JPS62215398A - 医療診断用指示要素として羊水中のホスフアチジルグリセロ−ルの量を測定する方法とそのキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は羊水中ホスフアチノルグリセロル（ｐｂｏｓｐ
ｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（以下ＰＧと略す）
の濃度を数値的に測定するための方法に関する。さらに
詳しくは、胎児の肺成熟（ｆｅｔａｌ　　ｌｕｎｇ　　
ｍ１ｔｕｒｉｔｙ（以下ＦＬＭと略す）を診断するため
の医療診断用指示要素として羊水中ＰＧを測定する方法
に関する。

′（従来の技術） 出産前に胎児が死亡する主な原因は、胎児の未熟からき
ていることは依然として変わらない。

未熟新生児の死亡のうち５０〜７０％は肺硝子膜症（ｈ
ｙａｌｉｎｅ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｃｌｉｓｅａｓ
ｅ）が主な原因となっている。この肺硝子膜症は肺表面
活性物’１１　（ｐｕｌａ＋ｏｎａｒｙ　　５ｕｒｆａ
ｃｔａｎｔ）の欠乏が原因となって起る。１９７１年に
グルツク　アンド　アソーシェフ（Ｇ　１ｕｃｋ　　ａ
ｎｄ　　Ａ　５ｓｏｃｉａｔｅｓ）がアム。

ジェー、オプステト　シネコル（Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓ
Ｌｅｔ　　Ｇｙｎｅｃｏｌ）（１０９：４４０−４４５
）の中で、羊水を分析し胎児肺表面活性物質を調べ薄層
クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を利用し、レシチンース
フインゴメエリン比（Ｌ／Ｓ比）を記録する方法を発表
した。この検査方法は今なお、肺成熟の検査の基準とな
っている。

しかしながら、前記の薄層クロマトグラフィー検査はコ
ストが高いうえに測定に時間がかかり、しかも高度な熟
練を要し、精度管理も極めて慎重に行なう必要がある。

また、技術的に数多（の難問をかかえ、多くの場合Ｌ／
Ｓ比の正確性に欠けていた。例えば、胎児を持つ妊婦が
糖尿病、高血圧もしくは前期破水（ｐｒｅＩＩ＋ａｔｕ
ｒｅｒｕｐｔｕｒｅ　　ｏｆ　　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）
にみまわれた場合、Ｌ／Ｓ比は不安定となり測定上信頼
すべきものとなり得なくなる。従って、たとえＬ／Ｓ比
が充分な値を出しそれによって胎児に呼吸障害の問題が
ないと判断できても、実際に糖尿病母体中の胎児に呼吸
障害症候群（ＲＤ　Ｓ　）が発生するという研究報告が
多（見られる。

この他に肺成熟の検査法として、バブル試験もしくはシ
ェイク試験並びに蛍光偏光測定法等が挙げられるが、こ
れらの検査法は時折測定結果に誤差が生じる。

ホールマンその他の研究者たちは、ペグイアトル。レス
、　（Ｐｅｄｉａｔｒ、　　Ｒｅｓ、　）（９：３９６
−４０２（１９７５））の中で、ＲＤＳにかかっている
幼児の肺呼吸からＰＧが見出せない一方ＲＤＳから回復
段階にある幼児にはＰＧが出現しているとの発表をして
いる。

それ故に、ＰＧの値がＦＬＭの度合を示す重要な指示要
素と考える研究者が多い。これまで羊水中ＰＣの測定に
幾度らのクロマトグラフィー法（Ｔ　Ｌ　Ｃ）が扱われ
てきたが、上述したように色々な欠点を有している。

また、レシチンとＰＧの定量測定が酵素学的に行なわれ
た。［タリン、ケＡ　、（ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｂｅｗ。

）２５：１０３−１０７：マイクロクロム、ノエ＋、　
（Ｍｉｃｒｏｃｈｒｏｍ、　　Ｊ、）２４：２３９−２
５８及びアム、ジェー、オンステト　シネフル、　（Ａ
ｍ、　　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ　　Ｇｙｎｅｃｏｌ、）１
４５　：４７４−４８０１、Ｌかし、多くの場合、有機
溶媒による抽出法が利用され、抽出に時間がかかり煩雑
であった。しかも、使用される溶媒が危険で、リン脂質
の回収率が１００％以下に下ることが多い。その上、抽
出物の乾燥処理後、有機溶媒の残留量が認められ、酵素
を不活性化してしまう可能性がある。そこで、７ナオカ
ルその他の研究者たちは、タリン、ケム、　（ＣＩｉｎ
、　Ｃｈｅｖａ。

）（２５：１０３−１０７）の中で、またアルティスそ
の他の研究者たちは、マイクロクロム、ノエ＋、　（Ｍ
ｉｃｒｏｃ！＋ｒｏｍ、Ｊ、　）（２５：１５３−１６
８及び２４：２３９−２５８）の中で、両者ともに、羊
水抽出法を利用せずに、酵素学的にレシチンを抽出する
方法を発表した。この方法によれば、羊水検体は遠心分
離法により浄化処理することもあればそのまま、浄化処
理しないこともあった。しかし、前者の遠心分離処理を
行なうとリン脂質物質が消滅し分析できなくなる。

また一方、後者の浄化処理しない場合の検体は吸光度に
よる測定結果が安定性に欠き、あるいは誤差が生じるこ
とになる。そこで、アナオカルその他の研究者たちは後
酵素抽出方法を利用し、混濁の問題の除去を計ったが、
かえって前記で述べたような欠点が生じる結果となった
。

