JPH02174695A - 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、電子受容体の存在においてアナライト（Ａｎ
ａｌｙｔｅｎ　）　ｆ酵素酸化し、アナライトの量の尺
度として還元嘔れ九電子受容体を発色により定量するこ
とによるアナライトの比色定量方法に関する。

さらに、本発明は、オキシドレダクターゼおよび発色性
電子受容体を含有する、アナライトの酵素酸化によるア
ナライトの比色定量試剤に関する。

本発明に、殊にアナライト／オキシダーゼ系ま７’ｌ＋
にアナライ）　／　ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナ
ーゼ系の直接電子受容体として、＋１と−１の間の酸化
段階にある窒素を有する化合物群からの物質の使用にも
及ぶ。

殊に、本発明は、オキシドレダクターゼを用いるアナラ
イトの酸化の際に発色性電子受容体として、ニトロソ化
合物、ヒドロキシルアミンおよびオキシムの群からの物
質の使用に関する。

〔従来の技術〕

酵素酸化は、分析術において種々の試料中の物質の検出
および定量が可能となる。この場合、酸化酵素は酸化反
応の電子を収容する受容体の存在で相応する酵素基質に
対して作用する。電子受容体の還元は、酵素基質の存在
を指示する。

この場合、還元烙れ友電子受容体を発色により検出しう
るのが、従来とくに有利であることが立証されている。

それというのもこれに必然的に高価な測定装置ｌヲ用い
た場合にだけ可能ではなく、場合によっては視覚により
行なうこともできるからである。

酸化酵素を用いる物質の公知比色定量法は、オキシダー
ゼまたはデヒドロゲナーゼを使用する。双方の酵素群は
、オキシドレダクターゼの主族に属する（　Ｒｏｅｍｐ
ｐｓ　Ｃｈｅｍｉｅ−Ｌｅｘｉｋｏｎ　。

Ｆｒａｎｃｋｈ出版代理店、ストットガルト、８版（１
９８５年）、第４巻、第２９５２頁；Ｌｅｘｉｋｏｎ　
Ｂｉｏｃｈ、ｅｎｏｉｅ　、　　Ｈｒｓｇ、　Ｈ，Ｄ、
　Ｊａｋｕｂｋｓ　。

Ｃｈｅｍｉｅ出版、ワインハイム、第２版（１９８１年
）、第１９４頁）、その構成員はその天然の電子受容体
に従って区別することができる。分析物の比色定量の九
めオキシダーゼ使用の先行技術の代表的なものに、タン
ス）　（Ａ、　Ｋｕｎｓｔ　）等によＶ“メソーズ・イ
ン・エンテマティック争アナリシス（Ｍｅｔｈｏａａ　
ｉｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ　）　’　
（Ｈｒｓｇ、　Ｈ，Ｕ、　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　＊Ｃｈ
ｅｍｉｓ出版、ワインハイム）、第３版（１９８４年）
、第６巻、第１７８〜１８５頁に引用ちれている。ここ
では、血清、血漿または脱タンパク血液中のグルコース
が、水溶液中でのグルコース・オキシダーゼとの反応お
よび突気酸化によって、この反応の際酸素の還元により
生成した過酸化水素がペルオキシダーゼの存在で、同様
に反応混合物中に存在するフェノールおよび４−アミノ
フェナジンに対して酸化的、従って発色的に作用するこ
とにより検出される。この文献自体には、誤差源として
、アスコルビン酸、尿酸ま念はグルタチオンのような還
元作用物質の存在が挙げられる。さらに、遷移金属イオ
ン、または血液からの試料中に容易に出現しうるヘムお
よびヘムタンパク質も不利な作用をする。

それというのもこれらは過酸化水素を分解するからであ
る。過酸化水素およびペルオキシダーゼおよび場合によ
り検出試薬中に含有されている他の物質、たとえばフェ
ノールま友は４−アミノフェナジンで発色する試料内容
物も、不正な結果を生じうる。かかる物ｆｉｊは、たと
えばビリルビンまたはα−メチルドーパのような医薬で
あってもよく、これらは完全に血液から誘導されｔ試料
ま７ｔは尿中に出現しうる。

ジーデル（Ｊ、　８１ｅｄｅｌ　）等は、１メソーズｅ
インーエンナマテイツク・アナリシス （Ｍｅｔｈｏａｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎａ
ｌｙｓｉｇ　）”（Ｈｒｓｇ、　Ｈ，Ｕ、　Ｂｓｒｇｍ
ｅｙｅｒ　、　　Ｃｈｓｍｉｇ出版、ワインハイム）、
第６版（１９８４年）、第８巻、第１６９〜第１４８頁
に、血？′ｆ！：ま次は血漿中の全コレステリンの比色
定量ゲ、まずエステル結合しているコレステリンをコレ
ステリンエステラーゼで遊離させるように記載している
。次いで、コレステリン七、コレステリンオキシダーゼ
および空気中酸素と水溶液中で反応場せて定量し、この
反応の際に生成し几過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在で、同様に、反応混合物中に存在するフェノールおよ
び４−アミノアンチピリンに対して酸化的、それと共に
発色的に作用する。発色は試料中の全コレステリン量の
尺度である＠ オキシダーゼを用いてグルコースを定量する上記の方法
につき記載逼れ九すべての欠点は、同程度に、記Ｉｖ芒
れ几コレステリン定量法にも該肖する。これらの欠点に
、検出反応をまたとえはヨーロッパ特許出願公開第００
１６３８７号、西ドイツ国特許出願公開第６２４７６０
８号、ヨーロッパ特許出願公開第０２６２４４５号ま几
はヨーロッパ特許出願公開第０２５６８０６号から公知
であるようなキュベツト中マ九に乾式試薬担体上で実施
するか否とは無関係である。

殊に、上記定量法をいわゆる乾式試験で固形担体上で実
施する場合、虐素必要量が付加的に不利であると立証さ
れた。なかんずく、高濃度の鼻累基質の酸化の次めに多
量の酸素が使用されると１！ニ、空気から反応媒体中へ
の酸素の拡散が速度決定工種になりかつ長い反応時間を
生じるか、または殊に動的測定法の場合には不正な結果
を生じうる。

デヒドロゲナーゼに全く一般的に、酵素基質の酸化にニ
コテ／アミド豊アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ　）
ま几はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リ
ン酸（ＮＡＤＰ　）　’ｉ自然の直接電子受容体として
必要とするようなものと、ＮＡＤ−ま九にＮＡＤＰ−非
依存性であって、酵素酸化反応の際に自然の直接電子受
容体以外の物質を使用するものとに分けることができる
。

比色測定にデヒドロゲナーゼを使用することは、たとえ
ば西ドイツ国特許出願公開第２１４７４６６号から公知
である。ここに仁、ラクテートをラクテート・デヒドロ
ゲナーゼの触媒作用下にニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチドと反応憾せて、ピルベートおよび還元され
たニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドにするこ
とが記載されている。生成し九ＮＡＤＨに、次いで九と
えば酵素ジアホラーゼの存在でテトラ・ｔリウム塩と、
ＮＡＤおよび有色ホルマザンの生成下に反応させ、その
濃度を光度測定によって定量することができる。ジアホ
ラーゼの代りに、ＮＡＤＨからテトラゾリウム塩への電
子の移動のための還元触媒としてＮ−メチルツェナジニ
ウム・メトサルフェートモ挙ケラれている。

