JPS6219100A - 胆汁酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血清等生体試料中の胆汁酸の新規定量法に関
する。

〔発明の背景〕

胆汁酸は肝臓に於てコレステロールから合成され、グリ
シン又はタウリンと抱合してＩ］！汁中に排出ｙれ、大
部分は小腸で吸収、門脈を経て肝臓にもどる賜肝循環を
行なっている。この胆汁酸の血中濃度は、胆７１うっ滞
や肝細胞障害で−Ｉ−ｉし、消化管疾患（例えば吸収不
良症候群）では低下することが知られている。従って、
胆汁酸の測定は、肝疾患や消化器疾患の早期診断、予後
の判定等臨床的に重要な意義をもつものである。

従来より、ｌｊｌ汁酩の測定法は種々検討されているが
、胆汁酸がＮ　Ａ　Ｄ　”（酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ”（酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の共存下で、３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ
５Ｄ）によってケト型に変化し、同時にＮＡＤ＋又はＮ
ＡＤ　Ｐ＋が夫々ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）に変化する反応
を利用し、ここに生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの敬
を蛍光法又は比色法により定量し、血清中の胆汁酸濃度
を求める方法が一般によく知られている。

ここで用いられる蛍光法としては、例えばレサズリンが
ジアホラーゼの存在下、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＦＨにより
還元され蛍光物質であるレゾルフィンを生成する反応を
利用する方法等が挙げられるが、蛍光法は試料中の酵素
類を加熱処理により予め不活化しなければならないこと
、測定に蛍光光度計を使用しなければならないことなど
［１常検査に導入するにはいくつかの問題を有している
。

一方、比色法は日常検査法として最も一般的な方法であ
り、例えばＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの測定を、ジアホラ
ーゼ又は電子伝達体を介してテトラゾリウム塩を有色の
ホルマザンに還元し、これを比色定量することにより行
なっている。しかしながら、この比色法にも、反応によ
り生成したホルマザンのキュベツトへの染着による誤差
等の問題があり、この点の改善が要望されていた。

これに対し、木発明者の一部らは、上述したようなホル
マザン発色法の欠点を解決すべく鋭意研究を重ね、還元
型補酵素に電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより、還元型補酵素を定量′する還元
型補酵素の新規定量法を見出し、従来のホルマザン発色
系を過酸化水素発色系に置き換えることに成功している
　（特開昭５９−２１０８９９号公報）。

本発明者らは、この定量法を胆汁酸の定量に応用すべく
鋭意研究の途４−１該方法により胆汁酸を定量する場合
、従来上として用いられている非ステロイド性ヒドロキ
シ酸脱水素酵素阻害剤であるピルビン酸が呈色反応を阻
害し、また、血清中の過酸化水素消費物質により負誤差
を生ずるなど、測定の正確性に問題が生ずることが明ら
かになった。

〔発明の目的〕

本発明は−１−記した如き状況に鑑みなされたもので、
従来より改善が求められていたセルの染着の問題、妨害
酵素の影響回避方法に付随した問題、血清中の過酸化水
素消費物質による誤差の問題等をすべて解決した胆汁酸
の新規で目、つ精度の高い定量法を提供することを目的
とする。

〔発明の構成〕

本発明は、胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類
或いはオキサム酸又はその塩類の存在Ｆ、３α−ヒドロ
キシステロイド脱水素酵素　（３α−ＨＳＤ）、酸化型
補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより行なう胆汁酸の定量法、及び胆汁
酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム
酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイミド又はマ
レイミド誘導体の存在下、３α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素（３α−ＨＳＤ）、酸化型補酵素及び電子伝
達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量することに
より行なう胆汁酸の定量法、並びに胆汁酸を含む試料に
、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム酸又はその塩類
と、アジド化合物及びマレイミド又はマレイミド誘導体
と、スーパーオキドジスムターゼ（ＳＯＤ）の存在下、
３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（３α−ＨＳＤ
）、　酸化型補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行なう胆汁酸の定量
法の発明である。