そこで、羊水ＰＧの測定を今度は凝集反応検査法を導入
して行なわれた。この検査法は迅速であり、ＰＧに対し
て特異的である。

しかしながら、検査そのものが半定量的で、コストが高
（、安定性に欠ける試薬（時間や温度によって不安定）
を使用し、そのうえ操作技量の良し悪しにも影響する。

以上、ＰＧが存在しているか消失しているかにより、胎
児にＲＤＳの恐れが実際あるか否が判断できる。

従って、クロマトグラフィーを利用せずにＰＧの定量測
定する方法のほうが目下広く使用されているＩＷＮクロ
マトグラフィー測定法よりも秀れた点がある。

（目的） 本発明の目的は羊水中のＰＧの濃度を測定するための方
法を提供することにある。

（構成） 本発明では、被測定検体として、経腹壁羊水穿刺（ｔｒ
ａｎｓ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ　　ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅ
ｓｉｓ）によって採果した羊水を一定量用意しておくの
が最良であるが、経膣的に採集した検体でもよい、採集
した羊水検体は、リボソマル（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）凝
集体もしくは膜状凝集体に含まれるＰＣを溶解化するべ
（処理する。すなわち、ＰＧｉｌＨｌ［を作成する０次
に、こうして出来だ粒子状もしくは綿状の検体を浄化処
理する。このとき、後に行なう酵素分析に先立ち浄化処
理を行なってしまうのが望ましい。

また、羊水検体をトリトン　Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ
　　Ｘ−１００）水溶液などの表面活性剤によって処理
し、検体から凝集物を除去して、溶解化することにより
、ＰＧｆ＃液を作るか、もしくはＰＧを分散化するのが
望ましい、この上うに、ＰＣより凝集物を除去し溶液化
する方法は他に、超音波分解法、機械的分解法、凍解サ
イクル法、突然解圧法並びに渦流混合法なとがあり、ど
れでも利用できる。

こうしてＰＧを溶解化処理した後、遠心分離又は濾過に
より、粒子状物質ないし綿状物質を除去する。尚、濾過
を利用する際は濾過媒体がＰＧを吸着しないよう注意し
なければならない。

また、浄化処理については酵素分析の間もしくはその後
に行なってもよいし、または行なわなくともよい、さら
には、濾過と遠心分離とを組み合わせでもよい。

次に、遊離グリセロール（ｆｒｅｅ　　ｇｌｙｃｅｒｏ
ｌ）を破壊する単−又は複数の酵素と上記の羊水検体を
混合させ、一定時間インキエベートし、含有するグリセ
ロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を−切除去する。

この時、この遊離グリセロール破壊酵素と羊水検体との
混合物の中に、補酵素（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ）、７クチベ
ータ、エンへンサー、スタビライザー、抗菌剤等も加え
てよい、但し、おおむね、検査に支障をきたさない程度
とする。

かくして処理された羊水検体は、内因性グリセロールが
除去され、次に他のａｍの酵素すなわちグリセロール分
離酵素（ｇｌｙｅｅｒｏｌ　　ｌｉｂｅｒａｔｉｎｇ　
　ｅｎｚｙｍｅｓ）により該検体を処理し、ＰＧからグ
リセロールを分離する。分離したグリセロールに発色指
示薬すなわち、色原体を加えて、検査すると発色を、起
こす、この時、発色した色を測定し、標準物質と比較し
、羊水中のホス７７チノルグリセロールの濃度を算出す
る。

（発明の実施例） 本発明の方法を実施する際、先ず妊婦より羊水検体を採
集する。羊水検体の採集方法は経腹壁羊水穿刺でもよい
し、従来の技術と手法により経膣的に検体を採集しても
よい。

採集した羊水検体は検査泪検体に処理するが、この処理
は、リボソマル凝集体（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　　ａｇｇ
ｒｅｇａＬｅｓ）もしくは膜状凝集体（ｍｅｍｂｒａｎ
ｏｕｓ　　ｔｇｇｒｅｇａｔｅｓ）よりＩ’Ｇを分離す
る処理方法によって行なう。この際、表面活性剤と羊水
検体とを混合する処理過程を設けることが望ましい。こ
の混合処理は手作業でもよいし、渦流混合装置その他の
混合装置によって行なってもよい０以上の検体処理に要
する時間（混合処理時間及び完了時間を合わせた時間）
は検体の状態、使用する表面活性剤の効果及び混合路Ｊ
！！！過程の効率の程度によって異なる。表面活性剤は
、ＰＧを帰 溶解化できる〆浄剤又は乳化剤もしくはその組′み合わ
せ又は希釈したものでよい。

７７クチエオ：ｙ　（Ｍ　ｃＣｕｔｃｌ＋ｅｏｎ）Ｗの
「乳化剤と洗浄剤」［ノース　アメリカン　エディジョ
ン（Ｎｏｒｔｈ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｅｄｉｔｉｏ
ｎＬ　１９８３　ｔエムシー　パブリッシング　カンパ
ニー、グレンロック、ニレーシＴ−シー　０７４５２（
ＭＣＰｕｂｌｉｓｌ＋ｉｎｇ　　Ｃｏ、　ｔ　　Ｇｌｅ
ｅｓ　　ＲｏｅｋｔＮｅｗＪｅｒｓｅｙ　　Ｏ７４５２
）］によれば、多くの表面活性剤が挙げられている。そ
のどれもが、以後の酵素測定に支障をきたさない限り、
上記の混合処理に適したものである。これらの表面活性
剤の内どれを選択するかは、ホスファチジルグリセロー
ルの溶解化にどの程度効率があるか、さらに後に続く分
析に支障がないかが唯一の条件である。従って、使用す
る表面活性剤の効率が良ければ、それだけその使用ｆｉ
（容量）が少なくて済む。その上、検体の希釈量を減ら
して検出感度を高めることができる。

