JPS6219100A - 胆汁酸の定量法 - Google Patents
胆汁酸の定量法Info
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- JPS6219100A JPS6219100A JP15628685A JP15628685A JPS6219100A JP S6219100 A JPS6219100 A JP S6219100A JP 15628685 A JP15628685 A JP 15628685A JP 15628685 A JP15628685 A JP 15628685A JP S6219100 A JPS6219100 A JP S6219100A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、血清等生体試料中の胆汁酸の新規定量法に関
する。
する。
胆汁酸は肝臓に於てコレステロールから合成され、グリ
シン又はタウリンと抱合してI]!汁中に排出yれ、大
部分は小腸で吸収、門脈を経て肝臓にもどる賜肝循環を
行なっている。この胆汁酸の血中濃度は、胆71うっ滞
や肝細胞障害で−I−iし、消化管疾患(例えば吸収不
良症候群)では低下することが知られている。従って、
胆汁酸の測定は、肝疾患や消化器疾患の早期診断、予後
の判定等臨床的に重要な意義をもつものである。
シン又はタウリンと抱合してI]!汁中に排出yれ、大
部分は小腸で吸収、門脈を経て肝臓にもどる賜肝循環を
行なっている。この胆汁酸の血中濃度は、胆71うっ滞
や肝細胞障害で−I−iし、消化管疾患(例えば吸収不
良症候群)では低下することが知られている。従って、
胆汁酸の測定は、肝疾患や消化器疾患の早期診断、予後
の判定等臨床的に重要な意義をもつものである。
従来より、ljl汁酩の測定法は種々検討されているが
、胆汁酸がN A D ”(酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド)又はNADP”(酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸)の共存下で、3
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−H
5D)によってケト型に変化し、同時にNAD+又はN
AD P+が夫々NADH(還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド)又はNADPH(還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸)に変化する反応
を利用し、ここに生成したNADH又はNADPHの敬
を蛍光法又は比色法により定量し、血清中の胆汁酸濃度
を求める方法が一般によく知られている。
、胆汁酸がN A D ”(酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド)又はNADP”(酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸)の共存下で、3
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−H
5D)によってケト型に変化し、同時にNAD+又はN
AD P+が夫々NADH(還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド)又はNADPH(還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸)に変化する反応
を利用し、ここに生成したNADH又はNADPHの敬
を蛍光法又は比色法により定量し、血清中の胆汁酸濃度
を求める方法が一般によく知られている。
ここで用いられる蛍光法としては、例えばレサズリンが
ジアホラーゼの存在下、NADH又はNADFHにより
還元され蛍光物質であるレゾルフィンを生成する反応を
利用する方法等が挙げられるが、蛍光法は試料中の酵素
類を加熱処理により予め不活化しなければならないこと
、測定に蛍光光度計を使用しなければならないことなど
[1常検査に導入するにはいくつかの問題を有している
。
ジアホラーゼの存在下、NADH又はNADFHにより
還元され蛍光物質であるレゾルフィンを生成する反応を
利用する方法等が挙げられるが、蛍光法は試料中の酵素
類を加熱処理により予め不活化しなければならないこと
、測定に蛍光光度計を使用しなければならないことなど
[1常検査に導入するにはいくつかの問題を有している
。
一方、比色法は日常検査法として最も一般的な方法であ
り、例えばNADH又はNADPHの測定を、ジアホラ
ーゼ又は電子伝達体を介してテトラゾリウム塩を有色の
ホルマザンに還元し、これを比色定量することにより行
なっている。しかしながら、この比色法にも、反応によ
り生成したホルマザンのキュベツトへの染着による誤差
等の問題があり、この点の改善が要望されていた。
り、例えばNADH又はNADPHの測定を、ジアホラ
ーゼ又は電子伝達体を介してテトラゾリウム塩を有色の
ホルマザンに還元し、これを比色定量することにより行
なっている。しかしながら、この比色法にも、反応によ
り生成したホルマザンのキュベツトへの染着による誤差
等の問題があり、この点の改善が要望されていた。
これに対し、木発明者の一部らは、上述したようなホル
マザン発色法の欠点を解決すべく鋭意研究を重ね、還元
型補酵素に電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより、還元型補酵素を定量′する還元
型補酵素の新規定量法を見出し、従来のホルマザン発色
系を過酸化水素発色系に置き換えることに成功している
(特開昭59−210899号公報)。
マザン発色法の欠点を解決すべく鋭意研究を重ね、還元
型補酵素に電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより、還元型補酵素を定量′する還元
型補酵素の新規定量法を見出し、従来のホルマザン発色
系を過酸化水素発色系に置き換えることに成功している
(特開昭59−210899号公報)。
本発明者らは、この定量法を胆汁酸の定量に応用すべく
鋭意研究の途4−1該方法により胆汁酸を定量する場合
、従来上として用いられている非ステロイド性ヒドロキ
シ酸脱水素酵素阻害剤であるピルビン酸が呈色反応を阻
害し、また、血清中の過酸化水素消費物質により負誤差
を生ずるなど、測定の正確性に問題が生ずることが明ら
かになった。
鋭意研究の途4−1該方法により胆汁酸を定量する場合
、従来上として用いられている非ステロイド性ヒドロキ
シ酸脱水素酵素阻害剤であるピルビン酸が呈色反応を阻
害し、また、血清中の過酸化水素消費物質により負誤差
を生ずるなど、測定の正確性に問題が生ずることが明ら
かになった。