即ち、本発明者らは、従来より改善が求められていたセ
ルの染着の問題を解消した特開昭５９−２１０８９９号
の発明を利用した胆汁酸の定量法を確立すべく鋭意研究
を重ねた結果、非ステロイド性ヒドロキシ酸脱水素酵素
阻害剤として、ピルビン酸の代わりにシュウ酸又はその
塩、オキサム酸又はその塩、又はこれらの混合物を用い
れば、呈色反応のβ１１害は起らないことを見出し、更
に、アジド化合物とマレイミド又はマレイミド誘導体を
用いれば、血清中の過酸化水素消費物質による負誤差が
回避できること、また、スーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）を加えることにより呈色が安定になることを
見出し、本発明を完成するに到った。

本発明に用いられる酸化型補酵素としては、例えば、Ｎ
ＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋等が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。その使用濃度は特に限定されない
が１通常０．５〜４ｍｍｏ　ｌ／　ｌの濃度が好ましく
用いらねる。

本発明に用いられる電子伝達体としては、例えば、フェ
ナジンメトサルフェー＋−（ＰＭＳ）、Ｉ−メトキシフ
ェナジンメトサルフェー１−（１−メトキシＰＭＳ）、
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナツキソニウムク
ロリド（メルドラブルー）等が挙げられるが、これらに
限定されるものではなく、これらと同等な作用を有する
電子伝達体であれば全て用いることができる。その使用
濃度は特に限定されないが、通常０．００２〜０．３　
＋ｍｍｏｌ／ｌの濃度が好ましく用いられる。

本発明の方法に於て、非ステロイド性ヒドロキシ酸脱水
素酵素阻害剤として用いられるシュウ酸又はその塩、或
いはオキサム酸又はその塩の塩類としては、例えばナト
リウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩やアン
モニウム塩等が挙げられる。

本発明に於て用いられるシュウ酸又はその塩は、反応液
中、３　ｍｍｏｌ／ｌ以−］二含有していればよいが、
通常７〜３００ｍ＋ｉｏ　ｌ／　ｌの濃度が好ましく用
いられる。また、オキサム酸又はその塩は、反応液中、
５　ｍ’ｍｏｌ／１以上含有していればよいが、通常１
０〜６０ｍｍｏｌ／Ｉの濃度が好ましく用いられる。

シュウ酸又はその塩を用いた場合、血清により濁りを生
ずる場合があるが、この濁りを回避するには、午レート
剤の添加が有効である。用いられるキレート剤は、通常
キレート試薬といわれているもの、例えばエチレンジア
ミン四酢酸（Ｅ　Ｄ　ＴＡ）、トランス−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミ
ン五酢酸　（ＤＴＰＡ）、グリコールエーテルジアミン
四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ニトリロ玉酢酸（ＮＴＡ）、二
ｌ・リロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、Ｎ−ヒドロキシエ
チルエチレンジアミン三酢酸（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−ＯＨ
）、トリエチレンテトラミン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ”　
、Ｎ”’、Ｎ”’−六酢酸（ＴＴＨＡ）、１．３−ジア
ミノプロパン−２−オール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四
酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）又はこれらの塩などがあげられ
るが、これらに限定されるものではないことは勿論であ
る。これらの使用濃度は、最終呈色液中０．１〜ｂが好
ましく用いられる。

本発明の方法に於て、血清中の過酸化水素消費物質によ
る負誤差を回避する目的で用いられるアジド化合物とし
ては、例えばアジ化すトリウム等のアジ化物が挙げられ
る。その濃度は、反応液中、０．００２％以Ｉ−であれ
ばよいが、通常０．ＱＯ４〜０．１％が好ましく用いら
れる。

