２７８９９９号公報）等が知られ
ている。

特開昭６１−１２４３９４号公報の方法の場合、ＮＡＨ
ＯＤは、Ｎ−アセチルグルコサミンの他に基質として使
用されているキトペンタオースをも酸化してしまう性質
を有している為、非常に高いブランクが生じてしまう。

従って、該方法では、低リゾチーム活性を有する試料で
の正確な活性が求めにくいという欠点がある。

特開昭６２−２７８９９９号公報の方法の場合、リゾチ
ーム及びＮＡＧの作用ｐＨ（約６．０）での、ｐ−ニト
ロフェノールの解離が不充分である。その為、リゾチー
ムの反応終了後、ｐＨをアルカリ側に調整し、ｐ−二ト
ロフェノールを十分に解離させてから測定しなければな
らない。従って、該方法ではリゾチーム活性を経時的に
測定することができないという欠点がある。

発明が解決しようとする課題 リゾチーム活性を高感度で経時的に測定できる定量法が
求められている。

課題を解決するための手段 本発明は試料中のリゾチームを下記式（１）で表される
４−ニトロフェニルキトペンタオサイドに作用させ、４
−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グルコサミナ
イドを生成させ、該４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−１”ルコサミナイドにβ−Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコサミニダーゼを作用させ、Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミンを生成させ、該Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミンにＮ−アセチルヘキソサミンオキシダー
ゼを作用させ生成する温酸化水素を定量することを特徴
とするリゾチーム活性の定量法及び定量用組成物に関す
る。

前記の酵素反応が下記の反応式で示される。

４−ニトロフェニルキトペンタオサイドリゾチーム キトテトラオース＋４−ニトロ フェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−１”ルコサミナイド
（反応１） ４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−１’ＡＧ ルコサミナイド＋８２０　−　　Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン＋４−二トロフェノール（反応２） Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン＋８２０十〇２Ａ
ＨＯＤ ＝Ｎ−アセチルグルコサミン酸＋ Ｈ２Ｏ２（反応３） ↓ 定量 前記反応１において、４−ニトロフェニル−Ｎアセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイドと同時に生成したキトテト
ラオースのＮＡＨＯＤによる酸化速度は非常に遅いので
、キトテトラオースから生じる過酸化水素の１は無視で
きる程度である。

従って、生成するキトテトラオースはリゾチーム活性の
定量には影響しない。

本発明で用いる基質、４−ニトロフェニルキトペンタオ
サイドの濃度としては、０．０　Ｏ５〜１ｍＭの範囲が
好ましい。

ＮＡＧとしては、４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミナイドを加水分解してＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミンを生成する酵素であればいかな
る起源のものでもよく、例えば、牛腎臓、そら豆、微生
物由来のものが用いられる。ＮＡＧの使用濃度としては
、０．０１〜２単位／　ｍ　Ｉの範囲が好ましい。

ＮＡＨＯＤとしては、Ｎ−アセチル−β−Ｄグルコサミ
ンを酸化して過酸化水素を生成するものであればいかな
る起源のものでもよく、例えば、微生物、特にシュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物の生産する
ものが用いられる。

ＮＡＨＯＤの使用濃度としては、０．１〜５単位／ｍ　
ｌの範囲が好ましい。

本発明を実施するには、一般にｐＨ４〜９の媛新剤、例
えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸１水和物
（ＭＥＳ）、　　リン酸塩、トリス塩酸塩、コハク酸塩
等中で、酵素の至適作用温度付近、通常２５〜４０℃で
行われる。又、前記反応液に必要に応じて、界面活性剤
としてトリトンＸ−１００（商品名）を添加してもよい
。

過酸化水素の定量法としては、公知の手法がいずれも適
用できる。

過酸化水素の生成量又は速度の測定法としては、化学発
光分析法、電気化学的分析法、けい光分析法２分光学的
分析法などが知られている（たとえば、有機合成化学基
会誌、第３９巻、第７号、　ｐ６５９〜６６６　（１９
８１）参照）。本発明においては、そのいずれもが適用
可能であるが、本発明の目的から迅速かつ高速度に過酸
化水素を検出するシステムを採用することが好ましい。