この方法の欠点は、ＮＡＤＨＯ代りに、場合により九と
えは血液、血清、血漿まｍＨ尿のような生物試料中に出
現する、グルタチオンのような他の還元性物質ま友はメ
ナルドーパま九にドペスレート（Ｄｏｂｅｓｙｌａｔ　
）　ノヨウナ薬ｔ、ジアホラーゼまたはＮ−メチルツェ
ナジニウム・メトサル７エートテトラデリウム塩のよう
な還元触媒の存在で相応するホルマザンに変え、こうし
てプラスの不正な結果を生じる点に昭められる。

逼らに、アナライトの酸化によって遊離する電子をアナ
ライト／酵素系から発色に役立′）電子受容体の系に伝
達するために、ジアホラーゼま之に２エナジニウムメト
サルフエートのような還元触媒が必要であることも、こ
れにより他は同じ条件下で還元されず、マイナスの不正
な結果を生じる他の試料随伴物質も還元されるという欠
点を内包する。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明に、上述し次先行技術の欠点の救済策ｔ−講じる
。殊に、本発明の課題は、殊に生物学的液体の分析の友
め、電子受容体の存在でアナライト／酵素系化し、アナ
ライトの量の尺度として発色により電子受容体を定量す
る、アガイドノの比色定量法であって、試料、殊に血液
により同伴される液体、たとえば血清のような生物学的
試料中または尿中の、殊に過酸化水素ケ分解が する還元性同伴物質ｒ妨害せず、ジアホラーゼまたｆｌ
Ｎ−メチルツェナジニウムメトサルフェートのような濃
元触媒の使用を回避し、その代りに酸素を必要とゼず、
かつこれによって高い基質濃度において迅速な発色最終
値を可能にする方法全提供することである。

ケらに、オキシドレダクターゼおよび発色電子受容体？
含有する、前記方法の実施に適当な、アナライトの比色
定量試剤も利用されるぺ！である。

詳細には課題は、上記のような改良され次定量法および
定Ｊｔ１５に剤用の発色性電子受容体として使用するこ
とのできるような物質の遇択にも及ぶ。

〔課題を解決する几めの手段〕

この課題に、特許請求の範囲に記載され次発間によって
解決される。

これによれば、アナライトを電子受容体の存在で酵素酸
化し、アナライトの量の尺度として発色により還元され
た電子受容体を定量する、アナライトの比色定量法であ
って、アナライト？、直接電子受容体として＋１と−１
の間の酸化段階にある窒素を有する化合物群からの物質
の存在で相応するオキシドレダクターゼを用いて酸化す
ることを特徴とする比色定量法が見出ちれた◇ さらに、オキシドレダクターゼおよび発色性電子受容体
を含有する、酵素酸化によるアナライトの比色定量試剤
であって、発色電子受容体が、直接にアナライト／酵素
系と反応する、＋１と−１の間の酸化段階にある窒素を
有する化合物群からの物質であること１に特徴とする比
色定量試剤が見出逼れ九。

直接電子受容体として＋１と−１の間の酸化段階にある
窒素２１ｉ−有する化合物群からの物質の使用がとくに
適当であることが見出嘔れｔ０本発明によれば、′アナ
ライト”とは酵素によＶ酸化されるような物質を表わす
。多くの場合、アナライトは、検査すべき試料中で直接
に検出ま念に定量されるような物質である。次とえば、
グルコースに直接にグルコースオキシダーゼで酸化し、
比色法で定量することができる。

しかし、アナライトラ、他の物質から前接された１りま
几ニ幾つかの反応によってはじめて生成させ、こうして
アナライトの存在および濃度から間接的に出発物質の存
在および濃度を推論することも可能である。九とえはグ
リセリンに、最初の反応でグリセリンをグリセリンキナ
ーゼおよびアデノシン三リンＩＭＩ−用いてグリセリン
−３−リン酸と７デノシンニリン酸とに変え、引１■第
二反応でグリセリン−６−リン酸をグリセリン−ろ−リ
ン酸オキシダーゼで酸化するようにして検出し、定量す
ることができる。

この場合、グリセリン−６−リン酸にアナライトであっ
て、その濃度は定量丁べき物質、つまジグリセリンの濃
度に一致する。しかし、アナライトはこの場合でも、比
色定量されるような化合物である。

本発明においてアナライトは、それぞれの酸化ｌＰ１累
の基質として受容されるような物質である。アナライト
を酸化する比めには、酵素の共同作Ｔｐ下にアナライト
から電子を受は取る電子受容体が同時に添加されていな
ければならない。

ところで意外にも、＋１と−１の間の酸化段階にある窒
素を有する化合物群からの物質、望ましくは＋１または
−１の酸化段階にある窒素を有する化合物は酸化酵素用
の発色性電子受容体でありうることが見出嘔れた。

この点で”発色１とは、電子受容体が還元後に直接にそ
れ自体がアナライトのｒ９１素僚化前とで因果的に反応
混合物の変色を生じることを宍わ丁。この場合変色は、
無色からＭ色への変換々らびに１つの色から他の色への
変換を包含する。連続反応による発色には専門家に多数
の方法が公知であり、それから条件に応じて選択するこ
とができる。九とえば、還元された電子受容体自体が有
色化合物の部分になるような反応、たとえば酸化的カッ
プリング反応が挙げられる。

発色的逐次反応は、還元された電子受容体が他の物質に
対するその還元作用によって該物質を変色するようなも
のであってもよい。

酸化段階とは、中性の分子ま几は電荷を有する錯イオン
であってもよい化合物中の特定原子の酸化状態を示す数
値を戎わす。専門家には、酸化段階を確かめる手段に公
知である。この数値に確かめる次めの指針は化学の基本
的教科書、たとえば１アンオルガニツシエ・ヒエミー（
Ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　）　”　（
Ｈｏｆｍａｎｎ　＆Ｒｕｅｄｏｒｆｆ　、　　Ｆ、　Ｖ
ｉｅｗｅｇ　＆ｌ　８ｏｈｎ出版、ブラウンシュパイク
）、第２０版（１９６９年）、第２１６〜ｆｆ１２１８
員：　”レールブラフ・デル・ア／オルガニツシエン・
ヒエミー（Ｌｅｈｒｂｕｃｈｄｅｒ　ａｎｏｒｇａｎｉ
ｓｃｈｅｎ　Ｃｈａｍｉｅ　）　’　（Ｈｏｌｌｅｍａ
ｎｎ−Ｗｉｂｅｒｇ　、　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｏ　Ｇｒｕ
ｙｔｅｒ　＆ｓ　Ｃｏ、出版、ベルリン）、第７１４第
８０版（１９７を年）、第１９７〜第１９９頁、ま飽１
アンオルが二りム（Ａｎｏｒｇａｎｉｋｕｍ　）　”　
（Ｈｒｓｇ、　Ｌ、　Ｋｏｌｄｉｔｚ　。

ＷＥＢ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ科学出版、ベルリン）、第
４版（１９７２年）、第４４６頁から昭められる。

本発明による望ましい電子受容体は、Ｎ−オキシド、ニ
トロソ化合物、ヒドロキシルアミンおよびオキシムであ
る。とくに望ましいのＵＮ−オキシド、ニトロソ化合物
およびオキシムである。