本発明は−1−記した如き状況に鑑みなされたもので、
従来より改善が求められていたセルの染着の問題、妨害
酵素の影響回避方法に付随した問題、血清中の過酸化水
素消費物質による誤差の問題等をすべて解決した胆汁酸
の新規で目、つ精度の高い定量法を提供することを目的
とする。
従来より改善が求められていたセルの染着の問題、妨害
酵素の影響回避方法に付随した問題、血清中の過酸化水
素消費物質による誤差の問題等をすべて解決した胆汁酸
の新規で目、つ精度の高い定量法を提供することを目的
とする。
本発明は、胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類
或いはオキサム酸又はその塩類の存在F、3α−ヒドロ
キシステロイド脱水素酵素 (3α−HSD)、酸化型
補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより行なう胆汁酸の定量法、及び胆汁
酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム
酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイミド又はマ
レイミド誘導体の存在下、3α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素(3α−HSD)、酸化型補酵素及び電子伝
達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量することに
より行なう胆汁酸の定量法、並びに胆汁酸を含む試料に
、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム酸又はその塩類
と、アジド化合物及びマレイミド又はマレイミド誘導体
と、スーパーオキドジスムターゼ(SOD)の存在下、
3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素(3α−HSD
)、 酸化型補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行なう胆汁酸の定量
法の発明である。
或いはオキサム酸又はその塩類の存在F、3α−ヒドロ
キシステロイド脱水素酵素 (3α−HSD)、酸化型
補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素
を定量することにより行なう胆汁酸の定量法、及び胆汁
酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム
酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイミド又はマ
レイミド誘導体の存在下、3α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素(3α−HSD)、酸化型補酵素及び電子伝
達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量することに
より行なう胆汁酸の定量法、並びに胆汁酸を含む試料に
、シュウ酸又はその塩類或いはオキサム酸又はその塩類
と、アジド化合物及びマレイミド又はマレイミド誘導体
と、スーパーオキドジスムターゼ(SOD)の存在下、
3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素(3α−HSD
)、 酸化型補酵素及び電子伝達体を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行なう胆汁酸の定量
法の発明である。
即ち、本発明者らは、従来より改善が求められていたセ
ルの染着の問題を解消した特開昭59−210899号
の発明を利用した胆汁酸の定量法を確立すべく鋭意研究
を重ねた結果、非ステロイド性ヒドロキシ酸脱水素酵素
阻害剤として、ピルビン酸の代わりにシュウ酸又はその
塩、オキサム酸又はその塩、又はこれらの混合物を用い
れば、呈色反応のβ11害は起らないことを見出し、更
に、アジド化合物とマレイミド又はマレイミド誘導体を
用いれば、血清中の過酸化水素消費物質による負誤差が
回避できること、また、スーパーオキシドジスムターゼ
(SOD)を加えることにより呈色が安定になることを
見出し、本発明を完成するに到った。
ルの染着の問題を解消した特開昭59−210899号
の発明を利用した胆汁酸の定量法を確立すべく鋭意研究
を重ねた結果、非ステロイド性ヒドロキシ酸脱水素酵素
阻害剤として、ピルビン酸の代わりにシュウ酸又はその
塩、オキサム酸又はその塩、又はこれらの混合物を用い
れば、呈色反応のβ11害は起らないことを見出し、更
に、アジド化合物とマレイミド又はマレイミド誘導体を
用いれば、血清中の過酸化水素消費物質による負誤差が
回避できること、また、スーパーオキシドジスムターゼ
(SOD)を加えることにより呈色が安定になることを
見出し、本発明を完成するに到った。
本発明に用いられる酸化型補酵素としては、例えば、N
AD+又はNADP+等が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。その使用濃度は特に限定されない
が1通常0.5〜4mmo l/ lの濃度が好ましく
用いらねる。
AD+又はNADP+等が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。その使用濃度は特に限定されない
が1通常0.5〜4mmo l/ lの濃度が好ましく
用いらねる。
本発明に用いられる電子伝達体としては、例えば、フェ
ナジンメトサルフェー+−(PMS)、I−メトキシフ
ェナジンメトサルフェー1−(1−メトキシPMS)、
9−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナツキソニウムク
ロリド(メルドラブルー)等が挙げられるが、これらに
限定されるものではなく、これらと同等な作用を有する
電子伝達体であれば全て用いることができる。その使用
濃度は特に限定されないが、通常0.002〜0.3
+mmol/lの濃度が好ましく用いられる。
ナジンメトサルフェー+−(PMS)、I−メトキシフ
ェナジンメトサルフェー1−(1−メトキシPMS)、
9−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナツキソニウムク
ロリド(メルドラブルー)等が挙げられるが、これらに
限定されるものではなく、これらと同等な作用を有する
電子伝達体であれば全て用いることができる。その使用
濃度は特に限定されないが、通常0.002〜0.3
+mmol/lの濃度が好ましく用いられる。
本発明の方法に於て、非ステロイド性ヒドロキシ酸脱水
素酵素阻害剤として用いられるシュウ酸又はその塩、或
いはオキサム酸又はその塩の塩類としては、例えばナト
リウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩やアン
モニウム塩等が挙げられる。
素酵素阻害剤として用いられるシュウ酸又はその塩、或
いはオキサム酸又はその塩の塩類としては、例えばナト
リウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩やアン
モニウム塩等が挙げられる。
本発明に於て用いられるシュウ酸又はその塩は、反応液
中、3 mmol/l以−]二含有していればよいが、
通常7〜300m+io l/ lの濃度が好ましく用
いられる。また、オキサム酸又はその塩は、反応液中、
5 m’mol/1以上含有していればよいが、通常1
0〜60mmol/Iの濃度が好ましく用いられる。
中、3 mmol/l以−]二含有していればよいが、
通常7〜300m+io l/ lの濃度が好ましく用
いられる。また、オキサム酸又はその塩は、反応液中、
5 m’mol/1以上含有していればよいが、通常1
0〜60mmol/Iの濃度が好ましく用いられる。
シュウ酸又はその塩を用いた場合、血清により濁りを生
ずる場合があるが、この濁りを回避するには、午レート
剤の添加が有効である。用いられるキレート剤は、通常
キレート試薬といわれているもの、例えばエチレンジア
ミン四酢酸(E D TA)、トランス−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸(CyDTA)、ジエチレントリアミ
ン五酢酸 (DTPA)、グリコールエーテルジアミン
四酢酸(GEDTA)、ニトリロ玉酢酸(NTA)、二
l・リロ三プロピオン酸(NTP)、N−ヒドロキシエ
チルエチレンジアミン三酢酸(E D T A −OH
)、トリエチレンテトラミン−N、N、N’ 、N”
、N”’、N”’−六酢酸(TTHA)、1.3−ジア
ミノプロパン−2−オール−N、N、N’ 、N’−四
酢酸(DPTA−OH)又はこれらの塩などがあげられ
るが、これらに限定されるものではないことは勿論であ
る。これらの使用濃度は、最終呈色液中0.1〜bが好
ましく用いられる。
ずる場合があるが、この濁りを回避するには、午レート
剤の添加が有効である。用いられるキレート剤は、通常
キレート試薬といわれているもの、例えばエチレンジア
ミン四酢酸(E D TA)、トランス−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸(CyDTA)、ジエチレントリアミ
ン五酢酸 (DTPA)、グリコールエーテルジアミン
四酢酸(GEDTA)、ニトリロ玉酢酸(NTA)、二
l・リロ三プロピオン酸(NTP)、N−ヒドロキシエ
チルエチレンジアミン三酢酸(E D T A −OH
)、トリエチレンテトラミン−N、N、N’ 、N”
、N”’、N”’−六酢酸(TTHA)、1.3−ジア
ミノプロパン−2−オール−N、N、N’ 、N’−四
酢酸(DPTA−OH)又はこれらの塩などがあげられ
るが、これらに限定されるものではないことは勿論であ
る。これらの使用濃度は、最終呈色液中0.1〜bが好
ましく用いられる。
本発明の方法に於て、血清中の過酸化水素消費物質によ
る負誤差を回避する目的で用いられるアジド化合物とし
ては、例えばアジ化すトリウム等のアジ化物が挙げられ
る。その濃度は、反応液中、0.002%以I−であれ
ばよいが、通常0.QO4〜0.1%が好ましく用いら
れる。
る負誤差を回避する目的で用いられるアジド化合物とし
ては、例えばアジ化すトリウム等のアジ化物が挙げられ
る。その濃度は、反応液中、0.002%以I−であれ
ばよいが、通常0.QO4〜0.1%が好ましく用いら
れる。
また、マレイミド又はマレイミド誘導体としては、例え
ばマレイミド、N−エチルマレイミド (NEM) 、
N−(9−アクリジニル)マレイミド、 N−(1−
アニリノナフチル−4)マレイミド、N−(4−アニリ
ノフェニル)マレイミド、N−(p−(2−ベンズイミ
ダゾリル)フェニルコマレイミド、N−(?−ジメチル
アミノー4−メチルクマリニル)マレイミド、N−(3
−フルオランチル)マレイミド等や特開昭59−204
171号公報で開示されている、一般式[I] で表わ
されるN−置換マレイミドなど各種のものが使用できる
が、なかでもN−メチルマレイミド (N E M)が
水に対する溶解性が良い点から好ましく用いられる。
ばマレイミド、N−エチルマレイミド (NEM) 、
N−(9−アクリジニル)マレイミド、 N−(1−
アニリノナフチル−4)マレイミド、N−(4−アニリ
ノフェニル)マレイミド、N−(p−(2−ベンズイミ
ダゾリル)フェニルコマレイミド、N−(?−ジメチル
アミノー4−メチルクマリニル)マレイミド、N−(3
−フルオランチル)マレイミド等や特開昭59−204
171号公報で開示されている、一般式[I] で表わ
されるN−置換マレイミドなど各種のものが使用できる
が、なかでもN−メチルマレイミド (N E M)が
水に対する溶解性が良い点から好ましく用いられる。
〔式中、R1は水素、ニトロ基、゛ジ低級アルキルアミ
7基又はR”−CONH−なる基(但し、R3は低級ア
ルキル基又はツーニル基である。)であり、R2は水素
又は二1・口広である。また、マレイミド置換基はベン
ゾイル置換基のオルト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中、0.1mmol/l以」−含有
されていればよいが、通常は0.5〜50mmo l/
lが好ましく用いられる。
7基又はR”−CONH−なる基(但し、R3は低級ア
ルキル基又はツーニル基である。)であり、R2は水素
又は二1・口広である。また、マレイミド置換基はベン
ゾイル置換基のオルト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中、0.1mmol/l以」−含有
されていればよいが、通常は0.5〜50mmo l/
lが好ましく用いられる。
本発明の方法を実施するには2例えば、3α−HSD、
NAD、電子伝達体、シュウ酸又はその塩類或いはオキ
サム酸又はその塩類、アジド化合物、マレイミド又はマ
レイミド誘導体、界面活性剤を含むM衝液(第1試液)
を試料に加え、胆汁酸と3α−HSD及びNAD+の反
応により生成したNADHが電子伝達体と反応して定量
的に生成した過酸化水素を、過酸化水素定量試薬(第2
試液)で比色定縫すればよい。
NAD、電子伝達体、シュウ酸又はその塩類或いはオキ
サム酸又はその塩類、アジド化合物、マレイミド又はマ
レイミド誘導体、界面活性剤を含むM衝液(第1試液)
を試料に加え、胆汁酸と3α−HSD及びNAD+の反
応により生成したNADHが電子伝達体と反応して定量
的に生成した過酸化水素を、過酸化水素定量試薬(第2
試液)で比色定縫すればよい。
過酸化水素定量試薬としては、酸化呈色試薬とペルオキ