また、マレイミド又はマレイミド誘導体としては、例え
ばマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド　（ＮＥＭ）　、
　Ｎ−（９−アクリジニル）マレイミド、　Ｎ−（１−
アニリノナフチル−４）マレイミド、Ｎ−（４−アニリ
ノフェニル）マレイミド、Ｎ−（ｐ−（２−ベンズイミ
ダゾリル）フェニルコマレイミド、Ｎ−（？−ジメチル
アミノー４−メチルクマリニル）マレイミド、Ｎ−（３
−フルオランチル）マレイミド等や特開昭５９−２０４
１７１号公報で開示されている、一般式［Ｉ］　で表わ
されるＮ−置換マレイミドなど各種のものが使用できる
が、なかでもＮ−メチルマレイミド　（Ｎ　Ｅ　Ｍ）が
水に対する溶解性が良い点から好ましく用いられる。

〔式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、゛ジ低級アルキルアミ
７基又はＲ”−ＣＯＮＨ−なる基（但し、Ｒ３は低級ア
ルキル基又はツーニル基である。）であり、Ｒ２は水素
又は二１・口広である。また、マレイミド置換基はベン
ゾイル置換基のオルト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中、０．１ｍｍｏｌ／ｌ以」−含有
されていればよいが、通常は０．５〜５０ｍｍｏ　ｌ／
　ｌが好ましく用いられる。

本発明の方法を実施するには２例えば、３α−ＨＳＤ、
ＮＡＤ、電子伝達体、シュウ酸又はその塩類或いはオキ
サム酸又はその塩類、アジド化合物、マレイミド又はマ
レイミド誘導体、界面活性剤を含むＭ衝液（第１試液）
を試料に加え、胆汁酸と３α−ＨＳＤ及びＮＡＤ＋の反
応により生成したＮＡＤＨが電子伝達体と反応して定量
的に生成した過酸化水素を、過酸化水素定量試薬（第２
試液）で比色定縫すればよい。

過酸化水素定量試薬としては、酸化呈色試薬とペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）とを組合わせた試薬や、４価のチタ
ン化合物と２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）　−
５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェ
ノール又は／及びその塩とから成る試薬などを用いるこ
とができる。

ＰＯＤと組合わせて本発明に用いられる酸化呈色試薬と
しては、通常、Ｈ２Ｏ２−Ｐ　ＯＤ系で用いられている
自体公知のものがすべて使用でき、例えば、４−アミノ
アンチピリンと、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置
換アニリン系化合物とを組合わせた酸化呈色試薬、３−
メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とア
ニリン系化合物との組合わせ試薬、トリフェニルメタン
系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、０−トリジン誘導体
、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘
導体、ロイコメチレンブルー誘導体、〇−フェニレンジ
アミン、２，２°−アジノビス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−６−スルホン酸）又はその塩等が挙げられるが
、これらに限定されるものではない。

第１試液の液性は、ｐＨ８〜１０の範囲であれば通常特
に問題はないが、なかでもｐＨ７〜９の範囲が好ましく
用いられる。第２試液は、用いられる過酸化水素定量試
薬の定量条件及び試薬の安定性に適した液性に調製すれ
ばよい。即ち、第２試液の役割は、第１試液と胆汁酸の
反応により生成した過酸化水素の比色７鼾反応のみであ
るので、胆汁酸と３α−ＨＳＤ及びＮＡｒ）＋の反応条
件とは全く無関係に比色定早法の選択ができる点は、本
発明の利点の１つである。

更に、本発明に於て、ＳＯＤを第１試液又は第２試液に
添加することにより、過酸化水素７帛試薬の呈色度が増
大され、目、つ呈色安定性も改善されることが判った。

ＳＯＤは通常 ２０２”＋　２　Ｈ＋−→０２　＋　Ｈ２Ｏ２で示され
る反応を触媒する酵素として知られているが、本発明の
反応系に於ては、呈色安定性に効果がみられる。このよ
うな効果は全く予想外なことである。ＳＯＤは第１試液
に添加しても、また第２試液に添加しても（この場合、
第１試液にはＳＯＤ無添加）同じような効果を示す。こ
のことは、本来のＳＯＤ作用とは全く異なった働きをし
ていることを示している。