尚、検査用検体を準備する方法としては、この他に、物
理的に上記ＰＧ含有凝集体を分解する方法がある。この
方法は表面活性剤を加えても加えなくても行なうことが
できる。この物理的分解を行なうには、凍解サイクル、
超音波冷解装置、突然解圧並びに長時間及び／又は強力
な混合等の公知方法により行なうことができる。

さて、準備した検査用検体は濾過処理又は遠心分離処理
により、浄化するも任意である。この浄化処理を打なえ
ば検査用検体は分光光度測定に適したものとなる。しか
し、該検体から粒子状物質または綿状物質が除去されで
いる場合や、分光光度によらない測定法を扱う場合は、
そのような浄化処理は不要である。この浄化処理はＰＧ
の溶解化工程の前に行なうことは出来るが、その場合Ｐ
Ｇ分析成分が消失する可能性がある。そこで、酵素分析
の間もしくはその後に浄化処理を行なってもよい。すで
に述べたように、浄化処理は遠心分離法またはｍ適法の
どちらでもよく、また両者を組み合わせた方法でもよい
。また、遠心分離と濾過を同時に行ない検体を処理して
もよい、濾過装置及び濾過媒体の選択については、所望
の浄化力及び１過速度を有していて、ＰＧを吸着せず、
後に続く分析に支障をきたさないものに限る。その他、
検体を限外濾過法で処理することにより、以後の分析に
妨害となるような微粒子並びにヘモグロビン等のタンパ
ク質をもろとも除去してよい。

以上の如（調製した検査用検体を所定量用意し、すでに
述べた所定の酵素を含む所定量の試薬と混合させ、一定
時間インキュベートさせる。

この混合物中、該酵素は、以後の分析に妨害となる物質
を除去する機能を有するものとする。

尚、主要な妨害物質としてグリセロールがある。

それに次ぐ妨害物質としては、次の分析過程で反応する
基質［例えば、グリセロール−３−ホス７エイト（ｇｌ
ｙｃｅｒｏｌ　−３−ｐｂｏｓｐｌ＋ａｔｅ）及びベル
オキサイド（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）］がある。

また、上述の酵素は、以後の発色過程で、ＰＧ自由米グ
リセロールを色に変える機能を同時にそなえているもの
とする。この場合下記の酵素系が好ましい。（Ｅ、Ｃ，
番号は括弧にて示す、） グリセロールキナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ　Ｋｉｎａｓ
ｅ）（２゜７．１．３０） グリセロホス７エイト　オキシダーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏ
ｐｈｓｏｐｂａｔｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）［Ｅ、Ｃ，番号
なし。＃アサインド（＃ａｓｓｉｇｎｅｄ）］ ベルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１，１１
，１，７）グリセロール　キナーゼ（ＧＫ）は、ＡＴＰ
を加えるとグリセロールをグリセロール−ホス７エイト
（ｇｌｙｃｅｒｏｌ　−ｐｌ＋ｏｓｐｈａｔｅ）に変え
る。グリセロール　ホス７エイト　オキシダーゼ（Ｇ　
Ｐ　Ｏ）をデバイドロキシアセトン　ホス７エイト（ｃ
ｌｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅＬｏｎｅ　　ｐｂｏｓｐｈａ
ｔｅ）とハイドロゲンペルオキサイド（ｈｙｄｒｏｇｅ
ｎ　　ｐｅｒｏｘｉｄｅ）とに変える。ベルオキサイド
はベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）によって水と酵素に変わ
る。

前記酵素含有試薬には、水、１ｆｃｆｒ剤、食塩、Ｉｆ
ｆ酵素、抗菌剤、溶解化剤、アクチベーター、エンへン
サー、スタビライザーないしレドックス　カップラー（
ｒｅｄｏｘ　　ｃｏｕｐｌｅｒ）を加えてもよい。レド
ックス　カップラー（ｒｅｄｏｘ　　ｃｏｕｐｌｅｒ）
はペルオキシダーゼ指示薬系に属する。このレドックス
　カップラーはペルオキシダーゼを比色測定用指示薬の
成分に酸化結合させる機能がある。該比色測定用指示薬
は前記妨害物質除去処理を終えたのち加えるものである
。また、このレド・２クス　カップラーは、妨害物質除
去処理の間においては、非発色反応にてベルオキサイド
を消滅させる機能もある。従って、妨害物質除去処理中
に存在または発生するいがなるべ工程で使用する比色測
定用指示薬系に妨害を与えない。さて、上記酵素を所定
時間及び所定温度のもとで、上記妨害物質が完全に反応
または除去するまで（はとんどそれに近い位）インキユ
ベートする。この場合、通常、２０″Ｃ〜５０°Ｃの温
度で５〜３０分の時間が適当である。

この際、前記のインキユベートした混合物を同一分量の
もとに２分量用意する。それには、２分量の検査用検体
を同じ所定量の酵素によって処理するか、もしくは１分
量の検査用検体を所定量の酵素により処理した後２つの
等し一１部分標本に分割するか、そのどちらでもよい、
こうして分けた一方の１分量または１部分標本をブラン
ク部分標本と表示し、他方の１分１１またはＩＷＳ分標
本を検体部分標本と表示しておく。

