WO2004035817A1 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 - Google Patents

高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 Download PDF

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WO2004035817A1
WO2004035817A1 PCT/JP2003/013259 JP0313259W WO2004035817A1 WO 2004035817 A1 WO2004035817 A1 WO 2004035817A1 JP 0313259 W JP0313259 W JP 0313259W WO 2004035817 A1 WO2004035817 A1 WO 2004035817A1
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cholesterol
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salt
bile acid
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Yuki Katayama
Mayumi Fujinaka
Satoshi Moriyama
Shigeru Murata
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein (hereinafter abbreviated as HDL) in a sample, a measuring reagent, a measuring kit, a novel bile acid derivative, and a method for producing a novel bile acid derivative About.
  • HDL high-density lipoprotein
  • Lipoproteins in the living body can be classified into high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (hereinafter abbreviated as LDL), very low density lipoprotein (hereinafter abbreviated as VLDL), chylomicron (hereinafter abbreviated) , Abbreviated as CM).
  • HDL high density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • CM chylomicron
  • HD L cholesterol Conventional methods for measuring cholesterol in HDL (hereinafter abbreviated as HD L cholesterol) consist of two steps: fractionation by ultracentrifugation, immunochemical methods, electrophoresis, precipitation, and cholesterol quantification. Become. However, the fractionation operation is complicated, takes a long time, and has a problem in terms of safety. Therefore, the measurement methods involving these separation operations were extremely inefficient and were not suitable for practical use. '
  • polyadiones such as dextran sulfate, divalent metal salts, specific nonionic surfactants and samples derived from samples.
  • a measuring method using albumin different from albumin Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-285298 is known. Serum or plasma is treated with a solution containing a lipoprotein fraction (a combination of polyadiones such as dextran sulfate and divalent cations such as magnesium ions).
  • cholesterol in lipoproteins other than HDL is preferentially converted to hydrogen peroxide by acylpolyoxyethylene sorbitan ester, and the generated hydrogen peroxide is eliminated.
  • a method for enzymatically measuring HDL cholesterol by adding polyoxyethylene alkyl ether Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-299
  • a biological sample a cholesterol monoesterase derived from a knee
  • a cholesterol monoesterase oxidase Cholesterol and bile acids such as colic acid under conditions in which albumin is present
  • Methods for measuring cholesterol International Publication No. 97/40736 pamphlet
  • the treated biological sample is contacted with cholesterol esterase derived from a microorganism, and LDL cholesterol is reacted with the enzyme (cholesterol monoolesterase and cholesterol reoxidase derived from microorganisms).
  • LDL cholesterol is reacted with the enzyme (cholesterol monoolesterase and cholesterol reoxidase derived from microorganisms).
  • a sample containing lipoprotein is reacted with an enzyme (cholesterol esterase and cholesterol oxidase) in the presence of a bile acid derivative and / or an amphoteric surfactant.
  • a non-ionic surfactant having a polyoxyethylene chain is added to the reaction solution, and HDL cholesterol and HDL cholesterol are selectively reacted.
  • No or LDL Cholesterol A method for measuring the rule (JP-A-2000-325509) is known. However, these assays may take a long time to measure and are not necessarily specific to HDL cholesterol.
  • An ester of cholic acid having an oxyethylene group in the ester portion is known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-221541), but a method for measuring HDL cholesterol using the ester is not known.
  • a method of synthesizing an ester compound generally, a method of synthesizing by a condensation reaction of a carboxylic acid and an alcohol is simple, and particularly, an azeotropic esterification method using an acid catalyst is often used.
  • compounds with bulky substituents or water-soluble groups may have lower yields (CK Ingo 1d), “Structure-and-Mechanism-in-Ogrek-Chemis” Terry Structure and Mechanism in Organic Chemistry) "(UK), 2nd edition, Bell (Be 11), 1969, Chapter 15, p. 1 128-1 178).
  • JP-A-5-221941 describes a method for synthesizing a cholate by reacting cholic acid and diethylene glycol monomethyl ether using p-toluenesulfonic acid as an acid catalyst.
  • the yield of the cholesteric acid ester is as extremely low as 23%, and the post-treatment operation is complicated and complicated.
  • An object of the present invention is to provide a method for simply and accurately measuring cholesterol in high-density lipoprotein in a sample, and a measuring reagent and a measuring kit used for the method.
  • the present invention provides the following [1 :! ⁇ [42].
  • a sample and a cholesterol ester hydrolase or cholesterol oxidase or a cholesterol ester hydrolase or an oxidized coenzyme or cholesterol dehydrogenase are combined with an aqueous solution containing a bile acid derivative.
  • a method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein which is characterized by measuring hydrogen peroxide or reduced capture enzyme produced by reacting in a medium.
  • a chemically modified cholesterol ester hydrolase is used as a group mainly composed of polyethylene glycol, a group mainly composed of polypropylene dalicol, a group having a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol,
  • the cholesterol esterase according to [3] which is a cholesterol ester hydrolase modified by a group selected from the group consisting of a group containing a water-soluble polysaccharide, a sulfopropyl group, a sulfoptyl group, a polyurethane group, and a group having a chelating function.
  • a bile acid derivative having an anionic surfactant is cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, deoxycholate or a salt thereof. Salt, chenodeoxycholic acid or a salt thereof, ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 3259
  • a bile acid derivative having an amphoteric surfactant has the general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonio group
  • R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • a bile acid derivative having a nonionic surfactant has a general formula (I
  • a reagent for measuring cholesterol in high-density lipoprotein comprising a cholesterol esterase, a cholesterol oxidase, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • Cholesterol ester hydrolase is a chemically modified cholesterol ester hydrolase [1 2] ⁇ ! : The reagent according to any one of 15).
  • Chemically modified cholesterol ester hydrolase activity s a group mainly composed of polyethylene dalicol, a group mainly composed of polypropylene dalicol, and a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol Cholesteryl ester hydrolase modified with a group selected from the group consisting of a group containing a water-soluble polysaccharide, a sulfopropyl group, a sulfobutyl group, a polyurethane group, and a group having a chelating function.
  • a bile acid derivative having an anionic surfactant is cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, dexocholic acid or a salt thereof.
  • Kenodeoxycholic acid or a salt thereof ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, and 12-oxokenodeoxycholic acid Or its salt, 7-oxodoxycholic acid or its salt, hyocholic acid or its salt, hyodeoxycholic acid or its salt, and dehydrocholic acid or its salt
  • the reagent according to [19] which is a bile acid derivative selected from the group consisting of salts.
  • a bile acid derivative having an amphoteric surfactant has the general formula (I)
  • a bile acid derivative having a nonionic surfactant has the general formula (I
  • n is a compound represented by ⁇ representing an integer of 3 to 400.
  • a first reagent containing a bile acid derivative, and a cholesterol ester A high-density lipoprotein comprising a second reagent containing a hydrolase and a cholesterol oxidase; and a hydrogen peroxide measurement reagent being contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • Cholesterol measurement kit a first reagent containing a bile acid derivative, and a cholesterol ester
  • a bile acid derivative comprising a first reagent containing a reagent for measuring hydrogen peroxide and a second reagent containing cholesterol esterase and cholesterol oxidase, wherein the bile acid derivative is either the first reagent or the second reagent
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein characterized in that it is contained in one or both.
  • a first reagent containing a cholesterol ester hydrolase and a second reagent containing a cholesterol dehydrogenase, wherein a bile acid derivative and an oxidized coenzyme are either a first reagent or a second reagent.
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein characterized in that it is contained in one or both.
  • a first reagent containing a bile acid derivative, and a second reagent containing cholesterol ester hydrolase and cholesterol dehydrogenase, wherein the oxidized capture enzyme is a first reagent and a second reagent A kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, characterized in that it is contained in one or both of them.
  • kit according to any one of [25] to [30], further comprising albumin in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • Chemically modified cholesterol ester hydrolase may be used to form a group mainly composed of polyethylene glycol, a group mainly composed of polypropylene dalicol, a group having a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol, Cholesterol ester hydrolase modified by a group selected from the group consisting of a group containing a polysaccharide, a sulfopropyl group, a sulfobutyl group, a polyurethane group, and a group having a chelating function [32] The kit according to the above.
  • Bile acid derivatives are bile acid derivatives with anionic surfactant activity [25 :! The kit according to any one of [34] to [34].
  • a bile acid derivative having an anionic surfactant is cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, dexocholic acid or a salt thereof.
  • Kenodeoxycholic acid or a salt thereof ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, and 12-oxokenodeoxycholic acid Or a bile acid derivative selected from the group consisting of a salt thereof, 7-oxodoxycholic acid or a salt thereof, hyocholic acid or a salt thereof, hyodeoxycholic acid or a salt thereof, and dehydrocholic acid or a salt thereof [ 35]
  • the kit as described above ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, and 12-oxokenodeoxycholic acid Or a bile acid derivative selected from the group consisting of a salt thereof, 7-oxodoxycholic acid or a salt thereof, hyocholic acid or a
  • the bile acid derivative is a bile acid derivative having an amphoteric surfactant action [25 :!
  • the kit according to any one of [34] to [34].
  • a bile acid derivative having an amphoteric surfactant has the general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3-cholamidopropyl) dimethylammonio group
  • R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • a bile acid derivative having a nonionic surfactant has a general formula (II)
  • n is an integer of 3 to 4 ⁇ 0 ⁇ .
  • ⁇ represents an integer of 3 to 400 ⁇ .
  • w represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkyl group, a cycloanolequinolene group, a cycloalkenoinole group, an anorecanoinole group, an annalekenol group, an alkynyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group, 11 represents an integer of 3 to 400) or a compound represented by the general formula (VII)
  • the method for measuring HDL cholesterol of the present invention is a method for measuring HDL uresterol without eliminating cholesterol in lipoproteins other than HDL.
  • Samples used in the measurement method of the present invention include, for example, whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, knee fluid and the like, and plasma and serum are preferred.
  • the cholesterol ester hydrolase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of hydrolyzing cholesterol esters.
  • cholesterol esterase derived from animals, plants or microorganisms Cholesteryl esterase, riboprotein lipase, etc., produced by engineering techniques can also be used.
  • cholesterol esterase an unmodified cholesterol esterase or a chemically modified cholesterol esterase can be used.
  • a commercially available product can be used as the cholesterol esterase.
  • cholesterol esterases include cholesterol esterase "Amano” 2 (CHE 2; manufactured by Amano Enzym), cholesterol esterase "Arnano” 3 (CHE 3; manufactured by Amano Enzym), lipoprotein lipase ( LPL 311; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), lipoprotein lipase "Amano” 6 (LPL 6; manufactured by Amano Enzym), cholesterol monoesterase [COE 3 13 (chemically modified cholesterol esterase) ' Manufactured by Toyobo Co., Ltd.].
  • two or more cholesterol esterases can be used in combination.
  • groups that modify the enzyme include, for example, a group mainly composed of polyethylene glycol, a group mainly composed of polypropylene glycol, and poly (pyrene glycol and poly).
  • a group having a copolymer of ethylene glycol and a water-soluble polysaccharide examples thereof include a contained group, a sulfopropyl group, a sulfobutyl group, a polyurethane group, and a group having a chelating function, and a group containing polyethylene glycol as a main component is preferable.
  • the water-soluble polysaccharide include dextran, pullulan, and soluble starch.
  • the reagent (chemical modifying agent) for chemically modifying cholesterol ester hydrolase includes a functional group or a structure capable of reacting with the above chemical modifying group and an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, or the like of the enzyme. And the like, which have both.
  • the functional group or structure capable of reacting with the amino group in the enzyme include a carboxyl group, an active ester group (such as N-hydroxysuccinimide group), an acid anhydride, an acid chloride, an aldehyde, an epoxide group, and the like. 1,3-propane sultone and 1,4-butane sultone.
  • Examples of the functional group or structure capable of reacting with the carboxyl group in the enzyme include an amino group.
  • Examples of the group or structure reactive with the sulfhydryl group in the enzyme include a maleimide group, dis / sulfide, and a haloester (such as thioester ester).
  • Chemical modifiers include Sunplite VFM-4101, Sunplight MEAC-5 OHS, and Sunplight MEC, which have a group containing polyethylenedaricol as the main component and an N-hydroxysuccinimide group.
  • the chemical modification of cholesterol esterase can be performed, for example, by the following method, but is not limited to this method.
  • a chemically modified cholesterol ester hydrolase not only the reaction solution itself, but also an unreacted chemical modifier removed by an ultrafiltration membrane if necessary Can also be used.
  • the concentration of cholesterol ester hydrolase used in the reaction is not particularly limited as long as the concentration of HDL cholesterol of the present invention can be measured, but the concentration of 0.01 to 20 OUZmL in the reaction solution is not limited. And more preferably 0.02 to 100 U / mL.
  • the cholesterol oxidase in the present invention is not particularly limited as long as it has an ability to oxidize cholesterol to generate hydrogen peroxide.
  • cholesterol oxidase derived from animals, plants or microorganisms it is also possible to use genetic engineering. Cholesterol oxidase "Amano" 1 (CHOD 1; manufactured by Amano Enzym), cholesterol oxidase (CO-PE; manufactured by Kikkoman), cholesterol oxidase and the like can also be used.
  • Commercially available products such as oxidase (C00321; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) can also be used.
  • two or more cholesterol oxidases can be used in combination.
  • the cholesterol oxidase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • the chemically modified cholesterol oxidase can be produced, for example, by using the above-mentioned chemical modifying agent and by the above-mentioned chemical modifying method.
  • the concentration of cholesterol oxidase used in the reaction is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured. Concentration, preferably More preferably, the concentration is from 0.02 to 10 OUZmL.
  • the cholesterol dehydrogenase in the present invention is not particularly limited as long as it has an ability to oxidize cholesterol in the presence of an oxidized coenzyme to generate a reduced coenzyme.
  • cholesterol de'hydrogenase produced by a genetic engineering technique can be used.
  • Commercial products such as cholesterol dehydrogenase "Amano" 5 (CHDH5; manufactured by Amano Enzym) can also be used.
  • two or more cholesterol dehydrogenases can be used in combination.
  • the cholesterol dehydrogenase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • a chemically modified cholesterol dehydrogenase can be produced, for example, by using the aforementioned chemical modifying agent and by the aforementioned chemical modification method.
  • the concentration of cholesterol dehydrogenase used in the reaction method is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured, but it is 0.01 to 20 OIJ / mL in the reaction solution. Preferably, the concentration is 0.02 to 10 OUZmL. .
  • an oxidized coenzyme is used.
  • the oxidized coenzyme include NAD, NADP, thio-NAD, thio NADP and the like.
  • the albumin used in the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement of the HDL cholesterol of the present invention, and examples thereof include albumin derived from pest, poma, hidge, and human. And serum albumin (BSA). Albumin produced by a genetic engineering technique can also be used. In the present invention, two or more types of albumins having different origins can be used in combination.
  • the concentration of albumin in the measurement of HD L cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as it allows the measurement of HD L cholesterol of the present invention, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 10 %, Preferably 0.0 1 to 1% 3 013259
  • the bile acid derivative in the present invention is a bile acid capable of measuring HDL cholesterol of the present invention, and is not particularly limited as long as it is a derivative, for example, a bile acid derivative having an anionic surfactant, an amphoteric surfactant And a bile acid derivative having a nonionic surfactant activity.
  • a bile acid derivative having a nonionic surface-active activity is HDL cholesterol using a cholesterol measuring enzyme such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase and cholesterol esterase. It is particularly preferable in terms of measurement accuracy or reproducibility, storage stability of a cholesterol measurement enzyme, and the like.
  • bile acid derivatives having an anionic surfactant examples include cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, deoxycholic acid or a salt thereof, and chenodero.
  • Xicholic acid or a salt thereof ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, and 12-oxokenodeoxycholic acid or a salt thereof Salts, 7-oxodoxycholic acid or a salt thereof, hyocholic acid or a salt thereof, hydrodoxycholic acid or a salt thereof, dehydrocholic acid or a salt thereof, and the like.
  • the salt include an ammonium salt, a lithium salt, a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a calcium salt and the like.
  • the concentration of the bile acid derivative having an anionic surfactant activity is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured, but the concentration in the reaction solution is 0.0001 to 0.001. It is preferably 30%, more preferably 0.01 to 3%.
  • bile acid derivatives having an amphoteric surfactant include compounds of the general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonio group
  • R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • compound Object (I) the compound (I) in which R 2 is a hydrogen atom
  • CHAP SO the compound (I) in which R 2 is a hydroxyl group
  • the concentration of the bile acid derivative having an amphoteric surfactant effect is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 30%. Preferably, it is 0.01 to 3%.
  • Bile acid derivatives having a nonionic surfactant activity include, for example, those represented by the general formula (II)
  • Alkyl groups and alkanoyl groups in the compound (II) include alkyls having a straight or branched chain having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl, ethylenol, propynol, isopropyl, butynol, isopchinolen, sec.
  • Examples of the substituent in the substituted alkyl group and the substituted alkanoyl group in the compound (II) include a hydroxyl group and a halogen atom.
  • Halogen atoms are fluorine, chlorine, bromine, and iodine atoms.
  • a compound in which R 4 is a hydrogen atom, a substituent A and a substituent A is referred to as deoxyGBIGAP, and a compound in which R 4 is a hydroxyl group, a substituent A and a substituent A is referred to as BIG CHAP.
  • bile acid derivative having a nonionic surfactant examples include, for example, a compound represented by the general formula (III)
  • Q represents an oxygen atom or NH
  • W is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, an alkanoyl group, or an alkenoyl.
  • the compound [hereinafter, referred to as compound (III)] can also be mentioned.
  • Compound (III) has, for example, the general formula
  • W ′ represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, an alkanoyl group, an alkenoyl group, an alkynyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group;
  • ⁇ represents an integer of 3 to 400
  • compound (VI) or a compound represented by the general formula (VII):
  • ⁇ represents a substituted or unsubstituted aminoalkyl group, and ⁇ represents an integer of 3 to 400
  • compound (VII) It can be produced (synthesized) by reacting in a solvent below. In this reaction, a base can be allowed to coexist as necessary.
  • X, ⁇ and ⁇ represent a hydrogen atom, a hydroxyl group or an oxo group, and it is preferable that at least one of X, ⁇ and ⁇ is a hydroxyl group.
  • X ', Y', and Z ' represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an oxo group, and a small number of X', Y ', and Z' 9
  • At least one is preferably a hydroxyl group.
  • alkyl group common to the alkyl group and the alkanol group in the compound (III) and the compound (VI) include a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and an isopropyl group.
  • the alkenyl group common to the alkenyl group and the alkenyl group in the compound (III) and the compound (VI) includes a linear or branched C 2-8 alkenyl group such as a vinyl group, a propenyl group, and an isopropyl group. And a phenyl group, an aryl group, a butenyl group, a pentenyl group, a hexenyl group, a heptenyl group and an otathenyl group.
  • alkynyl group common to the alkynyl group and alkynyl group in the compound (III) and the compound (VI) include a straight-chain or branched C 2-8 ethynyl group, a propynyl group, a propargyl group, and a butyr group. And pentenyl, hexynyl, heptul and otachel groups.
  • Examples of the cycloalkyl group in the compound (III) and the compound (VI) include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and a cyclooctyl group having 3 to 8 carbon atoms. can give.
  • Examples of the cycloalkenyl group in compound (III) and compound (VI) include those having 4 to 8 carbon atoms, for example, cyclopropenyl group, cyclobutenyl group, cyclopenteninole group, cyclohexeninole group, cyclohepteninole group, cyclooctane group. And a tur group.
  • Examples of the aryl group in the compound (III) and the compound (VI) include a carbon group having 6 to 15 carbon atoms, such as a phenyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a phenanthrinole group and a biphenyl group.
  • Examples of the substituent of the substituted aryl group in the compound (III) include an alkyl group.
  • Examples of the alkyl group include the aforementioned alkyl groups.
  • Examples of the substituted aminoalkyl group in the compound (III) and the compound (VII) include an N-monosubstituted aminoalkyl group and an N, N-disubstituted aminoalkyl group.
  • the two substituents on the nitrogen atom in the N, N-disubstituted aminoalkyl group may be the same or different.
  • Examples of the substituent on the nitrogen atom in the N-monosubstituted aminoalkyl group and the N, N-disubstituted aminoalkyl group include the aforementioned alkyl groups.
  • N-substituted aminoalkyl group examples include 2- (N-methylamino) ethyl group, 2- (N-ethylamino) ethyl group, 2- (N-propylamino) ethyl group, and 2- (N-propyl 3- (N-methylamino) propyl, 3- (N-ethylamino) propyl, 3- (N-propylamino) propyl, 3- (N-butylamino) propyl, 4- (N-propylamino) propyl, 3- (N-methylamino) propyl, 3- (N-propylamino) propyl
  • Specific examples thereof include a methylamino) butyl group, a 41- (N-ethylamino) butyl group, a 41- (N-propylamino) butyl group, and a 41- ( ⁇ -butylamino) butyl group.
  • Examples of the ⁇ , ⁇ -disubstituted aminoalkyl groups include 2- ( ⁇ , ⁇ -dimethylamino) ethyl, 3- ( ⁇ , ⁇ -dimethylamino) propyl, and 4- ( ⁇ , ⁇ -dimethylamino) butyl. Specific examples can be given.
