PT753583E - Metodo para analise quantitativa do colesterol - Google Patents

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Description

DESCRICÀO "Método para análise quantitativa do colesterol"
Campo Técnico 0 presente invento refere-se a um método para medição do colesterol em lipoproteínas de alta densidade, eliminando a necessidade de pré-tratamentos, tal como separação por centrifugação, e proporcionando eficazmente um método analítico simples ao mesmo tempo que requerendo apenas pequenas quantidades de uma amostra.
Arte Anterior
Os lípidos séricos tais como o colesterol encontram-se ligados a apoproteínas e formam lipoproteínas. As lipoproteínas são classificadas em quilomicra, lipoproteínas de muito baixa densidade, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), e lipoproteínas de alta densidade (HDL), com base em diferenças nas propriedades físicas. De entre estas lipoproteínas, as LDL são reconhecidas como sendo aterogénicas, e as HDL são reconhecidas como apresentando acção anti-aterogénica.
Como foi provado cpidcmiologicamente que o nível de colesterol nas HDL se correlaciona inversamente com a frequência do início de doenças arterioscleróticas, a medição do colesterol nas HDL é hoje em dia bastante comum com o objectivo de prever e diagnosticar doenças isquémicas. São conhecidos diversos métodos para medir o colesterol nas HDL. Num método, por exemplo, o colesterol é medido após separação das HDL das outras lipoproteínas utilizando uma ultracentrifugação. Num outro método, os lípidos são corados depois de serem isolados por electroforese, e é medida a intensidade do desenvolvimento da cor. No entanto, todos estes métodos envolvem problemas tais como procedimentos complexos, incapacidade para lidar com muitas amostras, etc., e por conseguinte, não têm sido utilizados rotineiramente em laboratórios clínicos. O método mais amplamente utilizado para medição do colesterol nas HDL em laboratórios clínicos é um método por precipitação. Neste método, é adicionado um precipitante a uma amostra a fim de agregar as lipoproteínas
85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 2 outras que não as HDL, as lipoproteínas agregadas são precipitadas por centrifugação, e é medido o colesterol presente num sobrenadante contendo apenas HDL.
Embora este método seja mais simples Ho que a ultracentrifugação ou a electroforese, nem todos os passos analíticos podem ser completamente automatizados. Isto porque este envolve uma operação de separação utilizando uma centrifugação. Os processos manuais para obtenção de um sobrenadante contendo apenas HDL neste método aumentam o risco de ocasionar um erro analítico e exigem uma quantidade relativamente maior de amostra quando comparados com outros testes clínicos automatizados.
Por outro lado, estão a ser estudados métodos que utilizam enzimas a fim de determinar fraccionadamente o colesterol nas HDL. Por exemplo, é conhecido um método no qual a reacção enzimática é levada a cabo na presença de um sal de ácido biliar ou de um tensioactivo não iónico (Pedido de Patente Japonesa Disponível ao Público (kokai) N°. 63-126 498). Este método baseia-se na verificação de que a velocidade da reacção enzimática na etapa inicial da reacção se encontra em proporção com a concentração em LDL, e consequentemente, com a concentração de colesterol nas HDL. Este método não pode ser citado como sendo preciso, dado que a reacção enzimática com o colesterol nas HDL não pode ser completamente separada da reacção com outras lipoproteínas. Por outras palavras, o colesterol submetido à reacção enzimática transfere-se de colesterol nas LDL para aquele nas HDL, não de uma forma escalonada mas de uma forma gradual envolvendo sobreposição parcial.
De acordo com outro método conhecido, as lipoproteínas outras que não as HDL são agregadas antecipadamente, e apenas o colesterol nas HDL reage enzimaticamente. Depois disso, as enzimas são inactivadas, e a lipoproteína agregada é simultaneamente redissolvida a fim de medir a absorção (Pedido de Patente Japonesa Disponível ao Público (kokai) N°. 6-242 110). Este método requer a adição de reagente pelo menos três vezes. Por conseguinte, apenas pode ser aplicado a auto-analisadores limitados, originando uma desvantagem no que se refere à gama de utilizações. Além disso, ao redissolver a precipitação, é necessária a utilização de um sal em concentração elevada. Assim, este método não é satisfatório, não só do ponto de vista da deterioração
85 030 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 3 do aparelho analítico, mas também da dificuldade na eliminação do reagente residual.