シダーゼ(POD)とを組合わせた試薬や、4価のチタ
ン化合物と2−(5−ブロモ−2−ピリジルアゾ) −
5−(N−プロピル−N−スルホプロピルアミノ)フェ
ノール又は/及びその塩とから成る試薬などを用いるこ
とができる。
シダーゼ(POD)とを組合わせた試薬や、4価のチタ
ン化合物と2−(5−ブロモ−2−ピリジルアゾ) −
5−(N−プロピル−N−スルホプロピルアミノ)フェ
ノール又は/及びその塩とから成る試薬などを用いるこ
とができる。
PODと組合わせて本発明に用いられる酸化呈色試薬と
しては、通常、H2O2−P OD系で用いられている
自体公知のものがすべて使用でき、例えば、4−アミノ
アンチピリンと、フェノール系化合物又はN、N−ジ置
換アニリン系化合物とを組合わせた酸化呈色試薬、3−
メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)とア
ニリン系化合物との組合わせ試薬、トリフェニルメタン
系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、0−トリジン誘導体
、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘
導体、ロイコメチレンブルー誘導体、〇−フェニレンジ
アミン、2,2°−アジノビス(3−エチルベンゾチア
ゾリン−6−スルホン酸)又はその塩等が挙げられるが
、これらに限定されるものではない。
しては、通常、H2O2−P OD系で用いられている
自体公知のものがすべて使用でき、例えば、4−アミノ
アンチピリンと、フェノール系化合物又はN、N−ジ置
換アニリン系化合物とを組合わせた酸化呈色試薬、3−
メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)とア
ニリン系化合物との組合わせ試薬、トリフェニルメタン
系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、0−トリジン誘導体
、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘
導体、ロイコメチレンブルー誘導体、〇−フェニレンジ
アミン、2,2°−アジノビス(3−エチルベンゾチア
ゾリン−6−スルホン酸)又はその塩等が挙げられるが
、これらに限定されるものではない。
第1試液の液性は、pH8〜10の範囲であれば通常特
に問題はないが、なかでもpH7〜9の範囲が好ましく
用いられる。第2試液は、用いられる過酸化水素定量試
薬の定量条件及び試薬の安定性に適した液性に調製すれ
ばよい。即ち、第2試液の役割は、第1試液と胆汁酸の
反応により生成した過酸化水素の比色7鼾反応のみであ
るので、胆汁酸と3α−HSD及びNAr)+の反応条
件とは全く無関係に比色定早法の選択ができる点は、本
発明の利点の1つである。
に問題はないが、なかでもpH7〜9の範囲が好ましく
用いられる。第2試液は、用いられる過酸化水素定量試
薬の定量条件及び試薬の安定性に適した液性に調製すれ
ばよい。即ち、第2試液の役割は、第1試液と胆汁酸の
反応により生成した過酸化水素の比色7鼾反応のみであ
るので、胆汁酸と3α−HSD及びNAr)+の反応条
件とは全く無関係に比色定早法の選択ができる点は、本
発明の利点の1つである。
更に、本発明に於て、SODを第1試液又は第2試液に
添加することにより、過酸化水素7帛試薬の呈色度が増
大され、目、つ呈色安定性も改善されることが判った。
添加することにより、過酸化水素7帛試薬の呈色度が増
大され、目、つ呈色安定性も改善されることが判った。
SODは通常
202”+ 2 H+−→02 + H2O2で示され
る反応を触媒する酵素として知られているが、本発明の
反応系に於ては、呈色安定性に効果がみられる。このよ
うな効果は全く予想外なことである。SODは第1試液
に添加しても、また第2試液に添加しても(この場合、
第1試液にはSOD無添加)同じような効果を示す。こ
のことは、本来のSOD作用とは全く異なった働きをし
ていることを示している。
る反応を触媒する酵素として知られているが、本発明の
反応系に於ては、呈色安定性に効果がみられる。このよ
うな効果は全く予想外なことである。SODは第1試液
に添加しても、また第2試液に添加しても(この場合、
第1試液にはSOD無添加)同じような効果を示す。こ
のことは、本来のSOD作用とは全く異なった働きをし
ていることを示している。
本発明に用いられるSODとしては、現在知られている
銅−亜鉛−5OD (Cu・Zn−3OD)、−27カ
7−3OD (Mll−3OD) 、鉄−5OD(F
e−5OD)のいずれでもよく、その由来はヒト、動物
、酵母、植物、微生物のいずれでも差支えない。
銅−亜鉛−5OD (Cu・Zn−3OD)、−27カ
7−3OD (Mll−3OD) 、鉄−5OD(F
e−5OD)のいずれでもよく、その由来はヒト、動物
、酵母、植物、微生物のいずれでも差支えない。
以下に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらに
より何ら限定されるものではない。
より何ら限定されるものではない。
実施例1.検量線の作成
[測定試薬1
■試液I (検体用)
0.0258 +=リスー塩酸緩衝液(pH8,5)中
に、3α−HSDを1400#L 、 N A Dを1
40n+g/dl、 !−メトキシPMSを0.03m
mol/l、シュウ酸ナトリウムを1%、EDTA−2
Naを2.7mmol/I、アジ化すトリウムを0.旧
%、NEMを21IIIol/1. S ODを30
0U/al!及びエマルゲン120(花王石鹸製)を0
.25%の濃度含有するように調製した。
に、3α−HSDを1400#L 、 N A Dを1
40n+g/dl、 !−メトキシPMSを0.03m
mol/l、シュウ酸ナトリウムを1%、EDTA−2
Naを2.7mmol/I、アジ化すトリウムを0.旧
%、NEMを21IIIol/1. S ODを30
0U/al!及びエマルゲン120(花王石鹸製)を0
.25%の濃度含有するように調製した。
■試液工 (検体盲検用)
試液工 (検体用)の組成から、3α−HSDを除いた
組成の試液を調製した。
組成の試液を調製した。
■試液IT
0.1M+−リス−塩酸緩衝液(pH7,7)中に、4
−アミノアンチピリンを0.018%、N−エチル−N
−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トル
イジンナトリウム (以下、TOO5と略す。)を0.
07%、PODを?200U/見及びエマルゲン120
を0.25%の濃度含有するように調製した。
−アミノアンチピリンを0.018%、N−エチル−N
−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トル
イジンナトリウム (以下、TOO5と略す。)を0.