  • Examples of the unsubstituted aminoalkyl group in the compound (III) and the compound (VII) include a 2-aminoethyl group, a 3-aminopropyl group and a 4-aminobutyl group.
  • ⁇ represents the average degree of polymerization of the oxyethylene group in the ester portion.
  • the average degree of polymerization is not particularly limited as long as it is within a range in which the measurement of HD L cholesterol of the present invention is possible, but is preferably 3 to 400, more preferably 8 to 300, and 1 5-200 is particularly preferred.
  • Compound (V) includes, for example, cholic acid, lithocholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, 7-oxolithic acid, 12-oxolithic acid, 12- Oxochenedoxycholic acid, 7-oxodoxycholic acid, hyocholic acid, hydoxycholic acid, dehydrococholic acid and the like.
  • W is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, and a substituted or unsubstituted amino group;
  • the compound (III) which is a group selected from the group consisting of alkyl groups (hereinafter referred to as compound (IIla)
  • the compound (VI) or the compound (VII) The equivalent ratio is preferably from 0.5 to 1.5 ′, and more preferably from 1 to 1.2.
  • the compound (VI) of the compound (V) is preferably 1.3 to 4.1, more preferably 1.7 to 2.2.
  • the reaction temperature for synthesizing the compound (III) is preferably from 10 to 40 ° C, more preferably from 20 to 35 ° C.
  • the reaction solvent for synthesizing the compound (III) is not particularly limited as long as it does not hinder the condensation reaction between the compound (V) and the compound (VI), and examples thereof include an organic solvent.
  • the organic solvent include aromatic hydrocarbon solvents such as toluene and xylene, aliphatic ester solvents such as ethyl acetate, and halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane, chloroform and dichloroethane. Can be
  • the condensing agent used for synthesizing the compound (III) is not particularly limited as long as it promotes a condensation reaction between the compound (V) and the compound (VI) or the compound (VII). , Pyridinium salts, (benzo) thiazolym salts, (benzo) oxazolym salts, isocyanates, carbonyl reagents, and the like, with carbodiimides being preferred.
  • Karboji Examples of imidos include 1,3-dihexyl hexyl carpimide, 1,3-di (tert-butyl) carpoxide, 1,3-diisopropylcarbodimide, and water-soluble carpoxide.
  • a water-soluble carpimide is particularly preferred.
  • the water-soluble carbodiimide include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide or a salt thereof.
  • the salt include hydrochloride, methyl iodide and the like.
  • the pyridium salt include 2-chloromethylpyridinumoxide salt, 2-purmomethylpyridinumoxide salt and the like.
  • the (benzo) oxazolidum salt include 2-chlorobenzoxazolidium boron fluoride salt and the like.
  • Examples of the (benzo) thiazolym salt include 2-chlorobenzothiazolym boron fluoride salt and the like.
  • Examples of the isocyanates include rosulfonyl isocyanate and the like.
  • Examples of the carbonyl reagent include 1,111-carboeldiimidazole and the like.
  • the equivalent number of the condensing agent in the condensation reaction is preferably from 1.0 to 5.0 equivalents, and more preferably from 1.1 to 2.5 equivalents to the compound (V).
  • the amount is preferably 1.0 to 5.0 equivalents to the compound (VI) or the compound (VII), and 1.1 to 2.5 equivalents. Equivalents are more preferred.
  • Examples of the base used as necessary when synthesizing the compound (III) include, for example, pyridine analogs.
  • pyridine analogs include pyridin, 2-picoline, 3-picoline, 4-picoline, 2-ethyl / reviridine, 3-ethylpyridine, 4-ethylpyridine, 2-propylpyridine, 3-propylpyridine, and 4-pyridine.
  • Monopyrrolidinopyridine and 4-piperidinopyridine are preferred.
  • the equivalent of the pyridine analog is preferably from 0.01 to 2.5 equivalents, more preferably from 0.7 to 1.2 equivalents, relative to compound (V).
  • the reaction solution for example, water or a mixed solvent of water and an organic solvent is added to the reaction solution, and the resulting reaction mixture is treated with the compound (III) [Compound (Ilia) or compound (IIIb)] is extracted with an organic solvent, water contained in the extracted solution is removed with a desiccant, the desiccant is filtered, and the solvent in the obtained filtrate is filtered. Is distilled off under normal pressure or reduced pressure. Further, the extraction solution containing the compound (III) may be washed with an acid to remove basic substances (condensing agent, condensing agent-derived substance, base) in the extraction solution.
  • basic substances condensing agent, condensing agent-derived substance, base
  • the acid-extracted extraction solution is preferably further washed with water or saline.
  • the organic solvent added to the reaction solution may be the same as or different from the organic solvent used in the reaction, but is preferably the same. Further, the organic solvent added to the reaction solution and the organic solvent used for extraction may be the same or different. Examples of the organic solvent added to the reaction solution and the organic solvent used for extraction include the above-mentioned organic solvents, and among them, dichloromethane, ethyl acetate and the like are preferable.
  • the reaction mixture containing the compound (III) obtained by the post-treatment of the condensation reaction of the compound (V) with the compound (VI) or the compound (VII) can be used as it is for the measurement of HDL cholesterol.
  • Those purified by separation and purification can also be used. Examples of the separation / purification method include silica gel column chromatography, HP LC, distillation, fractional distillation, and recrystallization. '
  • the concentration of the bile acid derivative having a nonionic surfactant is not particularly limited as long as the concentration enables the measurement of the HDL cholesterol of the present invention, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 30%. Preferably, it is 0.01 to 3%.
  • the aqueous medium used in the method for measuring HD L cholesterol of the present invention examples include deionized water, distilled water, and buffers, but buffers are preferred.
  • Examples of the buffer used for the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, and Good's buffer.
  • Good's buffers include, for example, 2 -morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxixeti ⁇ iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N_ (2-acetamide) ) Imino diacetic acid (ADA), piperazine mono-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (P
  • TEP SO piperazine-N, N, mono-bis (2-hydroxypropanesulfonate)
  • POP SO piperazine-N, N, mono-bis (2-hydroxypropanesulfonate)
  • HEPP SO mono-bis (2-hydroxy-2-hydroxy) -1 1-piperazinyl] 1 2 —Hydroxypropanesulfonic acid
  • HEPP SO 3- (4- (2-Hydroxyshenyl) -1-piperagenole) propane snolefonic acid
  • H EPPS
  • Examples thereof include aminoethanesulfonate (CHES), N-cyclohexyl-3-amine, 2-hydroxypropanesulfonic
  • Examples of the method for measuring HDL cholesterol of the present invention include the following embodiments.
  • Specimens and unmodified cholesterol esterase and cholesterol oxidase, or unmodified cholesterol esterase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase are combined with bile acid derivatives and albumin. React in an aqueous medium containing
  • the HD L cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the ⁇ (directly measured in (2) and the calibration curve prepared in advance.
  • Bile the specimen with chemically modified cholesterol esterase and cholesterol oxidase, or chemically modified cholesterol esterase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase Reacting in an aqueous medium containing an acid derivative and albumin;
  • HDL cholesterol in the sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and a calibration curve prepared in advance.
  • the reaction (1) is performed, for example, at 10 to 50 ° C., preferably at 20 to 40, for 1 to 60 minutes, preferably for 2 to 30 minutes.
  • the amount of generated hydrogen peroxide can be measured, for example, with a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance.
  • the detectable substance for example, a dye or a dye that emits light is preferable.
  • the detectable substance is a dye
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains an oxidative coloring type chromogen and a peroxide active substance such as peroxidase.
  • the oxidative coloring type chromogen examples include the following oxidative coloring type chromogen. If the detectable substance is luminescent, the reagent for measuring hydrogen peroxide contains a chemiluminescent substance. Examples of the chemiluminescent substance include luminol, isorluminol, lucigenin, ataridinium ester and the like.
  • Hydrogen peroxide can be quantified by reacting with an oxidative chromogenic type chromogen in the presence of a chemical active substance to generate a dye, and by quantifying the generated and quantified dye.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance is used, the hydrogen peroxide reacts with the chemiluminescent substance to generate photons, and the generated photons are quantified to obtain an excess. Hydrogen oxide can be determined.
  • oxidative coloring chromogen examples include a leuco chromogen, an oxidative coupling coloring chromogen, and the like.
  • Leuco-type chromogens are substances that are converted to dyes alone in the presence of peroxidative substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • MCD P 10-N-methylca ⁇ bamoyl-1,3,7-bis (dimethyl Reamino) 10H-Phenothiazine
  • DA-64 N- (Ripoxymethylamino diphenyl) 1,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt
  • BCMA Mono-bis (dimethylamino) diphenylamine
  • BCMA Mono-bis (dimethylamino) diphenylamine
  • BCMA Bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine
  • Oxidative coupling chromogens are substances in which two compounds are oxidatively coupled to form a dye in the presence of hydrogen peroxide and a peroxidase active substance such as peroxidase.
  • Examples of the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aniline, a combination of a coupler and a phenol, and the like.
  • Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-1AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine and the like.
  • anilines include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-13-sulfopropyl) -13-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3 —Sulfopropynole) 1,3,5-Dimethinoleaniline (MAOS), N—ethynole N— (2—Hydroxy-3-Snolephopropyl) 1,3,5-Dimethoxyaniline (DAO S), N—ethylethyl N— (3—Sulfo Propyl) 1-Methylaniline (TOPS), N— (2-H Droxy 3-sulfopropyl) 1,3,5-dimethoxyaniline (HDAO S), N, N-dimethyl-3-methylaniline, N, N-di (3-sulfop pill) — 3,5-dimethoxyaniline, N —Ethyl-N— (3-Snorrehop
  • the concentration of the peroxide active substance is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the measurement.
  • the concentration is preferably 1 to 100 kUZL.
  • the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 g // L.
  • Examples of the method for measuring the reduced type enzyme include a method for measuring the absorbance of the produced reduced type coenzyme, a method using a reagent for measuring the reduced type enzyme, and the like.
  • the absorbance in the method for measuring the absorbance of reduced coenzyme is preferably from 300 to 500 nm, more preferably from 330 to 400 nm, and particularly preferably around 340 nm.
  • the reduced coenzyme measurement reagent is a reagent for converting the generated reduced coenzyme into a detectable substance. Examples of the detectable substance include a dye.
  • the detectable substance is Examples of the reagent for measuring reduced coenzyme in this case include a reagent containing diaphorase, an electron carrier and a reduced chromogenic chromogen.
  • the electronic carrier include 1-methoxy 51-methylphenazine dimethyl sulfate.
  • Examples of reduced chromogenic chromogens include 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -1,2,5-diphenyl-12H-tetrazolium bromide (MTT), and 2- (4-pheodophenol).
  • MTT 2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -1,2,5-diphenyl-12H-tetrazolium bromide
  • 2- (4-pheodophenol 2- (4-pheodophenol).
  • 3 (4,2-Trofenyinole) 1—5— (2,4-Disulfophenyl) 1-2H-tetrazolium mononatridium salt (WST-1), 2- (4,4-dinitrophene) 1-3— (2,4-dinitrophene) Nore) — 5— (2,4-disulfofeninole) -12H-tetrazolium mononadium salt (WST-3).
  • Examples of the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention include the reagents in the following embodiments.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivative, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative and oxidized coenzyme is provided.
  • Unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase A reagent containing an element, a bile acid derivative, albumin and an oxidized coenzyme.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, reagents for measuring oxidized coenzyme and reduced coenzyme is provided.
  • Reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, albumin, oxidized coenzyme and reduced coenzyme measurement reagent Reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, albumin, oxidized coenzyme and reduced coenzyme measurement reagent.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivatives, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivatives, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative and oxidized coenzyme is provided.
  • Reagent 10 'A reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivatives, albumin and oxidized coenzyme.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivatives, reagents for measuring oxidized coenzyme and reduced coenzyme is provided.
  • Reagent 1 2 A reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, albumin, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme measurement reagent. '
  • the cholesterol monoester hydrolase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, albumin, and cholesterol monoester hydrolase described in the method for measuring HDL cholesterol monoester according to the present invention are used.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide, an oxidized coenzyme, and a reduced coenzyme are used.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the form of the kit is not particularly limited, and may be any of a two-reagent system and a three-reagent system, but a two-reagent system is preferable.
  • a two-reagent HDL cholesterol measurement kit consisting of a 'first reagent' and a second reagent, cholesterol esterase and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase are composed of the first reagent and the second reagent.
  • the bile acid derivative may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • the oxidized coenzyme used in the measurement method using cholesterol dehydrogenase may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide may be contained in one or both of the first reagent and the second reagent, but if the reagent contains an oxidized coupling type chromogen, the oxidative coupling type An embodiment in which each compound of the chromogen is contained in a separate reagent is preferred.
  • the reagent for measuring reduced coenzyme may be contained in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • Albumin may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • a kit of the following embodiment can be mentioned.
  • a reagent containing an unmodified cholesterol esterase, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • Kit 2 A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 2
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, bile acid derivative, albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 3
  • a reagent containing a chemically modified cholesterol esterase, a bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • Kit 4 A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 4
  • a reagent containing a chemically modified cholesterol esterase, a bile acid derivative, albumin, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • Kit 5 A reagent containing cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide. Kit 5
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivative, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring hydrogen peroxide A reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivatives, and a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a reagent containing albumin and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol oxidase, bile acid derivatives, and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing an unmodified cholesterol esterase and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized capture enzyme is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, bile acid derivative and albumin is a reagent containing unmodified cholesterol esterase, bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized capture enzyme is provided.
  • a reagent containing an unmodified cholesterol esterase and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, a bile acid derivative and albumin is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing a chemically modified cholesterol esterase and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme is provided.
  • a reagent containing cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme is provided.
  • a reagent containing a chemically modified cholesterol esterase and a bile acid derivative is provided.
  • a reagent containing a reagent for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized capture enzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing a chemically modified cholesterol esterase, a bile acid derivative and albumin is a chemically modified cholesterol esterase, a bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing a reagent for measuring cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme is oxidized coenzyme.
  • a reagent containing a bile acid derivative and albumin is A reagent containing a bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing a bile acid derivative is A reagent containing a bile acid derivative.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme and reduced coenzyme measurement reagent is provided.
  • a reagent containing a bile acid derivative and albumin is A reagent containing a bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing unmodified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme and reduced coenzyme measurement reagent is provided.
  • a reagent containing a bile acid derivative is A reagent containing a bile acid derivative.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and oxidized capture enzyme is provided.
  • a reagent containing a bile acid derivative and albumin is A reagent containing a bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and oxidized capture enzyme is provided.
  • Kit 23 Reagent containing bile acid derivative. Second reagent
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reduced coenzyme measurement reagent is provided.
  • a reagent containing a bile acid derivative and albumin is A reagent containing a bile acid derivative and albumin.
  • a reagent containing chemically modified cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, and reagent for measuring reduced enzymatic enzyme In the kit for measuring HDL cholesterol of the present invention, the cholesterol monoester hydrase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, bile acid derivative, albumin, and cholesterol monoester hydrase described in the method for measuring HDL cholesterol monophosphate of the present invention are used. Reagents for measuring hydrogen peroxide, oxidized coenzymes, and reduced capture enzymes can be used.
  • the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain an aqueous medium, a stabilizer, a preservative, an influencing substance scavenger, a reaction accelerator and the like, if necessary.
  • the aqueous medium include the above-described aqueous medium.
  • the stabilizer include polyethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride and the like.
  • preservatives include sodium azide, antibiotics and the like.
  • Examples of the influence substance elimination agent include ascorbate oxidase for eliminating the influence of ascorbate.
  • the reaction accelerator include enzymes such as colipase and phospholipase, and salts such as sodium sulfate and sodium chloride.
  • the reagent and kit for measuring HDL cholesterol of the present invention may be in a lyophilized state or a state dissolved in an aqueous medium.
  • the reagent is used by dissolving it in an aqueous medium.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention The content of cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, and cholesterol dehydrogenase is preferably 0.01 to 80 OU / mL when dissolved in an aqueous medium. More preferably, the content is 400 U / mL.
  • the content of the bile acid derivative in the reagent and the kit for measuring HD L cholesterol of the present invention is preferably such that the concentration in the state of being dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 30 ° / 0 , The content which becomes 0 to 10% is more preferable.
  • the content of albumin in the reagent for measuring HD L cholesterol and the kit for measurement of the present invention is preferably such that the concentration when dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 10%, and 0.01 to 10%. A content of 5% is more preferable.
  • HE PE S (manufactured by BDH Laboratory), EMS E (manufactured by Daito Kamix), serum albumin (BSA; manufactured by Oriental), 4-aminoantipyrine (manufactured by Saikyo Kasei) Peroxidase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) ), LPL 311 (cholesterol esterase; Toyobo Co., Ltd.), LPL6 (cholesterol esterase; Amano Enzym), CHE2 (cholesterol esterase; Amano Yunsim), C OE 3 13 (chemically modified cholesterol esterase; Toyobo), C003 21 (cholesterol oxidase; Toyobo), sodium cholate (ACROS), sodium taurocholate (Tokyo) Kaseisha), BI GCHAP (Dojindo), CHAP S (Dojindo), sodium dextran sulfate (Molecular weight 500,000) Pharmacia Co., Ltd.).
  • CHE 2 was added to HE PES buffer ( ⁇ 8.5, 0.15 mo 1 / L) to 50 g / L and cooled to 5 ° C, then sampler 1, VFM—4 10 1 (Japan (Manufactured by Yushi Co., Ltd.) to a concentration of 200 g / L, and further 3 hours Reacted.
  • the obtained modified enzyme solution was used as it was as chemically modified CHE 2 without purification and separation.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HJDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. ⁇
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • the kit consists of the following first and second reagents.
  • a kit for measuring HD L cholesterol was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. '
  • a kit for measuring HDL cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. '
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement key consisting of the following first and second reagents: 3259
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HD L cholesterol measurement key consisting of the following first and second reagents: T / JP2003 / 013259
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • Physiological saline (HDL cholesterol concentration: 0. OmgZdL) and serum (HDL cholesterol concentration: 60. Omg / dL) were used as standard solutions.
  • absorbance and the like represent a value obtained by subtracting E1 from E2 based on two absorbances (E1 and E2) measured in the following reaction. 'Add the standard solution (3/1 L) and the first reagent (0.24 mL) to the reaction cell, heat at 37 ° C for 5 minutes, and measure the absorbance (E 1) The secondary reagent (0.08 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was further heated at 37 ° C for 5 minutes. The absorbance (E2) of the reaction solution was measured at the main wavelength of nm, sub wavelength 700 nm.
  • Example 22 Measurement of HD L cholesterol '' Example 2 except that the kit of Example 2 was used instead of the kit of Example 1
  • HDL cholesterol in 30 human serum samples was measured by a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in the measurement method of 1.
  • Example 2 except that the kit of Example 1 was used instead of the kit of Example 1.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 4 was used instead of the kit of Example 1. It was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was determined using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 5 was used instead of the kit of Example 1. It was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was measured using a Hitachi Type 110 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 6 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • HDL cholesterol in 30 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 7 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 8 was used instead of the kit of Example 1, the HDL cholesterol in 30 human serum samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer. Nodding was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 1 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 9 was used instead of the kit of Example 1. It was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 10 was used instead of the kit of Example 1, the HDL in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 71700 automatic analyzer. Cholesterol was measured.
  • HDL cholesterol in 30 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 11 was used instead of the kit of Example 1. One hole was measured.
  • HDL cholesterol in 30 human serum samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 1 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 13 was used in place of the kit of Example 1, the HDL in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer. The cholesterol was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 14 was used in place of the kit of Example 1, the HDL in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 71720 automatic analyzer. Cholesterol was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 1 was used instead of the kit of Example 1, the HDL in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer. Cholesterol was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 3 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 4 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 17 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in human serum 30 samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 18 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in 30 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 19 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • the human serum 3-3 was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 20 was used instead of the kit of Example 1. HDL cholesterol in 0 samples was measured.
  • Table 1 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 21 to 40 and Comparative Examples 5 to 8 and the measurement method by the DCM method.
  • Example 34 From a comparison between Example 34, Example 35 and Example 36, when an unmodified enzyme was used as the cholesterol ester hydrolase, the condition in which cholic acid or taurocholic acid was present as the bile acid derivative was used.
  • the correlation between the addition of albumin and the measurement by the DCM method was better, but under the condition that BI GCHAP or CHAPS was present as a bile acid derivative, regardless of the presence or absence of albumin It was found that a good correlation was obtained with the measurement by the DCM method.
  • Example 21 and Example 37 the measurement using the chemically modified cholesterol esterase other than the chemically modified LPL 3 It turned out that good correlation was obtained.
  • the chemical modifier was prepared using a modifier other than VFM-4101. It was found that even when the chemically modified cholesterol esterase was used, a good correlation was obtained with the measurement by the DCM method.
  • a comparison between Example 21 and Example 40 shows that even when a commercially available chemically modified cholesterol esterase was used, a good correlation was obtained with the measurement by the DCM method. There was found.
