JPS63182567A - フルクトサミン測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖尿病の検査及び患者の糖尿病状態の観察の
一助として、血液等の検体中のフルクトサミン（ｆｒｕ
ｃｔｏｓａｍｉｎｅ）を測定し、それによってグルコー
ス値を測定するための単純呈色測定方法に関する。さら
に詳しくは、反応速度方法とは異なるエンド　ポイント
方式のフルクトサミン測定方法及び血清グルコース値の
測定方法に関する。

（先行技術） フルクトサミンの還元作用によって色の変化を起こす試
薬を使用して血清等の検体のフルクトサミン値を測定す
る比色測定方法は既にヨーロッパ特許第０．０８５，２
６３号〔発明者：ジョン　リチャード　ベイカー（Ｊ　
ｏｂｎ　　Ｒｉ　ｃｈａｒｄＢ　ａｋｅｒ）　）より公
知となっている。このヨーロッパ特許には、テトラゾリ
ウム塩類から選んだ染色剤を使用する基本的な血清処理
が扱われている。該テトラゾリウム塩類として、テトラ
ニトロブルーやテトラゾリウムが挙げられているが、前
記ヨーロッパ特許では、特にニトロブルー、テトラゾリ
ウムが好ましいとされている。このニトロブルー、　テ
トラゾリウムは還元されると色調の高い青色（紫色）の
ホルマザン色素に変化する。ホルマザン色素の最大吸収
波長は約５３５ｎｍである。かかるヨーロッパ特許の方
法によれば、一定時間の間隔を挾んで、反応速度に伴な
う呈色変化を２回測定し、標準物質よりフルクトサミン
値すなわちフルクトサミン含有量を算出する方法をとっ
ている。しかし、周知のように、反応速度に基づく測定
方法における手作業の操作は測定のタイミングを確実な
ものとせねばならず、正確に行なうには困難である。

（目的） 本発明は、フルクトサミンを１回のみで呈色測定する単
純呈色測定法を利用し、上記の反応速度方法に要求され
る一連の測定タイミングの煩わしさを大幅に解消せんと
するものである。

本発明では、上述したテトラゾリウム塩類を加える前に
、フルクトサミン以外の血清中に共存するアスコルビン
酸塩やグルタチオン等の還元物質を除去する。

本発明のもう一つ特徴として、妨害物質、即ち他の還元
物質を除去すれば、呈色原因のすべてがフルクトサミン
とテトラゾリウム塩の反応に限られてくる。そのため、
フルクトサミンの反応を停止することが可能となり、呈
色の測定におけるタイミングは大して問題にならなくな
る。すなわち、フルクトサミンとテトラゾリウム呈色物
質が反応している時に、この反応を停止する溶液を加え
れば、時間に拘束されずに分光光度測定を行なうことが
できる。従って、特定時間に測定せねばならない反応速
度法とは違って、都合のよい時に呈色測定をイテなうこ
とができる。このように、単純呈色測定法は上記ヨーロ
ッパ特許より時間がかからなくて済むものが主な特徴で
ある。

（発明の実施例） 本発明による方法の一つの特徴として、血液等検体を採
集した後、アスコルビン酸塩及び／又はグルタチオン等
の還元物質を除去又は破壊し、フルクトサミンを残すよ
う処理する。このような不要還元物質もしくは妨害物質
を除去するには、下記方法のどれを利用してもよい（以
下、この処理を妨害物質除去行程と呼ぶ）。

１、検体を低温度の下で長時間インキュベートする。こ
の場合、塩基を加えても加えなくともよいが、強塩基を
加えた方が望ましい。

２、検体を高温度の下でインキュベートする。

この場合、塩基を加えても加えなくともよいが一７＝ 強塩基を加えた方が望ましい。

３、検体を、少なくともＰＨ１０以上の高いＰＨ値にて
インキュベートする。

４、検体を、透析又はデル濾過クロマトグラフィーによ
り脱塩処理する。

５、フルクトサミン以外の妨害物質を酸化する一つ以上
の酸化剤を加える。

６、呈色試薬と反応を起こさない形態に妨害物質を変化
させる酵素を加える。

次ぎに、妨害物質を検体より除去した後、検体と呈色試
薬を混合し一定時間インキユベートする。この結果、呈
色した色の度合を光度測定法により測定すると、色の度
合はフルクトサミン量と比例する。この際、血清自体の
色によりバックグラウンドに色が認められ、これを差し
引くために血清ブランクも同時に測定してよい。