次に、ｆｉｖ素指示薬溶ｆｉ（ｅｎｚｙ論ａｔｉｃ　　
１ｎｄｉｃａｔ。

ｒ　　５ｏｌｕｔｉｏｎ）を用意し、これに、前記酵素
系の諸反応のうち１つの反応もしくはそれ以上の反応に
よって生じる酵素の活性を検出する試薬を含ませる。扱
う指示薬（比色測定用）としては、酵素の活性がない時
は無色状態を保ち、酵素の活性があった時は分光光度測
定または肉眼測定の′ＹＬ能な色を発色するものが望ま
し−１，この指示薬は単一化合物であってもよく複数化
合物の組み合わせであってもよい。また、該指示薬に２
種類以上の化合物を使用する場合、その化合物のうち１
種類以上をもとのグリセロール酵素試薬（ｇｌｙｃｅｒ
ｏｌ　　ｅｎｚｙｍｅ　　ｒｅａｇｅｎｔ）に加えても
よい、（もしくは、検査用検体に直接加えてもよい。） 但し、この場合、上述の妨害物質除去処理の前に加える
べきで、しかも、その妨害物質除去処理の間においでは
、はとんど又は完全に発色を起こさないことである。醪
素活性測定についでは、次のような公知の方法で行なっ
てもよい。

即ち、（１）反応速度論的方法（２）放射能化学的方法
（３）蛍光測定方法（４）化学的発光法（５）比濁法及
び（６）免疫学的方法。

かかる酵素指示薬溶液に、公知の緩衝剤、食塩、補酵素
、抗菌剤、溶解化剤、アクチベーター、エンハンサ−及
び／又はスタビライザーを加えてもよい。

さて、グリセロホス７オリパーゼＷＩ素としては、ホス
７オリパーゼ　Ｄ（Ｅ、Ｃ，番号：３゜１、　４．４．
　）（ｐｂｏｓｈｐｈｏｌｉｐａｓｅ　　Ｄ　　（Ｅ、
　Ｃ。

３．１．４，４．））が望ましい。この酵素には、ＰＧ
から基質（グリセロール）を発生させるＦａｍがあり、
その基質は妨害物除去処理中に残存する酵素に対して有
効である。この残存する酵素は、検査ｍ検体の部分標本
に前記酵素指示薬溶液と別にもしくは一緒に加えたもの
である。（但し、ブランク部分標本に加えたものではな
い、）次に、各々のブランク部分標本に所定量の酵素指
示薬溶液を加える一方、酵素指示薬溶液とグリ七ロホス
７オリパーゼ酵素の所ｉ１！＜この場合別々に用意して
もよいし、混合しでもよい：を各々の検査用検体部分標
本に加える。しかる後、総ての部分標本を混合処理し、
上述した如く所定温度の下に所定時間インキユベートす
る。

可能になる程度までインキユベートする。

尚、臨床化学分野において実際の現場でも用意している
ような、管理物質（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）及Ｖ／又は標準
物質（ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を本発明の実施１こあたり
使用しでよい、これらの管理物質及び標準物質は、検体
と並行して検体の測定方法と同じ方法により測定される
。ところで、Ｗ理物質及び標準物質というものは、検査
の有効性を確保し、確実に検査が正常に働きそして検体
の測定値を算出できることを目的として使用されて−す
る。こうした管理物質及び／又は標準物質は、生物学的
媒体及び／又は生物学的溶液中に含まれる既知量の分析
成分からなる。これら標準物質にも公知の緩衝剤、食塩
、抗菌剤、可溶化剤、スタビライザー及び／又は異物材
料すなわちグリセロールを加元てもよい。本発明による
酵素学的ＰＧ０分量おいても、Ｉｒ！！理物質及Ｖ／又
は標準物質を分析して測定値を出して検体の測定値と比
較することができる。従って、検体中の？”１／’墳−
色瞥請酷１ゆ作中＋ス書シ轟ｆや弧スＬまたＦＬＭの定
性的評価を行なうことが可能である。

検査にあたっては、各臨床検査研究所は一定の標準物質
を用意し、二重チェックを行なえるようまた検査の正確
さを最も効果的に得られるようにしておくことが肝要で
ある。そのため、本発明の検査方法を実施するための試
薬はキットとして販売されている１代表的なキットは下
記の試薬から成っている。

（ａ）羊水中に含まれる総てのＰＣを分散状態又は溶解
状態にすることが可能で、しかも分散状態又は溶解状態
となったＰＧがｔｇ通過体を通過する時に媒体中にとど
まることのないようにした、少なくとも１つの表面活性
剤を含む試薬。

（ｂ）羊水中に含まれる総ての内因性グリセロールを除
去、破壊又はカップリングすることが可能な試薬。

（ｃ）ＰＧよりグリセロールを分離することが可能な試
薬。

（ｄ）Ｐ　Ｇ　’ｃ含む少な（とも１つの標準試薬。

尚、ｍ過装置を含めるも任意である 望むらくは、キットの中に充分な試薬が入っていて、通
常、管状容器、バイフルもしくは同様な方法で密閉され
た容器に詰められ、少な（とも１つのブランク及び１つ
の検体が測定できるようなものがあればよい。従って、
このようなキットには次のような試薬が備えられている
。