代表的な過酸化水素の測定法を以下にいくつか列挙する
。

まず、化学発光分析法としては、ルミノールを赤血塩の
存在下で過酸化水素と反応させ、酸化に伴う発光量を測
定する方法が挙げられる。ルミノールの代わりにイソル
ミノーノペピロガロール、ビス（２，４，６−）リクロ
ロフェニル）オキザレートなどを、赤血塩の代わりにパ
ーオキシダーゼ、ヘマチン、ヘミン、塩化コバルトなど
を使用する方法も知られている。

電気化学的分析法としては、クラーク型過酸化水素電極
を用いる方法が一般的である。過酸化水素を、パーオキ
シダーゼ又はモリブデン酸塩などの触媒存在下で、ヨウ
素イオンと反応させてヨウ素イオン電極で測定する方法
も使用できる。

けい光分析法としては、ホモバニリン酸ヲパーオキシダ
ーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する２、２
′−ジヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフェニル−
５，５′−ジ酢酸のけい光強度を測定する方法が挙げら
れる。ホモバニリン酸の代わりにｐ−ヒドロキシフェニ
ル酢酸、ジアセチルフルオレスシン誘導体（シアセチル
フルオレスシン、ジアセチルジクロロフルオレスシンな
ど）などを用いることもできる。

分光学的分析法としては、パーオキシダーゼ法、カタラ
ーゼ法などが一般的である。パーオキシダーゼ法は、色
原体をパーオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応さ
せ、生成する色素を比色定量する方法である。色原体と
しては、たとえば０ジアニシジン、ビス〔３−ビス（４
−タロロフェニル）メチル−４−デイメチル−アミノフ
ェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）　、４−メトキシ−１−ナ
フトール、２．２’−アジノービス（３−エチルベンゾ
チアゾリン）−６−スルホン酸などの単独試薬、４アミ
ノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（３メチルフエニル
）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）　、
フェノール系化合物（たトエハ、フェノール、ｐ−クロ
ロフェノーノｕ、２，４．６トリブロモフエノールなど
）、アニリン系化合物（たとえば、Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ。

Ｎ−ジエチルアニリンなど）またはトルイジン系化合物
（たとえば、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジンなど）
との組み合わせ試薬、３−メチル２−ペンソチアゾリノ
ヒドラゾンとＮ、　　Ｎ−ジメチルアニリンとの組み合
わせ試薬などを使用することができる。カタラーゼ法と
しては、過酸化水素をカタラーゼの存在下でアルコール
（メタノールなど）と反応させ、生成するアルデヒドを
発色系に導いて色素の吸光度測定を行う方法などが挙げ
られる。

これらの過酸化水素の検出系はいずれも公知の方法であ
り、その実施にあたってはそれぞれ公知の操作、条件を
参照すればよい。

本発明を実施する際の最も好ましい方法は、パーオキシ
ダーゼの存在下、Ｈ２Ｏ２と色原体とを反応させて生成
する色素による着色を比色定量（色素の吸収極大値にお
ける吸光度の測定）する方法である。

この方法を実施する際には、パーオキシダーゼ及び色原
体も試薬に加えられる。パーオキシダーゼ及び色原体の
使用濃度としては、０．１〜５０単位／　ｍ　ｌ及び０
．０１〜１ｍｇ／ｍ＋の範囲が好ましい。

本発明で用いられるリゾチーム活性定量用組成物は（イ
）４−ニトロフェニルキトペンタオサイド、（ロ）ＮＡ
Ｇ及び（ハ）ＮＡＨＯＤからなり、これらは（イ）０．
００５〜１ｍＭ、（＋り０．０１〜２単位／ｍｌ及び（
ハ）０．１〜５単位／ｍ＋の量比にしたものは使用に便
利である。さらに、必要に応じて緩衝剤、界面活性剤を
この組成物に組み合わせることができる。