本発明に用いられるＳＯＤとしては、現在知られている
銅−亜鉛−５ＯＤ　（Ｃｕ・Ｚｎ−３ＯＤ）、−２７カ
７−３ＯＤ　　（Ｍｌｌ−３ＯＤ）　、鉄−５ＯＤ（Ｆ
ｅ−５ＯＤ）のいずれでもよく、その由来はヒト、動物
、酵母、植物、微生物のいずれでも差支えない。

以下に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらに
より何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１．検量線の作成 ［測定試薬１ ■試液Ｉ　（検体用） ０．０２５８　＋＝リスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）中
に、３α−ＨＳＤを１４００＃Ｌ　、　Ｎ　Ａ　Ｄを１
４０ｎ＋ｇ／ｄｌ、　！−メトキシＰＭＳを０．０３ｍ
ｍｏｌ／ｌ、シュウ酸ナトリウムを１％、ＥＤＴＡ−２
Ｎａを２．７ｍｍｏｌ／Ｉ、アジ化すトリウムを０．旧
％、ＮＥＭを２１ＩＩＩｏｌ／１．　　Ｓ　ＯＤを３０
０Ｕ／ａｌ！及びエマルゲン１２０（花王石鹸製）を０
．２５％の濃度含有するように調製した。

■試液工　（検体盲検用） 試液工　（検体用）の組成から、３α−ＨＳＤを除いた
組成の試液を調製した。

■試液ＩＴ ０．１Ｍ＋−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７）中に、４
−アミノアンチピリンを０．０１８％、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トル
イジンナトリウム　（以下、ＴＯＯ５と略す。）を０．
０７％、ＰＯＤを？２００Ｕ／見及びエマルゲン１２０
を０．２５％の濃度含有するように調製した。

■試料１ グリココール酸ナトリウムを夫々、５０．１００゜１５
０、２００．２５０．３００ｐｍｏｌ／Ｉ含む水溶液を
調製し、試料とした。

［操作法１ 試＄４４ｏｏ、ｚをとり、試液工　（検体用）ｌ−を加
え、３７°Ｃで５分間反応後、試液ＩＩ　　１−を加え
、３７°Ｃで１０分間加温した。試薬ブランクを対照と
して波長５５５ｎ■に於ける吸光度を測定した（Ｅｓｔ
ｄ）− 別に、同一試料４００４をとり、試液工　（検体盲検用
）１ｍｌを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した’ＪＳｔｄ−ＢＬ）。

第１図にグリココール酸ナトリウム濃度と吸光度（Ｅｓ
ｔｄ　　Ｅｓｔｄ−ＢＬ）との関係を示す。第１図より
明らかな如く、各グリココール酸ナトリウム濃度に対し
てプロットした吸光度（Ｅｓｔｄ−Ｅｓｔｄ−ＢＬ）を
結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な定
置性を示している。

実施例２．血清胆汁酸の定量 ［測定試薬１ ■試液■　（検体用） 実施例１に同じ。

■試液■　（検体盲検用） 実施例１１；同じ。

［試料１ 人血清１４検体を試料とした。

［操作法］ 試料４００４をとり、試液■　（検体用）ｌａｌを加え
、３７℃で５分間反応後、試液ｎ　　ｌｄを加え、３７
°Ｃで１０分間加温した。試薬ブランクを対照として波
長５５５ｎｍに於ける吸光度を測定した（Ｅ３〕。

別に、同一試料４００４をとり、試液Ｉ　（検体盲横用
）１ｍ／を加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した（ＥＢＬ）。

