JP3677452B2 - リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続および診断用製品 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続および診断用製品に関する。
【０００２】
冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）は、西洋産業国において、いまだに主な死亡原因である。冠動脈性心疾患の危険因子としてのコレステロールの重要性は一般的に認識されているが、蛋白質随伴トリグリセリドの評価、特に血清中に含まれるリポ蛋白質の評価も、この関連において考慮されている。
【０００３】
一般に、密度の違いに基づいて、超低密度のリポ蛋白質（「超低密度リポ蛋白質」、以下ＶＬＤＬと略す）、低密度のリポ蛋白質（「低密度リポ蛋白質」、ＬＤＬ）、および高密度のリポ蛋白質（「高密度リポ蛋白質」、ＨＤＬ）への、リポ蛋白質画分の分割が行われる。
さらなる特定のリポ蛋白質の種類は、キロミクロン（ＣＭ）のリポ蛋白質である。
当該リポ蛋白質は、さらに副画分に分割することができる。これらの中でも、特に「中密度蛋白質」（ＩＤＬ）および「スモールデンスＬＤＬ」が、ＣＨＤの形成に非常に重要である。上記のＬＤＬの２つの副画分には特にトリグリセリドが豊富であり、そのため、当該ＬＤＬトリグリセリドは、ＣＨＤの危険性に関して、確立したＬＤＬコレステロールよりも、より意味のあるものである。
【０００４】
冠動脈性心疾患、末梢動脈閉塞性疾患、およびミクロ−またはマクロ血管障害性変化のような血管系疾患の診断のために、個々のリポ蛋白質画分のトリグリセリド含有量と当該リポ蛋白質画分に含有される相対的な量は、相互に重要である。特に、ＬＤＬ画分において、高含有量のトリグリセリドは冠動脈性心疾患と関連していると考えられている。
【０００５】
リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの従来の測定手続は、本質的に２段階工程に基づく。
分画段階は、まず最初に、それぞれのリポ蛋白質画分をできるだけ明確に分離するために行われる。次いで、上記のようにして分離されたリポ蛋白質画分中のトリグリセリドの測定段階が行われる。
別の方法もこの分画段階では用いることができる。
沈澱方法は、主に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のトリグリセリド含有量の測定のためにデザインされている。ＬＤＬトリグリセリドの選択的な沈澱が明らかに試みられている。しかし、ＬＤＬ画分と一緒にかなりの量のＶＬＤＬも沈澱するので、この純粋な沈澱方法は不適当であることが証明され、そのため、それぞれのリポ蛋白質中のトリグリセリド含有量の識別は可能であるが、困難である（Ｒ．Ｓｉｅｋｍｅｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１７７，２３１頁（１９８８）、Ｒ．Ｓｉｅｋｍｅｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６，２１０９−２１１３頁（１９９０）、およびＭ．Ｎａｕｃｋら，Ｋｌｉｎ．Ｌａｂ．４０，１６７−１７６頁（１９９４））。
そのため、ＬＤＬトリグリセリドは、実際には密度に基づいた逐次超遠心分離によって測定され、この超遠心分離においては、ＬＤＬ画分を得るのに要した時間は４８時間に達し、または超遠心分離と沈澱を組み合わせて行って時間を短縮した。
すぐ上で述べた相対的に選択的な分離において、ＶＬＤＬ画分は、超遠心分離（約２４時間）を用いて最初に分離され、次いで、残りのＬＤＬ画分は適切な試剤によって、ほぼ選択的に沈澱される（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ＤＨＥＷ Ｎｏ．（ＮＩＨ）７５−６２８ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； ＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ，１−７４頁（１９７９））。
この後、ＬＤＬトリグリセリド含有量が、ＬＤＬ沈澱の前後のトリグリセリド濃度から計算により決定される。
ＤＥ１９５２０２１０Ａ１に記載されているように、適切な担体中、例えばアガロースゲル中でのリポ蛋白質の電気泳動による分離は、さらなる分画方法を示すものである。
【０００６】
当該分画段階に労力および時間がかかることが、リポ蛋白質画分中のトリグリセリドの特異的な測定のためのこれら従来手続の一般的な欠点となる。これらの従来方法はまた、殆ど自動化されることができないか、全くできない。しかし、個々のまたは異なったリポ蛋白質画分に対するトリグリセリド含有量の選択的な割り当てによってのみ、意味のある危険性の評価ができるので、このような分画段階なしでは、血管系疾患の危険因子としてのリポ蛋白質随伴トリグリセリドに基づいた診断結果を出すことは、実質的には不可能である。特に、もしＬＤＬトリグリセリド濃度が冠動脈性心疾患の予防に特別に意味があるとみなされるのであれば、ＬＤＬトリグリセリドをルーチンに検出または測定することが特に好ましい。
【０００７】
そのため、本発明は、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの、簡単で素早くて信頼できる測定手続を得るという目的に基づいており、本発明においては、個々のリポ蛋白質画分に関して、特に、診断学上特に意味のあるＬＤＬトリグリセリド含有量に関して可能である程度に良好な選択性が可能となる。
【０００８】
この目的は、以下の処置を有する、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続により達成される：
ａ）トリグリセリド含有リポ蛋白質と、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーから合成された非イオン性界面活性剤との反応、および
ｂ）トリグリセリド測定方法の実施。
【０００９】
本発明のさらなる主題は、クレーム１８記載の、上述の手続を行うために特に適切な診断用製品、およびクレーム３４記載の、上述の手続または血管系障害の体外診断用の診断用製品の使用からなる。
【００１０】
本発明によれば、驚いたことには、特別な型の非イオン性界面活性剤として、ポリプロピレンオキサイド単位とポリエチレンオキサイド単位から合成されたブロックコポリマーを使用することにより、ただひとつのまたはある種類のリポ蛋白質画分に関するトリグリセリド測定の優れた選択性が得られることがわかった。ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックコポリマー（以下ＰＯＰ／ＰＯＥと略する）の使用により、ＬＤＬリポ蛋白質画分に関して、特に高い選択性が得られるので、本発明の手続は、ＬＤＬトリグリセリドの選択的測定に特に極めて適切である。ＬＤＬリポ蛋白質からのトリグリセリドの測定のこのような選択性によって、その診断は、ここで関連する分野で特に意味あるものとなる。本発明の特別な利点は、リポ蛋白質画分の識別が、均質な溶液から行われるということにある。そのため、初めに記載した従来手続では必要であった特別な分画段階は、本発明の手続ではもはや必要ではない。特に、特定のリポ蛋白質画分の分離のための沈澱段階は必要ではなく、そのため、トリグリセリドの測定は、遠心分離段階なしで行うことができる。さらに、特別な非イオン性界面活性剤を使用することにより、均質な溶液が濁るのを防ぐことができるので、選択的に可溶化されたリポ蛋白質画分から、簡単で素早い方法で、トリグリセリド含有量を測定し、定量することが可能である。これにより、本発明の手続は、容易に自動化できるシステムのようなルーチンな診断へ特に簡単に適用可能となる。
【００１１】
