JPS6066993A - 生体液成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は内因性又は外因性干渉物質の影響を・受けるこ
となく生体液中の成分を容易かつ正４ｍに１ｌｌｌ１足
する方法に関する。

検出系に酵素法を適用して生体液中の目１１りＤｙ、分
を測定する方法においては、反応過程に遊離のＩｉ酵素
を必要とする酸化還元酵素による酔、＋：１叉Ｌｉ；を
適用する場合は、生成する還元型ニコグーンフ′ミ］゛
アデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸を最終的ＶＬｃｉ４１、−Ｆ
伝達体と被還元性発色剤との反応に導き、発色！ｌ勿を
比色定量するか、あるいは、遊離の補酵素を必要とせず
既に酵素蛋白に補酵素をもつ酸化還元酵素による酵素反
応を適用する場合は、次いで電子伝達体と被還元性発色
剤との反応に導き、同様に発色物を比色定量することに
よって、目的成分の逍を測定することが行なわれる。

血清あるいは血漿中の成分の測定に上述のような酵素法
を適用して発色物を比色定量する方法は従来から数多く
診断試薬に応用さｉｔでいる。例えば次の反応式で示す
方法は、その１例で各反応が定量的に進行するので、最
終のホルマザンの発色を比色定量すれば成分の測定がで
きる。

（１）測定すべき成分−→誘導物質 十ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋耐　誘導物質 （３）　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ十Ｈ十ｍ−ＰＭＳ　−＋　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）＋ｍ−ＰＭＳＨ２（４）　ｍ−ＰＭＳＨ２＋Ｎ
ＴＢ−＋　ｍ−ＰＭＳ＋ホルマザン（発色）ただし、Ｎ
ＴＢ　ニテトラゾリウム化合物の一つ、ニトロテトラゾ
リウムブルーを表わす。

しかしこの反応系は検体中に存在する干渉物ＩＰＩの影
響を受け易く予めこれを除かないと正確な測定ができな
い。もし上記反応（１）の誘導物質と同じものが検体中
に干渉物質として存在するとき（ｒよ、測定すべき成分
からの誘導物質と共に反応（２）以上が進行し、反応（
４）のホルマザンの比色定ｆ＃に正の誤差を与える。こ
のような干渉物質には、α−アミラーゼ測定における内
因性のグルコース、外因性のマルトース、ＧＯＴ　、　
ＧＰＴ側だにおけるＬ−グルタメート、トリグリセライ
ド測定におけるグリセリン等〃二ある。

従来は、このような場合測定すべき成分と干渉物質を一
緒に測定した吸光度から干渉物質のみを測定した吸光度
を差し引くことにより誤差を修ＩＥした。しかしこの方
法（ｄ操作を二度繰り返さなければならず煩雑でありし
かも試薬の無駄も大きい。

この様な干渉′物質による測定誤差１ｔ：ｆ、　％　目
Ｆ素蛋白に補酵素をもつｌ曖化還元酵素による１杼素反
尾、□□□：　、Ｉｉｌ’５用する場合にも同様に起る
ため、これら内因性及び外因性の干渉物質の作用を排除
することが＃ｒＩ安な技術的課題となっている。

本発明はこの様な実情に鑑みてなされたものであり、そ
の目的は、内因性及び外因性干渉物質の影響を全く受け
ずに、生体液中の目的成分を容易かつ正確に測定する方
法を提供することにある。

即ち、本発明の要旨は、酵素法を適用しかつ検出系に酸
化還元酵素、′電子伝達体及び被還元性発色剤を用いて
生体液中の目的成分を測定する方法において、予め、目
的成分以外に反応系に関与し干渉作用を有する生体液中
の内因性及び外因性の物質を、目的成分に直接作用する
酵素及び被還元性発色剤の非存在下でしかも少なくとも
酸化還元酵素及び′１４１子伝達体の存在下で反応させ
て消去することを特徴とする生体液成分の測定方法にあ
る。

本発明で使用する酸化還元酵素は、反応過程に遊１ζｌ
の補ｒｔチ素を必要とする酸化還元酵素であっても、あ
るいは遊離の補酵素を必要とせず既に酵素蛋白に補酵素
をもつ酸化還元酵素であってもよい。