なかんずく、Ｎ−オキシドのｒＲ素゛を有する窒素伸子
が芳香族環系の部分であるよりなＮ−オキシドが有利に
使用しうる。これの例は、九とえばヨーロッパ特許出願
公開第０１５６３４７号に記載されているようなレゾア
ズリンまたはレゾアズリン誘導体である。この化＠ｒ初
中でに、Ｎ−オキシドの窒素原子は酸化数−１を有する
。

電子受容体としてのレゾアズリンおよびレゾアズリン誘
導体は、酵素酸化の際にレゾルフィンないしはレデルフ
イ／誘導体に還元される。

これと明瞭な変色がｆｒ会している。たとえばレゾアズ
リンは青に、レゾルフィンに赤に着色逼れている。

さらに、有利に使用しうる芳香族Ｎ−オキシドとしては
、その炭素芳香族部分宿造が低分子環置換基によって置
換されていてもよいベンゾフロキサンまたはベンゾフロ
キサン誘導体を挙げることができる。この点で、低分子
４ｆｌ換基は約４００ダルトンまでの分子ｔを有するも
のであってもよい。

とくに望ましいペン・戸フａキサンは、九とえは一般式
■によって表わ嘔れる： 式中　Ｒ１およびＲ２ハ同じかま７’！＋は異っていて
もよく、水素、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ア
ルキルカルボニルまｅｈホルミルヲ異わす。

これらの化合物におけるＮ−オキシドの窒素原子に酸化
段階＋１を頁する。

低級アルキルおよび低級アルコキシは炭素原子数１〜５
の基である。とくに望ましいのはメチルないしにメトキ
シである。

低級アルキルカルボニルとは、アルキル基に１〜５個の
炭素原子を有するような基を衣わ丁。

とくに望ましいのはアセチルである。

酵素酸化の際電子受容体として一般式Ｉの上記ベンゾフ
ロキサンを使用する場合、無色化合？！Ｉは有色化合物
に還元される。大体において、オレンジ色の化合物の生
成が行なわれる。

本発明方法には、アナライトのＩＪｌ、素酸化に対する
直接呈色指示薬として上記の芳香族Ｎ−オキシドを使用
することができる。この几めには、酸化＃累を芳香族Ｎ
−オキシドと一緒に検査すべき試料と接触させる。試料
が、酵素によって酸化賂れうるアナライトを含有する場
合には、ＵＮ−オキシドは、還元によってその色が変わ
り、こうして試料中のアナライトの存在を指示する電子
受容体として使用される。新九に生成し比色の濃さから
、試料中のアナライトの濃度全推測することができる。

アナライトｒ比色定量するための本発明方法に使用でき
る適当がニトロソ化合物は、望ましくは、ニトロソ基を
芳香族基に結合して含有するようなものである。

とくに望ましいのに、ニトロソペンゾールおよびニトロ
ソペンゾール誘導体のような炭素芳香族ニトロソ化合物
である。この場合、ニトロソベンテール誘導体とじてに
、還元によってさきの説明の意味での発色のｔめに使用
することのできるような化合物に変わるすべてのニトロ
ソペンゾール誘導体が極めて好適である。

ニトロソペンゾールおよびニトロソペンテール誘導体は
一般に備かに有色の、黄、緑またに褐色に着色しており
、還元状態では着色されてない？Ｊ質である。従ってこ
のものは、アナライトを比色法で検出できるようにする
九めには、逐次反応で発色させねばならない。これは九
とえば、還元されたニトロソ化合物を他の物質と反応さ
せ、還元ａれたニトロソ化合物上部分構造として含有す
る有色物質が得られるようにすることによって達成する
ことができる。

酸化カップリンク反応す、この種の発色の１方法でちる
。それ攻、本発明方法にとり、酸化酵素の電子受容体と
して作用するだけでなく、還元状態でも酸化カップリン
グ反応に使用しうるようなニトロソペンゾール誘導体が
適当であるＯ とくに１ましいのは一般式ｎのニトロソペンゾール誘導
体である： 式中、Ｒはヒドロキシ基ま友はアミノ基を辰わし、その
際アミノ基は１個またに２＠の低級アルキルによって置
換烙れていてもよく、低級アルキル基それ自体は１個の
ヒドロキシ基、１個″！７？、μ数個の低級アルキルに
よって置換されたアミノ基、ｐｏ３ｕ、　、５ｏ３ｆ（
ま７？、はｃｏ２ａによって置換逼れていてもよい。

好適なのは、殊に弱揮発性であるような一般式りのニト
ロソペンプール誘導体である。

上記の定量において低級アルキルは、炭素原子数１〜５
のアルキル基’ｋｆｆわ丁。とくに望まのとしてま友に
壇の形でアンモニウム塩、アルカリ金ｍ塩ま几にアルカ
リ土類金属塩として存在シラる。アンモニウム塩は、非
置換のアンモニウムカチオンＮＨ４”　ｉ含有するもの
、まｔは１個または数個の低級アルキル、アリールま九
ｅコ／および低級アルキルアリールによって置換ちれ几
アンモニタムカナオンを含有するものである。低級アル
キルにそれぞれ炭素原子数１〜５のアルキル基を表わす
。アリール基は、炭素原子数６〜１０の芳香族理系であ
る。

低級アルキルとしてはメチルおよびエチルが有利に使用
される。望ましい了り−ル基は）工二ルであり、この場
合ベンジルは望ましい低級アルキルアリールｆである。

本発明方法の電子受容体としては、ｐ−ヒドロキシ−ニ
トロンペンゾール、ｐ−ジメチルアミン−ニトロンペン
ゾール、ｐ−ジエチルアミノ−ニトロソペン・戸−ルお
よびｐ−ジヒドロキシエテルアミノ−ニトロ７４７１戸
−ルがトくニ好適である。

上述したように、本発明方法にと９望ましくは、窒素が
＋１の酸化段階にあるニトロンペン・戸−ルまたけニト
ロンペンゾール誹導体を、検査すべき試料および酸化酵
素と接触させる。酵素基質として受容１れる試料中にア
ナライトが存在する場合、ニトロソペンゾールま几はニ
トロソペンゾール誘導体ｒｘ＊子受容体として＃Ｉ８、
これにより相応するアミンに還元される。一般に、ニト
ロソ化＆’＋Ｗ単独の還元はアナライトの比色定量には
十分で框ない。それというのも減色が生じるだけがまた
は変色が弱く認めうるにすぎないからである。還元され
次電子受容体は酸化カップリング反応の出発物質として
使用でき、この場合カップリング成分の選択により極め
て種々の色を得ることができる。

酸化カップリング反応は専門家に公矧であり、たとえば
ヨーロッパ特許出願公開第０１７５２５０号を九はヒュ
ニヒ（肌Ｈｕｅｎｉｇ　）等（′″Ａｎｇｅｗａｎｄｉ
ｓ　Ｃｈｅｍｉｅ″ｌ第７０巻、第２１５〜第２２２頁
（１９５８年））に記載されている。一般に、酸化カッ
プリングにしばしは染料の製造の九めに適用される。こ
の点で酸化カップリングは、電子富有芳香族化合物と酸
化可能カップリング成分との間の反応で、九とえばヘキ
サ７７ノ鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウムまたは−カリウム、
銅塩、水銀塩、塩化鉄（■）、二酸化鉛、過酸化水素、
テトラ酢酸鉛、過硫酸のす）　ＩＪウム塩ま九にカリウ
ム塩、過酢酸、過ヨウ素酸ま几ニクロラミンでのような
酸化剤の存在で経過する反応と把握することができる。