さて、血清中に存在する生理的還元物質にはグルコース
、フルクトース、グルコサミン、クレアチニン、尿酸塩
等があるが、この中でもアスコルビン酸塩とグルタチオ
ンのみが、テトラゾリウムないし同系列の還元性染色剤
に対し極めて大きい妨害作用を示す。このため、検体よ
り７スコルビン酸塩とグルタチオンを除去又は破壊すれ
ば、単純呈色測定法によってフルクトサミンの量を測定
することができる。

ところで、フルクトサミンを除いて、検体中の還元物質
の妨害作用を低下及び／又は除去させる方法としては、
既に述べた方法のうち一つでもあるいはそれ以上でも利
用してよい。しかし、望ましい方法としては、血清に少
量の塩基（例えば水酸化ナトリウム）を混合せしめ約Ｐ
Ｈ１０まで血清のＰＨ値を高めることである。

次に、この血清検体を少なくとも３０分間室温にて放置
させる。これによって、妨害作用を効果的に除去するこ
とができる。このように処理した検体を上記ヨーロッパ
特許の方法に従い測定してフルクトサミンの量を求める
。但し、呈色の測定は１回のみである。尚、検体、標準
物質、ブランクその地路々のものをすべて同一条件の下
に測定することが肝要である。また、フルクトサミンと
テトラゾリウムの反応にあっては、Ｐ　Ｈ１時間、温度
等の諸因子が常に一定していることが極めて重要な反応
条件となる。

この点において、反応による呈色の度合が必ず全検体中
のフルクトサミン濃度に比例するよう諸因子のすべてを
調整し管理しなければならな（１゜ Ａ１ 本発明を具体的に説明するため以下の実例を示す。

大溝づ− 血清検体を部分標本に分け、室温の下にμ）の容量単位
にて下記溶液と混合させた。

Δ　５００　　　　０　　　　　　　０　　１００［１
５００５００５０ Ｃ５０００５０５０ 次に、下記テトラゾリウム呈色試薬を使用した。

（０，１２Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ｐＨ１０，
８）１１．６４ｇのＮａ２ＣＯ３と０．５２．のＮａ１
ｌＣ０３をＮ　ａ　ＯＩＩによりｐＨ１０，８に調整し
、０．２９８の２−（４−イオドフェニル）−３−（４
−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム　ク
ロライド（２−（４−１ｏｄｏｐｂｅｎｙｌ　）−３−
（４−ｎ１ｔｒｏｌ）ｈｅｎｙｌ）　−５−１）ｌ＋ｅ
ｎｙｌ　Ｌｅｔｒａｚｏｌ　１ｕｒｎ　ｃｌ＋１ｏｒｉ
ｄｅｌ（Ｉ　Ｎ　Ｔ　）　　を加え、脱イオン水により
１イにしたもの。

次に、上記４種類の実験における血清を混合処理し、そ
の後正確に３０分たってから各々の血清を２０μノとり
、ＩＩＩＩＬの呈色試薬と混合させた。そして、９００
秒間（１２分間）発色させたのち、ただちに各々の血清
につ外適切な分光光度計を使用して５００ｒ＋ｍの吸光
度を測定した。測定した吸光度の結果は以下の通りであ
った。

大−」（吸洸Ｊはμ用堕工 Ａ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１２１Ｂ　　　　　　
　　００１４８ ＣＯ，１１８ Ｄ　　　　　　　　０．１２１ 上記実験りは、アスコルビン酸塩を含有し水酸化ナトリ
ウム溶液で処理したもので、アスコルビン酸塩による妨
害作用は示されなかった。

一方、実験Ｂはアスコルビン酸塩を含有して（・るが、
水酸化ナトリウム溶液による処理はしでおらず、妨害作
用があることを示した。

実例２ 血清検体を部分標本に分け、下記の如（、μｌの容量１
ｉ１位にて混合処理したのち、インキュベート処理した
。

実験 ＢＣＤ 血清　　　　　　　　５００　５００　５００　５００
Ｈ２０５００５００ ここで、各検体は２００分間インキュベート処理したの
ち、上記実例１に従い測定をイテなった。

吸光度の測定結果は以下の通りであった。

′ＬＪ！Ｌ　　　　　！ＬＬ反ｊｙ■吐Ａ　　　　　　
　　０．１０５ Ｂ　　　　　　　　Ｏ，１１？ ＣＯ，１００ Ｄ　　　　　　　　Ｏ，１０５ 以上の実験で判るように、アスコルビン酸塩妨害物質を
除去する手段として温度の上昇を利用することができる
。

火事ドし １．３＋ｎＭの１−デオキシ、１−モルフォリノ　フル
クトース（１−ｄｅｏｘｙ、１−＋ｎｏｒｐｈｏｌｉｎ
ｏ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ）（ＤＭＦ）を含有した血清検体
を用意し、上記実例１に従い処理した。