以上にそれぞれの具体例を挙ける。

グリセロール脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，６）グリセ
ロール＋ＮＡＤ−→ノヒドロギシアセトン十ＮＡ、ＤＩ グリセロ・３・リン酸脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，８
）グリセロ・３・リン数十ＮＡＤ→ジヒドロキ／アセト
ンリン酸十ＮＡＤＩ（ グルコース・６・リン酸脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，
４９）グルコース・６・リン酸−１−ＮＡＤＰ→グルコ
ノラクトン・６・リン数十ＮＡＤＰＨ グルタミン酸脱水素酵素（ＥＣ１，４゜１．２，１．４
．１．３，１．４．１．．４　）Ｌ−グルタミン酸＋Ｈ
，，０＋ＮＡＤ（Ｐ）’−→２−オキシグルタレイトー
１−ＮＨ３−４−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ などがあり、各々、生体液中のトリグリセリド、α−ア
ミラーゼ活性、トランスノ゛ミナーゼ活１／Ｉ：の測定
に有用である。

遊離の補酵素全必要としない酸化還元酵素：アルコール
脱水素酵素（ＥＣ１，１，９９・８）−級アルコール士
アクセグクーーアルデヒド＋＋＋７元型アクセッター グリコール酸脱水素酵素（ＥＣ１，１，９９，１４）グ
リコール数十アクセプターーグリオキシル酸＋還元、型
アクセッター グルコン酸２−脱水素酵素（ＥＣ１，１，９９，３）グ
ルコン数十アクセッター→２−ケトグルコン酸十還元型
アクセゾター コリン脱水素酵素（ＥＣ１，１，９９，１）コリン＋ア
クセグターー→　ベタインアルデヒド＋還元型アクセプ
ター ザルコ／ン脱水素酵素（ＥＣ１，５，９９，１）デルコ
シン十Ｈ２０＋アクセプター→グリシン＋ポルムアルデ
ヒド＋還元型アクセッター などがあり、いずれも電子伝達体の存在下に反応が進行
する。

本発明で使用する電子伝達体としては、ツェナノンメト
サルフェート又はメトキ７フェナノンメトサルフェート
等のフェナソンメトザルフヱート誘導体、ノアホラーゼ
、メルトラブル−などがある。

本発明で使用する被還元性発色剤としては、３−（ｐ−
（ンドフェニル）−２−（ｐ−＝）ｏフェニル）−５−
フェニル−２水素テトラゾリウムクロライド、３−（４
，５−ツメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニ
ル−２水素テトラゾリウムブロマイド、３．３’−（３
，３’−ノメトキンー４．４′−ビフェニレン）−ビス
［２−（ｐ−二トロフェニル）−５−フェニル−２水素
テトラゾリウムクロライド〕（通称ニトロテトラゾリウ
ムプル−）、３．３’−（３，３’−ジフトキン−４，
４′−ビフエニレンンービス（２，５−ジフェニル−２
水素テトラゾリウムクロライドなどのテトラゾリウム塩
、及び硫酸第２鉄アンモニウム、塩化第二鉄等の第二鉄
イオンとパンフェナンスロリン、パンフェナンスロリン
スルホン酸ナトリウム、２−ピリノルアルドキシム、３
−（２−ピリジル）　−５，６−ビス（４−スルフォニ
ル）　−ｉ＋ｓＬ４−　）　ＩＪアノンスルボン酸−Ｊ
−ト１）ラム、オルトフェナンスロリン、２−ニトロン
−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホノロビルアミノ）フ
エ’　”　（通称ニトロノーＰＳＡＰ）、２−ニトロン
−５−（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホノロビルアミノ）フェ
ノール、などのキレート剤との１１ｉ合せ４′どを用い
ることができ、これらの組成物は使用目的によって適宜
選択することができる。

本発明方法を適用する検出系として、被還元性発色剤と
して硫酸第２鉄アンモニウムとパンフェナンスロリンス
ルホン酸ナトリウムを用いた具体例を挙げる。ここで最
終的に得られるキレート複合物の発色を比色定量するこ
とからなる方法は従来よりあまシ例はなく例えばトリグ
リセリドの定騎法が特開昭５４−８０１９２号に記載さ
れており、次の反応式で示す各反応が定置的に進行する
ので最終のキレート複合物の発色を比色定位すれば目的
成分の測定ができる。

（５）　目的成分−一→生成物 （８）　Ｆｅ”＋３　（パンフェナンスロリンスルホン
酸ナトリウム）キレート複合物（発色） もし、上記反応（５）の生成物と同じものが検体中に干
渉物質として存在するときは、１］的成分からの生成物
と共に反応（６）以下が進行し反応（８）のキレート複
合物の比色定量に正の誤差を与える。