  • polyethylene glycol methyl ether (average molecular weight: 2000, manufactured by Aldrich) 110 g (55 mm o 1) 6.7 g (55 mm 0 .1) of dimethylaminopyridine (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) and 1 O OmL of dichloromethane were added and dissolved.
  • polyethylene glycol methyl ether (average molecular weight: 400, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., Uniox M-400) 4.8 g (12 mmo1), dimethylaminopyridine (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) 1.46 g (12 mmo 1) and 30 mL of dichloromethane were added and dissolved.
  • polyethylene glycol methyl ether (average molecular weight: 1,000, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., Uniox M-1 000) 12 g (l 2 mmo1), dimethylaminopyridine (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) 1.46 g (1 2 mmo 1) and 5 OmL of dichloromethane were added and dissolved. 4.08 g (1 Omm 0 1) of cholic acid (manufactured by Mikuni Chemical Industry Co., Ltd.) JP2003 / 013259
  • the mixture was stirred at room temperature under a nitrogen atmosphere for 12 hours, added with 50 mL of dichloromethane and 5 OmL of water, and extracted.
  • the organic layer was washed with 50 mL of 0.2 mol / L hydrochloric acid and twice with 50 mL of 10% salt solution. Thereafter, 30 OmL of ethyl acetate was added to the separated organic layer, and the mixture was washed three times with 300 mL of 1% sodium chloride solution.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate, the desiccant was removed by filtration, and the filtrate was concentrated using a rotary evaporator. Further, it was dried under reduced pressure at 80 ° C for 2 hours using a vacuum pump to obtain 48.5 g (yield: 90%) of a compound (Ilia-4) as a white waxy solid.
  • Example 45 Synthesis of Deoxycholate [Compound (IIIa-5)]
  • polyethylene glycol methyl ether (average molecular weight 2000, 22 g (11 mmo 1) manufactured by Aldrich Corporation, 1.34 g (11 mmo 1) of dimethylaminopyridine (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) and 5 OmL of dichloromethane were added and dissolved.
  • To this solution was added 3.93 g of deoxycholic acid (1 Ommo 1), followed by 2.3 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carposimide hydrochloride (manufactured by Iibai).
  • mmo 1) was added.
  • the organic layer was washed with 5 OmL of 0.2 mol 1 ZL of hydrochloric acid, and washed twice with 5 OmL of 10% saline. Thereafter, 20 OmL of ethyl acetate was added to the separated organic layer, and the mixture was washed three times with 300 mL of 10% saline. The organic layer was dried over magnesium sulfate, the desiccant was removed by filtration, and the filtrate was concentrated. Further, the mixture was dried under reduced pressure at 80 ° C for 2 hours using a vacuum pump, and the compound (I I)
  • Example 49 Synthesis of cholic acid ester at both ends [Compound (IIIb-1)]
  • polyethylene glycol manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., PEG 2,000
  • dimethylaminopyridine 2. 68 g (22 mmo 1)
  • 50 mL of dichloromethane were added and dissolved.
  • 4.08 g (l Oromo'l) of cholic acid was added to the solution, followed by 4.6 g (24 mmo1) of hydrochloride of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carposamide (manufactured by I-Bay). ) was added.
  • the mixture was stirred at room temperature for 12 hours under a nitrogen atmosphere, and extracted with 5 OmL of dichloromethane and 5 OmL of water.
  • the organic layer was washed with 5 OmL of 0.2 mol 1 ZL of hydrochloric acid and twice with 50 mL of 10% saline. Thereafter, 20 OmL of ethyl acetate was added to the separated organic layer, and the mixture was washed three times with 300 mL of 10% saline.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate, the drying agent was removed by filtration, and the filtrate was concentrated. Further, it was dried under reduced pressure at 80 ° C. for 2 hours using a vacuum pump to obtain 7.7 g (yield 90%) of a compound (Ilia-9) as a white lip-like solid.
  • polyoxyethylene diamine (average molecular weight 2000, PEO amine # 2000 manufactured by Kawaken Fine Chemicals Co., Ltd.) 10 g (5 mmo 1), 4-dimethylaminopyridine (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) 2. 56 g (21 mmo 1) and 50 mL of dichloromethane were added and dissolved.
  • the mixture was stirred at room temperature for 12 hours under a nitrogen atmosphere, extracted with 5 OmL of dichloromethane and 5 OmL of water.
  • the separated organic layer was washed by adding 22 mL of lmo1 / L hydrochloric acid and 5 OmL of water, and further washed twice with 5 OmL of 10% saline.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate, the desiccant was removed by filtration, and the filtrate was concentrated using a rotary evaporator. Further, the residue was dried under reduced pressure at 80 ° C. for 2 hours using a vacuum pump to obtain 11.9 g (yield 86%) of a compound (IIIA-10) as a pale yellow viscous liquid.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • Example 56 HD L Cholesterol Measurement Kit ′ An HD L cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. '
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. '
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared. '
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first and second reagents was prepared.
  • a kit for measuring HD L cholesterol comprising the following first and second reagents was prepared.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 53 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 54 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • the HDL cholesterol in 35 samples of human serum was determined using a 071170 type automatic analyzer. It was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 58 was used instead of the kit of Example 1, the HDL cholesterol in 35 human serum samples was determined using a Hitachi 7170 automatic analyzer. It was measured.
  • Example 7 2 Measurement of HDL cholesterol
  • a Hitachi 7170 automatic analyzer was used in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 59 was used instead of the kit of Example 1. HDL cholesterol in it was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 710 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 60 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 61 was used in place of the kit of Example 1, an automatic analyzer of type 7170 was used to analyze 35 HDL cholesterol was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 62 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 63 was used instead of the kit of Example 1. One hole was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Example 65 was used instead of the kit of Example 1. Was measured.
  • Comparative Example 13 Measurement of HDL Cholesterol HDL cholesterol in 35 human serum samples was measured using a Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 9 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • Example 21 In the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 10 was used instead of the kit of Example 1, the HDL cholesterol in 35 human serum samples was analyzed using a Hitachi 7170 automatic analyzer. It was measured.
  • HDL cholesterol in 35 human serum samples was measured using a standing type 170 automatic analyzer in the same manner as in Example 21 except that the kit of Comparative Example 12 was used instead of the kit of Example 1. did.
  • the human serum (35 samples) used in the measurements of Examples 66 to 78 and Comparative Examples 13 to 1'6 HDL cholesterol in the samples was measured by the DCM method, and each measurement method was used. And compared.
  • Table 2 shows the correlation coefficients between the measurement methods of Examples 66 to 78 and Comparative Examples 13 to 16 and the measurement method by the DCM method.
  • Reagents comprising the following compositions 1 to 8 to be used as the second reagent of the kit for measuring HDL cholesterol were prepared, and stored at 40 ° C for 48 hours (2 days) and 120 hours (5 days), respectively.
  • preparation Reagents consisting of compositions 1 to 8 each reagent stored at 40 ° C for 2 days, and cholesterol esterase in each reagent stored at 40 ° C for 5 days (LPL 311)
  • the enzyme activity of each of the cholesterol oxidase (C00321) and cholesterol oxidase (C00321) was measured, and the ratio of the enzyme activity of each reagent after storage to the enzyme activity of each reagent immediately after preparation (enzyme activity residual ratio) (%) was determined.
  • Enzyme activity was determined by the following method. -
  • the same measurement was performed using purified water in place of the reagents having compositions 1 to 8, and the per-minute Calculate the absorbance change (AAb sZmin). From the change in absorbance per minute ( ⁇ Abs / min) at 500 nm for each reagent consisting of compositions 1 to 8, the change in absorbance per minute ( ⁇ Abs / min) at 500 nm in purified water was calculated. The value ( ⁇ Abs / min) calculated by subtraction is used as an index for stabilizing cholesterol oxidase.
  • the method and method for measuring cholesterol in high density lipoprotein of the present invention By using a bile acid derivative having a nonionic surfactant activity as a bile acid derivative in a reagent or a kit, even when a reagent stored for a long time is used, the storage temperature can be reduced to 40%. It can be seen that cholesterol in high-density lipoprotein can be measured more accurately even when a reagent that may be exposed to ° C is used. '
  • a method for simply and accurately measuring cholesterol in a high-density lipoprotein in a sample, a reagent used for the method, and a high-density method in which enzyme activity is stably maintained even during long-term storage Reagents and kits for measuring cholesterol in lipoproteins are provided.

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Abstract

検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法およびそれに用いる試薬。

Description

3013259
明 細 書
高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 技術分野
本発明は、 検体中の高密度リポ蛋白 （以下、 HD Lと略記する） 中のコレ ステロールの測定方法、 測定用試薬、 測定用キット、 新規胆汁酸誘導体およ び新規胆汁酸誘導体の製造方法に関する。
背景技術 '
生体中リポ蛋白は、 その比重により高密度リポ蛋白 （HDL) 、 低密度リ ポ蛋白 （以下、 LDLと略記する） 、 超低密度リポ蛋白 （以下、 VLD Lと 略記する） 、 カイロミクロン （以下、 CMと略記する） に分類されており、 それぞれ主にァポ蛋白の種類の違いによつて生体中での働きが大きく異な つており、 脂質組成もさまざまである。 その中で、 HD Lは、 動脈壁を含め た各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステ 口ールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の 危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な 指針となることが知られている。
従来の HDL中のコレステロール （以下、 HD Lコレステロールと略記す る） の測定法は、 超遠心法、 免疫化学的方法、 電気泳動法、 沈殿法等による 分画操作とコレステロール定量操作の 2段階からなる。 し力 しながら、 分画 操作は、 操作が煩雑であり、 長時間を要するものであり、 また、 安全性の点 でも問題があった。 従って、 これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が 悪く、 実用化に適さない方法であった。 '
近年、 上記の問題を解決するための種々の測定法が開発されている。 例え ば、 HD L以外のリポ蛋白を凝集させる測定法として、 デキス トラン硫酸等 の HD L以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、 2価の金属塩、 および、 化学的 に修飾された酵素を用いる測定法 （特開 8— 1 3 1 1 9 7号公報） 、 ポリ ァニオン等の HDL以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシ エチレン一ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活 性剤とを用いる測定法 （特開平 8— 2 0 1 3 9 3号公報） 、 デキストラン硫 酸等のポリア二オン、 2価の金属塩、 特定の非イオン性界面活性剤および試 料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特開平 9 _ 2 8 5 2 9 8号公報） 等が知られている。 また、 血清または血漿を、 リポ蛋白 分画剤（デキストラン硫酸等のポリア二オンとマグネシウムイオン等の 2価 陽イオンとの組み合わせ） を含む溶液で処理し、 得られた混合液を固体およ び液体の分離処理することなく、 ァニオン性界面活性剤 （アルキルスルホン 酸または胆汁酸もしくはその誘導体） の存在下に、 コレステロールエステラ ーゼおよびコレステロールォキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を 測定することを特徴とする血清または血漿中の H D Lコレステロールを測 定する方法 （特開平 8— 1 1 6 9 9 6号公報） も知られている。
しかしながら、これらの H D L以外のリポ蛋白を凝集させる H D Lコレス テロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、 反 応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗 浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による 自動分析装置への過度の負荷という問題がある。
また、 H D L以外のリポ蛋白を凝集させない測定法として、 ァシルポリオ キシエチレンソルビタンエステルにより H D L以外のリポ蛋白中のコレス テロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、 ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、 H D Lコレステロール を酵素的に測定する方法 （特開平 9— 2 9 9号公報） 、 生体試料と、 膝臓由 来のコレステロ一ノレエステラーゼと、 コレステロ一ノレ才キシダーゼと、 コー ル酸等の胆汁酸とを、 アルブミンが存在する条件下で接触させ、 H D Lコレ ステロールと当該酵素との反応により消費される化合物または生成される 化合物を測定することを特徴とする H D Lコレステロールの測定方法（国際 公開第 9 7 / 4 0 3 7 6号パンフレッ ト） 等が知られている。
しかしながら、これらの H D L以外のリポ蛋白を凝集させない H D Lコレ ステロール測定法においては、 H D L以外のリポ蛋白中のコレステロールの 不完全な消去や、 H D L以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異 反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
胆汁酸類を用いる H D Lコレステロール測定法としては、前記の特開平 8 - 1 1 6 9 9 6号公報や国際公開第 9 7 / 4 0 3 7 6号パンフレッ トに記 載された方法の他に、 例えば血清または血漿を、 コレステロールエステラー ゼ、 コレステロールォキシダーゼ、 および、 胆汁酸塩もしくは胆汁酸誘導体 もしくはジォクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と 反応させ、 V L D Lおよび L D L中のコレステロールを H D Lコレステロ一 ルに先駆けて反応させ、'生成した過酸化水素を測定した後、 非イオン系のポ リオキシエチレンォキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、 H D Lコレ ステロールと当該酵素とを反応させ、 H D Lコレステロールを特異的に分別 定量する方法 ぐ特開昭 6 2 - 6 9 9 9 9号公報） 、 血清を、 特定の p Hおよ び特定の温度の下、膝臓由来のコレステロールエステラーゼ、 コレステロ一 ルォキシダーゼ、 胆汁酸群の界面活性剤、 および、 非イオン系界面活性剤を 含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることにより H D Lコレステロ一 ルを測定する方法 （特開昭 6 3 - 1 2 6 4 9 8号公報） 、 生体試料を、 アル ブミンおよび胆汁酸もしくはその塩の存在下に、膝臓由来のコレステロール エステラーゼとコレステロ一ノレォキシダーゼに接触させ、 H D Lコレステロ ールを当該酵素と反応させた後、処理された生体試料を微生物由来のコレス テロールエステラーゼと接触させ、 L D Lコレステロールを当該酵素 （微生 物由来のコレステロ一ノレエステラーゼとコレステローノレオキシダーゼ） と反 応させることにより、 H D Lコレステロールおよび L D Lコレステロールを 測定する方法（特開平 1 1一 9 3 0 0号公報）、リポ蛋白を含有する試料を、 胆汁酸誘導体および または両性界面活性剤の存在下に酵素（コレステロ一 ルエステラーゼおよびコレステロールォキシダーゼ） と反応させ、 H D Lコ レステロールを選択的に反応させた後、ポリオキシエチレン鎖を有する非ィ ォン性界面活性剤を反応液に添加し、 H D Lコレステロールを選択的に反応 させることにより、 H D Lコレステロ一ルおよびノまたは L D Lコレステロ ールを測定する方法 （特開 2000— 3 2 509 7号公報） 等が知られてい る。 しかしながら、 これらの測定法は、 測定に長時間を要する場合があり、 また、 必ずしも、 HD Lコレステロールに特異的な測定法ではなかった。 ォキシエチレン基をエステル部分に有するコール酸のエステルは公知で あるが （特開平 5— 2 2 1 94 1号公報） 、 当該エステルを用いた HD Lコ レステロールの測定法は知られていない。
エステル化合物の合成方法としては、 一般的に、 カルボン酸とアルコール との縮合反応により合成する方法が簡便であり、特に酸触媒を用いる共沸ェ ステル化法がよく利用されている。しかしながら、 嵩高い置換基や水溶性基 もつ化合物では収率が低いことがある（シー ·ケー 'インゴールド（C. K. I n g o 1 d) 著， 「ストラクチャ一 'アンド ' メカニズム■イン 'オーガ エック - ケミス ト リー Structure and Mechanism in Organic Chemistry) 」 （英国） ， 第 2版， ベル （B e 1 1 ) 1 96 9年， 1 5章， p . 1 1 28-1 1 78) 。 例えば、 前記の特開平 5— 22 1 941号公報 には、 酸触媒として p -トルエンスルホン酸を用いたコール酸とジエチレン グリコールモノメチルエーテルとの反応によるコール酸エステルの合成方 法が記載されているが、 72時間という長時間の加熱還流を行っても、 コー ル酸エステルの収率は 2 3%と ^極めて低く、 また、 後処理操作も複雑で煩雑 である。
また、分子内に水酸基をもつようなカルボン酸では自己エステル化も進行 するため、分子内の水酸基を保護してアルコールとのエステル化を行う方法 も用いられている。例えば、 ウルソデコール酸と 2—ヒ ドロキシェチルォキ シグルコシドとを用いたウルソデコール酸エステルの合成方法が知られて いるが （特開平 1 1一 1 9 95 98号公報） 、 本方法は、 1) ウルソデコ一 ル酸の水酸基を TB DM S (t—プチルジメチルシリル）基で保護する工程、 2) エステル化工程、 および、 3) 脱保護 （TBDMS基の除去） 工程を含 有する方法であるため簡便な合成法とは言い難い。 ' 発明の開示. 9
本発明の目的は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ 正確に測定するための方法、 ならびに、 その方法に使用する測定試薬および 測定キットを提供することにある。
本発明は、 下記 [1：！ 〜 [42] に関する。
[1] 検体と、 コレステロールエステル加水分解酵素おょぴコレステロ ール酸化酵素、 または、 コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補酵 素おょぴコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体 中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型捕酵素を測定することを特 徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
[2] 水性媒体が、 さらに、 アルブミンを含有する [ 1] 記載の方法。
[3] コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾されたコ レステロールエステル加水分解酵素である [1] または [2] 記載の方法。
[4] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主成 分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合 体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプチ ル基、 ポリウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より選 ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である [3] 記載の方法。
[5] ^学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素である [3,] 記載の方法。
[6] 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である [1] 〜 [5] のいずれかに記載の方法。
[71 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸もし くはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその 塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコ^ "ル酸もしくはその塩、 ケノ デォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 3259
7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 12—ォキソリ トコール酸もしく はその塩、 12—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソ デォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォデォ キシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロコール酸もしくはその塩か らなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である ，[6] 記載の方法。
[8] 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である [1] 〜 [5] のいずれかに記載の方法。
[9] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （I)
R1— CH2 - CH(R2) - CH2 - S03一 (I)
[式中、 R1は、 3— （3—コラミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物である [8] 記載の方法。
[10] 胆汁酸誘導体が、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導 体である [1] 〜 [5] のいずれかに記載の方法。
[1 1] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （I
I)
Figure imgf000007_0001
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （I I I)
Figure imgf000008_0001
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=〇） 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 ァノレキノレ基、 アルケニノレ基、 ァノレキニノレ基、 シクロアノレキノレ基、 シク ロ アルケニル基、 アルカノ'ィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V)
Figure imgf000008_0002
[式中、 X' 、 Y' および Z' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ. (=0) 基を表し、 mは、 pまたは 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物である [10] 記 載の方法。
[1 2] コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵 素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする 高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。 '
[1 3] コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ ^"ル脱水素 酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度 フ リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[1 4] さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する [1 3] 記載の試 薬。 '
[1 5] さらに、 アルブミンを含有する [1 2]〜 [14] のいずれか に記載の試薬。
[1 6] コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾された コレステロールエステル加水分解酵素である [1 2] 〜 ！： 1 5] のいずれか に記載の試薬。
[1 7] 化学的に修飾された、コレステロールエステル加水分解酵素力 s、 ポリエチレンダリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主 成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重 合体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホブ チル基、 ポリウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より 選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である
[1 6] 記載の試薬。
[1 8] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素力 ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロ一 ルエステル加水分解酵素である [1 6] 記載の試薬。
[1 9] 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導 体である [1 2] 〜 [1 8] のいずれかに記載の試薬。
[20] 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸も しくはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはそ の塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケ ノデォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその 塩、 7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2—ォキソリ トコール酸も しくはその塩、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォ キソデォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォ デォキシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロコール酸もしくはその 塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である [1 9] 記載の試薬。
[2 1] 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体であ る [1 2] 〜 [1 8] のいずれかに記載の試薬。
[2 2] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （I)
R1 - CH2— CH(R2)— CH2—S03— ( I )
[式中、 R1は、 3 - (3—コラミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物である [2 1] 記載の試薬。
[2 3] 胆汁酸誘導体が、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導 体である [1 2] 〜 [1 8] のいずれかに記載の試薬。
[24] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （ I
I)
Figure imgf000010_0001
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （I I I )
Figure imgf000011_0001
{式中、 X、 Yおよび zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=0) 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキエル基、 シクロアルキル基、 シクロ ァルケ-ル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換.もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （ I V)
Figure imgf000011_0002
[式中、 X' 、 Υ' および Z' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物である [23] 記 載の試薬。
[25] コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、 コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体およ び過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有 することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[26] 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、 コレステロールエステル 加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有 し、 過酸化水素測定用試薬を第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含 有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[27〕 過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、 コレステロール エステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬 とを含有し、 胆汁酸誘導体を第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含 有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[28] コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、 コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体お よび酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有するこ とを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[29] 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、 コレステロールヱステル 加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含 有し、酸化型捕酵素を第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有する ことを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[30] さらに、 還元型補酵素測定用試薬を、 第一試薬、 第二試薬のい ずれかまたは両方に含有する [28] または [29] 記載のキット。
[3'1] さらに、 アルブミンを、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは 両方に含有する [2 5] 〜 [30] のいずれかに記載のキット。
[32] コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾された コレステロールエステル加水分解酵素である [2 5] 〜 [3 1] のいずれか に記載のキット。
[3 3] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主 成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重 合体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプ チル基、 ポリウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より 選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である [32] 記載のキット。
[34] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素力 ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロ一 ルエステル加水分解酵素である [32] 記載のキット。
[3 5] 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導 体である [25：！ 〜 [34] のいずれかに記載のキット。
[36] 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸も しくはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはそ の塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケ ノデォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその 塩、 7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2—ォキソリ トコール酸も しくはその塩、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォ キソデォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォ デォキシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロコール酸もしくはその 塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である [35〕 記載のキット。
[37] 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体であ る [25：！ 〜 [34] のいずれかに記載のキット。
[38] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （ I )
R1— CH2— CH(R2) - CH2 - S03一 (I)
[式中、 R1は、 3— （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物である [3 7] 記載のキット。
[39] 胆汁酸誘導体が、 非ィオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導 体である [25] 〜 [34] のいずれかに記載のキット。
[40] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （ I I) ,
Figure imgf000014_0001
(Xは、 水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （ I I I )
Figure imgf000014_0002
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=0) 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニノレ基、 アルキ-ル基、 シクロアノレキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V)
Figure imgf000015_0001
[式中、 X， 、 Y' および ζ' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （==0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜4◦ 0の整数を表す } で表される化合物である [3 9] 記 載のキット。
[4 1] —般式 （I I I )
Figure imgf000015_0002
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=0) 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、.シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V)
Figure imgf000016_0001
[式中、 X' 、 Y， および ζ' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=〇） 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 ηは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物。
[42] 一般式 （V) .