吸光度の測定結果は次の通りであった。

′１ＬＵＬ　　　　　」笈廉邊μ願住 Ａ　　　　　　　　０．１５８ Ｂ　　　　　　　　Ｏ，１８１ ＣＯ，１５９ Ｄ　　　　　　　　Ｏ，１６１ この結果から、本測定用の標準物質として用意した合成
フルクトース化合物であるＤＭＦは以上の検体調整段階
では影響を受けないことが′４！Ｕる。

１隨り 検体処理については上記実例１に従ったが、本実例では
水酸化ナトリ・クム溶液に代え、酸化剤である２、０ｍ
Ｍのメキュリック　アセテ−）　（＋ｎｅｃｕｒｉｃ　
　ａｃｅｔａｔｅ）を使用した。

吸光度の測定結果は以下の如くである。

笈−４吸ｉ口’５０（睡り− Ａ　　　　　　　　Ｏ９１，４１ Ｂ　　　　　　　　Ｏ，１５３ ＣＯ，１２１ Ｄ　　　　　　　　０．１２に の実験から、メキュリック　アセテートが７スコルビン
酸塩による妨害作用を低下させる働きがあることが判る
。

求ｆｉｌ　５一 検体処理については上記実例１に従ったが、本実例では
前記アスコルビン酸溶液に代えて、１０ｍＭ濃度の還元
グルタチオン〔シグマ　ケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃ１＋
ｅ＋ｎ１ｃａｌ）製〕を使用した。

吸光度の測定結果は次の通り。

実　　験　　　　　　　　吸コし庫バ互りｂ」上Ａ　　
　　　　　　　　　　０．０９０Ｂ　　　　　　　　　
　　　Ｏ，１３５ＣＯｌ　０８７ Ｄ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０８４以上の実験結果
より、水酸化ナトリウムを使用し３０分間インキュベー
ションすることでも、グルタチオンによる妨害作用を除
去することができる。

夫Ｊす」し 上記実例１に従い血清検体の処理を行なったが、本実例
では、実験Ｃと実験りで使用すべき水酸化ナトリウムに
代えて、アスコルバートオキシグーゼ　試薬キット　〔
ベーリンガー。

マンハイム　バイオケミカｌレズ４インチ゛イアナボリ
スツインディア（Ｂ　ｏｅｂｒｉＢｅｒ＋Ｍ　ａｎｎｌ
＋ｅｉ＋ｎＢ　１ｏｃｌ＋ｅｍｉｃａｌｓ＋　Ｉ　ｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉ　ｎｄｉａｎａ）より入手。

製品番号：＃７３６６１９）を使用した。

また、次のような容量で水をμノ単位にて用意し、各血
清の希釈に使用した。即ち、実験Ａ及び実験Ｃは５０、
実験Ｂ及び実験りはＯ０尚、前記試薬キットには約１７
ユニツトのアスコルベート　オキシダーゼ酵素（Ｅ、Ｃ
０番号：１゜１０．３．３）が含有され、該酵素は水溶
液から７スフルビン酸を除去するために使用される。

１６一 本実例では、３０分間のインキュベーション処理過程で
数回この試薬キットを使用し血清と混合させた。

吸光度の測定結果は以下の通り。

及−１吸」Ｊ３臣更国（転）− Ａ　　　　　　　　０．０７６ Ｂ　　　　　　　　Ｏ，１０５ ＣＯ，０７７ Ｄ　　　　　　　　Ｏ，０８１ 以上の実験で、アスコルベート　オキシダーゼがアスコ
ルビン酸塩による妨害作用を低下させる働きがあること
が判る。

【笈り 本実例では、ゲル濾過クロマトグラフィーを利用して血
清検体を脱塩処理した。すなわち、用意した血清検体を
５００μノの分量に分け、２つの５００μノの検体にし
た。その一方の第１分止栓体に５０μノの水を加え、他
方の第２分止栓体に１．１ｍＭアスフルビン酸溶液５０
μノを加えた。