これらの有利な作用の基礎としては、非イオン性界面活性剤としてＰＯＰ−ＰＯＥを使用することにより、特定のリポ蛋白質画分の選択的可溶化が可能となり、そのため、このリポ蛋白質画分に元来伴っていたトリグリセリドは、トリグリセリドの測定および検出試薬に対して接近しやすくまた反応しやすくなり、一方、他のリポ蛋白質画分はより弱く可溶化されるか全く可溶化されず、従ってそこに含有されるトリグリセリドは測定および定量するために接近しにくいということが推測される。個々のリポ蛋白質画分に関する選択性は、ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの組成物により、所望に応じて調節することができる。この型のブロックコポリマーが、エチレンオキサイド単位を有する相対的に親水性であるブロックＡと、プロピレンオキサイドモノマーを有する相対的に疎水性であるブロックＢから合成されることをもし考慮するならば、それぞれのブロック単位ＡまたはＢにおいても、これら単位の互いに対する割合においても、当該ブロック単位を変化させることによって、特別なブロックコポリマーを形成することができ、次いで、これにより、特定のリポ蛋白質または２種のリポ蛋白質のグループの可溶化のための好ましい選択性を得る。ここで影響を及ぼす適切なパラメーターは、重合度、または個々のブロック単位ＡまたはＢにおける重合長さ、および全コポリマーに対するブロック単位の配列および割合である。プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーの一般的な概要から、個々のリポ蛋白質画分の可溶化に適切な物質を選択できるが、この概要は、Ｉ．Ｒ．ＳｃｈｍｏｌｋａによるＪ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５４，１１０頁（１９７７）、Ｍ．Ａ．ＰｌａｎｔによるＲ．Ｄ．Ｋａｒｓａ（Ｅｄ．）：“Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｏｎｄｏｎ，３１８−３３２頁（１９８６）およびＫ．Ｋｏｓｓｗｉｇによる“Ｕｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｖｏｌ．Ａ２５，７４７−８１７頁，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”，特にＣｈａｐｔｅｒ１０．１（１９９４）の文献を検討した結果得られる。ここで、最後に挙げた文献は可能な製造業者のリストも掲載している。
【００１２】
ＬＤＬ随伴トリグリセリドの選択的測定の結果としての診断上の意義が特によいので、ＬＤＬの可溶化における優れた選択性、およびＬＤＬ随伴トリグリセリドの測定および検出試薬への接近可能化によって特徴づけられる、ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーについて、以下により詳細に説明する。
本発明のこの好ましい態様によると、当該ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレンブロックＡと中心のポリオキシプロピレンブロックＢのトリブロックコポリマーＡ−Ｂ−Ａからなる。ＰＯＰ／ＰＯＥトリブロックポリマーＡ−Ｂ−Ａの分子量が１０００〜８０００の範囲である場合に、ＬＤＬトリグリセリドの測定において特に高い選択性が得られることが明らかになった。末端の親水性ブロック成分Ａに対する中心の疎水性ブロック成分Ｂの割合を守れば、さらに特に好ましい効果を得る。もし、トリブロックコポリマーＡ−Ｂ−Ａ全体に対するポリオキシプロピレンブロックＢの部分分子質量が、７５〜９５％、特に８５〜９５％の範囲であれば、ＬＤＬトリグリセリドの可溶化における選択性が特に好ましいことがわかった。上記条件で観察した場合には、ＬＤＬ画分における構造が不安定になるように親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）が調節され、一方、他のリポ蛋白質画分（ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ）における構造は比較的安定に保たれ、そのため、そこに含有されるトリグリセリドは測定に適用不可能か、あるいは比較的狭い範囲の測定にのみ適用できると考えられる。従って、上記知見から、ＬＤＬトリグリセリドに関する選択性は、ＰＯＰブロックＢの分子質量分率の増加に伴う疎水性に応じて増加することがわかる。
【００１３】
トリグリセリドリポ蛋白質含有サンプルとの反応用に形成された試薬におけるＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの含有量は、適切には０．００１〜１０重量％の範囲であり、好ましくは０．０１〜５重量％、特に好ましくは０．１〜１重量％である。
【００１４】
さらに、本発明の手続においては、当該リポ蛋白質含有サンプルをさらにリポ蛋白質画分の凝集剤と反応させることにより、個々のリポ蛋白質画分に関する選択性を増加させることができることを見出した。凝集剤によるこの選択性の増加は、適切に選択されたＰＯＰ／ＰＯＥ材料によってより弱く可溶化された当該リポ蛋白質画分はさらに凝集することによって安定化するという事実に基づいていると考えられる。
【００１５】
リポ蛋白質画分の適切な凝集剤の例としては、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストランサルフリックアシッドまたはその塩、ポリエチレングリコール、硫化シクロデキストリンまたはその塩、硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物が挙げられる。シクロデキストリンの例としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンが挙げられる。オリゴ糖の例としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースが挙げられる。使用されうる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。
【００１６】
好ましい凝集剤は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体である。特に、硫化α−シクロデキストリンを使用する場合には、その選択性はＬＤＬ随伴トリグリセリドに関して増加することが有利に示されている。
さらに好ましい凝集剤は、デキストランサルフリックアシッドまたはその塩デキストランサルフェートである。
また、ＬＤＬトリグリセリドに関する本発明の好ましい選択性において、硫化α−シクロデキストリンとデキストランサルフェートの組み合わせが、特に増強された作用を示すことがわかった。特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤によって特には可溶化されることはないリポ蛋白質画分の凝集の補助または安定化のために、凝集剤に加えて、２価金属イオンの塩がさらに用いられる。適切な２価金属イオンの例としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ニッケルおよびコバルトであり、マグネシウムが好ましい。
【００１７】
凝集剤または任意に用いられる２価金属イオンの塩の含有量は、個々のリポ蛋白質画分に関する所望の選択性および凝集剤の性質を考慮に入れて、それぞれの場合に適合させることができる。好ましい上限の含有量は、均質な溶液から直接にトリグリセリドを測定するのを妨げる濁りの出現、特に沈澱を防ぐことによって決定されるが、好ましい下限の含有量は、この場合には、所望の検出できる安定化効果によって決定される。
【００１８】