Figure imgf000016_0002
[式中、 ぉょび は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=ο) 基を表す] で表される化合物と、 一般式 （V I )
Figure imgf000016_0003
(式中、 w， は、 水素原子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキュル基、 シ クロアノレキノレ基、 シクロアルケ二ノレ基、 ァノレカノイノレ基、 ァノレケノィル基、 アルキノィル基、 または、 置換もしくは非置換のァリール基を表し、 11は、 3〜400の整数を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （V I I)
Figure imgf000017_0001
(式中、 Tは、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、 11は、 3〜 400の整数を表す） で表される化合物とを、 縮合剤の存在下に反応させる ことを特徴とする一般式 （I I I )
Figure imgf000017_0002
{式中、 X、 Υおよび Ζは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=〇） 基を表し、 Qは、 酸素原子または ΝΗを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキノレ基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V)
Figure imgf000017_0003
[式中、 X' 、 Y' および Z' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物の製造方法。 本発明の H D Lコレステロールの測定方法は、 H D L以外のリポ蛋白中の コレステロールを消去することなく、 H D Lユレステロールを測定する方法 である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、 例えば全血、 血漿、 血清、 髄液、 唾液、 羊水、 尿、 汗、 膝液等があげられるが、 血漿おょぴ血清 が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、 コレ テ ロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、 例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、 リポプ 口ティンリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコ'レステロ一 ルエステラーゼ、 リボプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロール エステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水 分解酵素も使用することができる。 また、 コレステロールエステル加水分解 酵素としては市販品を使用することも.できる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、 コレステ ロールエステラーゼ "Amano" 2 ( C H E 2 ；天野ェンザィム社製） 、 コレ ステロールエステラーゼ "Arnano" 3 ( C H E 3 ；天野ェンザィム社製） 、 リポプロテインリパーゼ （L P L 3 1 1 ；東洋紡製社製） 、 リポプロテイン リパーゼ "Amano" 6 ( L P L 6 ；天野ェンザィム社製） 、 コレステロ一ノレ エステラーゼ [ C O E 3 1 3 ( 学的に修飾されたコレステロールエステラ ーゼ） '；東洋紡績社製] 等があげられる。 また、 本発明においては、 2種類 以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることも できる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修 飾する基 （化学修飾基） としては、 例えばポリエチレングリコールを主成分 とする基、 ポリプロピレングリコールを主成分とする基、 ポリプロ'ピレング リコールとポ'リエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を 含有する基、 スルホプロピル基、 スルホブチル基、 ポリ ウレタン基、 キレー ト機能を有する基等があげられるが、 ポリエチレングリコールを主成分とす る基が好ましい。 水溶性多糖類としては、 例えばデキス トラン、 プルラン、 可溶性デンプン等があげられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化 学修飾剤） としては、 上記の化学修飾基と、 酵素のアミノ基、 カルボキシル 基、スルフヒ ドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物 等があげられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、 例えばカルボキシル基、 活性エステル基 （N—ヒ ドロキシサクシンイミ ド基 等） 、 酸無水物、 酸塩化物、 アルデヒ ド、 エポキシド基、 1 , 3—プロパン スルトン、 1， 4一ブタンスルトン等があげられる。 酵素中のカルボキシル 基と反応し得る官能基または構造としては、例えばァミノ基等があげられる。 酵素中のスルフヒ ドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマ レイミ ド基、 ジス/レフィ ド、 ーハロエステル (ひ一ョードエステノレ等） 等 があげられる。
化学修飾剤として、 市販品を使用することもできる。 市販されている化学 修飾剤としては、ポリエチレンダリコールを主成分とする基と N—ヒ ドロキ シサクシンィミ ド基とを有するサンプライ ト VFM— 4 1 01、サンプライ ト ME AC— 5 OHS、 サンプライ ト MEC—5 OHS (いずれも日本油脂 社製） 、 ポリアルキレングリ コールを主成分とする基と酸無水物構造とを有 するサンブライ ト A KMシリーズ (例えば、 サンブライ ト AKM— 1 5 1 0 等） 、 サンプライ ト A DMシリーズ、 サンブライ ト A CMシリーズ (いずれ も日本油脂社製） 、 ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド 基とを有する E POX— 3400、 M— EPOX- 5000 (いずれも S h e a w a t e r P o l yme r s社製） 、 キレート機能を有する基と酸無 水物構造とを有するジエチレントリアミンー N， N， N' , N' ' ， N' ' 一ペンタ無水酢酸 （DTPA a n h y d r i d e ; 同仁化学社製） 等があ げられる。 2003/013259
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で 行うことができるが、 本方法に限定されるものではない。 まず、 コレステロ ールエステル加水分解酵素を p H 8. 0以上の緩衝液 （例えば H E P E S緩 衝液） に溶解し、 0〜55でで0. 01〜 500倍モル量の化学修飾剤を添 加し、 5分間〜 5時間攪拌する。 実際の酵素反応においては、 化学的に修飾 されたコレステロールエステル加水分解酵素として、 この反応液そのものの みならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応 化学修飾剤等を除去し たものも、 使用することもできる。 ，
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度 としては、本発明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば 特に制限はないが、 反応液中で 0. 01〜20 OUZmLの濃度であること が好ましく、 0. 02~ 100 U/mLであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、 コレステロールを酸化 して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例え ば動物、植物または微生物由来のコレステロールォキシダーゼの他、遺伝子 工学的な手法により製造されるコレステロールォキシダーゼ等も用いるこ とができ、 コレステロ一ノレォキシダーゼ "Amano" 1 (CHOD 1 ；天野ェ ンザィム社製） 、 コレステロールォキシダーゼ （CO— PE ；キッコーマン 社製） 、 コレステロールォキシダーゼ （C00321 ；東洋紡績社製） 等の 市販品を用いることもできる。 また、 本発明においては、 2種類以上のコレ ステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、 無修飾の酵素であっても、化学的に修飾され た酵素であってもよい。 化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、 例 えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することが できる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発 明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はな いが、 反応液中で 0. 01〜 20 OUZmLの濃度であることが好ましく、 0. 0 2〜10 OUZmLの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の 在 下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素 であれば特に制限はなく、 例えば動物、植物または微生物由来のコレステロ 一ルデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステ ロールデ'ヒ ドロゲナーゼ等も用いることができる。 コレステロールデヒ ドロ ゲナーゼ " Amano" 5 ( C H D H 5 ；天野ェンザィム社製） 等の市販品を 用いることもできる。 また、 本発明においては、 2種類以上のコレステロ一 ル脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。 コレステロール脱水素酵 素は、 無修飾の酵素であっても、 化学的に修飾された酵素であってもよい。 化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤 を用いて、 前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本 発明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限は ないが、反応液中で 0. 01〜 20 OIJ/mLの濃度であることが好ましく、 0. 02〜 10 OUZmLの濃度であることがより好ましい。 .
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補 酵素が使用される。 酸化型補酵素としては、 例えば NAD、 NADP、 チォ -NAD, チォー NADP等があげられる。
本発明において用いられるアルプミンとしては、本発明の HD Lコレステ ロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ヒ ト由来のアルブミン等があげられるが、 ゥシ血清アルブミ ン （B SA) が好ましくあげられる。 また、 遺伝子工学的な手法により製造 されるアルブミンも使用することができる。 本発明においては、 由来の異な る 2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明の HD Lコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、 反応液中の濃度が 0. 00 1〜1 0%であることが好ましく、 0. 0 1〜1% 3 013259
がより好ましい。
本発明における胆汁酸誘導体としては、本発明の H D Lコレステロールの 測定を可能とする胆汁酸.誘導体であれば特に制限はないが、例えば陰イオン 性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘 導体、 非ィォン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体等があげられる。
本発明の胆汁酸誘導体としては、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸 誘導体が、 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素 およぴコレステロールエステル加水分解酵素等のコレステロール測定酵素 を用いた H D Lコレステロールの測定の正確性もしくは再現性の点、または コレステロール測定酵素の保存安定性の点等で特に好ましい。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸 もしくはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくは その塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケノデォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはそ の塩、 7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2—ォキソリ トコール酸 もしくはその塩、 1 2 —ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7— ォキソデォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒ ォデォキシコール酸もしくはその塩、デヒ ドロコール酸もしくはその塩等が あげられる。 塩としては、 例えばアンモ-ゥム塩、 リチウム塩、 ナトリウム 塩、 カリウム塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩等があげられる。 陰イオン 性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明の H D Lコレ ステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の 濃度が 0 . 0 0 1 〜 3 0 %であることが好ましく、 0 . 0 1 〜 3 %がより好 ましい。 ' 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、 例えば一般式 （I )
R1 - CH2~ CH(R2) - CH2- S03~ ( I )
[式中、 R 1は、 3 - ( 3 —コラミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R 2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物 [以下、 化合 物 （I ) という] 等があげられる。 以下、 R2が水素原子である化合物 （ I ) を CHAP Sと、 R2が水酸基である化合物 （ I ) を CHAP SOとよぶ。 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明の HDLコ レステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中 の濃度が 0. 00 1 ~ 30 %であることが好ましく、 0. 0 1〜 3 %がより 好ましい。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、 例えば一般式 ( I I )
Figure imgf000023_0001
(Xは、 水素原子または水酸基を表し、 R 3および R 4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル、 または、 置換もしくは非置換のアル力 ノィノレを表す) で表される化合物 [以下、 化合物 ( I I ) という] 等があげ られる。 化合物 （ I I ) におけるアルキル基、 アルカノィル基に共通のアル キルとしては、 直鎖または分枝状の炭素数 1〜 1 0の、 例えばメチル、 ェチ ノレ、 プロピノレ、 イソプロピル、 プチノレ、 イソプチノレ、 s e c一プチノレ、 t e r t一プチノレ、 ペンチノレ、 ネオペンチノレ、 へキシノレ、 へプチノレ、 ォクチノレ、 ノニル、 デシル等があげられる。 化合物 （ I I ) 中の置換アルキル基および 置換アルカノィル基における置換基としては、 例えば水酸基、 ハロゲン原子 等があげられる。 ハロゲン原子は、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素の各原子を
' 意味する。 化合物 U I ) のうち、 R3および R4が共に、
COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH
(以下、 置換基 Aという） である化合物が好ましい。 以下、 X、 R3および 2003/013259
R4がそれぞれ、 水素原子、 置換基 Aおよび置換基 Aである化合物を d e o x y-B I GCHAP,水酸基、 置換基 Aおよび置換基 Aである化合物を B I G CHAPという。
また、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、 例えば一 般式 （ I I I )
{式中
Figure imgf000024_0001
たは ォキソ （==〇） 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V)
Figure imgf000024_0002
[式中、 X' 、 Y' および Z' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0)基を表し、. mは、 0または 1を表す]で表される基 [以 下、 置換基 （ I V) という] を表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表 される化合物 [以下、 化合物 （I I I ) という] もあげることができる。 化合物 （ I I I ) は、 例えば一般式
Figure imgf000025_0001
[式中、 X、 Υおよび Ζは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=ο) 基を表す] で表される化合物 [以下、 化合物 （V) という] と、 一般式 （V I)
Figure imgf000025_0002
(式中、 W' は、 水素原子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シ クロアルキル基、 シクロアルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 または、 置換もしくは非置換のァリール基を表し、 ηは、 3〜400の整数を表す）で表される化合物 [以下、化合物（V I )という]、 または、 一般式 （V I I )
Figure imgf000025_0003
(式中、 Τは、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、 ηは、 3〜 400の整数を表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （V I I) という] とを、 縮合剤の存在下、 溶媒中で反応させることにより製造 （合成） するこ とができる。 本反応においては、 必要に応じて塩基を共存させることもでき る。
X, Υおよび Ζは水素原子、 水酸基またはォキソ基を表すが、 X， Υ, Ζ のうち少なくとも 1つは水酸基であることが好ましい。 X'， Y' および Z' は水素原子、 水酸基またはォキソ基を表すが、 X' ， Y' ， Z' のうち少な 9
くとも 1つは水酸基であることが好ましい。
化合物 （ I I I ) および化合物 （V I ) におけるアルキル基、 アルカノィ ル基に共通のアルキル基としては、 直鎮または分岐状の炭素数 1〜1 8の、 例えばメチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 プチル基、 イソ ブチル基、 s e c-ブチル基、 t e r t—プチル基、 ペンチル基、 イソペン チル基、 ネオペンチル基、 へキシル基、 イソへキシル基、 ヘプチル基、 イソ ヘプチル基、 ォクチル基、 イソォクチル基、 ノニル基、 イソノエル基、 デシ ル基、 イソデシル基、 ゥンデシル基、 イソゥンデシル基、 ドデシル基、 イソ ドデシル基、 トリデシル基、 イソトリデシル基、 テトラデシル基、 イソテト ラデシル基、 ペンタデシル基、 イソペンタデシル基、 へキサデカシル基、 ィ ソへキサデカシル基、 ヘプタデシル基、 イソへプタデシル基、 ォクタデカシ ル基、 イソォクタデカシル基等があげられ、 メチル基、 ェチル基、 プロピル 基、 ノ-ル基、 ドデシル基等が好ましい。
化合物 （I I I ) および化合物 （V I ) におけるアルケニル基、 アルケノ ィル基に共通のアルケニル基としては、直鎖または分岐状の炭素数 2〜 8の、 例えばビニル基、プロぺニル基、イソプロぺ-ル基、ァリル基、ブテニル基、 ペンテニル基、へキセニル基、ヘプテニル基、オタテニル基等があげられる。 化合物 （ I I I ) および化合物 （V I ) におけるアルキニル基、 アルキノ ィル基に共通のアルキニル基としては、直鎮または分岐状の炭素数 2〜 8の、 例えばェチニル基、 プロピニル基、 プロパルギル基、 ブチュル基、 ペンチ二 ル基、 へキシニル基、 ヘプチュル基、 オタチェル基等があげられる。
化合物 （ I I I) および化合物 （V I) におけるシクロアルキル基として は、 炭素数 3〜 8の、 例えばシクロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロべ ンチル基、 シクロへキシル基、 シクロへプチル基、 シクロォクチル基等があ げられる。
化合物 （ I I I ) および化合物 （V I) におけるシクロアルケニル基とし ては、 炭素数 4〜 8の、 例えばシクロプロぺニル基、 シクロブテュル基、 シ クロペンテ二ノレ基、 シクロへキセニノレ基、 シクロへプテニノレ基、 シクロオタ テュル基等があげられる。
化合物 （I I I ) および化合物 （V I ) におけるァリール基としては、 炭 素数 6〜1 5の、 例えばフエ-ル基、 ナフチル基、 アント リル基、 フエナン トリノレ基、 ビフエニル基等があげられる。 化合物 （ I I I ) における置換ァ リール基の置換基としては、 例えばアルキル基等があげられる。 該アルキル 基としては、 例えば前述のアルキル基が挙げられる。
化合物 （ I I I) および化合物 （V I I ) における置換アミノアルキル基 としては、 例えば N—一置換アミノアルキル基、 N， N—二置換アミノアル キル基等が挙げられる。 N， N—二置換アミノアルキル基における窒素原子 上の 2つの置換基は同じでも異なっていてもよい。 N—一置換アミノアルキ ル基および N， N—二置換アミノアルキル基における窒素原子上の置換基と しては、 例えば前述のアルキル基等が挙げられる。 N——置換アミノアルキ ル基としては、 例えば 2— (N—メチルアミノ） ェチル基、 2― (N—ェチ ルァミノ） ェチル基、 2— （N—プロピルァミノ） ェチル基、 2— （N—プ チルァミノ） ェチル基、 3— （N—メチルァミノ） プロピル基、 3— （N— ェチルァミノ） プロピル基、 3— （N—プロピルァミノ） プロピル基、 3— (N—プチルァミノ） プロピル基、 4一 （N—メチルァミノ） ブチル基、 4 一 （N—ェチルァミノ） プチル基、 4一 （N—プ άピルァミノ） プチル基、 4一 （Ν—プチルァミノ） プチル基等を具体的に挙げることができる。 Ν， Ν—二置換アミノアルキル基としては、 例えば 2— (Ν, Ν—ジメチルアミ ノ） ェチル基、 3— （Ν, Ν—ジメチルァミノ） プロピル基、 4一 (Ν, Ν ージメチルァミノ) プチル基等を具体的に挙げることができる。 化合物 ( I I I ) お 'よび化合物 （V I I ) における非置換アミノアルキル基としては、 2—アミノエチル基、 3—ァ'ミノプロピル基、 4一アミノブチル基等を具体 的に挙げることができる'。
ηは、 エステル部分におけるォキシエチレン基の平均重合度を表す。 平均 重合度は、本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とする範囲であれば 特に制限はないが、 3〜400が好ましく、 8〜300がより好ましく、 1 5〜200が特に好ましい。
化合物 （V) としては、 例えばコール酸、 リ トコール酸、 デォキシコール 酸、 ケノデォキシコール酸、 ウルソデォキシコール酸、 7—ォキソリ トコ一 ル酸、 1 2—ォキソリ トコール酸、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸、 7 ーォキソデォキシコール酸、 ヒォコール酸、 ヒォデォキシコール酸、 デヒ ド 口コール酸等があげられる。
Wが、 水素原子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 アル力ノィル基、 アルケノィル基、 アルキノ ィル基、置換もしくは非置換のァリール基および置換もしくは非置換のアミ ノアルキル基からなる群より選ばれる基である化合物 （ I I I ) [以下、 化 合物 （ I I l a) という] を合成する場合には、 化合物 （V I ) または化合 物 （V I I ) の化合物 （V) に対する当量比は、 0. 5〜1. 5が好ましく'、 1〜1. 2がより好ましい。 Wが、 一般式 （I V) で表される基である化合 物 （ I Γ I) [以下、 化合物 （ I I I b) という] を合成する場合には、 化 合物 （V) の化合物 （V I ) または化合物 （V I I ) に対する当量比は、 1. 3〜4. 1が好ましく、 1. 7〜2. 2がより好ましい。
化合物 （ I I I ) を合成する際の反応温度としては、 1 0〜40°Cが好ま しく、 20〜3 5 °Cがより好ましい。 化合物 （I I I ) を合成する際の反応 溶媒としては、 化合物 （V) と化合物 （V I) との縮合反応を妨げないよう な溶媒であれば特に制限はないが、 例えば有機溶媒があげられる。 該有機溶 媒としては、 例えばトルエン、 キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、 酢酸ェ チル等の脂肪族エステル系溶媒、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロ ェタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒等があげられる。
化合物 （ I I I) を合成する際に使用する縮合剤としては、 化合物 （V) と化合物 （V I) または化合物 （V I I) との縮合反応を進行させるもので あれば特に制限はないが、 例えばカルポジイミ ド類、 ピリジニゥム塩、 （ベ ンゾ） チアゾリゥム塩、 （ベンゾ） ォキサゾリゥム塩、 イソシアナ一ト類、 カルボニル試薬等があげられるが、 カルポジイミ ド類が好ましい。 カルボジ ィミ ド類としては、 例えば 1， 3—ジシク口へキシルカルポジミ ド、 1， 3 ージ （ t e r t -プチル） カルポジミ ド、 1， 3—ジイソプロピルカルボジ ミ ド、 水溶性カルポジイミ ド等があげられるが、 水洗浄除去の簡便さから、 特に水溶性カルポジミ ドが好ましい。 水溶性カルボジミ ドとしては、 例えば 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルボジミ ドまたはその 塩等があげられる。 該塩としては、 例えば塩酸塩、 沃化メチル塩等があげら れる。 ピリジユウム塩としては、 例えば 2—クロロメチルピリジニゥムョー ド塩、 2—プルモメチルピリジユウムョード塩等があげられる。 （ベンゾ） ォキサゾリゥム塩としては、例えば 2—クロロべンゾォキサゾリゥムフッ化 ホウ素塩等があげられる。 （ベンゾ） チアゾリゥム塩としては、 例えば 2— クロロべンゾチアゾリゥムフッ化ホウ素塩等があげられる。 ィソシアナ一ト 類としては、 例えばク口ロスルホニルイソシアナ一ト等があげられる。 カル ポニル試薬としては、 例えば 1， 1一カルボエルジイミダゾール等があげら れる。
縮合反応における縮合剤の当量数としては、 化合物 （ I l i a) を合成す る場合には、 化合物 （V) に対して 1. 0〜5. 0当量が好ましく、 1. 1 〜2. 5当量がより好ましく、 化合物 （I I I b) を合成する場合には、 化 合物 （V I ) または化合物 （V I I ) に対して 1. 0〜5. 0当量が好まし く、 1. 1〜2. 5当量がより好ましい。
化合物 （ I I I ) を合成する際に必要に応じて使用する塩基としては、 例 えばピリジン類縁体があげられる。 該ピリジン類縁体としては、 例えばピリ ジン、 2—ピコリン、 3—ピコリン、 4—ピコリン、 2—ェチ /レビリジン、 3—ェチルピリジン、 4一ェチルピリジン、 2—プロピルピリジン、 3—プ 口ピルピリジン、 4一プロピノレビリジン、 2, 6ールチジン、 2 , 3—ルチ ジン、 2， 4ールチジン、 2， 5—/レチジン、 3， 4一ノレチジン、 3, 5— ノレチジン、 2, 4, 6—コリジン、 2， 3 , 5—コリジン、 2—ジメチノレア ミノピリジン、 4ージメチルァミノピリジン、 4一ピロリジノピリジン、 4 ーピペリジノピリジン等があげられ、 特に 4ージメチルァミノピリジン、 4 JP2003/013259
一ピロリジノピリジン、 4ーピペリジノピリジンが好ましい。 ピリジン類縁 体の当量としては、化合物（V)に対して 0. 0 1〜2. 5当量が好ましく、 0. 7〜1. 2当量がより好ましい。
化合物 （V) と化合物 （V I ) または化合物 （V I I) との縮合反応の後 処理としては、例えば水または水と有機溶媒との混合溶媒を反応溶液に加え、 生成した反応混合物から化合物 （I I I ) [化合物 （I l i a) または化合 物 （I I I b) ] を有機溶媒で抽出し、 抽出した溶液に含まれる水を乾燥剤 で除去した後、 該乾燥剤をろ過し、得られたろ液中の溶媒を常圧下または減 圧下で留去する、 という一連の操作があげられる。 また、 化合物 （I I I) を含有する抽出溶液を酸で洗浄し、 該抽出溶液中の塩基性物質 （縮合剤、 縮 合剤由来物質、 塩基） を除去してもよい。 酸で洗浄された抽出溶液は、 さら に水または食塩水で洗浄されることが好ましい。反応溶液中に加えられる有 機溶媒は、 反応に使用される有機溶媒と同じでも異なってもよいが、 同じで あることが好ましい。 また、 反応溶液中に加えられる有機溶媒と抽出に使用 される有機溶媒とは同じでも異なってもよい。反応溶液中に加えられる有機 溶媒や抽出に使用される有機溶媒としては、例えば前述の有機溶媒があげら れ、 中でもジクロロメタン、 酢酸ェチル等が好ましい。
化合物 （V) と化合物 （V I ) または化合物 （V I I) との縮合反応の後 処理により得られる化合物 （I I I ) を含有する反応混合物は、 そのままで も HD Lコレステロールの測定に使用できるが、適宜、分離 ·精製操作によ り精製されたものも使用することもできる。 該分離 ·精製方法としては、 例 えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、 HP LC、 蒸留、 分留、 再結晶 等があげられる。'
非イオン性界面活性を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応 液中の濃度が 0. 001〜30%であることが好ましく、 0. 0 1〜3%が より好ましい。
本発明の HD Lコレステロール測定法において使用される水性媒体とし ては、 例えば脱イオン水、 蒸留水、 緩衝液等があげられるが、 緩衝液が好ま しい。 緩衝液に用いる緩衝剤としては、 例えばトリス （ヒ ドロキシメチル） ァミノメタン緩衝剤、 リン酸緩衝剤、 ホウ酸緩衝剤、 グッドの緩衝剤等があ げられる。 グッドの緩衝剤としては、 例えば2—モルホリノエタンスルホン 酸 （ME S) 、 ビス （ 2—ヒ ドロキシェチ^ イミノ トリス （ヒ ドロキシメ チル） メタン （B i s—T r i s) 、 N_ (2—ァセ トアミ ド） イミノニ酢 酸 （ADA) 、 ピぺラジン一 N， N' —ビス （2—エタンスルホン酸） （P