西ドイツ国特許出願公開第３３３１５８８号によれば、
酸化剤としてオΦシダーゼも使用できる。上記のニトロ
ソペン１戸−ルに、その還元状態でに〜酵素酸化におけ
る電子受容体として作用し友後に、酸化カップリング反
応の酸化性カップリング成分として利用される化合物で
ある。このためには、還元によって生じ次アミンを、上
記に例示したような酸化剤により酸化して、同時に反応
混合物中に存在する電子富有カップリング成分と共に染
料ヶ生成させることができる。

専門家にとり多数の電子富有カップリング成分窄利用で
きる。これらのカップリング成分に、カンプリング生成
物の所望の色により選択しうる。例に芳香族アミン、フ
ェノールまｔにメチレン活性化合物である。とくに望ま
しい化合物は、アニリン群、九とえばＮ−メチルアント
ラニル酸およびヨーロッパ特許出願公開第０１７５２５
０号に挙げられているアニリノホスホン酸から選択する
ことができる。

発色により還元された電子受容体ケ定量するためのもう
１つの方法ニ、ニトロソ化合費の場合、還元され友ニト
ロン化合ｖｌを、それ自体酸化されｔ形から還元場れた
形へのこの移行に基づき発色する他の物質によって酸化
することであり、その際ここでも発色とは１つの色から
他の色へ、同様に無色状態から有色状態への変移を表わ
すものとする。かかる発色反応の例は、念とえば還元さ
れた電子受容体の金属塩による酸化であり、この場合該
金ｍ壇は低い酸化段階の金属を有する有色金属塩またに
場合により全部が中性の金属に還元嘔れる。銅（ｎ）塩
は、九とえは赤色の銅（１）塩に変え、銀塩は金属の銀
に変えることができる。リンモリブデン酸塩をモリブデ
ンブルーに還元することも可能である。

芳香族ニトロソ化合物の代りに、本発明方法に框、酵素
酸化の電子受容体として芳香族オキシムを使用すること
もできる。ニトロソ化合物は、オキシムと互変異性体平
衡にあることができる。これに殊に、この友めにニトロ
ソ基に対してα位にある１個の水素原子が利用しつるか
ｉ！念は電子および陽子の相応する非局在化が可能であ
るときである。

酵素酸化反応において電子受容体として働くニトロソ化
合物と共に、ニトロン／オキシムの互変異性体平衡にあ
ることのできるオキシムも同様に本発明方法において使
用しうろことが見出された。これは殊に、一般式■のオ
キシムにあてはまる： 式中、Ｒ′は酸素、別のオキシム基または正電荷を有す
るアミノ基を表わし、その際アミノ基は１個ま几は２個
の低級アルキル基によって置換されていてもよく、低級
アルキル基自体はヒドロ中７基、１個または２個の低級
アルキル基によって置換嘔れたアミノ基、ＰＯ３Ｈ２、
ｃｏ２Ｈま友ｌ−Ｊ　５ｏ３Ｈによって置換嘔れていて
もよい。

上記の定義において、低級アルキル基Ｈ炭素原子数１〜
５のアルキル基ｔ−表わす。とくに望ましいのにメチル
およびエチルである。

酸基ＰＯ３Ｆ！２．５ｏｒ３ＨおよびＣ０５Ｈｌ：［そ
のものとして１ｔに塩の形でアンモニウム塩、アルカリ
金Ｍ［またはアルカリ土類金属塩として存在しつる。

アンモニウム塩は、非置換のアンモニウムカチオンＮｆ
（、＋を含有しているものまｆｃは１個ま次に数個の低
級アルキル、アリールま几は／および低級アルキルアリ
ールによって置換されたアンモニウムカチオンを含有し
ているものである。低級アルキルはそれぞれ炭素原子数
１〜５のアルキル基を表わす。アリール基は炭素原子数
６〜１０の芳香族環系である。低級アルキルとしてに、
メチルおよびエチルが望ましい。望ましいアリール基は
フェニルであり、この場合ベンジルが望ましい低級アル
キルアリール基である。

かかるオキシム中の窒素は酸化段階−１を有する。

ニトロソペンゾールと同様に、一般式１（７）、オキシ
ムも無色の物質であるかまたは還元され次状態では着色
してない着色物質である。本発明方法において電子受容
体としてのニトロソペンゾールにつき上述し之ように、
芳香族オキシムも電子受容体としてのその機能に従い発
色１？ることもできる。ニトロソ化合物ならびにオキシ
ムも、還元し尽嘔れた場合にはアミンを生じ応を発色の
ために使用できる。

本発明方法に対し電子受容体として使用することのでき
るヒドロキシルアミンに、とくに同様に芳香族化合物で
ある。殊にフェニル環に置換基を有−ｒる、フェニルヒ
ドロキシルアミンの誘導体は、本発明方法の電子受容体
として適尚である。これらの化合物における窒素原子に
酸化数−１を有する。

、！：＜ＫＷましいフェニルヒドロキシルアミンに−・
般式■のものである： 式中、Ｒ“は一般式■におけるＲと同じものを表わす。

ヒドロキシルアミンも還元により、若しくは着色してな
い相応するアミンに変えられる。従つ−Ｃ，ニトロソ化
合物およびオキシムにつき記載し九ように、本発明方法
によるアナライトの酸化およびそれと結合した電子受容
体の還元に、還元逼れ九電子受容体から出発して発色を
生じる逐次反応を続けねばならない。これには原則とし
て、本発明方法において電子受容体としてのニトロソ化
合物ま７ｔｉオキシムの使用につき既述したと同じこと
が言える。これら丁ぺての逐次反応の出発化合物は、ア
ミンの段階に還元され次、酵素酸化の電子受容体である
。

意外なことに、＋１と−１の間の酸化段階にあるｖｉ素
、とくに＋１または−１の酸化段階を有する窒素を有す
る化合物、殊にＮ−オキシド、ニトロソ化ｆｌ＋、オキ
シムおよびヒドロキシルアミンの群からの化合物、なか
んずく上述し友ようなＮ−オキシド、ニトロソ化合物お
よびオキシムの群からの化合物が、オキンドレダクター
ゼにより接触される多数の酵素酸化の発色性電子受容体
として使用しうろことが見出された。

これらの化合物は情ましくは、酸化すべきアナライトか
ら発色性電子受容体への電子伝達には、ジアホラーゼま
た１ｄＮ−メナルフエナジニウム・メトスルフェートの
ような還元触媒に所望でないところで使用できる。意外
にも、これらの物質に、酸化酵素としてオキシダーゼま
たはＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼを使用する
場合に有利であることが見出され次。かかる酵素ｔアナ
ライトの酸化に使用する場合、アナライト／酵素系から
上記の発色性電子受容体への電子伝達は直接に、つまり
還元触媒ｔ−緒に使用することなく行なうことができる
。この点で、アナライト／酵素系とげ１酸化反応に必要
な、アナライトと酸化酵素、ならびに場合により酸化に
通常必要な、ｌ＃累と協同作用する補酵素および／°ま
几は補因子、之とえは金属塩からなる組合せと解逼れる
。

本発明方法にａフラビン依存性オキシダーゼがとくに１
ましい。例にＬ−およびＤ−アミノ酸オΦシダーゼ、コ
レステリンオキシダーゼ、グルコースオキシダーセ、ク
リセリン−６−リン酸オキシダーゼ、ラクテートオキシ
ダーゼおよびぎルベートオΦシダーゼである。本発明に
よりとくに適当なオキシダーゼは、グルコースオキシダ
ーゼ、グリセリン−６−リン酸オΦシダーゼ、ラクテー
トオキシダーゼおよびぎルベートオキシダーゼである。