即ち、２〜１０＠＠パーセント（望むらくは約３〜Ｇｆ
ｆｉ量パーセント）の　トリトン　Ｘ−１００（Ｔｒｉ
ｔｏｎ　　Ｘ−１００）のような表面活性剤水溶液から
なる試薬１．試薬２はＣＰｏｌＧＫ、又はペルオキシダ
ーゼ等の乾燥グリセロール酵素の混合物からなり、グリ
セロール酵素再生試薬を一定１加えることにより再生可
能なしのである。試薬３はレドックス　カップラーを含
むグリセロール酵素再生試薬である。試薬４は、酵素ホ
ス７オリパーゼ　Ｄ　（Ｐ　Ｌ　−Ｄ　）である、試薬
５はベルオキサイドと反応し発色する発色試薬であるｌ
薬６は濾過カラム又は１１１過装置のオプンａンである
。試薬７は、標準ＰＧを望むらくは、各々、θμＭ、２
．５μＭ１５゜０μＭよりなる複数の比較標準試薬を含
んでなる。

さて、以下の実例により、臨床化学分野の習熟者が行な
うところの本発明の実施をさらに例を示しで説明する。

叉１」− 女性の妊婦より採果した羊水検体を充分に混合し、これ
を１分量とり、アルキルエトキシポリエトキシ　エタノ
ール（ａｌｋｙｌｅＬｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｌ＋。

にｙ　　ｅｔｈａｎｏｌ）と分類される表面活性剤のト
リトン　Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００）［
ｏ−ムアンド　ハース（Ｒｏｈｍ　　＆　　Ｈａａｓ）
］をｓｏｇ／Ｌ含む溶液により処理する。この溶液は、
ＡＦを１０の割合に対し該トリトンｘ−ｉｏｏを１の割
合で作成したものである０次に、検体を過流混合装置に
て１５秒間混合処理したのち５分間放置させ、再び混合
処理した。こうしで小米だ検査用検体をガラス繊維紙を
使用しｍ過し標本にして、その部分標本２ケを用意しく
ブランク１ケと検体１ケ）、これを試験管に注入した。

そして、次の如く調整した標準試薬を夫々５００μＬの
部分標本にしたうえ、これを２ＩＩＩＬ用意し、他の試
Ｗｋ管に注入した。即ち、５８／Ｌトリトン　ＴＸ−１
００水溶液に０８ＭのＰＧｆｒ：含む標準試薬、同水溶
液に２．５μＭのＰＧを含む標準試薬及び同水溶液に５
．０μＭのＰＧを含む標準試薬、さらに、５００μＭの
グリセロール溶液を５００μＬの部分標本にし、これを
２ケ用意し、前記標準試薬２．ＩＩｌの試験管の中に注
入した１次に、総ての試験管の中に５００μＬのグリセ
ロール酵素溶液を加えた。ここで使用したグリセロール
酵素溶液には以下のものが含まれている。

ト　リ　ト　ン　　　Ｘ−１００ｓｇ トリス　（Ｔ　ｒｉｓ）［）リス（ハイドロキシメチル
）アミ／エタン　［Ｔｒｉｓ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｂ
ｙｌ）ａｍｉ１＋　ｏ　ｅ　ｔ　ｂ　ａ　ｎ　ｃ　］の
略Ｆｔｌ　　　　　　　　　１Ｂ、２μハ　　　　・　
　　　　　０　嘗ｔ　　　Ａ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｍ　　　　　八　　１Ｍｇｃｈ’　
６　Ｈ２Ｏ１、４２ｇ ＭＥＨＡ［２−（Ｎ−エチル−（ヘ−１リエデイノ）−
エタノール［２−（Ｎ　−ｅｔｂｙｌ　−ｍ　−ｔｏｌ
ｕｄｉｎＡＴＰ、−Ｈ２Ｏ［アデノシン　／リン酸（ａ
ｄｅ、ｎｏｓｉｎｅ　　ｔｒｉｌ）ｂｏｓｐｈａｔｅ）
の略語］　　　１，１１゜Ｇ　Ｐ　Ｏ［７エロコツカス
　ヴイリダンス（ａｅｒ。

ｃｏｃｃｕｓ　　ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来の酵素］　　
　９．３３にυＰ　ＯＤ　（西洋ワサヒ由来）酵素）１
７．６ＫＵＧＫ［ストレプトミセス　クロモ７スクス（
ｓｔｒｅｐｔｏＢｃｅｓ　　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ
）由来の酵素　　ＩＫυまた、上記グリセロールＭ、素
溶液は濃塩酸によりＩ’ｌ＋７．６に調整し、蒸留水で
１リツトルに希釈した。

以上の総ての試験管を混合処理し、３０″Ｃの下で１２
分間インキエベートした。次に、５０μＬのペルオキシ
ダーゼ指示薬溶液をブランクの入った試験管の各々に加
え、５０μＬのホスフォリパーゼＤ指示薬溶液を検体の
入った試験管の各々に加えた。これらの指示薬溶液の成
分以下の通りである。

ペルオキシダーゼ指示薬溶液 トリス　　　　　　　　　　　　１８．２ｇＣａｃｌｚ
　＠　２　Ｈ２０２，０４ｇ４−アミ／アンチピリン　
　４．ｏｓｇ（４−ＡＡＰ） このペルオキシダーゼ指示薬溶液は濃塩酸によりＰ１１
７．６に調整し、蒸留水により１リツトルに希釈した。