1 PE S) 、 N- (2—ァセトアミ ド） - 2—アミノエタンスルホン酸 (A C E S) 、 3一モルホリノ一 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 （MO P S O) 、 N， N—ビス （ 2—ヒ ドロキシェチノレ） 一 2—アミノエタンスルホン 酸 （BE S) 、 3—モルホリノプロパンスルホン酸 （MOPS) 、 N— 〔ト リス（ヒ ドロ.キシメチル）メチル〕一 2—アミノエタンスルホン酸（TE S)、
2 - [4 - ( 2—ヒ ドロキシェチル') 一 1ーピぺラジュノレ〕 エタンスノレホン 酸 （HE PE S) 、 3— [Ν, N—ビス （2—ヒ ドロキシェチル） ァミノ〕 一 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 （D I P S〇） 、 N— 〔トリス （ヒ ド 口キシメチル) メチル〕 — 2—ヒ ドロキシー 3—アミノプロパンスルホン酸
(TAP SO) 、 ピぺラジン一 N, N， 一ビス （2—ヒ ドロキシプロパンス ルホン酸） （POP SO) 、 3— 〔4一 （2—ヒ ドロキシェチノレ） 一 1ーピ ペラジニル〕 一 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸 （HEPP S.O) 、 3— 〔4一 （2—ヒ ドロキシェチル） 一 1ーピぺラジュノレ〕 プロパンスノレホン酸 〔 (H) E P P S〕 、 N— 〔トリス (ヒ ドロキシメチル) メチル〕 グリシン (T r i c i n e) 、 N, N—ビス （2—ヒ ドロキシェチル） グリシン （B i c i n e) 、 N— トリス （ヒ ドロキシメチル) メチルー 3—ァミノプロパ ンスルホン酸 (TAP S) 、 N—シクロへキシノレ一 2—アミノエタンスルホ ン酸 （CHE S) 、 N—シク口へキシルー 3ーァミノー 2—ヒ ドロキシプロ パンスルホン酸 （CAP SO) 、 N—シクロへキシノレ一 3—ァミノプロパン スルホン酸 （CAP S) 等があげられる。 緩衝液の濃度は測定に適した濃度 であれば特に制限はされないが、 0. 00 1~2. 0mo 1 /Lが好ましく、 0. 005〜1. 0 mo 1 /Lがより好ましい。
以下に、 本発明の HDLコレステロ ^ルの測定方法、 測定用試薬および測 定用キットを具体的に説明する。
(HD Lコレステロールの測定方法）
本発明の HD Lコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の 方法があげられる。
測定方法 1
( 1 ) 検体と、 無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレス テロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型捕酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有す る水性媒体中で反応させ、
(2) 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3) (2) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、検体中の HD Lコレステロール を測定することができる。
測定方法 2
( 1 ) 検体と、 無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレス テロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体およびァ ルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、
(2) 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、 '
(3) (2) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、検体中の HD Lコレステロール を測定することができる。
測定方法 3
( 1 ) 検体と、 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素お よびコレステロール酸化酵素、 または、化学的に修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、
( 2 ) 生成した過酸化水素または還元型捕酵秦を測定し、
(3) (2) で測定した^ (直と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、検体中の HD Lコレステロール を測定することができる。
測定方法 4
(1) 検体と、 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素お よびコレステロール酸化酵素、 または、 化学的に修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、 胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する水性媒体中で反応-させ、
(2) 生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、 ：
(3) (2) で測定した値と、 予め作成した検量線とから、 検体中の HDL コレステロール濃度を算出することにより、検体中の HDLコレステロール を測定することができる。
本測定法においては、 （1) の反応は、 例えば 1 0〜50°Cで、 好ましく は 20 ~ 40 で、 1〜 60分間、 好ましくは 2〜 3 0分間反応を行う。 生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素測定用試薬により測定する ことができる。 過酸化水素測定用試薬は、 生成した過酸化水素を検出可能な 物質へ変換するための試薬である。 検出可能な物質としては、 例えば色素、 発光等があげられる力、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、 過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルォキシダーゼ等の過 酸化活性物質を含有する。 酸化発色型色原体としては、 例えば後述の酸化発 色型色原体があげられる。 検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測 定用試薬は、 化学発光物質を含有する。 化学発光物質としては、 例えばルミ ノール、 イソルミノール、 ルシゲニン、 アタ リジニゥムエステル等があげら れる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルォキシダーゼ 等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、 過酸化水素は、 過酸 化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成し 色素を定量することにより、 過酸化水素を定量することができる。 また、 化 学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素 は、 化学発光物質と反応してフォ トンを生じ、 生じたフォ トンを定量するこ とにより、 過酸化水素を定量することができる。
酸化発色型色原体としては、 例えばロイコ型色原体、 酸化カップリング発 色型色原体等があげられる。 ロイコ型色原体は、 過酸化水素およびペルォキ シダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。 具体的には、 1 0— N—カルボキシメチルカルバモイルー 3， 7一ビス (ジ メチルァミノ） 一 1 0H—フエノチアジン （CCAP) 、 1 0— N—メチル カ^^バモイル一 3, 7—ビス （ジメチ レアミノ） 一1 0H—フエノチアジン (MCD P) 、 N— （力ルポキシメチルァミノ力ルポニル） 一 4， 4' ービ ス (ジメチルァミノ） ジフエニルァミン ナトリ ゥム塩 （D A— 64) 、 4， 4， 一ビス （ジメチルァミノ） ジフエ ^ルァミン、 ビス 〔3—ビス （4ーク ロロフエニル） メチルー 4ージメチルァミノフエニル〕 ァミン （BCMA) 等があげられる。
酸化カツプリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダーゼ等 の過酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸化的カツプリングして色素を 生成する物質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、 カプラーと'ァニ リン類との組み合わせ、カプラーとフエノール類との組み合わせ等があげら れる。 カプラーとしては、 例えば 4ーァミノアンチピリン （4一 AA) 、 3 ーメチルー 2—べンゾチアゾリノンヒ ドラジン等があげられる。 ァニリン類 としては、 N— （3—スルホプロピル） ァニリン、 N—ェチル一 N— (2— ヒ ドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3—メチルァニリン （TOOS) 、 N ーェチルー N— （2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピノレ） 一 3， 5—ジメチ ノレァニリン （MAOS) 、 N—ェチノレー N— （2—ヒ ドロキシー 3—スノレホ プロピル） 一 3， 5ージメ トキシァニリン （DAO S) 、 N—ェチル一 N— (3—スルホプロピル） 一 3—メチルァニリン （TOP S) 、 N— （2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキシァニリ ン （HDAO S) 、 N, N—ジメチルー 3—メチルァニリン、 N, N—ジ （3—スルホプ 口ピル) — 3, 5—ジメ トキシァニリ ン、 N—ェチルー N— (3—スノレホプ 口ピル） 一 3〜メ トキシァニリン、 N—ェチル一 N— （3—スルホプロピル） ァニリン、 N—ェチルー N— ( 3一スルホプロピル) 一 3， 5—ジメ トキシ ァニリン、 N— (3一スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキシァニリン、 N ーェチルー N— ( 3一スルホプロピル) 一 3， 5—ジメチルァニリン、 N— ェチノレ一 N— (2—ヒ ドロキシー 3—スノレホプロピゾレ) 一 3—メ トキシァニ リ ン、 N—ェチル一 N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スノレホプロピノレ）ァ-リ ン、 N—ェチルー N— (3—メチノレフエニル） 一 N' ーサクシニノレエチレンジァ ミン （EMSE) 、 N—ェチノレー N— （ 3—メチノレフエ二ノレ） 一 N， ーァセ チルエチレンジァミン、 N—ェチノレ一N— (2—ヒ ドロキシー 3—スノレホプ 口ピル) 一 4一フルオロー 3， 5ージメ トキシァニリン （F— DAOS) 等 があげられる。フエノール類としては、フエノール、 4一クロ口フエノール、 3—メチルフエノール、 3—ヒ ドロキシー 2， 4， 6— トリ ョード安息香酸 (HT I B) 等があげられる。
過酸化水素の測定において、 過酸化活性物質の濃度は、 測定に適した濃度 であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーォキシダーゼを用い る場合は、 1〜100 kUZLが好ましい。 また、 酸化発色型色原体の濃度 は、 測定に適した濃度であれば特に制限はないが、 0. 01〜1 0 g//Lが 好ましい。
還元型捕酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸 光度を測定する方法、還元型捕酵素測定用試薬を用いる方法等があげら れる。 還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、 3 0 0〜 5 00 n mが好ましく、 3 3 0〜 40 0 n mがより好ましく、 340 nm付近が特に好ましい。 還元型補酵素測定用試薬は、 生成した 還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能 な物質としては、 例えば色素等があげられる。 検出可能な物質が色素の 場合の還元型補酵素測定用試薬としては、 例えばジァホラーゼ、 電子キ ャリァーおよび還元発色型色原体を含有する試薬があげられる。電子キ ャリア一としては、例えば 1ーメ トキシー 5一メチルフエナジゥムメチ ルサルフェート等があげられる。 還元型補酵素測定用試薬として、 ジァ ホラーゼ、電子キヤリァーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用 いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量する ことにより、 還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、 例えば 3— （4， 5—ジメチルー 2—チアゾ リル） 一 2, 5ージフエ-ル一 2H—テトラゾリゥム プロミ ド （MTT) 、 2— （4—ョードフエ-ノレ） 一 3— （4一二トロフエ二ノレ） 一 5— （2， 4 一ジスルホフエニル) 一 2H—テトラゾリゥム モノナトリゥム塩 （WST - 1 ) 、 2— （4一ョードフエ二ノレ） 一 3— （2， 4ージニトロフエ二ノレ） — 5— ( 2， 4一ジスルホフエ二ノレ) 一 2H—テトラゾリゥム モノナトリ ゥム塩 （WST— 3) 等があげられる。
(HD Lコレステロール測定用試薬）
本発明の HDLコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の 試薬があげられる。
5 ^薬 1 ,
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 2
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 3
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬 4
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 胆汁酸誘導体、 アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬 5
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 胆汁酸誘導体、 酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する 試薬。
試薬 6
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 胆汁酸誘導体、 アルブミン、 酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試 薬を含有する試薬。
g ^薬 ,
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
5式 O
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル酸化酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミンおよび過'酸化水素測定用試薬を含有 する試薬。
試薬 9
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素、 胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬 1 0 ' 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステ ΰ一 ル脱水素酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試 薬。
試薬 1 1
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素、 胆汁酸誘導体、 酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬 を含有する試薬。
試薬 1 2 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミン、 酸化型補酵素および還元型補酵 素測定用試薬を含有する試薬。 '
本発明の H D Lコレステロール測定用試薬においては、前述の本発明の H D Lコレステロ一ノレの測定方法においてあげられたコレステロ一ノレエステ ル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステロール脱水素酵素、 胆 汁酸誘導体、 アルブミン、 過酸化水素測定用試薬、 酸化型補酵素、 還元型補 酵素測定用試薬を用いることができる。
(H D Lコレステロール測定用キット）
本発明の H D Lコレステロール測定用試薬は、 キットの形態で保存、 流通 および使用されてもよい。 キットの形態としては、 特に制限はなく、 2試薬 系、 3試薬系等のいずれであってもよいが、 2試薬系が好ましい。 . 第一試薬'と第二試薬とからなる 2試薬系の H D Lコレステロール測定用 キットにおいては、 コレステロールエステル加水分解酵素と、 コレステロ一 ル酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、 第一試薬と第二試薬に 別々に含有されても、 第二試薬に一緒に含有されてもよいが、 第一試薬と第 二試薬に別々に含有される場合には、 コレステロールエステル加水分解酵素 が第一試薬に、 コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が 第二試薬に含有される態様が好ましい。 胆汁酸誘導体は、 第一試薬、 第二試 薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。 コレステロール脱水素酵素を 用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、 第一試薬、 第二試薬のい ずれかまたは両方に含有されてもよい。過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有されても.よいが、当該試薬が酸化カツ プリング型色原体を含有する場合には、酸化力ップリング型色原体のそれぞ れの化合物は別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元型補酵素測定用 試薬は、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。 ま た、 アルブミンは、 第一試薬: 第二試薬のいずれかまたは両方に含有されて もよい。 具体的には、 例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット 1
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体および過酸 化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 2
ill— 5式薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミ ンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 3
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体 および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 4
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体、 アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素およぴ過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 キット 5
第一 - 過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 一 薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
¾ッ 卜 6
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
一
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 7
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット 8
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素おょぴ胆汁酸誘導体を含 有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型捕酵素を含有する試薬。
キット 1 0 2003/013259
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアル プミンを含有する試薬。
Figure imgf000041_0001
コレステロール脱水素酵素および酸化型捕酵素を含有する試薬。
キット 1 1
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含 有する試薬。
^一
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬 を含有する試薬。
キット 1 2
^一 5式薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアル ブミンを含有する試薬。
^一 δ式
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬 を含有する試薬。
キット 1 3
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸 誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 4
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体 およびアルブミンを含有する試薬。
第一 B式薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 5
第一試薬 '
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸 誘導体を含有する試薬。
一
コレステロール脱水素酵素、酸化型捕酵素および還元型補酵素測定用試薬 を含有する試薬。
キット 1 6
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体 およびアルブミンを含有する試薬。
一 5式
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬 を含有する試薬。
キット 1 7
一 δ式
'胆汁酸誘導体を含有する試薬。
一 薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵 素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 8
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵 素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット 1 9
第一 薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
一 BA¾¾
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 0
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
一 BA¾¾
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、 酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット 2 1
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素および酸化型捕酵素を含有する試薬。
キット 2 2
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素および酸化型捕酵素を含有する試薬。
キット 2 3 胆汁酸誘導体を含有する試薬。 第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キッ ト 2 4
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
一 p薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型捕酵素測定用試薬を含有する試薬。 本発明の H D Lコレステロール測定用キットにおいては、前述の本発明の H D Lコレステロ一ノレの測定方法においてあげられたコレステロ一ノレエス デル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステロール脱水素酵素、 胆汁酸誘導体、 アルブミン、 過酸化水素測定用試薬、 酸化型補酵素、 還元型 捕酵素測定用試薬を用いることができる。
本発明の H D Lコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要 に応じて、 水性媒体、 安定化剤、 防腐剤、 影響物質消去剤、 反応促進剤等が 含有されてもよい。 水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等があげられ る。 安定化剤としては、 例えばヱチレンジァミン四酢酸 （E D T A ) 、 シュ 一クロース、 塩化カルシウム等があげられる。 防腐剤としては、 例えばアジ 化ナトリウム、 抗生物質等があげられる。 影響物質消去剤としては、 例えば ァスコルビン酸の影響を消去するためのァスコルビン酸ォキシダーゼ等が あげられる。 反応促進剤としては、 例えばコリパーゼ、 ホスホリパーゼ等の 酵素、硫酸ナトリゥム、塩化ナトリゥム等の塩類といったものがあげられる。 本発明の H D Lコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥 された状態でも、 水性媒体に溶解された状態でもよい。 凍結乾燥された状態 の試薬を用いて検体中の H D Lコレステロールを測定する場合には、当該試 薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明の H D Lコレステロール測定用試薬おょぴ測定用キットにおける コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素、 コレステ ロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 01〜80 OU/mLとなる含量が好ましく、 0. 0 2〜400U/mLと なる含量がより好ましい。本発明の HD Lコレステロール測定用試薬および 測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、水性媒体で溶解された 状態での濃度が 0. 00 1〜30°/0となる含量が好ましく、 0. 0 1~1 0% となる含量がより好ましい。本発明の HD Lコレステロール測定用試薬およ び測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された 状態での濃度が 0. 00 1〜10%となる含量が好ましく、 0. 01〜5% となる含量がより好ましい。
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を何ら限定するものではない。 尚、 本実施例においては、 下記の試薬およ び酵素を使用した。
HE PE S (BDH L a b o r a t o r y社製） 、 EMS E (ダイ トー ケミックス社製） 、 ゥシ血清アルブミン （B S A ；オリエンタル社製） 、 4 ーァミノアンチピリン（埼京化成社製） ペルォキシダーゼ（東洋紡績社製）、 L P L 31 1 (コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製） 、 L PL 6 (コレステロールエステル加水分解酵素；天野ェンザィム社製） 、 C HE 2 (コレステロールエステル加水分解酵素；天野ユンザィム社製） 、 C OE 3 1 3 (化学修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡 績社製） 、 C003 2 1 (コレステロールォキシダーゼ；東洋紡績社製） 、 コール酸ナトリウム （ACROS社製） 、 タウロコール酸ナトリウム （東京 化成社製）、 B I GCHAP (同仁化学社製）、 CHAP S (同仁化学社製）、 デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万； フアルマシア社製） 。
また、 本実施例において、 胆汁酸誘導体の同定に際して、 下記の分析機器 を用いて各種データを取得した。
椟磁気共鳴スぺク トル（ -應 R， 13C - MR)： J EOL 03 一400 (日本 電子社製） -眉 Rスぺク トル測定においては、テトラメチルシランを内部標準として 用い、 テトラメチルシランを基準とした化学シフ ト （S)を表す。 13C -画 Rス ぺクトル測定においては、 CDC13由来の 3本のピークの中心のピークを 77.0 ppraとした時の各ピークの化学シフト （δ)を表す。
赤外吸収スぺク トル （ I R) ： N i c o l e t NE XU S 470 (ニコ レー社製）
ゲルパーミエーシヨンクロマ小グラフィー （GP C) ：
システム ： TOSOH HLC- 8 1 20GPC (東ソ一社製） GPCカラム： TSKg e l S u e r H— RC (低分子分析用） (東ソ一社製） 2本を直列接続した。
力ラム保持温度： 40 °C
展開溶媒：テトラヒドロフラン
流速： 0. 5mLZ分
検出器： R I (屈折率）
検量線作成用標準物質：ポリエチレンダリコール
発明を実施するための最良の形態
参考例 1 化学修飾 L P L 3 1 1 (化学的に修飾された L P L 3 1 1 ) の調 製
HEP E S緩衝液 （ρΗ8. 5， 0. 1 5 m o 1 /L) に、 LP L 3 1
1を 3 3 g/Lとなるように加え 5 °Cに冷却した後、サンブライ ト VFM -4 1 0 1またはサンブライ ト AKM— 1 5 1 0またはサンブライ ト ME AC- 50HS (いずれも日本油脂社製） を 330 g/Lとなるように加 え、 さらに 3時間反応させた。 得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのま ま化学修飾 L P L 3 1 1として使用した。
参考例 2 化学修飾 CHE 2 (化学的に修飾された C HE 2) の調製
HE P E S緩衝液 （ρΗ8. 5 , 0. 1 5 m o 1 /L) に、 CHE 2を 50 g/Lとなるように加え 5 °Cに冷却した後、サンプライ 1、 VFM— 4 10 1 (日本油脂社製） を 200 g/Lとなるように加え、 さらに 3時間 反応させた。得られた修飾酵素溶液を'精製分離せずそのまま化学修飾 C H E 2として使用した。
実施例 1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HEP E S (ρΉ 7. 5) 1 0 mm o 1 L
Figure imgf000047_0001
HE Ρ Ε S (ρ Η 7. ひ） 1 0 mm o i / L
4一ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺ/レオキシダーゼ 20 k
化学修飾 L P L 31 (V FM- 4 10 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L コール酸ナトリウム 6. 0 g/L 実施例 2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HJDLコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE PE S (pH7. 5) 1 0 mm o 1 / L EMS E 0. 3 .g/L
Figure imgf000047_0002
第二試薬
HE P E S (pH7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾したもの） P T/JP2003/013259
0. 2 k U/L
C OO 3 2 1 3. 0 k U/L .