07%、PODを?200U/見及びエマルゲン120
を0.25%の濃度含有するように調製した。
■試料1
グリココール酸ナトリウムを夫々、50.100゜15
0、200.250.300pmol/I含む水溶液を
調製し、試料とした。
0、200.250.300pmol/I含む水溶液を
調製し、試料とした。
[操作法1
試$44oo、zをとり、試液工 (検体用)l−を加
え、37°Cで5分間反応後、試液II 1−を加え
、37°Cで10分間加温した。試薬ブランクを対照と
して波長555n■に於ける吸光度を測定した(Est
d)− 別に、同一試料4004をとり、試液工 (検体盲検用
)1mlを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した’JStd−BL)。
え、37°Cで5分間反応後、試液II 1−を加え
、37°Cで10分間加温した。試薬ブランクを対照と
して波長555n■に於ける吸光度を測定した(Est
d)− 別に、同一試料4004をとり、試液工 (検体盲検用
)1mlを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した’JStd−BL)。
第1図にグリココール酸ナトリウム濃度と吸光度(Es
td Estd−BL)との関係を示す。第1図より
明らかな如く、各グリココール酸ナトリウム濃度に対し
てプロットした吸光度(Estd−Estd−BL)を
結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な定
置性を示している。
td Estd−BL)との関係を示す。第1図より
明らかな如く、各グリココール酸ナトリウム濃度に対し
てプロットした吸光度(Estd−Estd−BL)を
結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な定
置性を示している。
実施例2.血清胆汁酸の定量
[測定試薬1
■試液■ (検体用)
実施例1に同じ。
■試液■ (検体盲検用)
実施例11;同じ。
[試料1
人血清14検体を試料とした。
[操作法]
試料4004をとり、試液■ (検体用)lalを加え
、37℃で5分間反応後、試液n ldを加え、37
°Cで10分間加温した。試薬ブランクを対照として波
長555nmに於ける吸光度を測定した(E3〕。
、37℃で5分間反応後、試液n ldを加え、37
°Cで10分間加温した。試薬ブランクを対照として波
長555nmに於ける吸光度を測定した(E3〕。
別に、同一試料4004をとり、試液I (検体盲横用
)1m/を加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した(EBL)。
)1m/を加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測
定した(EBL)。
Es ”BLを算出し、実施例1.で得られた検量線
(第1図)から試料中の胆汁酸濃瓜を求めた。
(第1図)から試料中の胆汁酸濃瓜を求めた。
測定結果を表1に示す。
参考例1.血清胆汁酸の定量
[測定試薬1
■試液■ (検体用)
0.05M リン酸塩緩衝液(pH7,5)中に、3α
−H5Dを400U#1、ジアホラーゼヲ400U/J
l、NADを 1.4mmol/l、ニトロテトラゾリ
ウムブルー(NO2−T B )を0.03%、ピルビ
ン酸ナトリウムを1%、エマルゲン120を0.3%の
濃度含有するように調製した。
−H5Dを400U#1、ジアホラーゼヲ400U/J
l、NADを 1.4mmol/l、ニトロテトラゾリ
ウムブルー(NO2−T B )を0.03%、ピルビ
ン酸ナトリウムを1%、エマルゲン120を0.3%の
濃度含有するように調製した。
■試液■ (検体盲検用)
試液■ (検体用)の組成から、3α−HSDを除いた
組成の試液を調製した。
組成の試液を調製した。
■試液II
0.4N−塩酸を調製した。
[試$’l]
実施例2.と同じものを使用。
[操作法1
試料40011!をとり、試液■ (検体用) 1−
を加え、37°Cで10分間反応後、試液111a/を
加えて混和し、試薬ブランクを対照として波長560n
+sに於ける吸光度を測定した(Es)。
を加え、37°Cで10分間反応後、試液111a/を
加えて混和し、試薬ブランクを対照として波長560n
+sに於ける吸光度を測定した(Es)。
同一・試料4004をとり、試液■ (検体盲検用)l
rRlを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測定
した(EBL)。
rRlを加え、上記と同一操作を行なって吸光度を測定
した(EBL)。
別に、グリココール酸ナトリウム 50pmol/1の
水溶液(標準液)を調製し、試ネ1の代りに標準液を用
いて同様に操作し、”s td及びEstd、BLを測
定した。
水溶液(標準液)を調製し、試ネ1の代りに標準液を用
いて同様に操作し、”s td及びEstd、BLを測
定した。
次式により、試料中の111!汁酸濃度を算出した。
A11定結果を表1に示す。
表1に示されるように、実施例2.と参考例1、の相関
性は良好であった。
性は良好であった。
表 1
Y = 1.287 X + 0.852(y =
0.984)実施例3.シュウ酸塩の効果 [71111定試薬1 ■試液■ (検体用) 実施例1.に同じ。
0.984)実施例3.シュウ酸塩の効果 [71111定試薬1 ■試液■ (検体用) 実施例1.に同じ。
■試液■ (検体盲検用)
実施例1.に同じ。
■試液■I
実施例1.に同じ。
[試料1
人血清に、オリエンタル酵母■製乳酸脱水素酵素(LD
H) (Pig Heart、 E168万Wr6bl
ewski単位/rn!〕を加えて、LDH5,000
Wr6blewski *位/′−を含む血清を調製し
、試料とした。
H) (Pig Heart、 E168万Wr6bl
ewski単位/rn!〕を加えて、LDH5,000
Wr6blewski *位/′−を含む血清を調製し
、試料とした。
[操作法1
上記測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作により、
LDH添加血清の吸光度を測定した。
LDH添加血清の吸光度を測定した。
また、別に、比較のため、LDH無添加の血清について
も同様にして吸光度を測定した。
も同様にして吸光度を測定した。
測定結果を表2に示す。
比較例1゜
[測定試薬]
■試液I (検体用)
実施例1.の試液■ (検体用)の組成から、シュウ酸
ナトリウムを除いた組成の試液を調製した。
ナトリウムを除いた組成の試液を調製した。
■試液I (検体盲検用)
実施例1.の試液I’ (検体盲検用)の組成から、シ
ュウ酸す]・リウムを除いた組成の試液を調製した。
ュウ酸す]・リウムを除いた組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料l
実施例3.と同じものを使用。
[操作法1
に記測定試薬を用いて、実施例1.と同一操作により、
L D H添加血清の吸光度を測定した。
L D H添加血清の吸光度を測定した。
測定結果を表2に示す。
以下余白
表 2
((支)LDH添加血清の調製に用いた血清衣2より明
らかなように、実施例3ではLDH無添加血清と添加血
清の胆汁酸測定値には有意差は認められない。しかしな
がら、シュウ酸すl・リウムを含まない比較例1.では
、LDH添加血清でLDHのためにEs、EBLとも異
常に高い吸光度を示し、しかもE8よりもEBLが高い
という逆転現象を示し、胆汁酸濃度を求めることができ
なかった。
らかなように、実施例3ではLDH無添加血清と添加血
清の胆汁酸測定値には有意差は認められない。しかしな
がら、シュウ酸すl・リウムを含まない比較例1.では
、LDH添加血清でLDHのためにEs、EBLとも異
常に高い吸光度を示し、しかもE8よりもEBLが高い
という逆転現象を示し、胆汁酸濃度を求めることができ
なかった。
実施例4.添加回収テスト
[測定試薬]
■試液■(検体用)
実施例1.に同じ。
■試液1(検体盲検用)
実施例1.に同じ。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
グリココール酸ナトリウム標準液(100g mol/
1)(a)、プール血清(b)及びグリココール酸ナト