適切に形成された試薬中に含まれる上記成分の適切な量は、以下の範囲にある。５０００〜２０，０００の分子量を有する０．０２〜１０ｍＭのヘパリンまたはその塩、４０００〜８０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭのリンタングステン酸またはその塩、１０，０００〜５００，０００の分子量を有する０．０１〜５ｍＭのデキストランサルフリックアシッド、または１０００〜１０，０００の分子量を有する０．１〜２０ｍＭのデキストランサルフリックアシッドまたはその塩、４０００〜２５，０００の分子量を有する０．３〜１００ｍＭのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０００〜３０００の分子量を有する０．１〜５０ｍＭの硫化シクロデキストリンまたはその塩、４００〜３０００の分子量を有する０．１〜５０ｍＭの硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物。好ましくは、１４，０００〜１６，０００の分子量を有する０．０３〜１ｍＭのヘパリンまたはその塩、５０００〜７０００の分子量を有する０．１〜３ｍＭのリンタングステン酸またはその塩、１５０，０００〜２５０，０００の分子量を有する０．０１〜５ｍＭのデキストランサルフェートまたはその塩、１０００〜５０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭのデキストランサルフリックアシッドまたはその塩、５０００〜２２，０００の分子量を有する１．０〜５０ｍＭのＰＥＧ、１０００〜２０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭの硫化シクロデキストリンまたはその塩、４００〜２０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭの硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物である。
２価金属イオンの塩の濃度は、適切には０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭである。
【００１９】
本発明の手続のさらなる処置ｂ）は、トリグリセリド測定方法を実施することからなる。このために、それ自体公知の測定方法、例えば、初めに述べたリポ蛋白質トリグリセリドの従来の測定手続で用いられる測定方法を使用することができる。この場合には、従来行われてきた酵素的な測定方法を用いることにより、本発明の概念に有利な効果をもたらす。なぜならば、一方では、これに用いられる酵素は、特に不安定化されたかまたは可溶化されたリポ蛋白質画分中のトリグリセリドに到達することができ、そのため、反応する（グリセロールの形態で、トリグリセリドの酵素的開裂に主に関連する）ことができ、他方では、優先的に可溶化されないリポ蛋白質画分、および凝集剤によって任意に付加的に安定化されたリポ蛋白質画分は、そこに存在するトリグリセリドを酵素反応から守るからである。
【００２０】
当該酵素的開裂は、リパーゼまたはエステラーゼの助けをかりて、好都合に行われる。これにより遊離したグリセロールは、酵素的測光試験、特に色検出反応によって、測定し定量することができる。トリグリセリドの測定を行うための商業的に入手可能な試験の概要は、Ａ．ＢｒｕｃｋｎｅｒおよびＭ．ＭｏｒｅｔによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２１，９７−１０６頁（１９８３）に記載されている。
【００２１】
本発明によれば、酵素であるグリセロキナーゼおよびグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応によって、前述したように遊離したグリセロールを測定し、この反応により、ＮＡＤまたはＦＭＮのような還元／酸化当量体の還元された受容体が形成され、次いでその部分を検出反応によって測定することからなる測定方法は、特に感度がよいことが証明されている。
【００２２】
感度のよい検出反応として、呈色反応の実行が推奨され、当該呈色反応においては、電子カプラーによって、還元された受容体、即ち、ＮＡＤＨまたはＦＭＮＨ2 のような還元／酸化当量体によって色素が還元され、その色素の還元体を、対応する吸収波長によって、測光的に測定することができる。例えば、適切な電子カプラーとしては、酵素のジアホラーゼまたは合成フェナジンメトサルフェートである。色素の例としては、テトラゾリウムブルー、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、テトラゾリウムバイオレット、テトラゾリウムパープル、および２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）のようなテトラゾリウム塩である。これら色素を、ホルマザン形成剤と反応させることにより、適切な吸収波長で、例えばＮＢＴまたはＩＮＴの場合には５７０ｎｍで、測光的に測定され、定量されることができる色素を得る。
他の例としては、特に高感度の点から、蛍光測光的および輝度測定を含む。
【００２３】
酵素であるトリオースリン酸イソメラーゼおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いることに加えて、遊離したグリセロールとの酵素反応を含むことによって、トリグリセリド測定方法の実施に関連して、さらに感度が増加する。感度増加により、遊離したグリセロール１分子あたり、１分子だけでなく２分子の還元された還元／酸化当量体が生成される。したがって、遊離したグリセロール１分子あたり、ＮＡＤＨまたはＦＡＤＨのような還元された還元／酸化当量体２分子が得られ、その結果、検出感度も２倍となる。
【００２４】
トリグリセリド含有リポ蛋白質と特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤との反応（処置Ａ）およびトリグリセリド測定方法の実施（処置Ｂ）を同時に行うことができるということが、本発明の特に有利な点となる。これによって、従来必要であった２段階手続が、１段階手続に減らされる。さらに、労力および時間を消費する分画段階はもはや必要ではなくなり、処置ａ）によるインキュベーションおよび処置ｂ）によるトリグリセリド測定は、１バッチで同時に、あるいは少なくとも時間的に重なって行うことができる。もし、選択性を増加させるための本発明の好ましい態様に従って、リポ蛋白質の凝集剤、およびもし適切ならばさらに２価金属イオンの塩が使用されるならば、しかしながら、まず最初に、これら成分を、測定されるべきサンプルと短時間（例えば、２、３分間）インキュベートし、次いで、特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤およびトリグリセリド測定用試薬をこのバッチに加えるだけであることが好都合であると証明されている。さらに２、３分間のインキュベーション後、適切な検出、例えば上述の測光を次いで行うことができる。
【００２５】
特定のリポ蛋白質画分からトリグリセリドを選択的に接近しやすくするかあるいは遊離させるかするためのインキュベーション、および同時にまたは続いてのトリグリセリド測定方法の実施は、適切な緩衝液系で行われ、この緩衝液系は、好ましくはｐＨ範囲５〜９、特に好ましくはｐＨ範囲約６．５〜９で緩衝される。例えば、５〜５００ｍＭ濃度のグリシルグリシン緩衝液またはトリス緩衝液が適切である。ＡＴＰ（例えば０．１ｍＭ〜５０ｍＭのＡＴＰ）のようなエネルギーリッチなリン酸エステルの受容体、ＥＤＴＡ（例えば０〜５ｍＭのＥＤＴＡ）のようなカルシウムイオンキレート剤、およびＭｇＣｌ2 （例えば１ｍＭ〜５０ｍＭ）のようなマグネシウム塩が、当該酵素反応にさらに適切に用いられる。
【００２６】