ＮＡＤ　（Ｐ　）非依存性デヒドロゲナーゼのうち、ピ
ロロキノリン・キノン（ＰＱＱ　）　依存ｆｉデヒドロ
デナーゼが本発明方法にとくに■利に使用できる。殊に
グルコ＝スデヒドロゲナーーｔ？カ、Ｑ色性電子受容体
として＋１と−１の間の酸化段階にある窒素を有する化
合物の存在でのグルコースの比色定肴のために好適であ
る。同様に、エタノールのようなアルコールの定量のた
めにＮＡＤ（Ｐ）非依存性アルコールデヒドロゲナーゼ
全使用することができる。

本発明方法に、検査すべき試料を、適当なオキシドレダ
クターゼおよび上記の発色性電子受容体の１つま交ａ幾
つかと接触させるように実施壜れる。試料が、オキシド
レダクターゼにより酸化されるアナライトを含有する場
合にａ。

発色性電子受容体に還元される。還元され７５１．電子
受容体がそれの酸化された形の、もとの電子受容体と異
なる色’を有するか、ま次は電子受容体が酵素酸化反応
によって無色状態から着色状態に変わる場合に汀、生成
し次色の濃さ全直接に視覚により、場合によっては比較
色によるかま念は光度測定により試料中のアナライトの
濃度と相関させることができる。還元された電子受容体
の色が大体においてはじめに使用され念蹴子受容体の色
と同じであるか、ま友は退色壕友は完全な脱色が生じる
場合には、酵素酸化反応に、濃さを視覚によるかまたに
光度測定により同様に試料中のアナライトの濃度を確か
めることのできる色を生じる逐次反応を接続する。

本方法は、いわゆる湿式試験として、九とえはキュベツ
ト中で、またはいわゆる乾式試験として相応する試薬支
持体上で実施することができ、この場合必要な試験試薬
に固形支持体、殊に吸収性ま−ｈｒｘＭｅ潤可能材料上
に存在する。かかる試薬支持体にたとえばヨーロッパ秤
許出願公開第００１６３８７号、西ドイツ国特許出願公
開第３２４７６０８号、ヨーロッパ特許出願公開第０２
６２４４５号またにヨーロッパ特許出願公開第０２５６
８０６号から公仰である。

特許請求の範囲に記載毛れているような、本発明方法を
実施するためのアナライトの比色定量試剤も、同様に本
発明の対象である。かかる試剤は、定量すべきアナライ
トの酵素酸化に必要なオキシドレダクターゼのほかに、
酸化の際に遊離する電子を直接にアナライト／酵素系か
ら引受ける発色性電子受容体を含有する。酸化酵素およ
び発色性電子受容体としては上記に本発明方法につき記
載し次物質が使用される。

本方法の実施に適白々−値（殊に使用すべき酵素による
）１に維持するために、本発明による試剤は緩衝系全含
有する。さらに、次とえは湿潤剤、安定剤等のような、
かかる試剤に通常使用逼れる他の適当な添加剤上含有し
うる。電子受容体の酸化が測定可能な変色を生じない場
合には、本発明によるアナライトの比色定量試剤はもち
ろん逐次反応に必要な試薬を含有する。

本発明による試剤は、溶液の形で存在するかまたは吸収
性または＊１１１１可能な支持体上に塗布されて存在し
ていてもよい。溶液の形では、試剤は望ましくは本発明
方法に必要な全試薬を含有する。溶媒としては、水、水
溶性有機溶媒、九とえばメタノール、エタノール、アセ
トンまたはジメチルホルムアずド、を比は水とこれら育
機溶媒からなる混合物が挙げられる。保存上の理由から
は、試験に必要な試薬を２りま几は幾つかの溶液に分【
す、本来の検査の際にはじめてｆ％会するの・が有利で
ある。これは殊に、アナライトの重化後、還元ちれた電
子受容体を逐次反応、九とえば酸化カップリング反応で
嘔らに反応させる場合がこれに該当する。本発明による
試剤中で使用される電子受容体の代嵌的濃度は、ｏ、ｏ
ｉ〜１００ξミル１００ミリ０、１〜２５ミリモル／Ｉ
Ｉである。逐次反応用試薬は、電子受容体に対し少なく
とも，化学量論的割合で、望ましくは過剰に、殊に２〜
１０倍過剰に使用される。

本発明による試剤は、試験細片の形で存在しうる。かか
る試験細片は多種の構成が、友とえはヨーロッパ特許出
願公開Ａ００１６５８７号、ヨーロッパ特許出願公開Ａ
３２４７６０８号、ヨーロツパ特許出願公開Ａー０２６
２４４５号まｔはヨーロッパ特許出願公開Ａ　−　０２
５６８０６号から公知である。すべてに共通なのは、定
量法の実施に必要な試薬が固形の支持層上に存在するこ
とである。支持層としては、殊に検査すべき試料液によ
り濡らされる吸収性および／′Ｖ！念は＊潤可能材料が
挙げられる。例はゼラチン、在する。

試験細片上に試料液を塗布するかまたは試験細片を試料
液中へ浸漬する場合に、細片中に液体環境が構成し、そ
の内部で検出反応が経過する。反応によって惹起嘔れる
発色は視覚によるかま友は光度計、友とえは反射光度計
で評価することができる。

本発明の特殊な対象は、アナライト／オキシドレダクタ
ーゼ系の直接電子受容体として、＋１と−１の間の酸化
段階にある窒素を有する化合物群からの物質を使用する
ことに関する。この点で、アナライト／オキシドレダク
ターゼ系と認められるのは、アナライトと酸化酵素なら
びに場合により酸化に肖然必要な、酵素と協同作用する
フラビンまたはＰＱＱのような補Ｈ％ｍｔたは／および
たとえば金属塩のような補因子からなる、酵素酸化反応
に必要な組合せである。

ニトロソ化合物、Ｎ−オキシド、ヒドロヤシルアミンお
よびオキシム、望ましくはニトロソ化合物、Ｎ−オキシ
ドおよびオキシムの群からの物質は、一般にオキシドレ
グクターゼによるアナライトの酸化の際に使用しうろこ
とが見出されｆＦ．　。

本発明は、発色電子受容体の還元のｔめにジアホラーゼ
ま窺はＮ−メチルツェナジニウムメトスルフェートのよ
うな還元触媒を必要としないという利点を提供する。そ
の還元は、直接ペアナライト／酵素系によって行なうこ
とができる。こうして場合により不利な鴎反応を１ける
ことができる。

殊に、アナライトの酵Ｘ酸化の几めオキシダーゼ七使用
する場合に、本発明による化合物の使用によって、比色
定量法の前駆物質としての過酸化水素の生成が嘔けられ
る。これにより、還元作用を有する化合物の不利な影響
が除去または減少される。