Ｅｓ　　”ＢＬを算出し、実施例１．で得られた検量線
　（第１図）から試料中の胆汁酸濃瓜を求めた。

測定結果を表１に示す。

参考例１．血清胆汁酸の定量 ［測定試薬１ ■試液■　（検体用） ０．０５Ｍ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中に、３α
−Ｈ５Ｄを４００Ｕ＃１、ジアホラーゼヲ４００Ｕ／Ｊ
ｌ、ＮＡＤを　１．４ｍｍｏｌ／ｌ、ニトロテトラゾリ
ウムブルー（ＮＯ２−Ｔ　Ｂ　）を０．０３％、ピルビ
ン酸ナトリウムを１％、エマルゲン１２０を０．３％の
濃度含有するように調製した。

■試液■　（検体盲検用） 試液■　（検体用）の組成から、３α−ＨＳＤを除いた
組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ ０．４Ｎ−塩酸を調製した。

［試＄’ｌ］ 実施例２．と同じものを使用。

［操作法１ 試料４００１１！をとり、試液■　（検体用）　　１−
を加え、３７°Ｃで１０分間反応後、試液１１１ａ／を
加えて混和し、試薬ブランクを対照として波長５６０ｎ
＋ｓに於ける吸光度を測定した（Ｅｓ）。

同一・試料４００４をとり、試液■　（検体盲検用）ｌ
ｒＲｌを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測定
した（ＥＢＬ）。

別に、グリココール酸ナトリウム　５０ｐｍｏｌ／１の
水溶液（標準液）を調製し、試ネ１の代りに標準液を用
いて同様に操作し、”ｓ　ｔｄ及びＥｓｔｄ、ＢＬを測
定した。

次式により、試料中の１１１！汁酸濃度を算出した。

Ａ１１定結果を表１に示す。

表１に示されるように、実施例２．と参考例１、の相関
性は良好であった。

表　　　　　　　１ Ｙ　＝　１．２８７　　Ｘ　＋　０．８５２（ｙ　＝　
０．９８４）実施例３．シュウ酸塩の効果 ［７１１１１定試薬１ ■試液■　（検体用） 実施例１．に同じ。

■試液■　（検体盲検用） 実施例１．に同じ。

■試液■Ｉ 実施例１．に同じ。

［試料１ 人血清に、オリエンタル酵母■製乳酸脱水素酵素（ＬＤ
Ｈ）　（Ｐｉｇ　Ｈｅａｒｔ、　Ｅ１６８万Ｗｒ６ｂｌ
ｅｗｓｋｉ単位／ｒｎ！〕を加えて、ＬＤＨ５，０００
Ｗｒ６ｂｌｅｗｓｋｉ　＊位／′−を含む血清を調製し
、試料とした。

［操作法１ 上記測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作により、
ＬＤＨ添加血清の吸光度を測定した。

また、別に、比較のため、ＬＤＨ無添加の血清について
も同様にして吸光度を測定した。

測定結果を表２に示す。

比較例１゜ ［測定試薬］ ■試液Ｉ　（検体用） 実施例１．の試液■　（検体用）の組成から、シュウ酸
ナトリウムを除いた組成の試液を調製した。

■試液Ｉ　（検体盲検用） 実施例１．の試液Ｉ’　（検体盲検用）の組成から、シ
ュウ酸す］・リウムを除いた組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料ｌ 実施例３．と同じものを使用。

［操作法１ に記測定試薬を用いて、実施例１．と同一操作により、
Ｌ　Ｄ　Ｈ添加血清の吸光度を測定した。

測定結果を表２に示す。

以下余白 表　　　２ （（支）ＬＤＨ添加血清の調製に用いた血清衣２より明
らかなように、実施例３ではＬＤＨ無添加血清と添加血
清の胆汁酸測定値には有意差は認められない。しかしな
がら、シュウ酸すｌ・リウムを含まない比較例１．では
、ＬＤＨ添加血清でＬＤＨのためにＥｓ、ＥＢＬとも異
常に高い吸光度を示し、しかもＥ８よりもＥＢＬが高い
という逆転現象を示し、胆汁酸濃度を求めることができ
なかった。