本発明の手続の実用的な実施のために、一般的に血液サンプル（血清または血漿）または尿サンプルからなる、トリグリセリド随伴リポ蛋白質含有の生物学的サンプルを、上述の構成成分を含む試薬と適切に希釈して混合する。その希釈は約０．１：１００〜１０：１００の範囲、特に０．５：１００〜２：１００の範囲である。凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンを好ましく使用した場合には、まず最初に、これら構成成分を含有する試薬を用いて上述したような方法で希釈混合物を準備し、短時間インキュベートし、その後、当該試薬を処置ａ）およびｂ）で記載された試剤に加える。
【００２７】
さらに、本発明は、本発明の手続を実施するのに特に適切である診断用製品を入手可能にした。この診断用製品は、この中の少なくともひとつの試薬において、構成成分ａ）（手続処置ａ）に対応）として上述した特別な界面活性剤と、構成成分ｂ）（手続処置ｂ）に対応）として上述したトリグリセリド測定用剤を含有する。構成成分ａ）および構成成分ｂ）の記載に関しては、対応の手続処置の上記記載を参照することができる。
【００２８】
界面活性剤とのインキュベーションおよびトリグリセリド測定のためのインキュベーションを有利な方法で同時に行うために、当該診断用製品は好ましくはキットとしてデザインされ、この場合には、構成成分ａ）およびｂ）は、当該診断キットの１つまたは２つの試薬に組み合わされる。
【００２９】
当該診断用製品の好ましい態様においては、さらにこれは、さらなる構成成分として、リポ蛋白質画分の凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンの塩を含む。上記記載において、この点についても言及されている。凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンの塩は、上述の構成成分ａ）およびｂ）からなる試薬とは異なる、診断キットの試薬中に好ましく含有される。これにより、特別な界面活性剤との反応および任意に同時に行われるトリグリセリド測定の前に、安定化凝集剤と、測定されるべきサンプルの上述の有利で好ましいインキュベーションが可能となる。
【００３０】
本発明は、均質な液体相におけるリポ蛋白質画分に関する高い選択性によって特徴づけられる。これは、特に、上記条件下でのＬＤＬトリグリセリドの選択的測定にあてはまる。
従来の測定手続と比較して、本発明の手段により得られた結果は、先行技術の結果ととてもよく相互に関連があることがわかった。しかし、本発明によれば、検査されるべきサンプルが少量でも十分であり、特定のリポ蛋白質随伴トリグリセリドはわずか２、３分間という短時間で測定できる。さらに当該測定は、均質相から直接行われるので、複雑な分画段階を含む２段階工程はもはや必要ではなくなる。
【００３１】
そのため、本発明は、簡単で信頼できるルーチンな診断用に極めて適しており、自動化することができる。それ自身が示唆する診断的可能性は、まず第１に、血管系疾患の危険性の体外診断または測定のために、本発明の手続または診断用製品を使用することである。
【００３２】
これに関連して、冠動脈性心疾患さらには糖尿病のマクロ−およびミクロ血管障害の普遍的な危険指標としての、および異常な組成物（フレドリクソンによるIII 型高脂血症）のＬＤＬ用指標としてのＬＤＬトリグリセリドの測定について、特に説明することができる。
【００３３】
以下の実施例によって、本発明をより詳細に以下に説明する。
【００３４】
実施例１
ＬＤＬトリグリセリドの選択的な測定のために、以下の成分を有する試薬をまず最初に形成した。
ＰＯＰ／ＰＯＥトリブロックコポリマー、分子量４５００、ＰＯＰ／ＰＯＥ割合９０重量％：０．１重量％
リパーゼ：１０ｋＵ／ｌ
グリセロキナーゼ：４．８ｋＵ／ｌ
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ：４８ｋＵ／ｌ
トリオースリン酸イソメラーゼ：３００ｋＵ／ｌ
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ：２４ｋＵ／ｌ
ジアホラーゼ：４．８ｋＵ／ｌ
ＡＴＰ：５ｍＭ
ＮＡＤ：５ｍＭ
ＥＤＴＡ：０．５ｍＭ
４−ＮＢＴ：３ｍＭ
グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．５）：０．２Ｍ、１００重量％になるまで
当該試薬４００μｌに血清サンプル４μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした。この時までに形成された色素を５７０ｎｍで測光した。
定量のために、標準化測定をさらに行った。このために、超遠心分離によって単離された既知量のＬＤＬトリグリセリドを最初に加え（５ｇ／ｌ）、次いで決められた希釈系列で、等張の生理的食塩水（０．９重量％）で１：１０に希釈した。それぞれの希釈液を、上述の手続と同様にして測定した。調製された希釈系列の範囲内で線形標準曲線が求められた。
さらに、血清サンプルからのＬＤＬトリグリセリドの特別な定量のために、商業的に得られる血清トリグリセリド試験を用いて、総トリグリセリドを測定した。超遠心分離および沈澱技術のような従来の２段階測定手続と比較して、適切に対応した値が、本発明の手続によって得られた。
【００３５】
実施例２
ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの代わりに、ブロックコポリマー全体に対して７０重量％のＰＯＰブロックの部分分子質量を有するものを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
特定のＬＤＬ種に関するトリグリセリド測定の反応性は、明らかに実施例１とちょうど同じ程度に良好であったが、たとえわずかであっても、他種のリポ蛋白質に対する反応性が観察されるべきであったということが、得られた結果からわかった。結局、ＬＤＬトリグリセリド測定における選択性はまだ実用的に満足のいくものであったが、実施例１よりもいくらか乏しかった。
【００３６】
実施例３
以下の成分を有する第１の試薬をまず最初に形成した。
硫化α−シクロデキストリン：０．５ｍＭ
デキストランサルフェート（分子量２００，０００）：１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ：２．５ｍＭ
グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）：０．２Ｍ、１００重量％になるまで
特定のＬＤＬトリグリセリドの測定を行うために、当該試薬３００μｌに血清サンプル４μｌを加え、この混合物を３７℃で５分間インキュベートした。緩衝液を除いた試薬成分の濃度が４倍高い以外は、実施例１で用いられたのと同様の試薬１００μｌを加え、この混合物を再び５分間インキュベートした。ＬＤＬトリグリセリドの測定、標準曲線との比較、および総血清トリグリセリドの測定は、実施例１で記載されたのと同じ方法で行った。
得られた結果は、従来の２段階トリグリセリド測定手続の結果によりよく一致し、このようにＬＤＬトリグリセリド測定のよりよい選択性を示した。
本発明は、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続および診断用製品に関する。
【０００２】
冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）は、西洋産業国において、いまだに主な死亡原因である。冠動脈性心疾患の危険因子としてのコレステロールの重要性は一般的に認識されているが、蛋白質随伴トリグリセリドの評価、特に血清中に含まれるリポ蛋白質の評価も、この関連において考慮されている。
【０００３】
一般に、密度の違いに基づいて、超低密度のリポ蛋白質（「超低密度リポ蛋白質」、以下ＶＬＤＬと略す）、低密度のリポ蛋白質（「低密度リポ蛋白質」、ＬＤＬ）、および高密度のリポ蛋白質（「高密度リポ蛋白質」、ＨＤＬ）への、リポ蛋白質画分の分割が行われる。