最後に１５本発明により使用される化合物は、空中ｅ素
の進入が制限されているかまたは不所望のところでは何
処でも真の二者択一性を提供する。酸素は、酵素酸化に
おける電子受容体としてこれらの化合物によって代える
ことができる。これは、試験細片の形の本発明による試
剤の場合に極めて有利である。Ｃれは従来殊に高いアナ
ライト濃度の場合、オキシダーゼによる酵素酸化の際に
空気中酸素が試験細片上に塗布されｔ試薬混合物に進入
するように構成されていなげればならなかつ九が、今や
試験細片はとくに迅速かつ確実に働くように構成するこ
とができる。従来フィルム試験細片においてはしばしば
試料は試験細片に塗布しｔ後、酸素がそもそも試験細片
中へ拡散進入しつるようにする几め特定時間再び拭き取
らねばならなかったが、この手段は本発明による電子受
容体を利用する場合には不要である。試験細片中に酸素
が時間に依存して拡散するの會防ぐことにより、動的測
定の場合アナライト濃閤に依存する反応速度、および終
点測定の場合終点においてアナライト濃度とは独立の、
従来可能であったよりも迅速、確実かつ簡単な定量法が
可能となる。

次側は、酵素酸化によりアナライトを比色定量するｔめ
の可能な方法の若干を示すものである。

〔実施例〕

例　　１ シトの還元 Ａ）ポリビニルプロピオネート４０Ｉ！（九とえばＰｒ
ｏｐｉｏｆａｎ　７Ｑ　Ｄ　、　　ＢＡＳＦ社裏品、ル
ードライヒスハーフエン、ドイツ連邦共和国） アルギン酸ナトリウム　　　　　　４５．！ｉ’（±と
えばＫｅｌｃｏ社のＡｌｇｉｐｏｎ　、　Ｍｅｒｃｋ　
＆ＣＯの部門、クラーク、ニュージャーシイ、米国〕、
水中１．７重Ｎ４ タンパク加水分解物　　　　　　　２．５ｇ（たとえば
Ｃｒｏｔｅｉｎ　Ｃ、Ｃｒｏｄａ　ＧｍｂＦＩ　、ネツ
テタール、ドイツ連邦共和国） トリス緩衝剤０．１Ｍ、ＦＪ−１７，５ｉＱｍグルコー
スオキシダーゼ（Ｅｃｌ、１．３．４）５０ＩＵ レゾアズリン　水中０．１Ｍ　　　　　　ｌ！ｎｌを撹
拌して均質な材料にし、片側に鳴消しポリカーボネート
シート（７ｔとえばＰｏｋａｌｏｎ　。

Ｌｏｎｚａ社、ライン７エルデン、ドイツ連邦共和国）
厚さ１４０μｍ　ｋドクターで貼付け（ドクター間隙２
００μＩｎ）、５０℃で３０分間乾燥し念。

かかるフィルム上にグルコース含有溶液（４０ダ／ｄｅ
）を塗布する際、試薬層は１分以内に青から赤に変色し
念。尿酸２０９／ｄ／およびグルタチオン２０〜／　ｄ
／の存在は呈色反応に何の障害も生じなかつ九。グルコ
ースを含有していない溶液を塗布する場合、試薬層は、
試料塗布前に■していた色を保持した。これは背色のま
°までありた。

グルコースおよびグルコースオキシダーゼを用いる代り
に、 ピルベートおよびビルベートオヤシダーゼ（ＥＣ’１．
２゜３．６） ラクテートおよびラクテートオキシダーゼ（ＦＣｌ、１
．）、２） グリセリン−３−リン酸およびグリセリン−３−リン駿
オキシダーゼ（ＥＩＣＩ　、１．５．２１）を用いても
同じ色結果が得られｆ：、。

Ｂ）上記フィルムの製造の際にＶｆアズリノの代りに次
のベンゾフロキサ／ 一〇 ａ）　　ＲｌｗＲ”　　：　Ｈ ｂ）　　Ｒ”　：Ｈ：Ｒ２：Ｃ０−ＣＦ（、Ｊ（製造は
Ｎ、　ＬＡ７７ａｎｇｏｖ　＊　　’　　５ｙｎｔｈｅ
ｓｔａ１９８７号、第６１６頁による） ｃ）　　’Ｒ１：Ｈ：　ＲＩＩ：ＣＨＯ（Ｊｉｌｔ造は
Ｍ、　Ｌ。

Ｒｄｗａｒｄａ　、　　’　Ｊ、　Ｈｅｔ。

Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　　第１６巻、第６５３頁（１９
７６年） ａ）　　Ｒ１−Ｒ２：ＣＦ！、（製造はＪ、　Ａ、　Ｕ
ａｔａ等、Ｊ、　Ｈａｔ、　Ｃｈｅｍｉａｔｏｒｙ　　
　第１８巻、第６５５頁（１９８１年） を、フィルムパッチにり１！　２５０１９の濃度で使用
しｔ場合、検査試料中にグルコースの存在する際、色は
それぞれ無色からオレンジに変色し次。グルコース濃度
の増加につれて色の濃さは増加した。

尿酸２０〜／ｄＪの存在は呈色反応に何の障害も生じな
かつ九。

基質／酵素の組； ぎルベート／ピルベートオキシダーゼ （Ｅ　Ｃ１，２，３，３） ラクテート／ラクテートオキシダーゼ （ＫＣｌ、１．３．２） グリセリン−３−リン酸／グリセリン−３−リン酸オ中
シダーゼ（Ｅ　Ｃ１，１，３，２１）は、同様に上記の
ベン・戸フロキサンで検出することができ九〇 例　　２ Ａ） ０．１　Ｍクエン酸／　ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６，０２
０００μｊ ｐ−二トロン−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、エタノール
中０．１　Ｍ　　　　　　２００μｊグルコースオ中シ
ダーゼ（ＥＣ１，１，３，４ン（２５００ＩＵ／ｒＩＬ
ｔ）または　１００　Ｉｌｌグルコースデヒドロゲナー
ゼ （ｇｃｌ、１．９９．１０） 既矧グルコース含量″ＩＣ有する試料 ２００μｊ ａ）　　　５ｍＭ ｂ）　　　　１０ｍＭ ｃ）　　　　１５−ｍＭ ｄ）　　　　２ＱｍＭ θ）　　　５ＱｍＭ　　　水中 を混合し、２分２５°ｃ′１′湛置し友。次いでＮ−メ
チルアントラニル酸　　　２５０μｊヘキサシアノ鉄（
ｎｕ！カリウム、 水中０．２Ｍ　　　　　　１２５μ！およびヘキサシア
ノ鉄（Ｉｌｌ）酸カリウム、水中０．２Ｍ　　　　　　
　　　　１２５．ａＪを加え次。ａらに１分後、２５倍
に希釈し、グルコースの存在で緑に看色する反応混合物
の吸光に７１０ｎｍ″″ｒ：空値（グルコースなしの上
記反応混合物）に対して測定した。

ｌｎｏ　＝　２４０００　Ｍ−”ｃｒｎ−１Ｏ吸光係数
ｋ、溶液中の未知グルコース濃度の測定の几めに利用す
ることができる。

Ｂ）　　Ａ）の上記試験においてｐ−ニトロンジメチル
アニリンを ａ）　　ｐ−ニトロソフェノール ｂ）ｐ−ニトロソ′″Ｎ　、　Ｎ−ジエチルアニリン ｃ）　　ｐ−ニトロソ−Ｎ、Ｎ−ジェタノールアニリン Ｃａ造はＤ’Ａｍ１ｃｏ等、′″Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃ
ｈｅｍ。

８ｏｃ、　　　第８１巻、第５９５７頁（１９５９年）
による） によって代え友場合、グルコースの存在において、Ｎ−
メチルアントラニル酸とのカップリングによって ａ）　　褐色から青色へ ｂ）黄色から緑色へ Ｃン　黄色から緑色へ の変色が観察され友。