実施例４．添加回収テスト ［測定試薬］ ■試液■（検体用） 実施例１．に同じ。

■試液１（検体盲検用） 実施例１．に同じ。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ グリココール酸ナトリウム標準液（１００ｇ　ｍｏｌ／
１）（ａ）、プール血清（ｂ）及びグリココール酸ナト
リウムが　ｌｏｏｇｍｏｌ／Ｉ　の濃度になるようにプ
ール血清に添加したもの（Ｃ）を試ネ４とした。

［操作Ｄ、］ 」−記測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作により
測定を行なった。

測定結果を表３に示す。

比較例２゜ Φ試給Ｉ（検体用） 実施例１．の試液■（検体用）の組成から、アジ化ナト
リウム及びＮＥＭを除いた組成の試液を調製した。

■試液■（検体盲検用） 実施例１．の試液■（検体盲検用）の組成から、アジ化
ナトリウム及びＮＥＭを除いた組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ により測定を行なった。

測定結果を表３に示す。

表　　３ 注）表中の数値は吸光度を示す。

表３より明らかなように、実施例４．では回収率は１０
０％と良好であったが、比較例２．では４２．１％と低
く、正確度に問題があった。

実施例５．ＳＯＤの効果 ［Ａ１１定試薬］ ■試液Ｉ（検体用） 実施例１．に同じ。

■試液Ｉ’　（検体榊盲検用） 実施例１．に同じ。

■試液１１ 実施例１．に同じ。

［試ネ１１コ 大血清及び標準液（２００＃Ｌｓｏ　ｌ／　ｌのグ１）
ココ−ルー酸ナトリウム水溶液）を試料とした。

［操作法］ ｌ金肥測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作により
測定を行なった。

４１１定結果を表４に示す。

実施例６．　Ｓ００の効果 ［測定試薬］ ■試液■（検体用） 実施例１．の試液Ｉ（検体用）の組成力）ら、Ｓ０Ｄを
除いた組成の試襄を調製した。

■試液Ｉ（検体盲検用） 実施例１．の試液１’（検体盲検用）の組成から、ＳＯ
Ｄを除いた組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．の試液ＩＩの組成に、ＳＯＤを３００Ｕ／ｍ
／の濃度になるように加えた組成の試液を調製した。

［試料］ 実施例５．と同じものを使用。

［操作法コ 上記測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作により測
定を行なった。

測定結果を表４に示す。

比較例３゜ ［測定試薬］ ■試液工（検体用） 実施例１．の試液工（検体用）の組成から、ＳＯＤを除
いた組成の試液を調製した。

■試液工（検体盲検用） 実施例１．の試液工“（検体盲検用）の組成から、ＳＯ
Ｄを除いた組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ 実施例５．と同じものを使用。

［操作法］ 上記測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作により測
定を行なった。

測定結果を表４に示す。

表　　　４ 注）発色後直ちに褪色し始めた。

実施例５．及び実施例６．の場合、血清、標準液ともに
その呈色は３０分以−１−安定であった。

表４より明らかなように、ＳＯＤを含まない試液を用い
た場合（比較例３）、血清、標準液ともに呈色が低く、
且つ血清試料の場合呈色が経時的に褪色した。

実施例７．キレート剤の効果 ［測定試薬］ ■試液Ｉ（検体用） 実施例１．に同じ。

■試液工（検体掛盲検用） 実施例１．に同じ。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ 人血清を試料とした。

［操作法］ −４−記測定試薬を用いて、実施例２．と同一操作によ
り測定を行なった。

＋１１１１定結果を表５に示す。

実施例８．キレート剤の効果 ［測定試薬］ ■試液工（検体用） 実施例１．の試液工（検体用）の組成から、ＥＤＴＡ−
２Ｎａを除き、代わりにＤＰＴＡ−０）（を３．５　ｍ
ｍｏｌ／ｌの濃度になるように加えた組成の試液を調製
した。