コール酸ナトリウム 6. 0 g/L
実施例 3 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第；試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE P E S (ρ H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g /L
•第二試薬
HE P E S ( p H 7. 0) 1 0 mm o l /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g /L
ペルォキシダーゼ , 2 0 k U/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 1 0 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
C O O 3 2 1 3. 0 k U/L タウロコ一ル酸ナトリウム 7. 0 gZL
実施例 4 HD Lコレステロール測定用キット .
以下の第一試薬おょぴ第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
HE P E S (p H 7. 5 ) 1 0 mm o l /L
EMS E 0. 3 g /L
B S A 2. 0 g/L
•第一 a 薬
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 gZL '
'ーゼ 2 0 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 1 0 1で修飾したもの）
0. 2 kU/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L タウロコ一ノレ酸ナトリウム 7. 0 gZL 実施例 5 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 10 mm o 1 L
Figure imgf000049_0001
第― 5式薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L 化学修飾 L P L 3 1 (VFM- 4 10 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L
B I GCHAP 4. 5 g/L 実施例 6 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1. L
Figure imgf000049_0002
- 一 5式薬
HE PE S (pH7. 0) 1 0 mm o 1
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L -ゼ 20 kU/L 化学修飾 LP L 3 1 1 (V FM- 4 10 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L
B I GCHAP 4. 5 g/L 実施例 7 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 ·
•第一試薬
HEPE S (ρΗ7. 5) 1 0 mm o I /L
Figure imgf000050_0001
-第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 10 1で修飾したもの）
0 · 2 k U/L
COO 321 3. 0 k U/L
CHAP S 6. 0 g/L 実施例 8 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HEPE S (ρ H 7. 5) 1 0 mmo l /L
EMS E 0. 3 g
， B S A 2. 0 g
• 弟一 朵
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mmo l /L ペルォキシダーゼ 2 0 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 1 0 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L
Figure imgf000051_0001
比較例 1 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる. HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o \ /L
Figure imgf000051_0002
第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 丄 . L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 2 0 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 1 0 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L 比較例 2 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 /L
Figure imgf000051_0003
-第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L 4—ァミノアンチピリン 0. 3 g ペルォキシダーゼ 20 kU/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾したもの）
. 0. 2 k U/L
COO 32 1 3. 0 k U/L 実施例 9 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
一 5式 ¾
HEP E S (p H 7. 5)
Figure imgf000052_0001
第二試薬
HEP E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺゾレオキシターゼ 20 k U/L
L P L 6 0. 0 5 k U/L COO 321 3. 0 k U/L コール酸ナトリウム 6. 0 g/L 実施例 10 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 '
•第一試薬
HE PES (p H 7. 5) 1 0 mmo l /L
EMS E 0. 3 g/L
•第二試薬 '
HE PES (p H 7. 0) 1 0 mmo l /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 0 5 kU/L COO 3 2 1 3. 0 kU/L コール酸ナトリウム 6. 0 g/L 実施例 1 1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第—試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE P E S (pH7. 5) 1 0 mm o 1 / L EMS E 0. 3 g/L
Figure imgf000053_0001
•第一 5式薬
HE P E S (pH7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0.- 3 g/L ぺノレォキシダ一ゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 0 5 k U/L
C OO 3 21 3. 0 k U/L タウロコール酸ナトリウム 7. 0 g/L 実施例 1 2 HDLコレステロール測定用キッ ト
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
• 一 ¾¾
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1
Figure imgf000053_0002
•第― 5式薬 '
HE PE S ( p H 7. 0 ) 1 0 mm o 1
4—ァミノアンチピリン ' 0. 3 g/L ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L L P L 6 0. 0 5 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L タウロコ一ル酸ナトリウム 7. 0 g/L 実施例 1 3 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 10 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L •第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4 _アミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 05 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L
B I GCHAP 4. 5 g/L 実施例 14 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HEP E S (p H 7. 5) 10 mm o 1 / L , EMS Ε 0. 3 g/L
B S A 2. 0 g/L •第二試薬
HE PE S (ρ H 7. 0) ' 1 0 mm o 1 / L 4—アミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 0 5 k U/L COO 3 2 1 3. 0 k
B I GCHAP 4. 5 g/L 実施例 1 5 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
'第一 5^¾¾
HE PE S (p H 7. 5)
EMS E 0. 3 g/L •第一 a式薬
HE PE S (p H 7. 0) 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
L P L 6 0. 0 5 k U/L COO 3 2 1 3. 0 k U/L
Figure imgf000055_0001
実施例 1 6 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L
B S A 2. 0 g/L
-第二試薬
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4—アミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 k U/L
L P L 6 0. 05 k U/L
C〇〇 3 2 1 3. 0 k U/L CHAP S 6. 0 ！
比較例 3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 '
-第一試薬
HE PE S (pH7. 5) 1 0 mm o 1 /L
EMS E 0. 3 g/L
-第二試薬
HEPE S ( p H 7. 0) 1 0 mmo l /L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L
L P L 6 0. 0 5 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L 比較例 4 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HEPE S (p H 7. 5) 1 0 · mm o 1 / L
EMS E 0. 3 i
B S A 2. 0 J
•第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L
L P L 6 _ 0. 0 5 kU/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L 実施例 1 7 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ 3259
ットを調製した。
•第一試薬
HEPE S ( Η7. 5) 1 0 mm o 1 /L
EMS E 0. 3 g/L
-第二試薬
HEPE S (ρ H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 CHE 2 (VFM-4 10 1で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 3. 0 k U/L コール酸ナトリウム 6. 0 g/L
実施例 18 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
' Wi一 B式 '
HEPE S (p H 7. 5) ( 1 0 mm o 1 /L
Figure imgf000057_0001
•第—
HE PE S ( p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4—ァミノアンチピリ ン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 k U/L
化学修飾 LP L 3 1 1 (MEAC- 50 HSで修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 3 21 3. 0 k U/L コール酸ナトリウム 6·' 0 g/L
実施例 1 9 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ T/JP2003/013259
ットを調製した。
•第一試薬
HE PE S ( H 7. 5) 1 0 mm o 1 L EMS E 0. 3 g
-第二試薬
HEP E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 上 L
4一アミノアンチピリン
ぺノレオキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 3 1 (AKM— l 5 1 0で修飾したもの）
0. 2 k U/L
COO 32 1 3. 0 kU/L コーノレ酸ナトリウム 6. 0 g /L
実施例 20 HD Lコレステロール測定用キッ ト
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE PE S (pH7. 5) . 1 0 mm o 1 /L
Figure imgf000058_0001
•第二試薬
HE PE S ( p H 7. 0) 1 0 mm o 1 L
4一ァミノアンチピリ ン · 0. 3
ぺノレオキシダーゼ 20
COE 3 1 3 1. 0 k
COO 321 3. 0 k U/L コール酸ナトリウム 6. 0 g/L
実施例 21 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットを用いて、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清
30検体中の HDLコレステロールを測定した。 P T/JP2003/013259
(1) 検量線の作成
標準液として、 生理食塩水 （HDLコレステロール濃度： 0. OmgZd L ) および血清 （HDLコレステロール濃度： 60. Omg/d L) を、 キ ットとして実施例 1のキットを用いて、 日立 71 70型自動分析装置により、 HDLコレステロール濃度と 「吸光度」 との間の関係を示す検量線を作成し た。
ここでの 「吸光度」 どは、 以下の反応で測定された 2つの吸光度 （E 1お よび E 2) を基に、. E 2から E 1を差し引くことにより得られた値を表す。 '反応セルへ標準液（ 3 /1 L ) と第一試薬（0. 24mL) とを添加し 3 7 °C で 5分間加温し、 反応液の吸光度 （E 1) を主波長 600 nm、 副波長 70 O nmで測定し、 次いで、 この反応液に第二試薬 （0. 08mL) を添加し さらに 3 7 °Cで 5分間加温し、反応液の吸光度（E 2)を主波長 600 nm、 副波長 700 n mで測定した。
(2) ヒ ト血清検体と実施例 1のキットとの反応による当該検体における 「吸光度」 の算出
(1) の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒ ト血清検体を用 いる以外は、 （1) の 「吸光度」 の算出方法と同様の方法により、 当該検体 における 「吸光度」 を算出した。
(3) ヒ ト血清検体中の HD Lコレステロール濃度の測定
(2) で算出した 「吸光度」 と、 （1) で作成した検量線とから、 各検体 中の HD Lコレステロール濃度を測定した。
実施例 22 HD Lコレステロールの測定 ' 実施例 1のキッ トの代わりに実施例 2のキットを用いる以外は実施例 2
1の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清 30 検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 23 Ht) Lコレステロールの測定
実施例 1のキクトの代わりに実施例 3のキットを用いる以外は実施例 2
1の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清 30 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 4 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 4のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 5 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 6 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 7 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 7のキットを角いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 8 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 8のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロ一ノレを測定した。
比較例 5 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに比較例 1のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
比較例 6 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに比較例 2のキ トを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 2 9 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 9のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 0 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 0のキッ トを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 1 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 1のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロ一ノレを測定した。
実施例 3 2 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 2のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 3 H D Lコレステロールの測定 '
実施例 1のキッ トの代わりに実施例 1 3のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロ一ノレを測定した。
実施例 3 4 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに実施例 1 4のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 5 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 5のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 2003/013259
0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 6 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 6のキッ トを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
比較例 7 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに比較例 3のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
比較例 8 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 4のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒト血清 3 0 検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 7 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 7のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 8 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 8のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 3 9 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 1 9のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 4 0 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに実施例 2 0のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 0検体中の H D L コレステロールを測定した。
—方、実施例 2 1〜4 0および比較例 5〜8の測定において用いたヒ ト血 清 3 0検体を用いて、 クリ二力ルケミストリー第 4 5卷、 1 0号 （1 9 9 9 年） に記載された D C M法 （Designated Comparison Method) により当該検 体中の H D Lコレステロールを測定し、 各測定法と比較した。
実施例 2 1〜 4 0およぴ比較例 5〜 8それぞれの測定法と、 D C M法によ る測定法との相関係数を表 1に示す。
表 1
Figure imgf000064_0001
実施例 21〜28の結果から明らかなように、 コレステロールエステル加 水分解酵素として化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵 素を用いた場合には、 アルブミンの有無にかかわらず、 コール酸、 タウロコ ール酸、 B I GCHAP, CHAP Sのいずれの胆汁酸誘導体の存在下でも、 D C M法による測定との間に良い相関が認められたが、比較例 5および 6に 示されているように、 胆汁酸誘導体の非存在下では、 アルブミンの有無にか かわらず、 DC M法による測定との間に良！/、相関が認められなかった。 一方、 実施例 29と実施例 30、 実施例 3 1と実施例 3 2、 実施例 33と 3013259
実施例 34、 実施例 3 5と実施例 3 6との比較から、 コレステロールエステ ル加水分解酵素として無修飾の酵素を用いた場合には、胆汁酸誘導体として コール酸またはタウロコール酸を存在させた条件下では、アルプミンを添加 した方が D C M法による測定との間の相関が良好であつたが、胆汁酸誘導体 として B I GCHAPまたは CHAP Sを存在させた条件下では、アルブミ ンの有無にかかわらず、 D CM法による測定との間に良い相関が得られるこ とが判明した。
また、 実施例 21と実施例 3 7との比較より、 化学修飾 L P L 3 1 1以外 の化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定 においても、 D CM法による測定との間に良い相関が得られることが判明し た。 さらに、 実施例 2 1と実施例 3 8との比較、 およぴ、 実施例 21と実施 例 39との比較より、 化学修飾剤として、 V FM— 4 10 1以外の修飾剤を 用いて調製した化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素 を用いた場合においても、 D C M法による測定との間に良い相関が得られる ことが判明した。 また、 例 2 1と実施例 40との比較より、 化学的に修 飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として市販品を用いた場合 においても、 D C M法による測定との間に良い相関が得られることが判明し た。
実施例 41 コール酸エステル [化合物 （I I I a— 1) ] の合成
滴下装置、 攪拌装置、 温度計、 冷却管および窒素ガス導入管を備えたフラ スコ内に、 ポリエチレングリコール メチル エーテル （平均分子量 200 0、 アルドリッチ社製) 1 1 0 g (5 5 mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピリジ ン （広栄化学工業社製） 6. 7 g ( 5 5 mm o .1 ) およびジクロロメタン 1 O OmLを力 Πえ、 溶解した。 その溶解液にコール酸 （ミクニ化学産業社製） 20. 4 g (50mm o 1 ) 、 次いで、 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァ ミノプロピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイバイッ社製） 1 0.5 g (55 mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 200mL、 水 30 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2m o 1 ,Lの 塩酸 2 0 0 m Lにて洗浄し、 1 0 %食塩水 3 0 0 m Lで 2回洗浄した。 その 後、 分離した有機層に酢酸ェチル 5 0 0 m Lを加え、 1 0。/。食塩水 3 0 0m Lで 3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥し、 乾燥剤をろ過除去 して、 ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。 さらに、 真空ポ ンプを用いて 8 0°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （I l i a— 1) 1 1 5 g (収率 9 6 %) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000066_0001
—丽 R (CDC13， δ ppra, 400MHz) ： 0.69 (s， 3H)， 0.90 (s, 3H) ， 0.98 (d， J=6.0Hz, 3H)， 0.98-2.40 (m, 27H) , 3.38 (s， 3H) , 3.64 (bs, 179H), 3.97 (s, 2H)， 4.22 (m, 2H) . 13C- NMR (CDC13, 5 ppm, 100MHz) ： 12.5, 17.3, 22.5 23.2, 26.4, 27.5， 28.3, 30.4, 30.8, 31.1， 34.7, 35.2, 35.3, 39.5, 39.6， 41.5, 41.7, 46.4, 47.0， 59.0， 63.4， 68.2, 69.1， 70.5， 70.9， 71.7， 71.9， 72.9, 174.2. IR (KBr Disk, era"1)： 2887, 1734, 1468, 1343, 1149, 1111, 1060, 963， 842. GPC (平均分子量） ： Mw 2390 (Mw/Mn 1.05) .
実施例 4 2 コール酸エステル [化合物 （ I I I a— 2) ] の合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリコール メチル エーテル （平均分子量 40 0、 日本油脂社製ュニオックス M— 4 00) 4. 8 g ( 1 2mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピリジン （広栄化学工業社製) 1. 4 6 g ( 1 2mm o 1 ) およびジクロロメタン 3 0mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミ クニ化学産業社製） 4. 0 8 g ( 1 Omm o 1 ) 、 次いで、 1ーェチルー 3 一 ( 3ージメチルァミノプロピル）カルボジミ ドの塩酸塩（アイバイッ社製） 2. 3 g ( 1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 20mL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2 m o 1 / Lの塩酸 50 m Lにて洗浄し、 10 %食塩水 50 m Lで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に酢酸ェチル 1 0 OmLを加え、 1 0%食塩水 1 0 OmLで 3回洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 乾燥剤をろ過 除去して、 ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。 さらに、 真 空ポンプを用いて 8 0°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I I I a— 2) 7. 8 g (収率 9 5%) を無色油状物質として得た。
Figure imgf000067_0001
¾—刚 R (CDC13, S ppm, 400MHz)： 0.68 (s, 3H)， 0.89 (s, 3H) , 0.98 (d， J=6. OHz, 3H)， 0.98-2.31 (m, 27H) , 3.38 (s， 3H) , 3.45 (bs， 1H), 3.55 (bs， 2H)， 3.65 (bs， 32H)， 3.85 (bs, 1H)， 3.96 (bs， 1H) , 4.22 (bs， 2H) . 13C -應 R (CDC13, δ ppm, 100MHz) ： 12.5, 17.3， 22.5， 23.2, 26.3, 27.5, 28.2， 30.4， 30.9, 31.2， 34.7, 34.8, 35.3, 39.5， 41.5, 41.6, 46.4， 47.0, 59.0, 63.4, 68.4, 69.2， 70.6, 71.8， 71.9， 73.0， 174.3. IR (KBr Disk, cm"1)： 2931 2868, 1734， 1451, 1375， 1299， 1251, 1110， 1111, 1045, 950, 856. GPC
(平均分子量） ： Mw 820 (Mw/Mn 1.04) .
実施例 43 コール酸エステル [化合物 （I I I a— 3) ] の合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリ コール メチル エーテル （平均分子量 1000、日本油脂社製ュニオックス M— 1 000) 1 2 g (l 2 mm o 1 )、 ジメチルァミノピリジン （広栄化学工業社製） 1.46 g (1 2mmo 1 ) およびジクロロメタン 5 OmLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミ クニ化学産業社製） 4. 08 g ( 1 Omm 0 1 ) 、 次いで、 1ーェチルー 3 JP2003/013259
一（3—ジメチルァミノプロピル）カルボジミ ドの塩酸塩（アイバイッ社製）
2. 3 g (1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 30mL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2 m o 1 / Lの塩酸 50 m Lにて洗浄し、 10 °/0食塩水 50 m Lで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に酢酸ェチル 20 OmLを加え、 1 0%食塩水20 OmLで 3回洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 乾燥剤をろ過 除去して、 ロータリーエバポレーターを用いて、 ろ液を濃縮した。 さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （I I I a— 3) 1
3. 2 g (収率 9 5%) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000068_0001
-匪 R (CDC13， δ ppm, 400MHz) ： 0.68 (s， 3H) , 0.89 (s， 3H) ， 0.98 (d， J=6.2Hz， 3H), 0.98-2.45 (m, 27H) , 3.38 (s， 3H) , 3.46 (bs， 1H), 3.55 (bs， 2H), 3.64 (bs， 請）, 3.84 (bs， 1H) , 3.96 (bs， 1H)， 4.22 (bs, 2H). 13C -删 R (CDC13, δ ppm, 100腿 z)： 12.5， 17.3， 22.5, 23.2, 26.4, .27.5, 28.3, 30.4, 30.8, 31.2， 34.8, 35.3， 39.5， 41.5, 41.7, 46.4， 47.0, 59.0, 63.4， 68.3， 69.1， 70.5, 70.9, 71.8, 71.9, 72.9, 174.2. IR (KBr Disk, era—1): 2870, 1732， 1466, 1345, 1112, 950， 844. GPC (平均分子量） ： Mw 1430 (Mw/Mn 1.04) .