次に、脱塩処理用カラム〔アイソラブ、インク。

（Ｉ　５ｏｌａｂ、　Ｉ　ｎｃ、　）製品番号：＃ＱＳ
−２Ｂ：ｌを２個用意し、これを生理食塩水で平衝させ
た。

ここで、前記５００μノ検体の各々を別々の該脱塩処理
用カラムに加え、溶出処理を行なった。

次に、ががる脱塩処理用カラムの各々に３００μノの生
理食塩水を加え、溶出処理を行なった。

さらに、各カラムの下に受は皿を設置したのち、５００
μノの生理食塩水を各カラムに加え、溶出液を採集した
。採集して溶液には脱塩処理された血清が含まれていた
。

さて、こうして脱塩処理した溶出液を部分標本に分けμ
ノ単位で、下記の溶液と混合させた。

Ａ　第１分止栓体　２００　　　　０　　　　２０Ｂ　
第１分止栓体　２００　　　２０　　　　　０Ｃ第２分
子ｆｉ検体　２００　　　　０　　　　２０次に、上記
各実験における検体を各々５０μノとり、上記実例１の
如く、夫々に１ｍＬの呈色試薬を混合させた。発色処理
は上記実例１に従い行なった。

吸光度の測定結果は次の通りであった。

１−【　　　　　吸ｆｆｉ国（転）− Ａ　　　　　　　　０．０７８ Ｂ　　　　　　　　Ｏ，２２８ ＣＯ，０７４ 以上の実験から、検体の脱塩処理を先に行ないその後フ
ルクトサミンの測定をすればアスコルビン酸塩の妨害作
用を除去できることが判る。

Ａ１影 血清検体を３つ用意し、上記実例１の実験Ｂに従い処理
した。そして、４℃にて保存し、上記実例１に従い当日
、翌日及び４日日の日程の順で測定を行なった。また、
前記ヨーロッパ特許と同様な方法で各日程毎にＤＭＦ標
準物質を測定して吸光度とＤＭＦ量との関係を検量した
。同時に検体ブランクも差し引いた。依って、検体中の
フルクトサミン濃度の測定結果は下記表に示す如くであ
る。

１９一 検体番号：　　１　　　２　　　３ 当日　　　　　　１．４０　　１．３３　　　２．６３
翌日　　　　　　１．３５　　　１．３８　　　２，６
２４日目　　　　　　　１．１１　　　１１２　　　　
２．３８以上のことから、検体を４℃にて保存するだけ
でアスコルビン酸塩の妨害作用を減少させることができ
る。

実例９ 本実例では、連続７０一方式の自動分析装置を使用して
フルクトサミン測定を行なった。使用した自動分析装置
は前記ヨーロッパ特許の実例２と同じくテクニコン　オ
ートアナライザー（Ｔ　ｅｃｌ＋ｎ１ｃｏｎ　　Ａ　ｕ
ｔｏａｎａｌｙｚｅｒ）　（製造元：テクニコン　イン
ストリューメンツ　コープ１．ニューヨーク州、ターリ
イタウン（Ｔ　ｅｃｈｎｉｃｏｎ　　Ｉ　ｎｔｒｕＩＩ
ｌｅｎｔｓ　　　Ｃｏｒｐ、　　、Ｔａｒｒｙｔｏｕ＋
ｎ＋Ｎ、　　Ｙ、　）：ｌ　である。この分析装置を操
作し、検体の割合を１として１５ｍＭ水酸化ナトリウム
の割合を３として、混合処理するようプログラムさせた
。この混合処理で、得た混合液を３７℃にて５分間加熱
した。

しかるのち、上記実例１で扱ったテトラゾリウム呈色試
薬を３の割合（全体量７の割合に対して）で前記混合液
に混合するよう分析装置をプログラムさせた。この混合
処理で得た混合液を３７℃にて２分間インキュベート処
理した。

次に、分析装置を操作して５００ｎｍにて吸光度の測定
を行なうようプログラムさせた。上記実例１の実験Ａ及
び実験Ｂに従い、正常血清検体と高濃度血清検体とを混
合させ、ただちに分析処理した。

吸光度の結果は以下の通り。

炙Δ　アスコルビン　　の１、　　！ＬｔＪＬ■男匝リ
ー正常　す　添加しない。　　　　　０．１１２正常　
　　添加した。　　　　　０．１１３高濃度　　添加し
ない。　　　　０．１．９６高濃度　　添加した。　　
　　　　０．１９４釆りづ二叩 正常血清検体１つと高濃度血清検体１つを用意し、これ
らを上記実例１の実験りに従い処理、　　− ’）１ｍＬの呈色試薬と混合させた。次に９００・−秒
間発色させた。９００秒たった時点で２．０＋ｎＬのＩ
Ｎ塩酸を加え混合処理し発色反応を停止させた。各検体
の吸光度の測定にあたっては、前記塩酸を加えてから５
分、１０分及び３０分たった時間の順で測定した。

測定結果は以下の通りであった。

Ａ　　正常　　０．０６３　０．０６４　０．０６３Ｂ
　　高濃度　０．１１３　０，１１３　０．１１１以上
の結果から、発色反応が停止可能であって、発色した色
が安定していることが判る。従って、都合のよい時に呈
色測定を行なうことができる。