（の試液Ｉ（検体盲検用） 試液Ｉ　（検体用）の組成から、３α−ＨＳＤを除いた
組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ 標準液（実施例１．で用いた標準液）及び実施例７．と
同じ人血清を試料とした。

し操作法］ 標準液を用いて、実施例１．と同一操作により測定を行
ない、検量線を作成した。

検量線を第２図に示す。第２図より明らかな如く、この
場合も検量線は原点を通る直線となり、良好な定植性を
示している。

？ＬＩられた検量線を用い、人血清中の胆汁酸濃度を測
定した。測定結果を表５に示す。

比較例４゜ ［測定試薬］ ■試液Ｉ（検体用） 実施例１．の試液■（検体用）の組成から、ＥＤＴＡ−
２Ｎａを除いた組成の試液を調製した。

■試液工　（検体盲検用） 実施例１．の試液工（検体用）の組成から、ＥＤ　Ｔ　
Ａ　−２Ｎａを除いた組成の試液を調製した。

■試液ＩＩ 実施例１．に同じ。

［試料］ 実施例７．と同じものを使用。

［操作法］ 」金肥測定試薬を用いて、実施例２．と同一・操作によ
り測定を行なった。

測定結果を表５に示す。

表　　　５ 表５より明らかなように、試液中にキレート剤を含まな
い場合（比較例４）、測定液は濁りを生じ、検体及び検
体盲検の吸光度はいずれも高値を示すが、試液中にキレ
ート剤を含む場合（実施例７、の場合はＥＤＴＡ−２Ｎ
ａ、実施例８．）場合はＤＰＴＡ−ＯＨを含む）は、濁
りが消えて、検体及び検体盲検の吸光度はいずれも低値
を示した。しかしながら、Ｅｓ’ＢＬの値は、実施例７
．実施例８．と比較例４の３者の間に有意差は認められ
なかった。

〔発明の効果〕

以１−述へた如く、本発明は、胆汁酸の定量を過酷化水
素発生系で、酸化呈色試薬の呈色を比色定量することに
より、高感度、高精度に行なう方法を提供するものであ
り、 ■従来のテトラゾリウム塩を用いる比色定量法と異なり
、生成した色素によるセルの汚染の問題が全くない、 ■より感度の高い酸化呈色試薬を選択することにより７
星感度を上げることが可能である、■血清中の妨害酵素
の影響回避方圧に４４随した問題がない、 ■血清中の過酸化水素消費物質の影響による誤差がない
。