α−アミラーゼの測定における内因性グルコース、外因
性マルトースは α−グルコアミラーゼ マルトース　２（グルコース） 十ＡＤＰ ホグルコン１俊十ＮＡＤ（Ｐ）ｉ（ の反応を介してＮＡＤ（Ｐ別Ｉを生じる。

また、トリグリセリド測定における内因性グリセロール
は、 ＋ＮＡＤ（すＨ の反応を介してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる。

ＧＯＴ　、　Ｇｌ）Ｔ測定におけるＬ−グルタメートは
、グルタメート脱水素酵素（ＧＬＤＨ）によってタル数
十ＮＨ３ の反応を介して、同様にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる。

これらの各々の目的成分の測定に対応した干渉物質から
生ずるＮＡＤ（Ｐ）Ｈは以下の反応にょシ消去される。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ十Ｈ”十ｍ−ＰＭＳ−ＮＡＤψ戸十ｍ−
ＰＭＳＨ２又は ただし　０２：溶存酸素 Ｈ２Ｏ２：過酸化水素 を表わす。

該ＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋に戻り、−またｍ−
ＰＭＳＨ２はｍ−ＰＭＳに戻る。以下、カタラーゼを使
用する場合は最終的に水と酸素を生ずるのみであり、ま
たＰＯＤを使用する場合は水を生ずる。したがって、続
く目的成分の測定の際には干渉物質の彩１”ｆ’は全く
除かれている。

すなわち、消去反応を行わせＺｂ後硫酸第２鉄アンモニ
ウムとパンフェナンスロリンスルホン酸ナトリウム及び
α−アミラーゼ測定の場合は、その基質となる修飾デン
プン、トリグリセリドの１ｉｌｌｌ定にはリノぞ一ゼ、
ＧＯＴ　、　ＧＰＴの測定ではＬ−アス／ぐラギン酸ま
たはＬ−アラニン、α−ケトグルタレートを各々添加す
ればよい。捷た、クレアチニンの測定の場合、内因性ク
レアチンは アルｒヒト＋ｍ−Ｐへ４３）１２ の反応を介してｍ−ＰＭＳの存在下にｍ−ＰＭＳＨ２を
生成する。以下１カタラーゼあるいはＰＯＤを用いるこ
とによシ、上記と同様の反応が進行し、干渉物質は消去
される。続く目的成分の測定に際してクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼ及び硫酸第２鉄アンモニウムとパンフェ
ナンスロリンスルホン酸ナトリウムを添加することによ
シ、正確な測定ができる。

また、前述のテトラゾリウム塩としてニトロテトラゾリ
ウムグルーを被還元性発色剤として用いる（１）〜（４
）の検出系においては、測定反応の過程で干渉作用を示
す内因性、外因性物質あるいはその生成物を脱水素酵素
の存在下に酸化してその干渉能力を失わせると同時にＮ
ＡＤ（Ｐ）＋を還元し生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを次にＰ
ＭＳまたはｍ−ＰＭＳの存在下に酸化しＮＡＤ（Ｐ）＋
に戻すと同時にＰＭＳ　１ｍ−ＰＭＳを還元してＰＭＳ
Ｈ２、ｍ−ＰＭＳＨ２を生ずるこのものは反応液中の溶
存酸素により直に酸化され元のＰＭｊＳ　、　ｍ−ＰＭ
Ｓに戻ると同時に過酸化水素を生成するが、この過酸化
水素はカタラーゼの作用で分解されて消失する。またペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ　）の存在下の場合は溶存酸素
によシ酸化され元のＰＭＳ　、　ｍ−ＰＭＳに戻ると同
時に水を生成する。また、遊離の補酵素を必要としない
酸化還元酵素の場合にもＰＭＳ　ｔたはｍ−ＰＭＳを介
して同様に反応が進行する。

このようにして検体中の干渉物質を後に影響を残すこと
なく消侭した後前述の通り成分の測定を行なうので、最
終段階のホルマザン又はキレート複合物の発色は成分の
肝に比例するものとなすｉＥ確な比色定敲ができる。な
おこの場合には被環元性発色剤が存在するのでＩυ終段
階のＰＭＳＨ２、ｍ−ＰＭＳＨ２は溶存酸素との反応に
優先して足付的にホルマザン又はキレート複合物の発色
を実現する。

これらのことは、その他に電子伝達体としてソアホラー
ゼ乞用いても同様に行なえ、６討）酸物についてｆ重々
の絹み合せが可能である。

本発明の方法は上述のように、酵素反応を適用して、目
的成分より順次定限的に生成する生成物を最終的に電子
伝達体−被還元性発色剤を用いで測定する、体液中のＣ
χ−アミラーゼのｉｌ！ｌＩ　５ｊ＃、トランスアミナ
ーゼの６１１１定、およびグリセリン脱水素酵素、また
はグリセロキナーゼーグリセロホス７エート脱水素酵素
によるトリグリセライドの測定等に適用でき、その効果
は顕著である。