以上、現在の特許の状況に則し、本発明の最上の形態並
びに好ましい実施態様を詳細に説明してきたが、本発明
はこれに限定されず、発明の範囲は特許請求の範囲に定
められている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液検体又は血液に由来する検体における血清グル
   コース値を測定する方法において、前記検体中より妨害
   物質を除去して検体のＰＨ値を１０及び１４の間に調整
   し、呈色作用物質を前記検体に加え、然る後、前記検体
   中の発色した色を測定し、次いで、その色の測定値を標
   準液の色と比較し、前記呈色作用物質の選択条件及びＰ
   Ｈの条件として、前記検体中のグルコースが検体血液中
   の蛋白質のアミン族と依然反応または会合している間で
   かつ該グルコースが分子転位を経てフルクトサミンの形
   態で存在している時に、呈色作用物質が該グルコースに
   よって呈色の変化を起こすことを条件とする血清グルコ
   ース値の測定方法。 ２、前記検体を強塩基または酸化剤又は酵素により処理
   するか、もしくは検体を脱塩することにより、前記妨害
   物質を除去することからなる前記特許請求の範囲第１項
   記載の血清グルコース値の測定方法。 ３、前記ＰＨ値が１０．５及び１０．８の間にある前記
   特許請求の範囲第１項記載の血清グルコース値の測定方
   法。 ４、前記検体に緩衝剤を加えることにより前記ＰＨ値を
   調整する前記特許請求の範囲第１項記載の血清グルコー
   ス値の測定方法。 ５、前記緩衝剤が、適当な配合のもとで炭酸ナトリウム
   及び重炭酸ナトリウムからなる前記特許請求の範囲第４
   項記載の血清グルコース値の測定方法。 ６、前記呈色作用物質がテトラゾリウム塩類である前記
   特許請求の範囲第１項記載の血清グルコース値の測定方
   法。 ７、前記テトラゾリウム塩類がＩＮＴである前記特許請
   求の範囲第６項記載の血清グルコース値の測定方法。 ８、検体中のフルクトサミン値を測定する方法であって
   、妨害物質を除去し、検体のＰＨ値を１０及び１４の間
   に調整し、フルクトサミンと反応して呈色する呈色作用
   物質を前記検体に加え発色させ、然る後、呈色測定を行
   ない、前記呈色作用物質で呈色した色を伴なった前記呈
   色結果の色とフルクトサミン標準液とを比較することか
   らなる検体中のフルクトサミン値測定方法。 ９、前記検体を３７℃以上の温度で保存す ることにより前記妨害物質を除去する前記特許請求の範
   囲第８項記載のフルクトサミン値測定方法。 １０、強塩基又は酸化剤又は酵素による処理か、もしく
   は脱塩処理により前記妨害物質を除去する前記特許請求
   の範囲第８項記載のフルクトサミン値測定方法。 １１、前記ＰＨ値が１０．５及び１０．８にある前記特
   許請求の範囲第８項記載のフルクトサミン値測定方法。 １２、前記検体に緩衝剤を加えることにより前記ＰＨを
   調整する前記特許請求の範囲第８項記載のフルクトサミ
   ン値測定方法。 １３、前記緩衝剤が、適当な配合のもとで炭酸ナトリウ
   ム及び重炭酸ナトリウムからなる前記特許請求の範囲第
   ８項記載のフルクトサミン値測定方法。 １４、前記呈色作用物質がテトラゾリウム塩類である前
   記特許請求の範囲第８項記載のフルクトサミン値測定方
   法。 １５、前記テトラゾリウム塩類がＩＮＴである前記特許
   請求の範囲第８項記載のフルクトサミン値測定方法。 １６、前記検体を３７℃以上の温度にて保存することに
   より前記妨害物質を除去する前記特許請求の範囲第１項
   記載の血清グルコース値の測定方法。 １７、前記呈色作用物質と前記血清グルコースとの反応
   が酸の添加により停止する前記特許請求の範囲第１項記
   載の血清グルコース値の測定方法。 １８、前記呈色作用物質と前記グルコースとの反応が酸
   の添加により停止する前記特許請求の範囲第８項記載の
   フルクトサミン値測定方法。 １９、前記ＰＨ値が５以下である前記特許請求の範囲第
   ８項記載のフルクトサミン値測定方法。 ２０、前記ＰＨ値を５以下に低下させることにより前記
   呈色作用物質と前記フルクトサミンとの反応を停止させ
   る前記特許請求の範囲第８項記載のフルクトサミン値測
   定方法。