Em US-A-4215993 é descrita a utilização de um tensioactivo não iónico incluindo polioxietileno num mótodo para isolamento dc lipoproteína3 de alta densidade a partir de lipoproteínas de baixa densidade para a determinação do colesterol. Este documento não descreve um método no qual sejam adicionados tensioactivos antes da adição de enzimas.
Em EP-A-0265933 descreve-se um precipitante para a separação de HDL das LDL, mas há omissão sobre o tensioactivo que não dissolve as lipoproteínas tal como descrito no presente invento.
Consequentemente, um objecto do presente invento é proporcionar um método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade, que elimina a necessidade de pré-tratamentos tais como a separação por centrifugação, que proporcione eficazmente uma medição simples, e que pode ser aplicado a uma diversidade de analisadores automatizados.
Nas circunstâncias anteriormente mencionadas, os presentes inventores conduziram estudos cuidadosos, e verificaram que o colesterol nas HDL pode ser quantitativamente determinado de forma eficiente utilizando analisadores automatizados se uma amostra á submetida a medição enzimática do colesterol depois deste ser misturado com um tensioactivo e com uma substância a qual forme um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL, conduzindo à conclusão do invento.
Descricão do Invento 0 presente invento refere-se a um método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade, caracterizado por a medição do colesterol numa amostra ser executada depois de um tensioactivo e de uma substância que forma um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL serem adicionados à amostra.
Melhor modo de levar a cabo o Invento A substância que forma um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL utilizada no presente invento pode ser qualquer substância desde que a
85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 4 sua afinidade para as HDL seja diferente daquela para lipoproteínas outras que não as HDL. Exemplos das referidas substâncias incluem poli-aniões tais como sulfato de dextrina, ácido fosfotúngstico, e heparina; iões metálicos bivalentes tais como iões de magnésio e iões de cálcio; polímeros solúveis em água tais como polietilenoglicol; θ anticorpos para lipoproteínas outras que não as HDL. Elas podem ser utilizadas isoladamente ou em combinações de duas ou mais. De entre as possibilidades, é preferida uma combinação de um poli-anião e de um ião metálico bivalente.
As quantidades destas substâncias a serem utilizadas não se encontram particularmente limitadas, e diferem dependendo dos tipos de substâncias. É suficiente que estas substâncias formem complexos em conjunto com lipoproteínas outras que não as HDL na altura da medição. Pode ou não ocorrer coagulação. Por exemplo, quando são utilizados em combinação um poli-anião e um ião metálico bivalente, é preferido que a concentração do poli-anião seja de 0,02 a 2% em peso, e que a do ião metálico bivalente seja de 10 a 500 mM, depois de serem misturados com a amostra. É particularmente preferido o caso onde a concentração de poli-anião é de 0,05 a 1 % em peso e a do ião metálico bivalente é de 20 a 200 mM. O lensioactivo utilizado no presente invento apresenta preferencialmente o efeito inibitório sobre a interacção entre as enzimas utilizadas para a detecção do colesterol e as lipoproteínas, ou noutras palavras, o tensioactivo preferencialmente não dissolve as lipoproteínas. Exemplos dos referidos tensioactivos incluem alquiléteres de polioxietileno, alquilfeniléteres de polioxietileno, produtos da condensação de polioxietileno - polioxipropileno, alquilétersulfatos de polioxietileno, e alquilbenzenossulfonatos. Exemplos preferíveis de alquiléteres de polioxietileno incluem cetiléter de polioxietileno (HLB 14) (como produtos comerciais, existem Emulgen 220 produzido por Kao Corp., elo.). Exemplos preferíveis de alquilfeniléteres de polioxietileno incluem nonilfeniléter de polioxietileno (HLB 15) (como produtos comerciais, existem Fmiilgen 913 produzido por Kao Corp., etc.). Exemplos preferíveis de produtos da condensação de polioxietileno - polioxipropileno incluem Pluronic F88 comercialmente disponível produzido por Asahi Denka K. K. Exemplos preferíveis de alquilétersulfatos de polioxietileno incluem laurilétersulfato sódico de polioxietileno (como produtos comerciais, existem Emal 20C produzido por
85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 5
Kao Corp., etc.). Exemplos preferíveis de alquilbenzenossulfonatos incluem dodecilbenzenossulfonatos de sódio.