次に本発明の方法およびその効果について実施例、試験
例によりさらに詳細に説明する。

なお消去反応の実施を前処理と表現する。

実施例１　α−アミラーゼの測定　・ 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測定できる
： （２）　分Ｎデンゾン　グルコース ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（６）　ＺＦｅ
　＋６　（ハンフェナンスロリンスルホン酸ナトリウム
）→キレート複合物（発色） ただし、ＡＴＰ　：アデノシン三すン酸ＡＤＰ　：アデ
ノシンニリン酸 を表わす。

反応（６）で生成するキレート複合物の吸光度を測定し
、その結果から、α−アミラーゼの活性値を計算する。

もし生体液中に内因性グルコース、または、最近盛んに
輸液として用いられているマルトースが干渉物質として
存在するときは反応（３）また、反応（２）、（３）に
より、次いで反応（４）　（５）　（Ｇ）によりキレー
ト複合物が生成するため、α−アミラーゼの測定値に正
の誤差を与える。

本発明においては、始めに反応（１）の修飾デングンを
加えることなく反応（２）以下を行なわせ内因性グルコ
ース、およびマルトースは反応（２）、（３）、（４）
により６−ホスホグルコン酸とし、これを除去する。次
いで反応（ｓ）　（６）は鉄キレート剤がイ′ｒ在しな
いので起らず次の別反応が進行する。

（７）　ＮＡＤ（Ｐ）Ｉ（＋Ｈ＋＋ｍ−ＰＭＳ→ＮＡＤ
（Ｐ）”＋ｍ−ＰＭＳＩ（２（８）　ｍ−ＰＭＳＨ２＋
０２−−→ｍ−ＰＭＳ＋Ｈ２０まただし、　０２：溶存
酸素 Ｈ２Ｏ２：過酸化水素 を表わす。

反応（７）〜ＯＱによシ干渉物質から生ずるＮＡＤ（Ｐ
）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋に戻り、またｍ−Ｐ？ｖｆＳＨ２
はｍ−ＰＭＳに戻ム　（２）カタラーゼを使用する場合
は最終的には水と酸メを生ずるのみであフ、またＰＯＤ
を使用する場合は水を生ずる。したがっＣ１続く成分の
測定の際には干渉物質の影響は全く除かれている。すな
わち　（３）前処理をした後、反応（１）よシ反応（６
）までを実施すればα−アミラーゼの正確な測定ができ
る。

１、試薬 （１）　ＡＴＰ　５　ｍｍｏｌ／Ａ　（４）ＮＡＤＰ＋
０．４　ｍｍｏｌ／Ａ ｍ　−ＰＭＳ　３０　μｍｏｌ／１ ＭｇＣＬ２　２０　ｍｍｏｌ／／− ヘキソキナーゼ　６００　ｕ／ｌ グルコース−６−リン酸　５００　ｕ／１脱水素酵素 グルコアミラーゼ　４８００　ｕ／１ ＰＯＤ　１００００　ｕ／を 牛アルグミン　０．１チ を含む１００　ｍｍｏｌ／１ｌｕｌｌ　Ｂ、　２コハク
酸緩衝液 パフ７エプツスロリンスルホン酸ナトリウム　１０ｍｍ
ｏ１／ｌソディウム・スターチ・グリコレート　７．２
　ｍ９１ｍ１を含む２０　Ｑ　ｍｍｏｌ／ｌトリエタノ
ールアミン緩衝液　ｐＨ７，０ 硫酸第二鉄アンモニウム　１．２５　ｍｍｏｌ／ｌクエ
ン酸　５　ｍｍｏ１μ を含む５０　ｍｍｏｌ／ｌ）リエタノール緩衝液　−１
６，６ シュウ酸　５０　ｍｍｏｌμ ｇＤＴＡ−ＯＨ４ｍｍｏｌ／ｌ ｋ　含ｔ）　０．１　ｍｏ　ｔ／ｚ　）リエタノールア
ミン緩衝液　ｐＨ８，６ ２、操作法 試薬＜１）　ｚ　ｍｔに血清検体２ｏμｔを加え３７℃
、５分間保温後、試薬（２）　（３）を等溶混和したも
の１　ｍｌを加えさらに３７℃、５分間保温後に試薬（
４）　１　ｍｌを加えて、反応を停止した後、波長５３
５　ｎｍで吸光度を測定する。別にα−アミラーゼ活性
既知の検体を上記と同様に操作し、検量線を造シ、この
検量線より血清検体のα〜アミラーゼ活性をめる。