さらなる特定のリポ蛋白質の種類は、キロミクロン（ＣＭ）のリポ蛋白質である。
当該リポ蛋白質は、さらに副画分に分割することができる。これらの中でも、特に「中密度蛋白質」（ＩＤＬ）および「スモールデンスＬＤＬ」が、ＣＨＤの形成に非常に重要である。上記のＬＤＬの２つの副画分には特にトリグリセリドが豊富であり、そのため、当該ＬＤＬトリグリセリドは、ＣＨＤの危険性に関して、確立したＬＤＬコレステロールよりも、より意味のあるものである。
【０００４】
冠動脈性心疾患、末梢動脈閉塞性疾患、およびミクロ−またはマクロ血管障害性変化のような血管系疾患の診断のために、個々のリポ蛋白質画分のトリグリセリド含有量と当該リポ蛋白質画分に含有される相対的な量は、相互に重要である。特に、ＬＤＬ画分において、高含有量のトリグリセリドは冠動脈性心疾患と関連していると考えられている。
【０００５】
リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの従来の測定手続は、本質的に２段階工程に基づく。
分画段階は、まず最初に、それぞれのリポ蛋白質画分をできるだけ明確に分離するために行われる。次いで、上記のようにして分離されたリポ蛋白質画分中のトリグリセリドの測定段階が行われる。
別の方法もこの分画段階では用いることができる。
沈澱方法は、主に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のトリグリセリド含有量の測定のためにデザインされている。ＬＤＬトリグリセリドの選択的な沈澱が明らかに試みられている。しかし、ＬＤＬ画分と一緒にかなりの量のＶＬＤＬも沈澱するので、この純粋な沈澱方法は不適当であることが証明され、そのため、それぞれのリポ蛋白質中のトリグリセリド含有量の識別は可能であるが、困難である（Ｒ．Ｓｉｅｋｍｅｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１７７，２３１頁（１９８８）、Ｒ．Ｓｉｅｋｍｅｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６，２１０９−２１１３頁（１９９０）、およびＭ．Ｎａｕｃｋら，Ｋｌｉｎ．Ｌａｂ．４０，１６７−１７６頁（１９９４））。
そのため、ＬＤＬトリグリセリドは、実際には密度に基づいた逐次超遠心分離によって測定され、この超遠心分離においては、ＬＤＬ画分を得るのに要した時間は４８時間に達し、または超遠心分離と沈澱を組み合わせて行って時間を短縮した。
すぐ上で述べた相対的に選択的な分離において、ＶＬＤＬ画分は、超遠心分離（約２４時間）を用いて最初に分離され、次いで、残りのＬＤＬ画分は適切な試剤によって、ほぼ選択的に沈澱される（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ＤＨＥＷ Ｎｏ．（ＮＩＨ）７５−６２８ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； ＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ，１−７４頁（１９７９））。
この後、ＬＤＬトリグリセリド含有量が、ＬＤＬ沈澱の前後のトリグリセリド濃度から計算により決定される。
ＤＥ１９５２０２１０Ａ１に記載されているように、適切な担体中、例えばアガロースゲル中でのリポ蛋白質の電気泳動による分離は、さらなる分画方法を示すものである。
【０００６】
当該分画段階に労力および時間がかかることが、リポ蛋白質画分中のトリグリセリドの特異的な測定のためのこれら従来手続の一般的な欠点となる。これらの従来方法はまた、殆ど自動化されることができないか、全くできない。しかし、個々のまたは異なったリポ蛋白質画分に対するトリグリセリド含有量の選択的な割り当てによってのみ、意味のある危険性の評価ができるので、このような分画段階なしでは、血管系疾患の危険因子としてのリポ蛋白質随伴トリグリセリドに基づいた診断結果を出すことは、実質的には不可能である。特に、もしＬＤＬトリグリセリド濃度が冠動脈性心疾患の予防に特別に意味があるとみなされるのであれば、ＬＤＬトリグリセリドをルーチンに検出または測定することが特に好ましい。
【０００７】
そのため、本発明は、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの、簡単で素早くて信頼できる測定手続を得るという目的に基づいており、本発明においては、個々のリポ蛋白質画分に関して、特に、診断学上特に意味のあるＬＤＬトリグリセリド含有量に関して可能である程度に良好な選択性が可能となる。
【０００８】
この目的は、以下の処置を有する、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続により達成される：
ａ）トリグリセリド含有リポ蛋白質と、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーから合成された非イオン性界面活性剤との反応、および
ｂ）トリグリセリド測定方法の実施。
【０００９】
本発明のさらなる主題は、クレーム１８記載の、上述の手続を行うために特に適切な診断用製品、およびクレーム３４記載の、上述の手続または血管系障害の体外診断用の診断用製品の使用からなる。
【００１０】
本発明によれば、驚いたことには、特別な型の非イオン性界面活性剤として、ポリプロピレンオキサイド単位とポリエチレンオキサイド単位から合成されたブロックコポリマーを使用することにより、ただひとつのまたはある種類のリポ蛋白質画分に関するトリグリセリド測定の優れた選択性が得られることがわかった。ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックコポリマー（以下ＰＯＰ／ＰＯＥと略する）の使用により、ＬＤＬリポ蛋白質画分に関して、特に高い選択性が得られるので、本発明の手続は、ＬＤＬトリグリセリドの選択的測定に特に極めて適切である。ＬＤＬリポ蛋白質からのトリグリセリドの測定のこのような選択性によって、その診断は、ここで関連する分野で特に意味あるものとなる。本発明の特別な利点は、リポ蛋白質画分の識別が、均質な溶液から行われるということにある。そのため、初めに記載した従来手続では必要であった特別な分画段階は、本発明の手続ではもはや必要ではない。特に、特定のリポ蛋白質画分の分離のための沈澱段階は必要ではなく、そのため、トリグリセリドの測定は、遠心分離段階なしで行うことができる。さらに、特別な非イオン性界面活性剤を使用することにより、均質な溶液が濁るのを防ぐことができるので、選択的に可溶化されたリポ蛋白質画分から、簡単で素早い方法で、トリグリセリド含有量を測定し、定量することが可能である。これにより、本発明の手続は、容易に自動化できるシステムのようなルーチンな診断へ特に簡単に適用可能となる。
【００１１】