点に顕著な効果を奏する発明であって、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、夫々実施例１．及び実施例８．に
於て得られた検量線を表わし、いずれも横１ｋｂｃｒ＋
各グリココール酸ナトリウム濃度（ｇｍａｌ／ｌ）につ
いて得られた吸光度（Ｅｓｔｄ−Ｅｓｔｄ、ＢＬ）を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和６１年１０月　Ｋ日 １　事件の表示 昭和６０年特許願第１．５６２８６号 ２　発明の名称 胆汁酸の定量法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 連絡先　′ｌ’ｉｌ：ｌ−０３−２７０−８５７１５補
正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書８頁８行目から９行目にかけて記載の「ス
ーパーオキＰジスムターゼ」ヲ［スーパーオキシドジス
ムターゼ」と補正する。 （３）明細書１２頁９行目から１０行目にかけて記載の
「Ｎ−メチルマレイミド」を「Ｎ−エチルマレイミド」
と補正する。 以上 別　　　　紙 ２、特許請求の範囲 （１）胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類の存在下、３α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素（３α−Ｈ８Ｄ　）、酸化型補酵
素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定
量することにより行々う胆汁酸の定量法。 （２）酸化型補酵素が、ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミ
ドアデニンノヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニ
コチンアミｌ？アデニンジヌクレオチドリン酸）である
、特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 （３）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトザルフェート（１
−メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキンニウムクロリド（メルドラブルー）である
、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の定量法。 （４）キレート剤を用いる、特許請求の範囲第１項〜第
３項のいずれかに記載の定量法。 （５）胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体の存在下、３α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素（３α−Ｈ８Ｄ　）　、酸化型補
酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を
定量することにより行々う胆汁酸の定量法。 （６）酸化型補酵素が、ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチＦ％）又はＮＡＤＰ＋（酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチＰリン酸）である
、特許請求の範囲第５項に記載の定量法。 （７）電子伝達体が、ツェナ・ノンメトザルフェート（
ＰＭＳ）、１−メトキシツェナノンメトザルフェート（
１−メトキシＰＭＳ　）、９−ツメチルアミノベンゾ−
α−フェナゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）で
ある、特許請求の範囲第５項又は第６項に記載の定量法
。 （８）キレート剤を用いる、特許請求の範囲第５項〜第
７項のいずれかに記載の定量法。 （９）胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体と、スー・ぐ−オキ２ドジス
ムターゼ（ＳＯＤ）の存在下、３α−ヒドロキシステロ
イド脱水素酵素（３α−Ｈ８Ｄ　）、酸化型補酵素及び
電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量する
ことにより行なう胆汁酸の定量法。 ０１酸化型補酵素が、ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）である、特
許請求の範囲第９項に記載の定量法。 ０１）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１
−メトキシＰＭＳ）、９−ツメチルアミノベンゾ−α−
フエナゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）である
、特許請求の範囲第９項又は第１０項に記載の定量法。 θつキレート剤を用いる、特許請求の範囲第９項〜第１
１項のいずれかに記載の定量法。 以上 ＝６１６−

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
   はオキサム酸又はその塩類の存在下、３α−ヒドロキシ
   ステロイド脱水素酵素（３α−ＨＳＤ）、酸化型補酵素
   及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量
   することにより行なう胆汁酸の定量法。
2. （２）酸化型補酵素が、ＮＡＤ＾＋（酸化型ニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＾＋（酸化
   型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）であ
   る、特許請求の範囲第１項に記載の定量法。
3. （３）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
   ＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１
   −メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ−α−
   フェナゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）である
   。特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の定量法。
4. （４）キレート剤を用いる、特許請求の範囲第１項〜第
   ３項のいずれかに記載の定量法。
5. （５）胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
   はオキサム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
   ミド又はマレイミド誘導体の存在下、３α−ヒドロキシ
   ステロイド脱水素酵素（３α−ＨＳＤ）、酸化型補酵素
   及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量
   することにより行なう胆汁酸の定量法。
6. （６）酸化型補酵素が、ＮＡＤ＾＋（酸化型ニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＾＋（酸化
   型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）であ
   る、特許請求の範囲第５項に記載の定量法。
7. （７）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
   ＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１
   −メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ−α−
   フェナゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）である
   、特許請求の範囲第５項又は第６項に記載の定量法。
8. （８）キレート剤を用いる、特許請求の範囲第５項〜第
   ７項のいずれかに記載の定量法。
9. （９）胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
   はオキサム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
   ミド又はマレイミド誘導体と、スーパーオキドジスムタ
   ーゼ（ＳＯＤ）の存在下、３α−ヒドロキシステロイド
   脱水素酵素（３α−ＨＳＤ）、酸化型補酵素及び電子伝
   達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量することに
   より行なう胆汁酸の定量法。
10. （１０）酸化型補酵素が、ＮＡＤ＾＋（酸化型ニコチン
    アミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＾＋（酸
    化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）で
    ある、特許請求の範囲第９項に記載の定量法。
11. （１１）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（
    ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（
    １−メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ−α
    −フェナゾキソニウムクロリド（メルドラブルー）であ
    る、特許請求の範囲第９項又は第１０項に記載の定量法
    。
12. （１２）キレート剤を用いる、特許請求の範囲第９項〜
    第１１項のいずれかに記載の定量法。