試験例１ （１）　α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影響 血ＩＮ検体にｆ　ル：ｙ　−スを２００．４００，６０
０゜８００・１０００　ｍｙ／ｄｌの濃度で添加した検
体について実施例１により吸光度を測定した。別に同じ
検体について本発明の前処理を行なわない方法、すなわ
ち、試薬（１）　２　ｍと試薬（２）　（３）を等溶混
和したもの］、　ｍｌの混合試薬に検体２０　、／Ｉｔ
を加えて、３７℃、５分間保温後に試薬（４）　１　ｍ
ｌ　ｉ加えて反応を停止した後、吸光度を測定した。そ
の結果は、次の表に示す。

上の表が示すように、内１丙性グルコースに対する前処
理を行なわない揚台は、グルコースにょシ、かなりの影
響を受け、結果として、α−゛アミラーゼ活性を測定し
ているとはいえない。本発明によれば、１０００Ｉｎ９
／／ｄｌの高濃度のグルコースによっても影響を受けず
にα−アミラーゼ活性を正確に１ｌｌｌ１１足できる。

（２）本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光度と
の関係 実施例１の方法により、α−アミラーゼ活性の濃度系列
について吸光ｅを測定し／（結果を第１図に示す。

との図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度と吸光度
とは、百ａ関係を示し、正しく、α−アミラーゼ活性を
測定できることが分る。

実施例２　トリグリセリドの測定 体液中のトリグリセリドは次の反応系にょシ測定できる
。

グリセロール脱水素酵素 （２）　グリセロール＋ＮＡＤψ戸−−−−−−一一一
−−−→ジヒドロキシアセトン＋ＮＡＤ■Ｈ 上述の反応で生成するキレート複合物の吸光度を測定し
その結果からトリグリセリド値を算出する。

生体液中に内因性グリセロールあるいは透析患者に用い
られるグリセロールが干渉物質として存在するときは測
定値に正の誤差を与える。

本発明においては、始めにグリセロールをグリセロール
脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）＋の反応によシ、ノヒドロキ
シアセトンにし、これを除去する。ついで生成したＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの除去はジアホラーゼと被ルオキシグーゼに
よシ前述の反応と同様に行なわれ干渉物質であるグリセ
ロールは消去される。

次いでリパーゼおよび鉄キレート剤を含む試薬を添加し
、トリグリセリドを正確に測定することができる。

１、試薬 （１）　ＮＡＤ＋４０　ｍｍｏ１７１ ノアホラーゼ　４０００　ｕ／Ｌ ペルオキシダーゼ　８０　ｒｎ９／ｌ グリセロール脱水素酵素　２００００ｕ／を牛アルグミ
ン　ｌルｔ ヲ含ムｌ　ＯＯｍｍｏｌ／ｌ）リエタノールアミン緩衝
液Ｐ１量　７．８ （２）　Ｎ１ｔｒｏａｏ　ＰＳＡＰ　１０　ｍｍｏｌ／
ｌｔ：　含ｔｒ　１００　ｍｍｏ１μトリエタノールア
ミン緩衝液ｐＨ７，８ （３）　シュウ酸　２０　ｍｍｏｌ／を硫酸第二鉄アン
モニウム　１０　ｍｍｏｌ／ｌリノや−ゼ　４　Ｘ　１
０　ｕ／Ｌ を含む１００ｍｍｏ１μトリエタノールアミン緩衝液ｐ
＋（７，２ （４）　ＥＤＴＡ　４　ｍｍｏｌ／ｌ を含む１００ｍｍｏｌμトリエタノールアミン緩衝液ｐ
ｉ（８，６ ２、操作法 試薬（１）　５００μｔに血清検体５μｔを加え、３７
℃ｌＯ分間保温後に試薬（２）　、　（３）各々２５０
μｔを加えさらに３７℃、２０分間保温後に試薬（４）
　４　ｍｌを加えて反応を停止した後、波長７５０　ｎ
ｍで吸光度を測定する。別に、グリセロール既知の検体
を上記と同様に操作し、検量線を造ｐ１この検量線より
血清検体のトリグリセリド社をめる。