実施例 44 コール酸エステル [化合物 （I I I a— 4) ] の合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリコーノレ メチノレ エーテル（平均分子量 5000、 アルドリッチ社製) 55 g (約 1 1 mm 0 1 ) 、 ジメチルァミノ ピリジン （広栄化学工業社製） 1.46 g (1 2mmo 1 ) およぴジクロ口 メタン 10 OmLを加え、 溶解した。 その溶解液にコール酸 （ミクニ化学産 業社製） 4. 08 g (1 0 mm o 1 ) 、 次いで、 1—ェチルー 3— （3—ジ メチルァミノプロピル） カルボジミ ドの塩酸塩 （アイバイッ社製） 2. 3 g ( 12 mm o 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロ メタン 50mL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2m o 1 / L の塩酸 50 m Lにて洗浄し、 1 0 %食塩永 50 m Lで 2回洗浄した。その後、 分離した有機層に酢酸ェチル 30 OmLを加え、 1 ひ％食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、 ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。 さらに、 真空ポンプを 用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I l i a— 4) 4 8. 5 g (収 率 90%) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000069_0001
¾—崖 R (CDC13, δρριη, 400MHz) ： 0.69 (s， 3H)， 0.90 (s, 3H) ， 0.98 (d, J=6.2Hz， 3H), 0.98-2. 3 (m， 27H) , 3.45 (s, 3H) , 3.56 (bs， 473H), 4.22 (bs， 2H). 13C -丽 R (CDC13, δ ppm, 100MHz) ： 12.5, 17.2, 22.5， 23.1， 26.4， 27.4, 28.3， 30.4, 30.8, 31.0, 34.6, 34.7， 35.1, 35.3， 39.5, 39.6, 41.5, 41.6， 46.3， 46.8, 58.9, 59.0， 61.4, 63.3， 67.9， 69.0, 69.6, 70.2， 70.5, 70.7， 71.0， 71.3, 71.5， 71.8， 72.5, 174.0. IR (KBr Disk, cm"1)： 2888, 1734， 1468， 1343, 1281， 1112， 963， 842. GPC (平均分子量） ： 5370 (Mw/Mn 1.04) .
実施例 45 デォキシコール酸エステル [化合物 （I I I a— 5) ] の合成 フラスコ内に、 ポリエチレングリコール メチル エーテル （平均分子量 2000、 アルドリ ツチ社製） 2 2 g (1 1 mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピ リジン （広栄化学工業社製） 1. 34 g (1 1 mmo 1 ) およぴジクロロメ タン 5 OmLを加え、 溶解した。 その溶解液にデォキシコール酸 3. 9 3 g ( 1 Omm o 1 ) 、 次いで、 1ーェチル一 3 _ ( 3—ジメチルァミノプロピ ル） カルポジミドの塩酸塩 （アイバイッ社製） 2. 3 g (1 2 mmo 1 ) を 加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 50mL、 水 5 OraLを加え、 抽出した。 有機層を◦. 2 m o 1 /Lの塩酸 5 OmLにて 洗浄し、 1 0°/0食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に 酢酸ェチル 200 m Lを加え、 1 0 %食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。 有 機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 乾燥剤をろ過除去して、 ろ液をロータリ 一エバポレーターを用いて濃縮した。 さらに、真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I I I a _ 5) 24. 2 g (収率 9 9 %) を白 色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000070_0001
-雇 R (CDC13， δ ppm, 400MHz) ： 0.68 (s, 3H), 0.91 (s, 3H) , 0.98 (d, J=6.3Hz, 3H), 0.98-2.45 (m， 28H) , 3.38 (s， 3H) , 3.47 (bs， 1H) , 3,65 (bs, 178H), 3.80 (bs, 1H) , 4.22 (bs, 2H) . 13C-丽 R (CDC13， δ ppm, 100MHz) ： 12.7, 17.3, 23.2, 26.1， 27.1， 27.4, 28.7， 30.4， 30.8, 31.1, 33.6， 34.1， 35.1， 35.3， 36.0， 37.0， 42.0, 46.4, 47.2, 48.2, 59.0, 61.6， 63.4, 69.1, 70.3, 70.5, 70.9, 71.2, 71.9， 72.6, 72.9， 174.1. IR (KBr Disk, cm—1) : 2889, 1735, 1468, 1343, 1281, 1112， 963， 842. GPC (平均分子量） ： Mw 2510 (Mw/Mn 1.08) · 実施例 46 ウルソデォキシコール酸エステル [化合物 （ I I I a— 6) ] の合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリコールメチル エーテル （平均分子量 2
000、 アルドリツチ社製) 2 2 g ( 1 1 mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピリ ジン （広栄化学工業社製） 1. 34 g (1 1 mmo 1 ) およぴジクロ口メタ ン 5 OmLを加え、 溶解した。 その溶解液にウルソデォキシコール酸 3. 9 3 g ( 1 Omm o 1 ) 、 次いで、 1ーェチル一 3— （3—ジメチルァミノブ 口ピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイバイッ社製） 2. 3 g (1 2 mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 50mL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2m o 1 ZLの塩酸 5 OmLに て洗浄し、 10%食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層 に酢酸ェチル 20 OmLを加え、 1 0 %食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 乾燥剤をろ過除去して、 ろ液を濃縮し た。 さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I I
1 a - 6) 23. 7 g (収率 9 9 %) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000071_0001
-丽 R (CDC13， S ppm, 400MHz) ： 0.68 (s， 3H), 0.92 (d， J=6.3Hz, 3H) , 0.95 (s， 3H) ， 0.96-2.45 (m, 28H), 3.38 (s， 3H), 3.65 (bs， 180H)， 4.22 (bs， 2H). 13C-NMR (CDC13, δ ppm, 100MHz) ： 12.1， 18.4, 23.4, 26.9， 28.5, 30.3 30.9, 31.1， 34.0, 35.0, 35.2， 37.1， 37.3, 39.1, 40.1， 2.4, 43.7, 54.9, 55.8， 59.0, 61.6， 63.3， 69.1, 70.3, 70.5, 70.8， 71.0， 71.1, 71.9, 72.5， 174.0. IR (KBr Disk, cm—1): 2889， 1736， 1468, 1343, 1281, 1112, 963, 842. GPC (平均分子量） ： Mw 2530 (M /Mn 1.08) .
実施例 47 ケノデォキシコール酸エステル [化合物 （ I I I a— 7) ] の 合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリコール メチル エーテル （平均分子量
2000、 アルドリツチ社製） 2 2 g ( 1 1 mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピ リジン （広栄化学工業社製） 1. 34 g (1 1 mm o 1 ) およびジク口ロメ タン 50mLを加え、 溶解した。 その溶解液にケノデォキシコール酸 3. 9
3 g ( 1 Omm o 1 ) 、 次いで、 1—ェチル— 3一 (3—ジメチルアミノプ 口ピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイバイッ社製） 2. 3 g (1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン 50mL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層を 0. 2m o 1 /Lの塩酸 5 OmLに て洗浄し、 1 0%食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層 に酢酸ェチル 20 OmLを加え、 1 0 %食塩水 30 OmLで 3回洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 乾燥剤をろ過除去して、 ろ液を濃縮し た。 さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （I I I a - 7) 23. 2 g (収率 97%) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000072_0001
¾ー丽 R (CDC13, 5 ppm, 400MHz) ： '0.66 (s， 3H) , 0.91 (s, 3H) ， 0.92 (d， J=6.3Hz, 3H), 0.92 - 2.43 (ra, 28H) , 3.38 (s, 3H)， 3.64 (bs， 180H), 4.22 (bs, 2H). 13C- MR (CDC13, δ ppm, 100MHz) ： 11.8, 18.3, 22.8， 23.6， 28.1， 30.6, 30.9, 31.0， 32.8, 34.7, 35.0, 35.3， 35.4, 39.4， 39.6, 39.8, 41.5, 42.6, 50.4, 55.7， 59.0, 61.6, 63.3, 68.2， 69.1, 69.6， 70.3， 70.5, 70.8， 2003/013259
71. , 71.7, 71.9, 72.6, 174.1. IR (KBr Disk, cm 1): 2889, 1736, 1468, 1343, 1281， 1111, 963, 842. GPC (平均分子量) ： Mw 2560 (Mw/ n 1.09) . 実施例 48 リ トコール酸エステル [化合物 （I I I a— 8) ] の合成 フラスコ内に、 ポリエチレングリ コーノレメチノレ エーテル (平均分子量 2 000、 アルドリツチ社製） 22 g ( 1 1 mm o 1 ) 、 ジメチルァミノピリ ジン （広栄化学工業社製） 1. 34 g (1 l mmo l ) およびジクロロメタ ン 50mLを加え、 溶解した。 その溶解液にリ トコール酸 3. 77' g (1 0 mm o 1 ) 、 次いで、 1—ェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル） 力 ルポジミ ドの塩酸塩（アイバイッ社製） 2. 3 g (1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジクロロメタン5 OmL、 水5 OmL を加え、 抽出した。 有機層を 0. 2m o 1 ZLの塩酸 5 OmLにて洗浄し、 10%食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に酢酸ェチ ル 200 m Lを加え、 10 %食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。 有機層を硫 酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （I I I a— 8) 2 3. 3 g (収率 98%) を白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000073_0001
-雇 R (CDC13， δ ppm, 400MHz) ： 0.64 (s, 3H), 0.91 (d， J=6.3Hz, 3H) , 0.92 (s, 3H) , 0.92-2.41 (m, 29H) , 3.38 (s, 3H)， 3.64 (bs， 17 9 H)， 4.22 (bs, 2H). 13C-NMR (CDC13， δ ppm, 100MHz) ： 12.0, 18.3, 20.8, 23.4, 24.2, 26.4, 27.2， 28.1, 30.5， 30.9， 31.1, 34.5， 35.3, 35.4, 35.8, 36.4， 40.1, 40.4, 42.0， 42.7, 55.9, 56.4, 59.0， 61.6, 63.3， 69.1, 69.7， 70.3, 70.5, 9
70.6, 70.7, 70.8， 71.1， 71.5, 71.9， 72.6, 174.1. IR (KBr Disk, cm"1)： 2888， 1736， 1468, 1343, 1281, 1111， 963, 842. GPC (平均分子量） ： Mw 2640 (Mw/Mn 1.06) .
実施例 49 両末端コール酸エステル [化合物 （ I I I b— 1) ] の合成 フラスコ内に、 ポリエチレングリコール （第一工業製薬社製、 PEG 2 000) 1 0 g (5mmo l ) 、 ジメチルァミノピリジン （広栄化学工業社 製） 2. 68 g ( 22mm o 1 ) およびジクロロメタン 50 mLを加え、 溶 解した。 その溶解液にコール酸 4. 08 g (l Oromo'l ) 、 次いで、 1— ェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイ バイッ社製） 4. 6 g (24mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間 室温攪拌し、 ジクロ.ロメタン 5 OmL、 水 50mLを加え、 抽出した。 有機 層を 0. 2mo 1 /Lの塩酸 5 OmLにて洗浄し、 1 0 %食塩水 50 m Lで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に酢酸ェチル 20 OnaLを加え、 1 0 %食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥し、 乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて 80°C で 2時間減圧乾燥し、 化合物 （I l l b— 1) 1 3. 2 g (収率 94 %) を 白色のロウ状固体として得た。
Figure imgf000074_0001
J=6.1Hz, 6H) ， 0.92-2.67 (m, 54H), 3.65 (bs, 180H), 3.96 (bs， 2H), 4.22 (bs, 4H). 13C -腿 R (CDC13, 5ppm, 100MHz) ： 12.5， 17.3, 22.4, 23.2， 26.3, 27.5, 28.2, 30.3， 30.8, 31.2, 34.7, 35.3, 39.5， 41.5, 41.6， 46.4, 46.5, 46.9, 61.6, 63.4, 68.3， 69.1, 69.7, 70.2, 70.4， 70.5, 70.6, 70.8, 71.3， 71.7, 72.6， 72.9， 174.2. IR (KBr Disk, cm"1)： 2885, 1734， 1468, 1345, 1281, 1113, 964， 842GPC (平均分子量） ： Mw 2940 (Mw/Mn 1.05) . 実施例 50 コール酸エステル [化合物 （ I I I a— 9) ] の合成
フラスコ内に、 ポリエチレングリコール （第一工業製薬社製、 PEG ,6 00) 1 2 g (20 mm o l ) 、 ジメチルァミノピリジン （広栄化学工業社 製） 1. 5 g (1 2mmo 1 ) およびジクロロメタン 5 OmLを加え、 溶解 した。 その溶解液にコール酸 4. 08 g ( 1 0 mm o 1 ) 、 次いで、 1ーェ チルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイバ イツ社製） 2. 3 g ( 1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室 温攪拌し、 ジクロロメタン 5 OmL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 有機層 を 0. 2mo 1 ZLの塩酸 5 OmLにて洗浄し、 1 0 %食塩水 50 m Lで 2 回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸ェチル 20 OmLを加え、 1 0% 食塩水 300 m Lで 3回洗浄した。 有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥し、 乾 燥剤をろ過除去して、 ろ液を濃縮した。 さらに、 真空ポンプを用いて 80°C で 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I l i a— 9) 7. 7 g (収率 90 %) を白 色の口ゥ状固体として得た。
Figure imgf000075_0001
-删 R (CDC13， δ ppm, 400MHz) ： 0.68 (s, 3H), 0.90 (s, 3H) , 0.98 (d， J=6.1Hz, 3H) ， 0.92-2.50 (m， 27H) , 3.15 (bs， 1H) , 3.44 (bs， 1H) , 3.66 (bs， 54H), 3.84 (bs, 1H), 3.96 (bs， 1H), 4.23 (bs， 2H) . 13C-匪 R (CDC13, Sppm, 100MHz) ： 12.5, 17.3， 22.5, 23.2， 26.3, 27.5, 28.2, 30.3, 30.8, 31.2, 34.7, 34.8, 35.3, 35.4, 39.5, 41.5, 46.4， 47.0, 61.5, 63.4, 68.3， 69.1, 69.7, 70.2, 70.5， 71.8， 72.6, 73.0， 174.3. IR (KBr Disk, cm—1) : 3404， 2929, 2868, 1732， 1453, 1352, 1251, 1103, 951. GPC (平均分子 量） ： Mw 1050 (Mw/Mn 1.05) .
実施例 5 1 コール酸ァミ ド [化合物 （ I I I b— 2)' ] の合成
フラスコ内に、 ポリオキシエチレンジァミン （平均分子量 2000、 川研 ファインケミカル社製 PEOアミン # 2000) 1 0 g ( 5 mm o 1 ) 、 4 ージメチルァミノピリジン （広栄化学工業社製） 2. 5 6 g (21 mmo 1 ) およびジクロロメタン 50 m Lを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミ クニ化学産業社製） 4. 0 8 g ( 1 0 mm o 1 ) 、 次いで、 1ーェチルー 3 - (3—ジメチルァミノプロピル) カルボジミ ドの塩酸塩（アイバイッ社製） 4.6 g (24mmo 1 ) を加えた。窒素雰囲気下で 1 2時間室温攪拌し、 ジ クロロメタン 50mL、 水 50mLを加え、 抽出した。有機層を 0. 2m o 1 ZLの塩酸 5 OmLにて洗浄し、 1 0 %食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。 その後、 分離した有機層に酢酸ェチル 20 OmLを加え、 1 0%食塩水 30 0 m Lで 3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥し、 乾燥剤をろ過 除去して、 ろ液を濃縮した。さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減 圧乾燥し、 化合物 （ I I I b_ 2) 1 2. 4 g (収率 8 8%) を白色のロウ 状固体として得た。
Figure imgf000076_0001
—丽 R (CDC13， δ pptn, 400MHz) ： 0.68 (s, 6H) , 0.89 (s, 6H)， 0.99 (d， J=6.1Hz, 6H) , 1.12 - 2.28 (ra, 48H) , 2.72 (bs， 6H), 3.31 (bs, 2H), 3.34 (bs， 4H), 3.65 (m， 176H), 3.96 (bs, 4H)， 4.22 (bs, 2H) . 13C - NMR (CDC13, 5 pm, 100MHz) ： 12.5, 17.4， 22.5， 23.3， 26.3, 27.6, 28.1， 29.1, 30.3， JP2003/013259
31.7, 33.2, 34.8, 35.4, 37.5， 39.4, 41.5, 46.3, 46.5, 68.3, 69.7, 70.1， 70.2, 70.5， 70.8, 71.7， 73.0, 174.1. IR (KBr Disk, cm"1)： 3442, 2912, 2871， 1648， 1456, 1352, 1251， 1107, 952. GPC (平均分子量） ： Mw 2990 (Mw/Mn 1.07) .
実施例 52 コール酸ァミ ド [化合物 （I I I a— 1 0) ] の合成
フラスコ内に、 ポリオキシエチレンジァミン （平均分子量 1 000、 川研 フアインケミカル社製 P EOァミン #1 000) 1 5 g (1 5 mm ο Γ) 、 4ージメチルァミノピリジン （広栄化学工業社製） 1.46 g (1 2mmo 1 ) およびジクロロメタン 5 OmLを加え、 溶解した。 その溶解液にコール 酸 （ミクニ化学産業社製） 4. 0 8 g (1 Ommo 1 ) 、 次いで、 1—ェチ ルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジミ ドの塩酸塩 （アイバイ ッ社製） 2. 3 g (1 2mmo 1 ) を加えた。 窒素雰囲気下で 1 2時間室温 攪拌し、 ジクロロメタン 5 OmL、 水 5 OmLを加え、 抽出した。 分離した 有機層に lmo 1 /L塩酸 22mLおよび水 5 OmLを加えて洗浄し、 さら に、 1 0%食塩水 5 OmLで 2回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾 燥し、 乾燥剤をろ過除去し、 ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮 した。さらに、 真空ポンプを用いて 80°Cで 2時間減圧乾燥し、 化合物 （ I I I a - 1 0) 1 1. 9 g (収率 8 6 %) を薄黄色の粘稠な液体として得た。
Figure imgf000077_0001
-雇 R (CDC13, δ ppm, 400MHz) ： 0.68 (s, 3H), 0.89 (s, 3H) , 0.99 (d, J=7.7Hz, 3H), 0.98 - 2.28 (m, 24H), 2.89 (bs, 3H), 3.29 (bt, J=6.0Hz , 2H), 3.31 (bt, J二 6.0Hz , 2H)， 3.53 (bs, 1H), 3.64 (bs, 84H) , 3.83 (bs, 2H)， 3.96 (bs, 2H), 4.22 (s， 2H)， 7.28 (bs， 1H) , 7.85 (bs, 2H) · 13C- NMR (CDC13, δ ppra, 100MHz) ： 12.5, 17.3, 17.4, 22.4， 23.3， 26.3, 26.5， 27.6， 28.1, 29.1, 30.3， 31.7, 33.1, 34.7, 34.8， 35.4, 37.3， 39.2, 39.5, 41.6, 46.3, 46.5, 68.2， 69.3, 69.4, 69.6, 70.0, 70.1, 70.2, 70.3, 70.4, ， 70.8, 71.7, 73.0， 174.1. IR (KBr Neat, cm"1)： 3372， 2867, 1648, 1464, 1350, 1298， 1251, 1110, 950. GPC (平均分子量） ： Mw 1400 (Mw/Mn 1.06) . 実施例 5 3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HEP E S (pH7. 5) 1 0 mm o 1 /L
Figure imgf000078_0001
-第二試薬
HE PE S (p H7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 410 1で修飾）
0 · 2 k U/L
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 化合物 ( I I I a— 1) 6. 0 g/L 実施例 54 HDLコレステロール測定用キッ ト
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 L
EMS E 0. 3 g/L 化合物 （ I l i a— 2) 0. 1 5 g/L
-第二試薬 03013259
HE PE S (p H 7. 0) mm o 1
4一ァミノアンチピリン g/L
ペルォキシダーゼ kU/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾）
. 0. 2 kU/L
COO 3 2 1 5. 0 kU/L 実施例 5 5 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HEP E S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L EMS E 0. 3 g/L
一 s¾薬
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 Z
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 3 (VFM- 41 0 1で修
0. 2 k U/L
COO 3 21 5. 0 k U/L 化合物 （ I I I a— 3 ) 1. 5
実施例 56 HD Lコレステロール測定用キット ' 以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
/L
Figure imgf000079_0001
•第一 薬
HE PE S ( p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L T/JP2003/013259
4一アミノアンチピリン 0. 3 g/L
ペルォキシダーゼ . 2,0 kU/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 10 1で修飾）
0. 2 k U/
COO 32 1 5. 0 k U/
化合物 （ I I I b— 2) 1. 0 g/L
実施例 57 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬おょぴ第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 Z JL
Figure imgf000080_0001
化合物 ( I I I a - 5) 0. 5
第— 5式'薬
HE P E S (p H 7. 0) mm o 1 / L
4一アミノアンチピリン 3 g/L
ぺノレォキシターセ kU/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾）
0. 2 kU/L
COO 3 21 5. 0 k U/L 実施例 58 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HEPE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 /L
EMS E 0. 3 I
B S A 2. 0 I
-第二試薬 HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 kU/L 化学修飾 L P L 3 (V FM- 4 1 0 1で修飾)
0 2 k
COO 3 21 5 0 k U/L 化合物 （ I I I a— 1 ) 6 0
実施例 59 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 '
•第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 L
EMS E 0. 3 g/L デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
" 一 5式
HEPE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 L ' 4一アミノアンチピリン 0. 3 g/L
' ぺノレォキシダーゼ 20 k U/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM- 4 10 1で修飾）
0. 2 k U/L
COO 3 21 5. 0 k U/L 化合物 （ I I I a— 1 ) 6. 0 g
実施例 60 HD Lコレステロール測定用キット
'以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
• — 薬
HE PE S ( p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万) 1. 0 g/L
HEP E S (p H 7. 0) 1 0 mm o \ / L.