リウムが loogmol/I の濃度になるようにプ
ール血清に添加したもの(C)を試ネ4とした。
1)(a)、プール血清(b)及びグリココール酸ナト
リウムが loogmol/I の濃度になるようにプ
ール血清に添加したもの(C)を試ネ4とした。
[操作D、]
」−記測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作により
測定を行なった。
測定を行なった。
測定結果を表3に示す。
比較例2゜
Φ試給I(検体用)
実施例1.の試液■(検体用)の組成から、アジ化ナト
リウム及びNEMを除いた組成の試液を調製した。
リウム及びNEMを除いた組成の試液を調製した。
■試液■(検体盲検用)
実施例1.の試液■(検体盲検用)の組成から、アジ化
ナトリウム及びNEMを除いた組成の試液を調製した。
ナトリウム及びNEMを除いた組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
により測定を行なった。
測定結果を表3に示す。
表 3
注)表中の数値は吸光度を示す。
表3より明らかなように、実施例4.では回収率は10
0%と良好であったが、比較例2.では42.1%と低
く、正確度に問題があった。
0%と良好であったが、比較例2.では42.1%と低
く、正確度に問題があった。
実施例5.SODの効果
[A11定試薬]
■試液I(検体用)
実施例1.に同じ。
■試液I’ (検体榊盲検用)
実施例1.に同じ。
■試液11
実施例1.に同じ。
[試ネ11コ
大血清及び標準液(200#Lso l/ lのグ1)
ココ−ルー酸ナトリウム水溶液)を試料とした。
ココ−ルー酸ナトリウム水溶液)を試料とした。
[操作法]
l金肥測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作により
測定を行なった。
測定を行なった。
411定結果を表4に示す。
実施例6. S00の効果
[測定試薬]
■試液■(検体用)
実施例1.の試液I(検体用)の組成力)ら、S0Dを
除いた組成の試襄を調製した。
除いた組成の試襄を調製した。
■試液I(検体盲検用)
実施例1.の試液1’(検体盲検用)の組成から、SO
Dを除いた組成の試液を調製した。
Dを除いた組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.の試液IIの組成に、SODを300U/m
/の濃度になるように加えた組成の試液を調製した。
/の濃度になるように加えた組成の試液を調製した。
[試料]
実施例5.と同じものを使用。
[操作法コ
上記測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作により測
定を行なった。
定を行なった。
測定結果を表4に示す。
比較例3゜
[測定試薬]
■試液工(検体用)
実施例1.の試液工(検体用)の組成から、SODを除
いた組成の試液を調製した。
いた組成の試液を調製した。
■試液工(検体盲検用)
実施例1.の試液工“(検体盲検用)の組成から、SO
Dを除いた組成の試液を調製した。
Dを除いた組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
実施例5.と同じものを使用。
[操作法]
上記測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作により測
定を行なった。
定を行なった。
測定結果を表4に示す。
表 4
注)発色後直ちに褪色し始めた。
実施例5.及び実施例6.の場合、血清、標準液ともに
その呈色は30分以−1−安定であった。
その呈色は30分以−1−安定であった。
表4より明らかなように、SODを含まない試液を用い
た場合(比較例3)、血清、標準液ともに呈色が低く、
且つ血清試料の場合呈色が経時的に褪色した。
た場合(比較例3)、血清、標準液ともに呈色が低く、
且つ血清試料の場合呈色が経時的に褪色した。
実施例7.キレート剤の効果
[測定試薬]
■試液I(検体用)
実施例1.に同じ。
■試液工(検体掛盲検用)
実施例1.に同じ。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
人血清を試料とした。
[操作法]
−4−記測定試薬を用いて、実施例2.と同一操作によ
り測定を行なった。
り測定を行なった。
+1111定結果を表5に示す。
実施例8.キレート剤の効果
[測定試薬]
■試液工(検体用)
実施例1.の試液工(検体用)の組成から、EDTA−
2Naを除き、代わりにDPTA−0)(を3.5 m
mol/lの濃度になるように加えた組成の試液を調製
した。
2Naを除き、代わりにDPTA−0)(を3.5 m
mol/lの濃度になるように加えた組成の試液を調製
した。
(の試液I(検体盲検用)
試液I (検体用)の組成から、3α−HSDを除いた
組成の試液を調製した。
組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
標準液(実施例1.で用いた標準液)及び実施例7.と
同じ人血清を試料とした。
同じ人血清を試料とした。
し操作法]
標準液を用いて、実施例1.と同一操作により測定を行
ない、検量線を作成した。
ない、検量線を作成した。
検量線を第2図に示す。第2図より明らかな如く、この
場合も検量線は原点を通る直線となり、良好な定植性を
示している。
場合も検量線は原点を通る直線となり、良好な定植性を
示している。
?LIられた検量線を用い、人血清中の胆汁酸濃度を測
定した。測定結果を表5に示す。
定した。測定結果を表5に示す。
比較例4゜
[測定試薬]
■試液I(検体用)
実施例1.の試液■(検体用)の組成から、EDTA−
2Naを除いた組成の試液を調製した。
2Naを除いた組成の試液を調製した。
■試液工 (検体盲検用)
実施例1.の試液工(検体用)の組成から、ED T
A −2Naを除いた組成の試液を調製した。
A −2Naを除いた組成の試液を調製した。
■試液II
実施例1.に同じ。
[試料]
実施例7.と同じものを使用。
[操作法]
」金肥測定試薬を用いて、実施例2.と同一・操作によ
り測定を行なった。
り測定を行なった。
測定結果を表5に示す。
表 5
表5より明らかなように、試液中にキレート剤を含まな
い場合(比較例4)、測定液は濁りを生じ、検体及び検
体盲検の吸光度はいずれも高値を示すが、試液中にキレ
ート剤を含む場合(実施例7、の場合はEDTA−2N
a、実施例8.)場合はDPTA−OHを含む)は、濁
りが消えて、検体及び検体盲検の吸光度はいずれも低値
を示した。しかしながら、Es’BLの値は、実施例7
.実施例8.と比較例4の3者の間に有意差は認められ
なかった。
い場合(比較例4)、測定液は濁りを生じ、検体及び検
体盲検の吸光度はいずれも高値を示すが、試液中にキレ
ート剤を含む場合(実施例7、の場合はEDTA−2N
a、実施例8.)場合はDPTA−OHを含む)は、濁
りが消えて、検体及び検体盲検の吸光度はいずれも低値
を示した。しかしながら、Es’BLの値は、実施例7
.実施例8.と比較例4の3者の間に有意差は認められ
なかった。
以1−述へた如く、本発明は、胆汁酸の定量を過酷化水
素発生系で、酸化呈色試薬の呈色を比色定量することに
より、高感度、高精度に行なう方法を提供するものであ
り、 ■従来のテトラゾリウム塩を用いる比色定量法と異なり
、生成した色素によるセルの汚染の問題が全くない、 ■より感度の高い酸化呈色試薬を選択することにより7
星感度を上げることが可能である、■血清中の妨害酵素
の影響回避方圧に44随した問題がない、 ■血清中の過酸化水素消費物質の影響による誤差がない
。
素発生系で、酸化呈色試薬の呈色を比色定量することに
より、高感度、高精度に行なう方法を提供するものであ
り、 ■従来のテトラゾリウム塩を用いる比色定量法と異なり
、生成した色素によるセルの汚染の問題が全くない、 ■より感度の高い酸化呈色試薬を選択することにより7
星感度を上げることが可能である、■血清中の妨害酵素
の影響回避方圧に44随した問題がない、 ■血清中の過酸化水素消費物質の影響による誤差がない
。
点に顕著な効果を奏する発明であって、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。
ところ大なる発明である。
第1図及び第2図は、夫々実施例1.及び実施例8.に