試験例２ （１）トリグリセリド測定におけるグリセロールの影響 血清検体にグリセロールｔｏｏ、４０，６０゜８０．１
００ψｌの濃度で添加した検体について、実施例２によ
り吸光度を測定した。別に同じ検体について、本発明の
前処理を行なわない方法、即ち、試薬（１）　５００μ
ｔと試薬（２）　（３）各々２５０μｔの混合試薬に検
体５μｔを加えて、３７’０２０分間保温後に試薬（４
）　４　ｄを加えて反応停止した後、吸光度を測定した
。その結果は次の表に示す。

上の表が示すように　４３．Ｑｙ応：によるグリセロー
ル消去の有無はトリグリセリド測だに大きな（し響を与
える。

（２）　本発明方法のトリグリセリド（ａ　ＩＩと吸光
度との関係 実施例２の方法によ）、トリグリセリドの濃度系列につ
いて吸光度を測定した結果を第２図に示す。この図が示
すように、トリグリセリド濃度と吸光度とは直線関係を
示し、正しくトリグリセリド濃度を測定できることが分
る。

実施例３　グルタメートオキデルアセテート転移酵Ｆ（
ＧＯＴ）およびグルタメートピルベート転移酵素（ＧＰ
Ｔ）の測定 体液中のＧＯＴ、　ＧＰＴはグルタメート脱水素酵素（
ＧＬＤＨ）を用い次の反応系により測定できる。

Ｌ−グルタメート＋オキサル酢酸 ＧＰＴ ２、　α−ケトグルタレート＋Ｌ−アラニンーー→Ｌ−
１”ルタメート＋ピルビン酸 ＋α−ケトグルタレート＋ＮＨ５ ｍ−ＰＭＳ又はノアホラーゼ ４、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ十ＮＴＢ　Φ）＋ホルマデン上述の
反応で生成するホルマザンの吸光度を測定し、その結果
からＧＯＴ、　ＧＰＴの活性値を計算する。

血清あるいは血漿中に干渉物質として存在するＬ−グル
タメートはＧＬＤＨと反応し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成す
るため、ＧＯＴあるいはＧＰＴの測定値に正の誤差を与
える。

本発明においては始めに内因性Ｌ−グルタメートをＧＬ
ＤＨとＮＡＤ（Ｐ）＋の反応により、α−ケトグルタレ
ートに転化し、これを除去する。次いで、生成したＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの除去については実施例１で述べたのと全く
同様に行なわれ干渉物質であるし一グルタメートは消侭
される。

次いで、Ｌ−アスノｅラギン酸′！またはＬ−アラニン
、α−ケトグルタレートおよびＮＴＢを含む試薬を添加
し、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ　、　ＧＰＴ　）活性
を正確にσＩｌｌ定することができる。

１、試薬 （１）　カタラーゼ　１００００ｕ／ｌグルタメート　
４００００ｕ／ｌ 脱水素酵素 ＮＡＤ＋４６　ｍｍｏｌ／１ ｍ−ＰＭＳ１００μｍｏ１μ又はジアホラーゼ４０００
　ｕ／ｌを含む１００　ｍｍｏ　ｔ／ｚ　、ｏ　７．　
Ｂリン酸緩衝液 （２）　ＧＰＴ測定用 ＤＬ−アラニン　８００　ｍｍｏ　ｌ／７α−ケトゲル
タレ−）　１１　ｍｍｏｌ／１ＮＴＢ　１．　Ｏｍｍｏ
　１μ を含む１００　ｍｍｏ１／ｌ　ｐＨ７，８リン酸緩衝液 ＧＯＴ　＋ｄｌｌ定用 Ｌ−アス、？ラギン酸　４００　ｍｍｏｌ／ｌα−ケト
ゲルタレ−）　１６　ｍｍｏｌ／１ＮＴＢ　１．　Ｏｍ
ｍｏ　ｌ／ｌ を含む１００　ｍｍｏｌ／ｌｐ＋（７，８リン酸緩衝液 （３）トリドアＸ−１０００，１％を含む０．ｌＮ−Ｈ
Ｃｌ溶液 ２、操作法 試薬（１）　２５０μｔに血清検体２０μｔを加え、３
７℃、ｉｏ分間保温後に、試薬（２）　２５０μｔを加
え、さらに３７℃、３０分間保温後に、試”Ｊ　（３）
　３　ｍｌを加えて反応を停止した後、波長５６０　ｎ
ｍで吸光度を測定する。