これらの有利な作用の基礎としては、非イオン性界面活性剤としてＰＯＰ−ＰＯＥを使用することにより、特定のリポ蛋白質画分の選択的可溶化が可能となり、そのため、このリポ蛋白質画分に元来伴っていたトリグリセリドは、トリグリセリドの測定および検出試薬に対して接近しやすくまた反応しやすくなり、一方、他のリポ蛋白質画分はより弱く可溶化されるか全く可溶化されず、従ってそこに含有されるトリグリセリドは測定および定量するために接近しにくいということが推測される。個々のリポ蛋白質画分に関する選択性は、ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの組成物により、所望に応じて調節することができる。この型のブロックコポリマーが、エチレンオキサイド単位を有する相対的に親水性であるブロックＡと、プロピレンオキサイドモノマーを有する相対的に疎水性であるブロックＢから合成されることをもし考慮するならば、それぞれのブロック単位ＡまたはＢにおいても、これら単位の互いに対する割合においても、当該ブロック単位を変化させることによって、特別なブロックコポリマーを形成することができ、次いで、これにより、特定のリポ蛋白質または２種のリポ蛋白質のグループの可溶化のための好ましい選択性を得る。ここで影響を及ぼす適切なパラメーターは、重合度、または個々のブロック単位ＡまたはＢにおける重合長さ、および全コポリマーに対するブロック単位の配列および割合である。プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーの一般的な概要から、個々のリポ蛋白質画分の可溶化に適切な物質を選択できるが、この概要は、Ｉ．Ｒ．ＳｃｈｍｏｌｋａによるＪ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５４，１１０頁（１９７７）、Ｍ．Ａ．ＰｌａｎｔによるＲ．Ｄ．Ｋａｒｓａ（Ｅｄ．）：“Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｏｎｄｏｎ，３１８−３３２頁（１９８６）およびＫ．Ｋｏｓｓｗｉｇによる“Ｕｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｖｏｌ．Ａ２５，７４７−８１７頁，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”，特にＣｈａｐｔｅｒ１０．１（１９９４）の文献を検討した結果得られる。ここで、最後に挙げた文献は可能な製造業者のリストも掲載している。
【００１２】
ＬＤＬ随伴トリグリセリドの選択的測定の結果としての診断上の意義が特によいので、ＬＤＬの可溶化における優れた選択性、およびＬＤＬ随伴トリグリセリドの測定および検出試薬への接近可能化によって特徴づけられる、ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーについて、以下により詳細に説明する。
本発明のこの好ましい態様によると、当該ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレンブロックＡと中心のポリオキシプロピレンブロックＢのトリブロックコポリマーＡ−Ｂ−Ａからなる。ＰＯＰ／ＰＯＥトリブロックポリマーＡ−Ｂ−Ａの分子量が１０００〜８０００の範囲である場合に、ＬＤＬトリグリセリドの測定において特に高い選択性が得られることが明らかになった。末端の親水性ブロック成分Ａに対する中心の疎水性ブロック成分Ｂの割合を守れば、さらに特に好ましい効果を得る。もし、トリブロックコポリマーＡ−Ｂ−Ａ全体に対するポリオキシプロピレンブロックＢの部分分子質量が、７５〜９５％、特に８５〜９５％の範囲であれば、ＬＤＬトリグリセリドの可溶化における選択性が特に好ましいことがわかった。上記条件で観察した場合には、ＬＤＬ画分における構造が不安定になるように親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）が調節され、一方、他のリポ蛋白質画分（ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ）における構造は比較的安定に保たれ、そのため、そこに含有されるトリグリセリドは測定に適用不可能か、あるいは比較的狭い範囲の測定にのみ適用できると考えられる。従って、上記知見から、ＬＤＬトリグリセリドに関する選択性は、ＰＯＰブロックＢの分子質量分率の増加に伴う疎水性に応じて増加することがわかる。
【００１３】
トリグリセリドリポ蛋白質含有サンプルとの反応用に形成された試薬におけるＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの含有量は、適切には０．００１〜１０重量％の範囲であり、好ましくは０．０１〜５重量％、特に好ましくは０．１〜１重量％である。
【００１４】
さらに、本発明の手続においては、当該リポ蛋白質含有サンプルをさらにリポ蛋白質画分の凝集剤と反応させることにより、個々のリポ蛋白質画分に関する選択性を増加させることができることを見出した。凝集剤によるこの選択性の増加は、適切に選択されたＰＯＰ／ＰＯＥ材料によってより弱く可溶化された当該リポ蛋白質画分はさらに凝集することによって安定化するという事実に基づいていると考えられる。
【００１５】
リポ蛋白質画分の適切な凝集剤の例としては、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストランサルフリックアシッドまたはその塩、ポリエチレングリコール、硫化シクロデキストリンまたはその塩、硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物が挙げられる。シクロデキストリンの例としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンが挙げられる。オリゴ糖の例としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースが挙げられる。使用されうる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。
【００１６】
好ましい凝集剤は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体である。特に、硫化α−シクロデキストリンを使用する場合には、その選択性はＬＤＬ随伴トリグリセリドに関して増加することが有利に示されている。
さらに好ましい凝集剤は、デキストランサルフリックアシッドまたはその塩デキストランサルフェートである。
また、ＬＤＬトリグリセリドに関する本発明の好ましい選択性において、硫化α−シクロデキストリンとデキストランサルフェートの組み合わせが、特に増強された作用を示すことがわかった。特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤によって特には可溶化されることはないリポ蛋白質画分の凝集の補助または安定化のために、凝集剤に加えて、２価金属イオンの塩がさらに用いられる。適切な２価金属イオンの例としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ニッケルおよびコバルトであり、マグネシウムが好ましい。
【００１７】
凝集剤または任意に用いられる２価金属イオンの塩の含有量は、個々のリポ蛋白質画分に関する所望の選択性および凝集剤の性質を考慮に入れて、それぞれの場合に適合させることができる。好ましい上限の含有量は、均質な溶液から直接にトリグリセリドを測定するのを妨げる濁りの出現、特に沈澱を防ぐことによって決定されるが、好ましい下限の含有量は、この場合には、所望の検出できる安定化効果によって決定される。
【００１８】
適切に形成された試薬中に含まれる上記成分の適切な量は、以下の範囲にある。５０００〜２０，０００の分子量を有する０．０２〜１０ｍＭのヘパリンまたはその塩、４０００〜８０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭのリンタングステン酸またはその塩、１０，０００〜５００，０００の分子量を有する０．０１〜５ｍＭのデキストランサルフリックアシッド、または１０００〜１０，０００の分子量を有する０．１〜２０ｍＭのデキストランサルフリックアシッドまたはその塩、４０００〜２５，０００の分子量を有する０．３〜１００ｍＭのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０００〜３０００の分子量を有する０．１〜５０ｍＭの硫化シクロデキストリンまたはその塩、４００〜３０００の分子量を有する０．１〜５０ｍＭの硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物。好ましくは、１４，０００〜１６，０００の分子量を有する０．０３〜１ｍＭのヘパリンまたはその塩、５０００〜７０００の分子量を有する０．１〜３ｍＭのリンタングステン酸またはその塩、１５０，０００〜２５０，０００の分子量を有する０．０１〜５ｍＭのデキストランサルフェートまたはその塩、１０００〜５０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭのデキストランサルフリックアシッドまたはその塩、５０００〜２２，０００の分子量を有する１．０〜５０ｍＭのＰＥＧ、１０００〜２０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭの硫化シクロデキストリンまたはその塩、４００〜２０００の分子量を有する０．１〜１０ｍＭの硫化オリゴ糖またはその塩、およびそれらの混合物である。