於て得られた検量線を表わし、いずれも横1kbcr+
各グリココール酸ナトリウム濃度(gmal/l)につ
いて得られた吸光度(Estd−Estd、BL)を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和61年10月 K日 1 事件の表示 昭和60年特許願第1.56286号 2 発明の名称 胆汁酸の定量法 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 連絡先 ′l’il:l−03−270−85715補
正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (2)明細書8頁8行目から9行目にかけて記載の「ス
ーパーオキPジスムターゼ」ヲ[スーパーオキシドジス
ムターゼ」と補正する。 (3)明細書12頁9行目から10行目にかけて記載の
「N−メチルマレイミド」を「N−エチルマレイミド」
と補正する。 以上 別 紙 2、特許請求の範囲 (1)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−H8D )、酸化型補酵
素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定
量することにより行々う胆汁酸の定量法。 (2)酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミ
ドアデニンノヌクレオチド)又はNADP+(酸化型ニ
コチンアミl?アデニンジヌクレオチドリン酸)である
、特許請求の範囲第1項に記載の定量法。 (3)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトザルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキンニウムクロリド(メルドラブルー)である
、特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の定量法。 (4)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第1項〜第
3項のいずれかに記載の定量法。 (5)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−H8D ) 、酸化型補
酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を
定量することにより行々う胆汁酸の定量法。 (6)酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチF%)又はNADP+(酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチPリン酸)である
、特許請求の範囲第5項に記載の定量法。 (7)電子伝達体が、ツェナ・ノンメトザルフェート(
PMS)、1−メトキシツェナノンメトザルフェート(
1−メトキシPMS )、9−ツメチルアミノベンゾ−
α−フェナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)で
ある、特許請求の範囲第5項又は第6項に記載の定量法
。 (8)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第5項〜第
7項のいずれかに記載の定量法。 (9)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体と、スー・ぐ−オキ2ドジス
ムターゼ(SOD)の存在下、3α−ヒドロキシステロ
イド脱水素酵素(3α−H8D )、酸化型補酵素及び
電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量する
ことにより行なう胆汁酸の定量法。 01酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド)又はNADP+(酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)である、特
許請求の範囲第9項に記載の定量法。 01)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトサルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ツメチルアミノベンゾ−α−
フエナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)である
、特許請求の範囲第9項又は第10項に記載の定量法。 θつキレート剤を用いる、特許請求の範囲第9項〜第1
1項のいずれかに記載の定量法。 以上 =616−
於て得られた検量線を表わし、いずれも横1kbcr+
各グリココール酸ナトリウム濃度(gmal/l)につ
いて得られた吸光度(Estd−Estd、BL)を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和61年10月 K日 1 事件の表示 昭和60年特許願第1.56286号 2 発明の名称 胆汁酸の定量法 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 連絡先 ′l’il:l−03−270−85715補
正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (2)明細書8頁8行目から9行目にかけて記載の「ス
ーパーオキPジスムターゼ」ヲ[スーパーオキシドジス
ムターゼ」と補正する。 (3)明細書12頁9行目から10行目にかけて記載の
「N−メチルマレイミド」を「N−エチルマレイミド」
と補正する。 以上 別 紙 2、特許請求の範囲 (1)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−H8D )、酸化型補酵
素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定
量することにより行々う胆汁酸の定量法。 (2)酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミ
ドアデニンノヌクレオチド)又はNADP+(酸化型ニ
コチンアミl?アデニンジヌクレオチドリン酸)である
、特許請求の範囲第1項に記載の定量法。 (3)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトザルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキンニウムクロリド(メルドラブルー)である
、特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の定量法。 (4)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第1項〜第
3項のいずれかに記載の定量法。 (5)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−H8D ) 、酸化型補
酵素及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を
定量することにより行々う胆汁酸の定量法。 (6)酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチF%)又はNADP+(酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチPリン酸)である
、特許請求の範囲第5項に記載の定量法。 (7)電子伝達体が、ツェナ・ノンメトザルフェート(
PMS)、1−メトキシツェナノンメトザルフェート(
1−メトキシPMS )、9−ツメチルアミノベンゾ−
α−フェナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)で
ある、特許請求の範囲第5項又は第6項に記載の定量法
。 (8)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第5項〜第
7項のいずれかに記載の定量法。 (9)胆汁酸を含む試料に、シーウ酸又はその塩類或い