以下に実施例を示す。

実施例１゜ 試料中のリゾチーム活性を下記試薬組成を用い、下記の
方法によって測定した。

（１）試薬 試薬Ａ ３０ｍＭ　　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，５）ト　リ　トン
Ｘ−１０００，５％ ４−アミノアンチピリン　　　０．４　ｍｇ／ｍ１４−
ニトロフェニルキトペンタオサイド０．５ｍＭ パーオキシダーゼ　　　　　　２０単位／ｍ１ＮＡＨＯ
Ｄ　　　　　　　　　　３．３　　”ＮＡＧ　　　　　
　　　　　　　０．６６”試薬Ｂ ５０ｍＭ　　ＭＥＳＩＪｊ衡液（ｐ　Ｈ６，５）ト　リ
　ト　ンＸ−１０００，５％ ＢＣＭＡ　　　　　　　　　　　０．０６ｍｇ／ｍ１（
２）測定方法 試薬Ａ　　１．５ｍｌに、既知濃度のリゾチームを含む
試料５０ＩＪ！！を添加した後、３７℃で５分間予備加
温した。ついで試薬Ｂ　　１，５ｍｌを添加し３７℃で
１０分間反応後生成した色素ｌを７５５ｎｍの吸光度で
測定した。

第１図に反応の経時変化を、第２図に検ｌ線をそれぞれ
示す。

実施例２゜ （１）試薬 試薬Ａ ３ＱｍＭ　　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，５）ト　リ　ト　
ン　　Ｘ−１０００，５％ＥＭＡＥ　　　　　　　　　
　　Ｏ，ｌｌｌ１ｇ／ｍ１４−ニトロフェニルキトペン
タオサイド０．５ｍＭ パーオキシダーゼ　　　　　　２０単位／ｍ　ＩＮＡＨ
ＯＤ　　　　　　　　　　３．３　　”ＮＡＧ　　　　
　　　　　　　　Ｏ，６６〃試薬Ｂ ５０ｍＭ　　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，５）ト　リ　ト　
ンＸ−１０００，５％ ４−アミノアンチピリン　　　０．　ｌ　ｍｇ／ｍ＋（
２）測定方法 試薬Ａ　　１．５ｍｌに、既知濃度のリゾチームを含む
試料５０層を添加した後、３７℃で５分間予備加温した
。これに、試薬Ｂを添加し、３７℃で１０分間反応後、
生成した色素量を５５５ｎｍの吸光度で測定した。

第３図に反応の経時変化を、第４図に検量線をそれぞれ
示す。

発明の効果 本発明方法により、リゾチーム活性を高感度で測定でき
る。

【図面の簡単な説明】

第１及び２図は実施例１における反応の経時変化及び検
量線をそれぞれ示す。 第３及び４図は実施例２における反応の経時変化及び検
量線をそれぞれ示す。 Ｏ 反　記・時間　（分） ○ 第２ 図 ソソ゛ナーム堡（ｍｇ／ｍＪり 厘１′ｉ：、騎聞 （分） 第４図 リソナーム！ （ｍｇ／ｍｉ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のリゾチームを下記式（ I ）で表される
   ４−ニトロフェニルキトペンタオサイドに作用させ、４
   −ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−−β−Ｄ−グルコサ
   ミナイドを生成させ、該４−ニトロフェニル−Ｎ−アセ
   チル−β−Ｄ−グルコサミナイドにβ−Ｎ−アセチル−
   Ｄ−グルコサミニダーゼを作用させＮ−アセチル−β−
   Ｄ−グルコサミンを生成させ、該Ｎ−アセチル−β−Ｄ
   −グルコサミンにＮ−アセチルヘキソサミンオキシダー
   ゼを作用させ生成する過酸化水素を定量することを特徴
   とするリゾチーム活性の定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）
2. （２）４−ニトロフェニルキトペンタオサイド、β−Ｎ
   −アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ及びＮ−アセチル
   ヘキソサミンオキシダーゼとからなるリゾチーム活性定
   量用組成物。