２価金属イオンの塩の濃度は、適切には０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭである。
【００１９】
本発明の手続のさらなる処置ｂ）は、トリグリセリド測定方法を実施することからなる。このために、それ自体公知の測定方法、例えば、初めに述べたリポ蛋白質トリグリセリドの従来の測定手続で用いられる測定方法を使用することができる。この場合には、従来行われてきた酵素的な測定方法を用いることにより、本発明の概念に有利な効果をもたらす。なぜならば、一方では、これに用いられる酵素は、特に不安定化されたかまたは可溶化されたリポ蛋白質画分中のトリグリセリドに到達することができ、そのため、反応する（グリセロールの形態で、トリグリセリドの酵素的開裂に主に関連する）ことができ、他方では、優先的に可溶化されないリポ蛋白質画分、および凝集剤によって任意に付加的に安定化されたリポ蛋白質画分は、そこに存在するトリグリセリドを酵素反応から守るからである。
【００２０】
当該酵素的開裂は、リパーゼまたはエステラーゼの助けをかりて、好都合に行われる。これにより遊離したグリセロールは、酵素的測光試験、特に色検出反応によって、測定し定量することができる。トリグリセリドの測定を行うための商業的に入手可能な試験の概要は、Ａ．ＢｒｕｃｋｎｅｒおよびＭ．ＭｏｒｅｔによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２１，９７−１０６頁（１９８３）に記載されている。
【００２１】
本発明によれば、酵素であるグリセロキナーゼおよびグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応によって、前述したように遊離したグリセロールを測定し、この反応により、ＮＡＤまたはＦＭＮのような還元／酸化当量体の還元された受容体が形成され、次いでその部分を検出反応によって測定することからなる測定方法は、特に感度がよいことが証明されている。
【００２２】
感度のよい検出反応として、呈色反応の実行が推奨され、当該呈色反応においては、電子カプラーによって、還元された受容体、即ち、ＮＡＤＨまたはＦＭＮＨ2 のような還元／酸化当量体によって色素が還元され、その色素の還元体を、対応する吸収波長によって、測光的に測定することができる。例えば、適切な電子カプラーとしては、酵素のジアホラーゼまたは合成フェナジンメトサルフェートである。色素の例としては、テトラゾリウムブルー、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、テトラゾリウムバイオレット、テトラゾリウムパープル、および２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）のようなテトラゾリウム塩である。これら色素を、ホルマザン形成剤と反応させることにより、適切な吸収波長で、例えばＮＢＴまたはＩＮＴの場合には５７０ｎｍで、測光的に測定され、定量されることができる色素を得る。
他の例としては、特に高感度の点から、蛍光測光的および輝度測定を含む。
【００２３】
酵素であるトリオースリン酸イソメラーゼおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いることに加えて、遊離したグリセロールとの酵素反応を含むことによって、トリグリセリド測定方法の実施に関連して、さらに感度が増加する。感度増加により、遊離したグリセロール１分子あたり、１分子だけでなく２分子の還元された還元／酸化当量体が生成される。したがって、遊離したグリセロール１分子あたり、ＮＡＤＨまたはＦＡＤＨのような還元された還元／酸化当量体２分子が得られ、その結果、検出感度も２倍となる。
【００２４】
トリグリセリド含有リポ蛋白質と特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤との反応（処置Ａ）およびトリグリセリド測定方法の実施（処置Ｂ）を同時に行うことができるということが、本発明の特に有利な点となる。これによって、従来必要であった２段階手続が、１段階手続に減らされる。さらに、労力および時間を消費する分画段階はもはや必要ではなくなり、処置ａ）によるインキュベーションおよび処置ｂ）によるトリグリセリド測定は、１バッチで同時に、あるいは少なくとも時間的に重なって行うことができる。もし、選択性を増加させるための本発明の好ましい態様に従って、リポ蛋白質の凝集剤、およびもし適切ならばさらに２価金属イオンの塩が使用されるならば、しかしながら、まず最初に、これら成分を、測定されるべきサンプルと短時間（例えば、２、３分間）インキュベートし、次いで、特別なＰＯＰ／ＰＯＥ界面活性剤およびトリグリセリド測定用試薬をこのバッチに加えるだけであることが好都合であると証明されている。さらに２、３分間のインキュベーション後、適切な検出、例えば上述の測光を次いで行うことができる。
【００２５】
特定のリポ蛋白質画分からトリグリセリドを選択的に接近しやすくするかあるいは遊離させるかするためのインキュベーション、および同時にまたは続いてのトリグリセリド測定方法の実施は、適切な緩衝液系で行われ、この緩衝液系は、好ましくはｐＨ範囲５〜９、特に好ましくはｐＨ範囲約６．５〜９で緩衝される。例えば、５〜５００ｍＭ濃度のグリシルグリシン緩衝液またはトリス緩衝液が適切である。ＡＴＰ（例えば０．１ｍＭ〜５０ｍＭのＡＴＰ）のようなエネルギーリッチなリン酸エステルの受容体、ＥＤＴＡ（例えば０〜５ｍＭのＥＤＴＡ）のようなカルシウムイオンキレート剤、およびＭｇＣｌ2 （例えば１ｍＭ〜５０ｍＭ）のようなマグネシウム塩が、当該酵素反応にさらに適切に用いられる。
【００２６】
本発明の手続の実用的な実施のために、一般的に血液サンプル（血清または血漿）または尿サンプルからなる、トリグリセリド随伴リポ蛋白質含有の生物学的サンプルを、上述の構成成分を含む試薬と適切に希釈して混合する。その希釈は約０．１：１００〜１０：１００の範囲、特に０．５：１００〜２：１００の範囲である。凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンを好ましく使用した場合には、まず最初に、これら構成成分を含有する試薬を用いて上述したような方法で希釈混合物を準備し、短時間インキュベートし、その後、当該試薬を処置ａ）およびｂ）で記載された試剤に加える。
【００２７】
さらに、本発明は、本発明の手続を実施するのに特に適切である診断用製品を入手可能にした。この診断用製品は、この中の少なくともひとつの試薬において、構成成分ａ）（手続処置ａ）に対応）として上述した特別な界面活性剤と、構成成分ｂ）（手続処置ｂ）に対応）として上述したトリグリセリド測定用剤を含有する。構成成分ａ）および構成成分ｂ）の記載に関しては、対応の手続処置の上記記載を参照することができる。
【００２８】
界面活性剤とのインキュベーションおよびトリグリセリド測定のためのインキュベーションを有利な方法で同時に行うために、当該診断用製品は好ましくはキットとしてデザインされ、この場合には、構成成分ａ）およびｂ）は、当該診断キットの１つまたは２つの試薬に組み合わされる。
【００２９】