はオキザム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体と、スー・ぐ−オキ2ドジス
ムターゼ(SOD)の存在下、3α−ヒドロキシステロ
イド脱水素酵素(3α−H8D )、酸化型補酵素及び
電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量する
ことにより行なう胆汁酸の定量法。 01酸化型補酵素が、NAD+(酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド)又はNADP+(酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)である、特
許請求の範囲第9項に記載の定量法。 01)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトサルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ツメチルアミノベンゾ−α−
フエナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)である
、特許請求の範囲第9項又は第10項に記載の定量法。 θつキレート剤を用いる、特許請求の範囲第9項〜第1
1項のいずれかに記載の定量法。 以上 =616−
Claims (12)
- (1)胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−HSD)、酸化型補酵素
及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量
することにより行なう胆汁酸の定量法。 - (2)酸化型補酵素が、NAD^+(酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド)又はNADP^+(酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)であ
る、特許請求の範囲第1項に記載の定量法。 - (3)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトサルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)である
。特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の定量法。 - (4)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第1項〜第
3項のいずれかに記載の定量法。 - (5)胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体の存在下、3α−ヒドロキシ
ステロイド脱水素酵素(3α−HSD)、酸化型補酵素
及び電子伝達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量
することにより行なう胆汁酸の定量法。 - (6)酸化型補酵素が、NAD^+(酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド)又はNADP^+(酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)であ
る、特許請求の範囲第5項に記載の定量法。 - (7)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(P
MS)、1−メトキシフェナジンメトサルフェート(1
−メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)である
、特許請求の範囲第5項又は第6項に記載の定量法。 - (8)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第5項〜第
7項のいずれかに記載の定量法。 - (9)胆汁酸を含む試料に、シュウ酸又はその塩類或い
はオキサム酸又はその塩類と、アジド化合物及びマレイ
ミド又はマレイミド誘導体と、スーパーオキドジスムタ
ーゼ(SOD)の存在下、3α−ヒドロキシステロイド
脱水素酵素(3α−HSD)、酸化型補酵素及び電子伝
達体を作用させ、生成する過酸化水素を定量することに
より行なう胆汁酸の定量法。 - (10)酸化型補酵素が、NAD^+(酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド)又はNADP^+(酸
化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)で
ある、特許請求の範囲第9項に記載の定量法。 - (11)電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート(
PMS)、1−メトキシフェナジンメトサルフェート(
1−メトキシPMS)、9−ジメチルアミノベンゾ−α
−フェナゾキソニウムクロリド(メルドラブルー)であ
る、特許請求の範囲第9項又は第10項に記載の定量法
。 - (12)キレート剤を用いる、特許請求の範囲第9項〜
第11項のいずれかに記載の定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15628685A JPS6219100A (ja) | 1985-07-16 | 1985-07-16 | 胆汁酸の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15628685A JPS6219100A (ja) | 1985-07-16 | 1985-07-16 | 胆汁酸の定量法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6219100A true JPS6219100A (ja) | 1987-01-27 |
Family
ID=15624492
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15628685A Pending JPS6219100A (ja) | 1985-07-16 | 1985-07-16 | 胆汁酸の定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6219100A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63245697A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Toyobo Co Ltd | 脱水素酵素又は基質の測定法 |
JPS63248399A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-14 | Toyobo Co Ltd | 脱水素酵素または基質の測定法 |
CN104155438A (zh) * | 2014-09-09 | 2014-11-19 | 湖北科技学院 | 一种总胆汁酸的测定试剂 |
-
1985
- 1985-07-16 JP JP15628685A patent/JPS6219100A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63245697A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Toyobo Co Ltd | 脱水素酵素又は基質の測定法 |
JPS63248399A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-14 | Toyobo Co Ltd | 脱水素酵素または基質の測定法 |
CN104155438A (zh) * | 2014-09-09 | 2014-11-19 | 湖北科技学院 | 一种总胆汁酸的测定试剂 |
CN104155438B (zh) * | 2014-09-09 | 2016-04-06 | 湖北科技学院 | 一种总胆汁酸的测定试剂 |
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