尚、ホスホリパーゼＤ指示薬溶液にはさらに、ストレプ
トミセス　クロモ７スクス由未のホスホリパーゼＤを１
３３．４ＫＵ／Ｌを含ませた。

次に、総ての試験管を混合処理し、３７°Ｃの下にもう
１２分間インキュベートした。しかるのち、各々試験管
の吸光度を５５０ｎｍの波長で分光光度計により測定し
た。吸光度の測定結果は次の通りであった。

Ｂ 番号検体　　ブランク検体のＢ−八ＰＧ（μＭ）の １　　　八Ｆ　　　　　　　　、０３９　　　　．１０
２　　　．０Ｂ３　　２．３９２０μＨのＰＣ 標準試薬　、０２１　　．０６９　．０４８−０．１７
３２．５μＨのｐｃ 標準試薬　、０１９　　．０８４　．０６５　２，７２
４５．０μＨのＰＧ 標準試薬　、０２１　　．０９９　．０７８　４，８９
５５００μＨの グリセロール、０２３　　．０７２　．０４９　０．Ｏ
６尚、上記のＰＧ（μＭ）の濃度は線形回帰分析法によ
り上記の３つの標準試薬を使用し測定した。グリセロー
ルは本分析の妨害とならなかった。

大ヱしし ＡＦからのＰＧ回収率に［ａ処理がどの程度効果がある
か調べた。羊水２７検体を採集し、２つの検査条件の下
に上記例１のように測定した。すなわち、管理試薬の条
件として、上記実例１に従い濾過処理を行なった。

士！−’Ｍ！ｆ４消久評し１ヂ　−←ｔゆ杆か４スソ番
−ベーシシン過程で完了した後にはじめて濾過処理を行
ない、その直後に分光光度定量測定を行なった。

この結果は添付図面に示すグラフの通りである。即ち、
濾過処理の前あるいは後にＰＧを羊水に加えた場合の測
定値はほぼ直線となった。

この測定値を線形回帰分析（ｎ＝２７）により処理する
と、相関係数は０．９９２となり回帰線方程式はＹ＝０
．９３５９Ｘ＋０．４９７となる。１５４ＭＰＧ（ｎ＝
２１）より低い値では、相関係数は０．９５４となり、
回帰線方程式はＹ＝１，００１Ｘ＋０．１４９となる。

即ち、後者の濾過処理では、表面活性剤を加えた場合、
検査ｍ検体よりＰＧを取り出すことはできないことを示
す。

友１− ＡＦの検体を充分に混合処理し、その部分標本を複数用
意して、下記条件にて各々処理した。

６−　　　　　処理− Ａ　　　　　　　　　瀘　過　後　５０ｇ／Ｌ　　の　
　ト　　リ　　ト　　ン　Ｘ　　−１００水溶液により
１０％希釈。

Ｂ　　　　１１０００Ｘにて１０分間遠心分離したのち
、５０ｇ／ＬのトリトンＸ−１００水溶液により１０％
希釈。

Ｃ５０ｇ／ｌ、ノ）　’）　）　ンＸ−１００水溶液を
混合したのち濾過処理。（上記実例 １に従う。） Ｄ　　　　５０ｇ／Ｌ　（７）　）　’）　）　ンＸ　
−１００水溶液を混合したのち１１０００Ｘにて１０分
間遠心分離処理。

Ｅ　　　　５０ｇ／　ＬのトリトンＸ−１１４水溶液を
混合したのち濾過処理、（上記実例 １に従う） Ｆ　’　　　５０ｇ／Ｌのブルロニク　Ｌ−３５（注）
（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ−３５）を混合したのち濾過処
理、（上記実例１に従う） （注）ＢＡＳＦヤンドット社（ＢＡ Ｓ　Ｆ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）製の表面活性剤以上の如
く処理した検体に対し、上記実例１の方法によりＰＣの
測定を行なった。

結果は下記の通り。

１Ｌ（も　　　　Ｌ灸＠」ｌ Ａ　　　　　　　６．４５ ８　　　　　　６．９９ ＣＢ、５１ Ｄ　　　　　　　８．２１ Ｅ　　　　　　　８．３（５ Ｆ　　　　　　　８．２１ 上記結果により、浄化処理の前に表面活性剤による処理
を行なうと、ＡＦからのＰＧ回収率が良くなることが判
る。

また、トリトンＸ　−１００に代わって他の表面活性剤
も使用できることも判る。

Ｘ」」− 上記実例１と同じ手順で行なったが、ベルオキシグーゼ
の活性を表示できる別の試薬を使用した。即ち、実験上
の条件は上記実例１と同一だが、下記の異なった試薬を
使用している点が相違する。

実験Ａ：同同上モル濃度１２．５＋＋＋Ｍ）にて、ＭＥ
ＨＡに代えで、ソディ９ム２−ハ イドロキシ−３，５−ヂクローロベン ゼン　サル７オネイト（Ｓｏｄｉｕｍ ２−　ｈｙｄｒｏｘｙ　−３＋　５−　ｄｉｃｌ＋Ｉｏ
ｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＨＤ　ＣＢ
　Ｓ　）を使用した。５１０ｎｍにて吸光度を測定した
。

実験Ｂ：同同上モル濃度１２，５ａ＋Ｍ）にて、ＭＥ　
ＨＡに代えて、３−ハイドロキシ−２，４，６−ドリプ
ロモベンゾイフク アシド（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　−２＊　４　ｔ　６−　
ｔｒｉｂｒｏｍｏｌ）ｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄ）を使
用した。５１３１１１１１にて吸光度を測定した。