Estes tensioactivos podem ser utilizados isoladamente ou em combinações de dois ou mais. Embora as suas quantidades não sejam particularmente limitadas, são preferencialmente utilizados em quantidades tais que a concentração depois de terem sido misturados com uma amostra seja de 0,01 a 5% em peso, em particular preferencialmente de 0,05 a 1 % em peso.
No presente invento, um tensioactivo e uma substância que forme um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL são primeiro adicionados à amostra. Os dois materiais podem ser adicionados como um reagente depois de terem sido combinados, ou podem ser adicionados como dois reagentes separados.
De seguida, a amostra à qual foram adicionados um tensioactivo e uma substância que forma um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL, é submetida a uma determinação directa do colesterol. Isto é, não é necessário qualquer pré-tratamento tal como centrifugação.
Qualquer método enzimático conhecido pode ser utilizado para medição do colesterol. Por exemplo, a colesterol-esterase e a colesterol-oxidase podem ser combinadas a utilizadas como reagentes enzimáticos. Alternativamante, podem ser combinadas a colesterol-esterase e a colesterol-desidrogenase. De entre os métodos enzimáticos, são preferidos os métodos que empregam uma combinação de colesterol-esterase e de colesterol-oxidase.
Depois da adição de uma enzima, é medida a quantidade de sinais num certo período de tempo, desse modo determinando a concentração do colesterol. A fim de aumentar a acuidade da análise, podem ser comparadas quantidades de sinal entre dois pontos fixos de tempo, após a adição da enzima (método dos 2 pontos). Para fins de calibragem, uma amostra com valor de HDL conhecido é analisada de forma semelhante. O método para determinação do colesterol na etapa final após a adição de reagente enzimático, etc., não é particularmente limitado. Por exemplo, pode ser utilizada uma análise de absorção na qual são combinados peroxidase e um
85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 6 cromogénio, bem como métodos para detecção de co-enzimas ou peróxido de hidrogénio.
Exemplos O presente invento será de seguida descrito por meio de exemplos, os quais não devem ser interpretados como limitativos do presente invento.
Exemplo 1:
Utilizando as amostras de soro Nos. 1 a 10 contendo lipoproteínas, o colesterol nas HDL foi determinado pelo presente invento e por um método de precipitação convencional, e os dados obtidos foram comparados. Os resultados encontram-se representados na Tabela 1.
Resumidamente, 4 μΙ de uma amostra foram combinados com 300 μΙ de um reagente contendo 0,2% de ácido fosfotúngstico, 100 mM de cloreto de magnésio, e 0,5% de um condensado de polioxietileno - polioxipropileno (Pluronic F-68, produzido por Asahi Denka K. K.). De seguida, foram adicionados 100 μΙ de um reagente para medição do colesterol contendo 0,2 U/ml de colesterol-esterase, 0,2 U/ml de colesterol-oxidase, 0,3 U/ml de peroxidase, 0,04% de N,N-dimetilmetatoluidina, 0,05% de 4-amino-antipirina, e 0,1% de Triton X-100. Subsequentemente, foi monitorizada a modificação na absorção a 545 nm, obtendo-se a concentração do colesterol nas HDL por comparação da modificação na absorção com aquela obtida com uma amostra possuindo um valor de HDL determinado. A operação acima foi executada utilizando um auto-analisador Hitachi modelo 7150.