当該診断用製品の好ましい態様においては、さらにこれは、さらなる構成成分として、リポ蛋白質画分の凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンの塩を含む。上記記載において、この点についても言及されている。凝集剤、およびもし適切ならば２価金属イオンの塩は、上述の構成成分ａ）およびｂ）からなる試薬とは異なる、診断キットの試薬中に好ましく含有される。これにより、特別な界面活性剤との反応および任意に同時に行われるトリグリセリド測定の前に、安定化凝集剤と、測定されるべきサンプルの上述の有利で好ましいインキュベーションが可能となる。
【００３０】
本発明は、均質な液体相におけるリポ蛋白質画分に関する高い選択性によって特徴づけられる。これは、特に、上記条件下でのＬＤＬトリグリセリドの選択的測定にあてはまる。
従来の測定手続と比較して、本発明の手段により得られた結果は、先行技術の結果ととてもよく相互に関連があることがわかった。しかし、本発明によれば、検査されるべきサンプルが少量でも十分であり、特定のリポ蛋白質随伴トリグリセリドはわずか２、３分間という短時間で測定できる。さらに当該測定は、均質相から直接行われるので、複雑な分画段階を含む２段階工程はもはや必要ではなくなる。
【００３１】
そのため、本発明は、簡単で信頼できるルーチンな診断用に極めて適しており、自動化することができる。それ自身が示唆する診断的可能性は、まず第１に、血管系疾患の危険性の体外診断または測定のために、本発明の手続または診断用製品を使用することである。
【００３２】
これに関連して、冠動脈性心疾患さらには糖尿病のマクロ−およびミクロ血管障害の普遍的な危険指標としての、および異常な組成物（フレドリクソンによるIII 型高脂血症）のＬＤＬ用指標としてのＬＤＬトリグリセリドの測定について、特に説明することができる。
【００３３】
以下の実施例によって、本発明をより詳細に以下に説明する。
【００３４】
実施例１
ＬＤＬトリグリセリドの選択的な測定のために、以下の成分を有する試薬をまず最初に形成した。
ＰＯＰ／ＰＯＥトリブロックコポリマー、分子量４５００、ＰＯＰ／ＰＯＥ割合９０重量％：０．１重量％
リパーゼ：１０ｋＵ／ｌ
グリセロキナーゼ：４．８ｋＵ／ｌ
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ：４８ｋＵ／ｌ
トリオースリン酸イソメラーゼ：３００ｋＵ／ｌ
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ：２４ｋＵ／ｌ
ジアホラーゼ：４．８ｋＵ／ｌ
ＡＴＰ：５ｍＭ
ＮＡＤ：５ｍＭ
ＥＤＴＡ：０．５ｍＭ
４−ＮＢＴ：３ｍＭ
グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．５）：０．２Ｍ、１００重量％になるまで
当該試薬４００μｌに血清サンプル４μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした。この時までに形成された色素を５７０ｎｍで測光した。
定量のために、標準化測定をさらに行った。このために、超遠心分離によって単離された既知量のＬＤＬトリグリセリドを最初に加え（５ｇ／ｌ）、次いで決められた希釈系列で、等張の生理的食塩水（０．９重量％）で１：１０に希釈した。それぞれの希釈液を、上述の手続と同様にして測定した。調製された希釈系列の範囲内で線形標準曲線が求められた。
さらに、血清サンプルからのＬＤＬトリグリセリドの特別な定量のために、商業的に得られる血清トリグリセリド試験を用いて、総トリグリセリドを測定した。超遠心分離および沈澱技術のような従来の２段階測定手続と比較して、適切に対応した値が、本発明の手続によって得られた。
【００３５】
実施例２
ＰＯＰ／ＰＯＥブロックコポリマーの代わりに、ブロックコポリマー全体に対して７０重量％のＰＯＰブロックの部分分子質量を有するものを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
特定のＬＤＬ種に関するトリグリセリド測定の反応性は、明らかに実施例１とちょうど同じ程度に良好であったが、たとえわずかであっても、他種のリポ蛋白質に対する反応性が観察されるべきであったということが、得られた結果からわかった。結局、ＬＤＬトリグリセリド測定における選択性はまだ実用的に満足のいくものであったが、実施例１よりもいくらか乏しかった。
【００３６】
実施例３
以下の成分を有する第１の試薬をまず最初に形成した。
硫化α−シクロデキストリン：０．５ｍＭ
デキストランサルフェート（分子量２００，０００）：１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ：２．５ｍＭ
グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）：０．２Ｍ、１００重量％になるまで
特定のＬＤＬトリグリセリドの測定を行うために、当該試薬３００μｌに血清サンプル４μｌを加え、この混合物を３７℃で５分間インキュベートした。緩衝液を除いた試薬成分の濃度が４倍高い以外は、実施例１で用いられたのと同様の試薬１００μｌを加え、この混合物を再び５分間インキュベートした。ＬＤＬトリグリセリドの測定、標準曲線との比較、および総血清トリグリセリドの測定は、実施例１で記載されたのと同じ方法で行った。
得られた結果は、従来の２段階トリグリセリド測定手続の結果によりよく一致し、このようにＬＤＬトリグリセリド測定のよりよい選択性を示した。
Claims (8)
- 以下の処置を有する、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための方法：
ａ）トリグリセリド含有リポ蛋白質と、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーから合成された非イオン性界面活性剤との反応、および
ｂ）トリグリセリド測定方法の実施。 - ＬＤＬトリグリセリドの選択的測定のために使用されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 均質な溶液中で行われることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
- 使用されるブロックコポリマーが、ポリオキシエチレンブロックＡと中心のポリオキシプロピレンブロックＢのＡ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマーであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかひとつに記載の方法。
- 以下の構成成分を有する、リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための診断用製品：
ａ）プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーから合成された非イオン性界面活性剤、および
ｂ）トリグリセリドの測定用剤。 - ＬＤＬトリグリセリドの選択的測定のために使用されることを特徴とする、請求項５記載の診断用製品。
- 構成成分ａ）のブロックコポリマーとして、ポリオキシエチレンブロックＡと中心のポリオキシプロピレンブロックＢのＡ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマーを含むことを特徴とする、請求項５または６記載の診断用製品。
- 体外診断または血管系疾患の危険性の測定のための、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の方法または請求項５〜７のいずれかひとつに記載の診断用製品の使用。
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