Ｃ）　　Ａ）の上記試験においてＮ−メチルアントラニ
ル酸ｔ ａ）　　Ｎ−メチル−Ｎ−メチレンホスホン酸アニリン ｂ）１−ヒドロキシ−ナフタリン−２−カルボン散 り　アニリ／−２−スルホン酸 によって代え念場合、グルコースの存在ニおいて、ｐ−
ニトロソ−Ｎ　、　Ｎ−ジメチルアニリンとのカップリ
ングによって ａ）λ　　−７５５ｎｍ ａｘ ｂ）λ　　−５９０ｎｍ ａｘ Ｃ）λｍａｘ＝６４０ｎｚ 紫有する色が観察された。

ｐ−ニトロン−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンおよびＮ−メ
チル−Ｎ−メチレンホスホン酸アニリンを使用する場合
、第１図に表わした、７３５ｎｍにおける吸光変化のグ
ルコース濃度との依存性が見出され比。この友めくは、
吸光金クエン酸塩緩衝液（−６）中（１：２４）希釈し
た後に測定し、試験パッチ中のグルコース濃度に対して
プロットした。

例　　６ 金ｍ銀の生成によるグルコースの検出 例２人におけるようなりエン酸塩緩衝液、ｐ−ニトロ７
−Ｎ　、Ｎ−ジメチルアニリン、クルコースオキシダー
ゼおよび試料からなるパッチを、２５℃で２分装置し、
水中の硫酸銀１００ミリモルの溶液２５０μ！ならびに
水中の金ナル２５０Ａｌ？加え友。（金デルの製造は次
の規定に従って行なり九二沸騰した蒸留水１００１に、
順次に水０．４１中のＨＡｕＣＡ４０．４　ｍｙ　：水
中７１　Ｎａ８ＣＮ　ｏ、ｉ　／〆　０．２１および水
中ＰＫ２Ｃｏ。

Ｏ０１／〆　ｏ、５ａｚｒ加える。１０分後放冷する・
）中間希釈なしに得られ之成績物を用い、７００ｎｍ、
８５０ｎｍおよび１３００ｎｍにおいて、第２図に示し
比曲線が得られ念。核曲線は、溶液中の未知グルコース
含量を確かめる友めの較正曲線として使用することがで
きる。

例　　４ モリプデ／ブルー生成によるグルコースの検出 ０．１Ｍのクエン酸／　ＮａＯＨ緩衝液（ｐｉ−１５）
９２０１μノ中の２．１８−リンモリブデン酸〔製造は
九とえばプラウア−（Ｇ、　Ｂｒａｕｅｒ　）（ｓＨａ
ｎｄｂｕｃｈ　ｄｅｒ　ｐｒａｅｐａｒａｔｔｖｅｎＡ
ｎｏｒｇａｎｉａｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　　　Ｅｎｋ
ｅ出版、ストットがルト、第１２７８頁（１９５４年）
１几はローゼ７　／ＮイＡ　（Ａ、　Ｒｏｓｅｎｈｅｉ
ｍ　）、トラウペ（Ａ、Ｔｒａｕｂｅ　）、’　Ｚ、Ａ
ｎｏｒｇ、Ｃｈｅｍｉｅ第メチルアニリンＸ、ｙｙｙ（
エタノール中）４０μｌならびにグルコースオキシダー
ゼ（６２５０ＩＵ／ｌｄ水）　４　Ｑ　ｐｉを加え九。

既知グルコース含量（１モル）のグルコース含有試料Ｉ
μ１（Ｘ−０，１，２，３，５，７，１０）を添加して
から１分後、５０＋ｔに希釈し、８２０ｎｍにおける吸
光変化（ΔＥ）を測定した。結果として、第３図に示し
た曲線が得られ之。該曲線は、溶液の未知グルコース含
量を確める九めの曲線として使用でき、その際Ｃは測定
の九めに実施した希釈前の試料中のグルコースの濃度を
表わす。

例　　５ ゼを用いるグルコースの動的定量 次の溶液を製造し几： 試験緩衝液：　０．１　Ｍ　トリス／＠酸（ｐＨ７，５
：牛の血清アルブミン１チ含有） 電子受容体：エタノール中肌ＩＭ１）−ニトロソ−Ｎ、
Ｎ−ジメチルアニリン 指示　　薬：２．１８−リンモリブデン酸、１００ダ／
Ｍ水 酵　　　素：グルコースーデヒドロデナーゼ（ｇｃｌ　
、１．９９．１７）、試験緩衝液５０　Ｉ　Ｕ／ｄ グルコース溶液： ａ）　　　　５６ａ９グルコース／ｄ！ヒト血漿ｂ）　
　　　７２ｒＡ９グルコース／ｄｌヒト血漿ｃ）　　　
１４４ダグルコース／ａｔヒト血漿ｄ）　　　３６０〜
グルコース／ｄ／ヒト血漿ｅ）　　　７２０ダグルコー
ス／ｄｌヒト血漿ｆ）１４４０ダグルコ一ス／ｄＪヒト
血漿ｇ）　　５６００　ｍｔｉグルコース／ｄｔ　ヒ）
　血漿１工のキュベツト中に、緩衝液１７４０μｊ１電
子受容体２５０μ１１指示薬２５０μ！およびグルコー
ス検出ド”Ｏゲナーゼ１０μｌを入れ、混合物１１−２
５℃に温度調節し、次いでグルコース溶液２５０μｌを
加えた。出発点としてグルコース溶液の添加により、８
２０ｎｍにおける毎分の吸光変化（ΔＥ／ｍ１ｎ）？記
録し几。次の値が得られ次ニ ゲルコース濃度　　　　　　　　　６１１７ｍ１ｎ３．
６　Ｗ９／　ｄＡｌ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ
，２０７，２ダ／（１１０，３８ １４，４〜／ａｌ　　　　　　　　　　　　　　０．５
７３６　Ｒ９／（１１１，００ ７２〜／ｄｊ？　　　　　　　　　　　　　　　　１．
６０１４４　■／ｌｌｌ　　　　　　　　　　　　　　
　２．２４６６０　ダ／ｄ〕　　　　　　　　　　　　
　　　　　３．１３例　　６ モリブデンプル−生成によるグルコース検出の危めの試
験細片 アルギン酸ナトリウム　　　　　　　　１ｇ（たとえば
Ｋｅｌｃｏ社のＡｌｇｉｐｏｎ　、　ＭｅｒＣｋ　＆Ｃ
ｏの分割会社、クラーク、ニュージャーシイ、米国） ポリビニルプロぎオン酸　　　　　　４５Ｉ（穴とえば
ＢＡ８Ｆ社のＰｒｏｐｉｏｐｈａｎ　７０　Ｄ　％ルー
ドウイツヒスへ−フエン、ドイツ連邦共和国） ノニル硫酸ナトリウム　　　　　　０．７５９リン酸二
水素カリウム　　　　　　１０．１５　＃蒸留水　　　
　　　　　　　　　　　５．８．５．＠アエロジルＣＯ
Ｋ　８４ （デグツサ、ハナウ、ドイツ連邦共和国）を撹拌して均
一な混合物にし、１ＯＮの苛性ソーダで−５，５に調節
する。