実験Ｃ：同一モル濃度（２０ｍＭ）にて、４−ＡＡＰに
代えて、３−メチル−２−ペ ンゾチ７ゾロネーハイドラゾン　ハ イドロクロライド（３−ｍｅｔｂｙｌ　−２−ｂｅｎｚ
ｏｔｌ＋１ａｚｏｌｏｎｅ　−ｈｙｄｒａｚｏｎｅ　　
ｈｙｄｒ。

ｃｌ＋１ｏｒｉｄｅ）３使用した。５９０ｎｍにて吸光
度を測定した。

以上の実験で、吸光度の測定結果は、表を作成して示す
、以後の実験手順は上記実例１のものに従った。

Ａ　　　　ＢＢ−＾　　０μＨのＩ’Ｇ実例　検体　　
ブ〜ン７ノ撞停　　　　　標準試薬番号　　　　　吸光
度嶋濃　　　　と５μＨのＰＧｌ”準試 との宅 １　０ＩＩＭのＰＣ，０２１，０６９，０４８標準試薬 １５μＨのＰＣ，０２１，０９９，０７８，０３０標準
試薬 １５００μＨの　　、０２３　　．０７２　．０４９グ
リセロール ４＾　０ＩＩＨのＰＣ，０３８，０８０，０４２標準試
薬 ４＾　５μＨのＰに　　　、０３７　　．１１３　．０
７６　　．０３４標準試薬 ４＾　５００μＨの　　、０７８　　．１１１　．０３
３グリセロール ４Ｂ　　ＯμＨのＰ（：　　　、０８２　　．１１６　
．０３４標準試薬 ４［ｌ　５μＨの　　　、０８２　　．１３７　．０５
５　　．０２１グリセロール ４８　５００μＨの　　、１０１　　．１３４　．０３
３グリセロール ４ＣＯμＨのＰに　　　、１４０　　．１８３　．０４
３標準試薬 ４Ｃ５μＨのＰＣ，１４２，２４９、ＩＯ２，０６４標
準試薬 ４Ｃ５００μＨの　　、１３３　　．１５７　．０２４
グリセロール 上記の測定結果より、他のカップラー及び発色指示薬が
使用できることが判る。

１乱り 上記実例４の実験Ａと同一の手順で行なった。

しかし、ＨＤＣＢＳを発色試薬（１２，５ｍＭ）に含有
させ、グリセロール酵素試薬には含有させなかった。さ
らに、各標準試薬に５０μＭのグリセロールを加え模擬
的な内因性羊水グリセロールを得ようとした。吸光測定
値は次の通りとなった。

検体 Ａ　　　　　Ｂ プーンク　プーンクへ−Ｂ ＯμＮのＰＧ及び５０μＭ　　、２１６　　　．２４８
　　．０３２のグリセロール ５μＨのＰＣ及び５０μＭ　　　、２１９　　　．２４
８　　．０２９のグリセロール ５００μＨのグリセロール＞３．０　　　＞３．０　　
−以上により、妨害物質除去処理中に残留または発生す
る物質を破壊するには、インキュベーション以前の過程
でカップラー（ＨＤ　ＣＢ　Ｓ　）を加えなければなら
ない、もし、そのように処理しないと、もともと存在し
ている内因性グリセロールが発色試薬を加える過程で、
発色してしまうことになる。

衷」口り 手順は上記実例１のものに沿って行なったが、次のよう
に変更を加えた。即ち、１２００μＬの検体を用意し、
これを１本の試験管に注入し薬を夫々１２００μＬ用意
し、各々の試験管に注入した。即ち、５ｇ／Ｌのトリト
ンＴＸ溶液に０μＭのＰＧを含有させた標準試薬、同溶
液に２．５μＭのＰＧを含有させた標準試薬及び同溶液
に５．０μＭのＰＧを含有させた標準試薬。

さらに、５００μＭのグリセロール溶液を１２００μＬ
用意し、これを１本の試験管に注入した。次に、１２０
０μＬのグリセロール酵素溶液を各試験管に加えた。以
上の試験管を混合処理し３７°Ｃの下に１２分間インキ
エベートした。そして、これらの試験管より、各々５０
０ＩｉＬの分量を２分量取り（ブランクの部分標本と検
体の部分標本）、別々の試験管に注入した。以後、上記
の実例１に従い測定をおこなった。

吸光度の測定結果は以下の通りであった。

吸 Ｂ 番号　検体　ブランク検体の　Ｂ−＾検出さの吸光度吸
光度　　　れたＰＧ μＨ １＾Ｆ　　　　　、０６１　．１０１　　．０４０　３
．３７２０μＨのＰＣ 標準試薬　　、０２３　．０４９　　．０２６　０，０
４３２．５μＨの ＰＧ標準試薬　、０２４　．０６０　　．０３４　２．
４２４５．０μＨの ＰＣ標準試薬　、０２Ｂ　　、８７３　　．０４７　５
．０４５５００μＮの グリ４：　ｏ　−ル、０２９　　、Ｑ５４　　．０２５
　−０．２０この結果により、第１回のインキュベーシ
ョンは１本の試験管で行なうことができ、然るのち検体
用試験管とブランク用試験管に分け、実例１に従い測定
することができる。

以上、現在の特許の状況に則し本発明の最上の形態と好
ましい実施態様を詳細に表わしかつ説明したが、本発明
はそれに限定するものではなく、その範囲は添付したク
レームに定められている。