Na determinação do colesterol nas HDL utilizando independentemente um método de precipitação, 0,2 ml de uma solução aquosa contendo 0,3% de sulfato de dextrano e 2% de cloreto de magnésio foram misturados com 0,2 ml de uma amostra. A mistura foi separada por centrifugação a 3 000 rpm durante 10 minutos. Foram recolhidos 50 μΙ de um sobrenadante e misturados com 3 ml de um reagente para medição do colesterol preparado tal como descrito acima, seguidos por incubação a 37°C durante 10 minutos. A absorção a 545 nm foi medida a fim de obter a concentração do colesterol nas HDL.
85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 7
Tabela 1
Amostra N°. Concentração de colesterol (mg/dl) método do invento método de precipitação 1 79 80 2 65 64 3 64 64 4 64 58 5 15 18 6 81 88 7 47 48 8 38 38 9 47 46 10 33 32 A partir dos resultados na Tabela 1, compreende-se que embora o método do presente invento seja simples, os valores obtidos foram comparáveis àqueles obtidos pelo método convencional.
Exemplo 2:
Utilizando as amostras Nos. 11 a 20 contendo lipoproteínas, foi determinado o colesterol nas HDL pelo método do presente invento e pelo método de precipitação convencional, e os dados obtidos foram comparados. Os resultados encontram-se representados na Tabela 2.
Resumidamente, 4 μΙ de uma amostra foram combinados com 300 μΙ de um reagente contendo 0,2% de ácido fosfotúngstico, 1,8 g/l de sulfato de dextrano, 100 mM de cloreto de magnésio, e 0,2% de um condensado de polioxietileno - polioxipropileno (Pluronic F-68, produzido por Asahi Denka K.K.). De seguida, foram adicionados 100 μΙ de um reagente para medição do colesterol, igual àquele utilizado no Exemplo 1. Seguidamente, foi obtida a concentração do colesterol nas HDL por um método semelhante ao do Exemplo 1.
Separadamente, foi executado um método de precipitação tal como descrito no Exemplo 1, 8 86 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ
Tabela 2
Amostra N°. Concentração de colesterol (mg/dl) método do invento método de precipitação 11 47 45 12 38 34 13 36 32 14 54 62 15 26 22 16 93 92 17 61 62 18 36 32 19 55 50 20 75 74 A partir dos resultados na Tabela 2, compreende-se que embora o método do presente invento seja simples e necessite apenas de uma pequena quantidade de amostra, os valores obtidos foram comparáveis àqueles obtidos pelo método convencionai.
Aplicabilidade Industrial
De acordo com o presente invento, o colesterol nas HDL pode ser determinado eficazmente por um método simples. Não requer quaisquer pré-tratamento3 tal como separação por centrifugação. Além disso, dado que este método proporciona uma medição específica com uma pequena quantidade de amostra e uma operação simples, pode ser adoptado numa diversidade de analisadores automatizados. Assim, o método é muito útil no âmbito dos ensaios clínicos.
Lisboa, & LI 2080
Por DAIICHI PURE CHEMICALS CO. LTD. - O AGENTE OFICIAL -

Claims (4)

  1. 85 039 ΕΡ 0 753 583/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade caracterizado por, antes da determinação do colesterol por um método enzimático, um tensioactivo que não dissolve lipoproteínas e uma substância que forma um complexo com lipoproteínas outras que não as lipoproteínas de alta densidade serem adicionados a uma amostra contendo lipoproteínas.
  2. 2. Método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade de acordo com a reivindicação 1, em que um tensioactivo e uma amostra ã qual foi adicionada uma substância que forma um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL, é directamente submetida a determinação do colesterol.
  3. 3. Método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a substância a qual forma um complexo com lipoproteínas outras que não as HDL é um poli-anião, um ião metálico bivalente, um polímero solúvel em água, ou um anticorpo para lipoproteínas outras que não as lipoproteínas de alta densidade.
  4. 4. Método para determinação quantitativa do colesterol em lipoproteínas de alta densidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o colesterol é determinado por um método no qual colesterol-esterase e colesterol-oxidase são utilizadas em combinação. Lisboa, ['Z. ?· Por DAIICHI PURE CHEMICALS CO. LTD. - O AGENTE OFICIAL -
    EMG.' ANTÓN1Ô JO· BA CUHRA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rge d»s Flores, 74-4.* 1ÊOO LIGBOA
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