引き続き、グルコースオキシダーゼ（２５０ｒ　Ｕ／Ｗ
）　６５１に９、ｐ　−ニトロ７−Ｎ　＃　Ｎ　−ジメ
チルアニリン２６（ｌｌｆ、２．１８−リンモリブデン
酸１．３．＠ｔ−加え九〇 混合物を厚さ１ｕのポリステロールシート上にドクター
で３２０μ屑のＩｆ１厚に塗布し、６０℃で１時間乾燥
し友。グルコース含有溶液０１＠ｉを加えると、１分以
内に明らかな祿着色が生じる。着色の強さはグルコース
濃度の増加につれて濃くなり、比較目盛につき視覚によ
るかまたは反射光度測定により評価することができる。

電子受容体ｐ−ニトロソ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンの
代りに、ｐ−ベンゾキノン−ジオキシムま友はｐ−ニト
ロソ−Ｎ　、　Ｎ−ジェタノールアニリンを使用するこ
ともできる。

室温で暗所に保存する場合、着色は数週間にわｔつて安
定である。

上記例においてｐ−二）ロソーＮ、Ｎ−ジメデルアニリ
ンをペルオキシダーゼ（１００ｆｆｉ９：２００ＩＵ／
ｍ９）に代え、リンモリブデン酸ｔ３．３’、５．５’
−テトラメチルペンテジン（６００■）に代えると、原
則的に技術水準から公知である酸素依存性グルコース試
験が得られる。この場合、上記例とは異なり、試料Ｆｊ
液を試験細片に塗布した後、酸素が拡散進入でき、そも
そも着色が起きるようにするために拭きとらねばならな
い。この欠点に対して付加的に、最終着色の到達がグル
コース濃度が高くなるにつれて次第に遅くなり、生じる
色はあｔｒ貯麓安定でない。従って、本発明による電子
受容体によるＩ！Ｐ素置換の利点は次のとおりである：
試験細片への塗布後の試料の拭取りが不要迅速な反応 動的測定の場合、アナライト濃度依存性反応速度 −終点測定の場合、終点におけるアナライト濃度非依存
性反応速度 −安定な色素 例　　７ 素溶液（試験緩衝液中グルコースデヒドＯゲナーゼ（［
１，１，９９，１７）２０（ＩＵ／！Ｊ）１００μｌを
加え次。２分後、酵素溶液の代りに試験緩ＩＩ液１００
μｊを有する、同じ処理された９値に対して、５３０ｎ
ｍにおける吸収を測定し次。次の結果が得られ九二 キュベツト中の試験緩衝液（クエン酸０’２Ｍ％アルブ
ばン１ｍ１ｍ俤、ｐ）１７．０）２０５０μ！および電
子受容体溶液（水中のレゾアズリフ１０ミリモル）１０
０μ！に、試料溶液（Ｃグルコース−０〜０．５４９モ
ル）２５０μ！および酵試料濃度Ｑ、５ｍＭに到るまで
は試験は線形である。この範囲内で、キュベツト中の濃
度は吸光係数’ａ５ｏ　−４３５０Ｍ−”　ａｎ−”か
ら計算スルことができる。より高い試料濃度では、中間
希釈ま几は小姑い試料容ｆＲを使用することができる。

低い試料濃度は、生成物レゾルフィンの螢光につき敏感
に測定できる。

同様に、試験はベンゾフロキサンおよび例１Ｂに挙げた
ベンゾフロキサン誘導体ならびに例２によるニトロソ化
合物を用いて実施できる。

ＮＡＤ　（Ｐ　）非依存性アルコールデヒドロデナーゼ
（ＥＣ１，１，９９，８）ｔ−用い同様にアルコールを
検出できる。

例　　８ ｆ　ｋ　−ｐ−二トロソアニリン０．１モル）５μ！お
よび既知ラクテート濃度を有する試料２５０μｌ’ｆｒ
混合し、２５°Ｃの恒温に保つ九。試験を、酵素溶液（
ラクテートオキシダーゼ （ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、　）　２００　Ｕ　
／　Ｉｊ試験緩衝液）５μ！で開始し、３９０ｎｍにお
ける吸光変化ΔＥ　／　ｍｉｎ　ｌｐ記碌した。次の結
果が得られ九二量 キュベツト中で、試験緩衝液（クエンｌ！！！０．２モ
ル／水酸化ナトリウム、ｐｉ−１６，３５）２２４０μ
７Ｘ　！子受容体（エタノール中Ｎ、Ｎ−ジメこの場合
、Ｃ５，テートは、キュベツト中で測定を冥施する際に
存在するラクテート濃度である。

試験は、電子受容体濃度、酵素濃度、観測波長および温
度を変えることによって早めるがま几は遅くすることが
でき几０電子受容体として、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ−ニ
トロソアニリン、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル
）−ｐ−二トロンアニリ／、ベンゾフロキサンおよびし
・ｔアズリンも使用することができ九。

【図面の簡単な説明】

給付図面は本発明による電子受容体としてのニトロソ化
合５吻使用の効果を示すもので、第１図はニトロソ化合
物の還元によりグルコ−スケ検出する場合のグルコース
濃度による７　３５　ｎｍにおける光吸収の変化金示す
白線図であり、 第２図は金属銀生成によフグルコースを検出する場合の
グルコース濃度による光吸収の変化を、中間希釈の有無
の場合につき示す曲線図であり、 第３図はモリブデンブルー生成によりグルコース金検出
する場合のグルコース濃度と８２０ｎｍにおける光吸収
の変化を示す曲線図である。 Ｏ 第 ３図 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成　１ 年 特許願 第 号 ３゜ 補正をする者 図 面（第１〜３図） り゛ルコース１月乏（ｍＭ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電子受容体の存在においてアナライトを酵素酸化し
   、アナライトの量の尺度として還元された電子受容体を
   発色により定量することによるアナライトの比色定量方
   法において、アナライトを、直接電子受容体として＋１
   と−１の間の酸化段階にある窒素を有する化合物群から
   の物質の存在で相応するオキシドレダクターゼで酸化す
   ることを特徴とする酵素酸化によるアナライトの比色定
   量方法。 ２、電子受容体としてＮ−オキシド、ニトロソ化合物、
   ヒドロキシルアミンおよびオキシムの群からの化合物を
   使用する、請求項１記載の方法。 ３、オキシドレダクターゼがオキシダーゼまたはＮＡＤ
   （Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼである、請求項１また
   は２記載の方法。 ４、オキシドレダクターゼおよび発色性電子受容体を含
   有する、アナライトの酵素酸化によるアナライトの比色
   定量試剤において、発色性電子受容体が、＋１と−１の
   間の酸化段階にある窒素を有する化合物群からの、アナ
   ライト／酵素系と直接に反応する物質であることを特徴
   とする酵素酸化によるアナライトの比色定量試剤。 ５、電子受容体がＮ−オキシド、ニトロソ化合物、ヒド
   ロキシルアミンおよびオキシムの群からの化合物である
   、請求項４記載の試剤。 ６、オキシドレダクターゼがオキシダーゼまたはＮＡＤ
   （Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼである、請求項４また
   は５記載の試剤。 ７、オキシダーゼがフラビン依存性である、請求項６記
   載の試剤。 ８、＋１と−１の間の酸化段階にある窒素を有する化合
   物の群からの物質である、アナライト／オキシドレダク
   ターゼ系の直接電子受容体。 ９、Ｎ−オキシド、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミ
   ンおよびオキシムの群からの物質である、オキシドレダ
   クターゼによりアナライトを酸化する際の発色性電子受
   容体。