【図面の簡単な説明】

添付の図面は、酵素インキュベージタンがＰＧの分析精
度に影響を及ぼさない程度まで１ｆ過した状態を示すグ
ラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、胎児肺成熟を診断するための医療診断用指示要素と
   して、ＰＧ、すなわちホスファチジルグリセロールを測
   定する方法であって、羊水検体より前記ＰＧの分散体も
   しくは溶液を形成せしめるようその羊水検体を処理し；
   前記ＰＧ溶液より内因性グリセロール（ｅｎｄｏｇｅｎ
   ｏｕｓ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を除去し；かかるＰＧ溶液
   において、グリセロールをＰＧから分離させるようその
   ＰＧ溶液を処理し、面して分離したグリセロールの濃度
   、すなわち前記羊水中のＰＧ濃度を示すところの濃度を
   測定することからなるホスファチジルグリセロールの測
   定方法。 ２、前記羊水を表面活性剤又は物理的分解方法により処
   理し、溶解化した前記ＰＧを含む溶液にさせ、このＰＧ
   溶液の形成の後に、かかる検体を濾過又は遠心分離もし
   くはそれらの組み合わせにより処理することからなり、
   かつ、ここで、少なくとも１つの酵素を使用する処理に
   より前記溶液より内因性グリセロールを除去することか
   らなる前記特許請求の範囲第１項記載のホスファチジル
   グリセロールの測定方法。 ３、前記の少なくとも１つの酵素が、ハイドロゲン　ペ
   ルオキサイド（ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ）
   を発生し、そのハイドロゲン　ペルオキサイドが、酵素
   、化学的還元体又はレドックス　カップラーの作用物質
   のうち少なくとも１つによって破壊されることからなり
   、かつ、ここで、グリセロール　キナーゼ（ｇｌｙｃｅ
   ｒｏｌ　ｋｉｎａｓｅ）及びグリセロホスフェイト　オ
   キシダーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｏｘ
   ｉｄａｓｅ）を使用して前記ハイドロゲン　ペルオキサ
   イドを発生させ、かつ、ここで、ペルオキシダーゼを使
   用することにより前記ハイドロゲン　ペルオキサイドを
   破壊することからなる前記特許請求の範囲第２項記載の
   ホスファチジルグリセロールの測定方法。 ４、前記におけるＰＧよりグリセロールを分離する処理
   はグリセロール分離酵素によって行ない、かつ、ここで
   、該グリセロール分離酵素としてホスフォリパーゼＤ（
   ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｄ）を使用し、かつ、こ
   こで、分離したグリセロールの濃度を少なくとも１つの
   酵素によって測定し、かつ、ここで、内因性グリセロー
   ルを溶液より除去したあとも残留する少なくとも１つの
   酵素によって、該分離したグリセロールの濃度を測定し
   、かつ、ここで、前記の少なくとも１つの酵素がハイド
   ロゲン　ペルオキサイドを発生し、このペルオキサイド
   の濃度をペルオキシダーゼを使用することにより測定す
   ることからなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、前記の分離したグリセロールの濃度を、発色指示薬
   により発色させて検出し、発色した色を測定することか
   らなり、かつ、ここで、ハイドロゲン　ペルオキサイド
   の濃度を発色指示薬を使用することにより測定して、か
   つ、ここで、ペルオキシダーゼの活性を発色指示薬及び
   レドックス　カップラーによって測定することからなり
   、かつ、ここで、前記レドックス　カップラーとして２
   −（Ｎ−エチル−メタ−トルイディノ）−エタノール［
   ２−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−ｍｅｔａ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｏ
   ）−ｅｔｈａｎｏｌ］を使用してなり、かつ、ここで、
   前記レドックス　カップラーとして、２−ハイドロキシ
   −３，５−ヂクロ−ロベンゼン　サルフォネイト（２−
   ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅ
   ｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を使用してなり、かつ、こ
   こで、前記発色指示薬として４−アミノアンチピレン（
   ４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｅｎｅ）を使用してなる
   前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、前記検体より発色した色を、ＰＧ含有の標準試薬に
   て発色した色に比較させて、羊水中ＰＧ濃度を測定する
   ことからなり、該標準試薬にＰＧとグリセロール双方が
   含有されてなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、羊水検体におけるＰＧの量を分析するためキットで
   あって、 （１）前記羊水を前記ＰＧの溶液に形成するための羊水
   処理用表面活性剤を少なくとも１つ含有する試薬と、 （２）かかるＰＧ溶液より内因性グリセロールを除去す
   ることが可能な試薬と、 （３）ＰＧよりグリセロールを分離させることが可能な
   試薬と、 （４）ＰＧを含有する少なくとも１つの標準試薬とから
   なるキット。 ８、前記ＰＧ溶液を浄化するための濾過装置を含んでな
   る前記特許請求の範囲第７項記載のキット。 ９、溶液から内因性グリセロールを除去することが可能
   な前記試薬が少なくとも１つの酵素からなり、ＰＧより
   グリセロールを分離させることが可能な前記試薬が少な
   くとも１つの酵素からなる前記特許請求の範囲第７項記
   載のキット。 １０、溶液からグリセロールを除去することが可能な前
   記試薬にレドックス　カップラーが含まれてなり、ＰＧ
   よりグリセロールを分離させることが可能な前記試薬に
   発色指示薬が含まれてなる前記特許請求の範囲第７項記
   載のキット。