別に、ＧＯＴ、　ＧＰＴ活性既知の検体を上記と同様に
操作し、検量線を造り、この検量線より、血清検体のＧ
ＯＴ、、ＧＰＴ活性をめる。

試験例５ （１）　ＧＯＴ、　ＧＰＴ測定におけるＬ−グルタメー
トの影響 血清検体にＬ−グルタメートを２０　、４０　。

６０　、　ｓｏ　、　ｌｏｏｍｙ／１ｔ（Ｄｔｌ：１度
で添加り、　ｆｃ検体について、実施例２により、吸光
度を測定した。別に同じ検体について、本発明の前処理
を行なわない方法、即ち試薬（１）　２５０μＬと試薬
（２）　２５０μｔの混合試薬に検体２０μｔを加えて
、３７Ｃ，３０分間保温後に試薬（３）　３　ｍｌを加
えて反応停止した後、吸光度を測定した。その結果は、
次の表に示す。

上の表が示すように、内因性Ｌ−グルタメートに対する
前処理を行なわない場合は、Ｌ−グルタメートにより、
かなりの影響を受け、結果として、ＧＯＴ、　ＧＰＴ活
性を測定しているとはいえない。本発明によれば、１０
０　ｍｇＡｔｔの高濃度のＬ−グルタメートによっても
影響を受けずに、ＧＯＴ、ＧＰＴ活性を正確に測定でき
る。

（２）本発明方法のＧＯＴ、ＧＰＴ活性濃度と吸光度と
の関係 実施例３の方法により、’ＧＯＴ、　ＧＰＴ活性の濃度
系列について吸光度を測定した結果を第３図に示す。

この図が示すように、ＧＯＴ、　ＧＰＴ活性の濃度と吸
光度とは、直線関係を示し、正しく　ＧＯＴ　、　ＧＰ
Ｔ活性を測定できることが分った。

実施例４　α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により　６＋１Ｊ
定できる： ＋ＡＩ）Ｐ （４）　グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）’−６
−ホスホグルコン酸十ＮＡＤ（Ｐ）Ｈｍ−ＰＭＳ又はジ
アホラーゼ （５）　ＮＡＤ■Ｈ＋ＮＴｌ１−−一−−−−−−−−
−−−→ＮＡＤＱ’、汁十和レマリンただし、ＡＴＰ　
：アデノシン三すン酸ＡＤＰ　：アデノシンニリン酸 ＮＴＢ　：ニトロテトラゾリウムグルー（テトラゾリウ
ム化合物） を表わす。

反応（５）で生成するホルマザンの吸光度を測定し、そ
の結果から、α−アミラーゼの活性値Ｔｈ１ｔ算する。

もし生体液中に内因性グルコース、または、最近盛んに
輸液として用いられているマルトースが干渉物質として
存在するときは反応（３）また、反応２、（３）ｖこよ
り、次いで反応（４）、（５）によりホルマザンが生成
するため、α−アミラーゼの測定値に正の誤差を４見る
。

本発明においては、始めに反応（１）の修飾アンシンを
加えることなく反Ｉ６　（２）以下を行なわせ内因性グ
ルコース、およびマルトースは反応（２）、（３）、（
４）により６−ホスホグルコン酸とし、これを除去する
。次いで反応（５）はＮＴＢが存在しないので起らず次
の別反応が進行する。

（６）　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋１（＋＋ｍ−ＰＭＳ−＋ＮＡ
Ｄ（Ｐ）＋＋ｍ−ＰＭＳＨ２（７）　ｍ−ＰＭＳＨ２＋
０２−−→ｍ−ＰＡ４Ｓ＋Ｈ２０まただし、０２：溶存
酸素 Ｈ２Ｏ２：過酸化水素 を表わす。

又は、 反応（６）〜（９）又はＱつ及び（７′）により干渉物
質から生ずるＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋に戻り、
カタラーゼを使用する場合は最終的には水と酸素ケ生ず
るのみであル、またＰＯＤを使用する場合は水を生ずる
。したがって、続く成分の測定の際には干渉物質の影響
は全く除かれている。すなわち前処理をした後、反応（
１）よシ反応（５）までを実施すればα−アミラーゼの
正確な測定ができる。

１、試薬 （１）　ＡＴＰ　５　ｍｍｏｌ／１ ＮＡＤＰ＋０．４　ｍｍｏ　ｔ／ｚ ｍ−ＰＭＳ　３０Ａｍｏ　１／を又はソアポラーゼ２０
００　ｕ／１ＭｇＣＬ２　２０　ｍｍｏｌ／ｌ ヘキソキカーゼ　６００　ｕ／１ グルコース−６−リン酸　５００　ｕ／１脱水素酵素 グルコアミラーゼ　４８００　ｕ／１ ＰＯＤ　１００００　ｕ／１ 牛アルブミン　０．１％ を含むｌ　００　ｍｍｏｌ／ｌｐｌ”１８．２コハク酸
緩衝液 （２）　ＮＴＢ　３　ｍｍｏｌ／ｌ トリトンＸ−１００１％ ソノウム・スターチ・グリコレート　７．２　ｍ９／ｒ
ｎｌを含む４０　ｍｍｏｌ／ｌｐＨ６，４ コンク酸緩衝液 （３）　ト　リ　ト　ン　Ｘ−１０００，３３％を含む
０．６　ＮＨＣｌ溶液 ２、操作法 試薬（す２ゴに血清検体２０μｔを加え３７Ｃ，５分間
保温後、試薬（２）　１　ｒｎｌ　ｆ加え、さらに３７
Ｃ１５分間保温後に試薬（３）　１　ｍｚを加えて、反
応を停止した後、波長６００　ｎｍで吸光度をｉｌす定
する。別にα−アミラーゼ活性既知の検体を上記と同１
子にｊ作し、検量線を造り、この倹肘紳より血清検体の
α−アミラーゼ活性をめる。

試験例４ （１）　α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影響 血清検体にグルコースを２００．４００，６００゜８０
０　、１０００ｍ９７ｄｌノｅ度テ添７ＪＩＩ　Ｌ　ｆ
Ｃ検体ＶＣライて実施例１により吸光度を６１１１定し
た。別に同じ検体について不発り１の前処理を行なわな
い方法、すなわち、試薬（１）　２　ｍｌと試薬（２）
　１　ｍｌの混合試薬に検体２０μｔを加えて、３７℃
、５分間保温後に試薬（３）　１　ｍｌを加えて反応を
停止した後、吸光度を測定した。その結果は、次の表に
示す。

上の表が示すように、内因性グルコースに対する前処理
を行なわない場合は、グルコースによ広かなりの影響を
受け、結果として、α−アミラーゼ活性を測定している
とはいえない。本発明によれば、ｔｏｏｏ〃個の高ず進
度のグルコースによっても影＃を受けずにα−アミラー
ゼ活性を正確に測定でき７Ａ。

（２）本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光度と
の関係 実施例４の方法によシ、α−アミラーゼ活性の濃度系列
について吸光度を測定した結果を第４図に示す。

この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度と吸光度
とは、直線関係を示し、正しく、α−アミラーゼ活性を
測定できることが分る。

以上述べた通り本発明方法は簡単な方法で検体中の干渉
性物質を除去し試薬の無駄な使用もなく正確な測定を可
能にした点で棲めて有用なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図の縦軸は吸光度を示し、横軸は血清の
希釈度を示す。 第１図ｅ印は血清中のα−アミラーゼ活性を、第２図ｅ
印はトリグリセリド濃度金、第３図００印はＧＯＴ活性
を、Δ印はＧＰＴ活性を示す。 また、第３図０印は、血清中のα−アミラーゼ活性を、
第２図の○印はＧＯＴ活性を、△印（はＧＩ）Ｔ活性を
、第４図○印は、α−アミラーゼ活性を示すＯ 第１図 に虜令欣屓 第　２　図 頂端（ぷＵ対〕褒度）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸素法を適用しかつ検出系に酸化還元酵素、電子
   伝達体及σ被還元性発色剤を用いて生体液中の目的成分
   を測定する方法において、予め、目的成分以外に反応系
   に関与し干渉作用を有する生体液中の内因性及び外因性
   の物質を、目的成分に直接作用する酵素及び被還元性発
   色剤の非存在下でしかも少なくとも酸化還元酵素及び電
   子伝達体の存在下で反応させて消去することを特徴とす
   る生体液成分の測定方法。
2. （２）酸化還元酵素は、補酵素ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チドリン酸と共役する酸化還元酵素であり、該酸化還元
   酵素は前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と対にな
   り消去反応に用いられる特許請求の範囲第（１）項記載
   の生体液成分の測定方法。
3. （３）電子伝達体はフェナジンメトサルフェートもしく
   はその誘導体又はソアホラーーーである時π「請求の範
   囲第（１）項記載の生体液成分の測定方法。
4. （４）被還元性発色剤はテトラゾリウム基又シ」二酸化
   型金属イオンとキレート剤との組合せである特許請求の
   範囲第（１）項記載の生体液成分の測定方法。
5. （５）酸化型金属イオンは第二鉄イオンであるｔＩｆ許
   請求の範囲第（１）項記載の生体液成分の１１１１定方
   法。