4ーァミノアンチピリ ン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾)
0. 2 k U/L
COO 3 21 5. 0 k U/L 化合物 （ I I I b— 2 ) 1. 0 g/L 実施例 61 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 '
-第一試薬
HEPE S ( p H 7 , 5) 1 0 mm o 1 L
Figure imgf000082_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L 化合物 （ I I I a— 2 ) 0. 1 5 g/L
■ ― g .^
HEPE S (ρ H 7. 0) 1 0 mm o I / L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM- 410 1で修飾）
0. 2 k U/L
C00321 5. 0 k U/L 実施例 62 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
.第一試 HEPE S (p H 7. 5) 1 0 mmo l /L
Figure imgf000083_0001
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 gZL
-第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 /L
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 LP L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾）
0. 2 k
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 化合物 （ I I I a— 3·) 1. 5 g/L 実施例 63. HD Lコレステロール測定用キット .
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。 '
HE PE S (p H 7. 5 ) 1 0 mmo l /L
EMS E 0 · 3 g/L
Figure imgf000083_0002
デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 gZL
•第二試薬
HEPE S (p H 7. 0) 1 0 mmo l /L
4ーァミノアンチピリン 0- 3 g/L ペルォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 LP L 3 1 1 (VFM-4 10 1で修飾）
0. 2 k U/L
C〇 O 3 2 1 5. 0 k U/L 化合物 ( I I I a - 1 ) 6. 0 g/L 実施例 64 HD Lコレステロール測定用キット JP2003/013259 以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 ·/ L
Figure imgf000084_0001
B S A 2. 0 g/L
デキス トラン硫酸ナトリウム （分干量 50万） 1. 0 g/L
• 一 5式
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 L
4一アミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレ才キシダーゼ 20 k U/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 10 1で修飾）
0 2 k U/L
C OO 32 1 5 0 k U/L 化合物 ( I I I b— 2) 1 0
実施例 65 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
•第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
Figure imgf000084_0002
B S A 2. 0 g
デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g
■ 一 ¾¾
HEPE S (ρ H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0.. 3 g/L
ペルォキシダーゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM-4 1 0 1で修飾) 0. 2 k U/L
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 化合物 （ I l i a— 3) 1. 5 g/L 比較例 9 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L EMS E 0. 3 i
第― B式薬
HE PE S ( H 7. 0) 1 0 mm o l L
4一アミノアンチピリン 0. 3 i
ぺノレ才キシダ一ゼ 20 kU/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM— 4 1 0 1で修飾）
0. 2 k U/L
C O O 3 21 5. 0 k U/L 比較例 10 HD Lコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
第一試薬
HE P E S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 L EMS E 0. 3 g/L
B S A 2. 0 g/L
第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) mm o 1 / し
4一ァミノアンチピリン 3 g/L ぺノレォキシダーゼ kU/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM- 4 10 1で修飾） JP2003/013259
0. 2 k
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 比較例 1 1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HDLコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
Figure imgf000086_0001
' デキストラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g/L
-第二試薬
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレ —キシダ一ゼ 20 kU/L
化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 41 0 1で修飾）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 比較例 1 2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなる HD Lコレステロール測定用キ ットを調製した。
-第一試薬
HE PE S (p H 7. 5) 1 0 mm o 1 / L
EMS E 0. 3 g/L 、
B S A 2. 0 g/L
デキス トラン硫酸ナトリウム （分子量 50万） 1. 0 g
HE PE S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4一アミノァンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 k U/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM- 4 1 0 1で修飾）
0. 2 k U/L
COO 3 2 1 5. 0 k U/L 実施例 66 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 3のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 6 7 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 54のキットを用いる以外は実施例 21の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置により ヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 68 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 5のキットを用いる以外は実施例 21の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 69 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 6のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 71 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 70 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 7のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 0立 71 70型自動分析装置によりヒト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 7 1 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 5 8のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 71 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
実施例 7 2 HDLコレステロールの測定 実施例 1のキットの代わりに実施例 5 9のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置に.よ.りヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 7 3 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6 0のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 7 4 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキッ トの代わりに実施例 6 1のキッ トを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 7 5 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6 2のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 7 6 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6 3のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロ一ノレを測定した。
実施例 7 7 H D Lコレステロ一ノレの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6 4のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
実施例 7 8 H D Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに実施例 6 5のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 7 0型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の H D Lコレステロールを測定した。
比較例 1 3 H D Lコレステロールの測定 実施例 1のキッ トの代わりに比較例 9のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒト血清 35 検体中の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 14 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 1 0のキットを用いる以外は実施例 2 1の測定法と同様にして、 日立 71 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 1 5 HD Lコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 1 1のキットを用いる以外は実施例 21の測定法と同様にして、 日立 7 1 70型自動分析装置によりヒ ト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。
比較例 1 6 HDLコレステロールの測定
実施例 1のキットの代わりに比較例 1 2のキットを用いる以外は実施例 21の測定法と同様にして、 立 7 1 70型自動分析装置によりヒト血清 3 5検体中の HD Lコレステロールを測定した。 一方、 実施例 66〜 78およ ぴ比較例 1 3 ~ 1' 6の測定において用いたヒト血清 3 5検体を用いて、 DC M法により当該検体中の HD Lコレステロールを測定し、各測定法と比較し た。 実施例 6 6〜 78および比較例 1 3〜 1 6それぞれの測定法と、 D CM 法による測定法との相関係数を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000090_0001
実施例 6 6 ~ 7 0と比較例 1 3より、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル 類または胆汁酸アミ ド類を用いた場合において、 D C M法による測定との間 に良好な相関が得られた。 また、 実施例 7 1と比較例 1 4、 実施例 7 2〜7 5と比較例 1 5、 実施例 7 6〜 7 8と比較例 1 6との対比から、 B S Aまた はデキストラン硫酸を添加した条件下、 もしくは両化合物を添加した条件下 においても、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル類または胆汁酸アミ ド類を 用いた場合において D C M法による測定との間に良好な相関係数が得られ ることが判明した。
試験例 1 各種胆汁酸誘導体 （陰イオン性界面活性剤、 両性界面活性剤、 非 イオン性界面活性剤） がコレステロール測定酵素の安定性へ及ぼす影響 .
HDLコレステロール測定用キットの第二試薬として使用される下記組 成 1〜8からなる試薬を調製し、 それぞれ 40°Cにて 48時間 （2日） 、 1 20時間 （5日） 保存した。 調製直後の組成 1〜 8からなる各試薬、 40°C にて 2日間保存した各試薬おょぴ 40°Cにて 5日間保存した各試薬におけ るコレステロールエステル加水分解酵素 （L P L 31 1 ) およびコレステロ ール酸化酵素 （C00321) それぞれの酵素活性を測定し、 調製直後の各 試薬における酵素活性に対する保存後の各試薬における酵素活性の比率（酵 素活性残存率） （％) を求めた。
酵素活性は以下の方法により求めた。 -
( 1 ) コレステロールエステル加水分解酵素活性測定法
測定試薬
0. 15 mo 1 Lリン酸カリ ウムバッファー （； H 7. 2) ト リ トン x- 00 2 g/ L
フエノ一ノレ 0. 15 g/L
パーォキシダーゼ 20 k U/L
コレステロ一ノレ酸化酵素 5 kU/L
4—ァミノアンチピリン 0. 2 g/L
測定基質溶液 '
コレステローノレリノレート イソプロパノール溶液 ( 6
操作法
測定試薬 3 m Lを石英セルに添加し、調製直後の組成 1 ' 8からなる各試 薬をそれぞれ 0. 05mL添加する。 37°Cにて 5分加温後、 反応液に測定 基質溶液を 0. lmL添加し、 さらに 37°Cにて加温する。 測定基質溶液を 添加して 5分後および 6分後のそれぞれの反応液の 500 nmにおける吸 光度を測定し、 当該両吸光度から、組成 1〜 8からなる各試薬における 50 0 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量 （AAb sZm i n) を算出する。 一方、組成 1〜8からなる各試薬の代わりに精製水を用いて同様の測定を行 い、精製水における 5 0 0 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量 （Δ Ab s /m i n) を算出する。 組成 1〜 8からなる各試薬における 5 00 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量 （AAb sZm i n) から精製水における 5 0 0 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量 （AAb s /m i n) を差し引いて 算出された値 （Δ ΔΑ1> sZm i n) を、 コレステロール加水分解酵素の安 定化の指標とする。
同様の一連の操作を、 調製直後の組成 1〜8からなる各試薬の代わりに,、 組成 1〜 8からなる各試薬を 4 0 °Cにて 2日間保存した各試薬、 および、組 成 1〜8からなる各試薬を 4 0°Cにて 5日間保存した各試薬を用いて測定 を行い、 各試薬における吸光度変化量 (Δ Δ A b s i n) を算出する。
(2) コレステロール酸化酵素活性測定法
測定試薬
0 · 1 5 m o 1 / Lリン酸カリ ウムバッファー （ ρ H 7. 2) ' トリ トン X— 1 0 0 2 g/L
フエノール 0. 1 5 g/L
パーォキシダーゼ 2 0 k U/L
4ーァミノアンチピリン 0. 2 g/L
測定基質溶液
コレステロール イソプロパノール溶液 （5 gZL)
操作法
' 測定試薬 3 mLを石英セルに添加し、調製直後の組成 1〜8からなる各試 薬を精製水で 6倍希釈した溶液をそれぞれ 0. 0 5mL添加する。 3 7°Cに て 5分加温後、 反応液に測定基質溶液を 0. 1 m L添加し、 さらに 3 7でに て加温する。測定基質溶液を添加して 5分後および 6分後のそれぞれの反応 液の 5 0 0 nmにおける吸光度を測定し、 当該両吸光度から、 組成 1〜 8か らなる各試薬における 5 0 0 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量（AAb s /m i n) を算出する。 一方、 組成 1〜8からなる試薬の代わりに精製水 を用いて同様の測定を行い、精製水における 5 0 0 nmでの 1分間当たりの 吸光度変化量 （AAb sZm i n) を算出する。 組成 1〜 8からなる各試薬 における 500 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量 （Δ Ab s /m i n) から精製水における 500 nmでの 1分間当たりの吸光度変化量（Δ Ab s /m i n) を差し引いて算出された値 （Δ Δ Ab s /m i n) を、 コレステ ロール酸化酵素の安定化の指標とする。
同様の一連の操作を、 調製直後の組成 1〜8からなる各試薬の代わりに、 組成 1〜8からなる各試薬を 40°Cにて 2日間保存した各試薬、 および、組 成 1〜8からなる各試薬を 4 0°Cにて 5日間保存した各試薬を用いて測定 を行い、 各試薬における吸光度変化量 （A AAb sZm i n) を算出する。 組成 1
HE P E S (p H 7. 0) 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0 3 g/L ぺノレオキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0 1 /L 化学修飾 LP L 3 1 1 (V FM41 0 1で修飾） 0 2 k U/L 組成 2
HEPE S (p H 7. 0) 0 mm o 1 / L
4一アミノアンチピリ ン 0 3 g/L ぺ /レオキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0
化学修飾 LP L 3 1 1 (VFM41 0 1で修飾） 0 2 k U/L コーノレ酸ナトリウム 6 0 g/L 組成 3
HE PE S (p H 7. 0) 0 mm o 1 / L
4ーァミノアンチピリン 0 3 g/L ペルォキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0 1 /L 化学修飾 LPL 3 1 1 (VFM41 01で修飾） 0 2 CHAP S 6. 0 g/L 組成 4
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4一アミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレオキシターセ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0. 1 g /L 化学修 L P L 3 1 1 (V FM4 1 0 1で修飾) 0. 2 k U/L B I GCHAP 4. 5 g
組成 5 .
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L
4一アミノアンチピリン 0. 3 g /L ぺノレオキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0. 1 g /L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM4 1 0 1で修飾) 0. 2 k U/L 化合物 （ I I I a— 1 ) 6. 0 g/L 組成 6
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 / L 4一アミノアンチピリン 0. 3 g/L ぺノレォキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0. 1 g/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM4 1 0 1で修飾) 0. 2 kU/L 化合物 （ I I I a— 2 ) 0. 4 5 g/L 組成 7
HE P E S ( H 7. 0) 1 0 mm o \ / L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g /L ぺノレォキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシゥムニ水和物 0. 1 g/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (VFM4 1 0 1で修飾) 0. 2 k U/L 化合物 （ I I I a — 3 ) 4. 5 g/L 組成 8
HE P E S (p H 7. 0) 1 0 mm o 1 L·
4—ァミノアンチピリン 0. 3 g /L ぺノレォキシダーゼ 2 0 k U/L 塩化カルシウム二水和物 0. 1 g/L 化学修飾 L P L 3 1 1 (V FM4 0 1で修飾) 0. 2 kU/L 化合物 （ I I I b— 2 ) 1. 0 g/L 測定結果を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000096_0001
表 3から明らかなように、 胆汁酸誘導体として、 陰ィオン性型胆汁酸誘導 体 （具体的には、 コール酸） および両性型胆汁酸誘導体 （具体的には、 CH AP S) を含有する試薬に比較して、 非イオン性型胆汁酸誘導体 [具体的に は、 B I G C H A P、 化合物 （ I I I a— 1 ) 、 化合物 （ I I I a— 2 ) 、 化合物 （ I I I a— 3) および化合物 （I I I b— 2) ] を含有する試薬の 方が、 コレステロール測定用酵素 （具体的には、 LP L 3 1 1および COO 32 1) の安定性が良好であった。 一般に、 酵素等の 40°C等の高温での保 存安定性は、 4 °Cまたは室温等の保存安定性を反映することが知られている。 従って、本発明の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定 試薬もしくはキットにおいて、 胆汁酸誘導体として、 非イオン性界面活性作 用を有する胆汁酸誘導体を用いることに り、長期間保存された試薬を用い た場合であっても、 また、保存温度が 4 0 °Cに晒されたおそれの有る試薬を 用いた場合であっても、 より正確に高密度リポ蛋白中のコレステロールが測 定できることがわかる。 '
産業上の利用可能性
本発明により、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正 確に測定する方法およびその,方法に使用する試薬、 ならびに、 長期間の保存 においても酵素活性が安定に保持される高密度リポ蛋白中のコレステロ一 ルを測定するための試薬およびキットが提供される。

Claims

請求の範囲
1. 検体と、 コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素、 または、 コレステロールエステル加水分解酵素、 酸化型補酵 素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体 中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特 徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
2. 水性媒体が、 さらに、アルブミンを含有する請求項 1記載の方法。
3. コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾されたコ レステロールエステル加水分解酵素である請求項 1または 2記載の方法。
4. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレンダリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主成 分とする基、ポリプロピ.レングリコールとポリエチレングリコールの共重合 体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプチ ル基、 ポリウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より選 ばれる基により修飾されたュレステロールエステル加水分解酵素である請 求項 3記載の方法。
5. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレングリ コールを主成分とする基により修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素である請求項 3記載の方法。
6. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 1〜 5のいずれかに記載の方法。 '
7. 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸もし くはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその 塩、 リ トコール酸もしぐはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケノ デォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2—ォキソリ トコール酸もしく はその塩、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7 _ォキソ デォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォデォ キシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロコール酸もしくはその塩か らなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項 6記載の方法。
8. 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である 請求項 1〜 5のいずれかに記載の方法。
9. 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （ I)
R1— CH2— CH(R2)_CH2_S03一 ( I )
[式中、 R1は、 3— （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物である請求項 8記載の方法。
10. 胆汁酸誘導体が、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 1〜 5のいずれかに記載の方法。
11. 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ I I )
Figure imgf000099_0001
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R 3および R 4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （ I I I )
Figure imgf000100_0001
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （= 0 ) 基を表し、 Qは、 酸素原子または N Hを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V) '
Figure imgf000100_0002
[式中、 X ' 、 Y ' および z， は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=〇） 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜4 0 0の整数を表す } で表される化合物である請求項 1 0 記載の方法。
12. コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、 胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高 密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
.
13. コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール脱水素酵 素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リ ポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
14. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項 1 3記載の試 薬。
15. さらに、 アルブミンを含有する請求項 1 2〜 1 4のいずれかに記 载の試薬。
16. コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾されたコ レステロールエステル加水分解酵素である請求項 1 2〜 1 5のいずれかに 記載の試薬。
17. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレンダリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主成 分とする基、ポリプロピレンダリコールとポリエチレンダリコールの共重合 体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプチ ル基、 リウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より選 ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請 求項 1 6記載の試薬。
18. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素である請求項 1 6記載の試薬。
19. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 1 2 ~ 1 8のいずれかに記載の試薬。
20. 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸もし くはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその 塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケノ デォキシコール酸もしくはその塩、ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2ーォキソリ トコール酸もしく はその塩、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソ デォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォデォ キシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロコール酸もしくはその塩か らなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項 1 9記載の試薬。
21. 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である 請求項 1 2〜1 8のいずれかに記載の試薬。
22. 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式 （I)
R1 - CH2- CH(R2) - CH2- S03~ ( I )
[式中、 R1は、 3— （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R 2は、，水素原子または水酸基である] で表される化合物である請求項 21記載の試薬。 ，
23. 胆汁酸誘導体が、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 1 2〜1 8のいずれかに記載の試薬。
24. 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ I I )
Figure imgf000102_0001
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （I I I)
Figure imgf000103_0001
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （= 0 ) 基を表し、 Qは、 酸素原子または N Hを表し、 Wは、 水素原 子、 ァノレキノレ基、 ァノレケニノレ基、 アルキニノレ基、 シクロアノレキノレ基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （I V) '
Figure imgf000103_0002
[式中、 X ' 、 Y， および Z ' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （= 0 ) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] ,で表される基を 表し、 .nは、 3〜4 0 0の整数を表す} で表される化合物である請求項 2 3 記載の試薬。
25. コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、 コ レステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体およぴ 過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有す ることを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
26. 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、 コレステロールエステル加 水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、 過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有す ることを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
27. 過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、 コレステロールェ ステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬と を含有し、 胆汁酸誘導体を第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有 することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
28. コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、 コ レステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体およ び酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有すること を特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
29. 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、 コレステロールエステル加 水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有 し、酸化型補酵素を第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両方に含有するこ とを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。 ―
30. さらに、 還元型補酵素測定用試薬を、 第一試薬、 第二試薬のいず れかまたは両方に含有する請求項 2 8または 2 9記載のキット。
31. さらに、 アルブミンを、 第一試薬、 第二試薬のいずれかまたは両 方に含有する請求項 2 5〜3 0のいずれかに記載のキット。
32. コレステロールエステル加水分解酵素が、 化学的に修飾されたコ レステロールエステル加水分解酵素である請求項 2 5〜3 1のいずれかに 記載のキット。
33. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレンダリコールを主成分とする基、ポリプロピレンダリコールを主成 分とする基、ポリプロピレンダリコールとポリエチレンダリコールの共重合 体を有する基、 水溶性多糖類を含有する基、 スルホプロピル基、 スルホプチ ル基、 ポリウレタン基、 および、 キレート機能を有する基からなる群より選 ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請 求項 3 2記載のキット。
34. 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、 ポ リエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロール エステル加水分解酵素である請求項 3 2記載のキット。
35. 胆汁酸誘導体が、 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 2 5〜 3 4のいずれかに記載のキット。
36. 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 コール酸もし くはその塩、 タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその 塩、 リ トコール酸もしくはその塩、 デォキシコール酸もしくはその塩、 ケノ デォキシコール酸もしくはその塩、 ウルソデォキシコール酸もしくはその塩. 7ーォキソリ トコール酸もしくはその塩、 1 2—ォキソリ トコール酸もしく はその塩、 1 2—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソ デォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、 ヒォデォ キシコール酸もしくはその塩、 および、 デヒドロ.コール酸もしくはその塩か らなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項 3 5記載のキット。
37. 胆汁酸誘導体が、 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である 請求項 2 5 〜 3 4のいずれかに記載のキット。
38. 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、 一般式.（I )
R1— CH2— CH(R2)— CH2_S03一 ( I )
[式中、 R 1は、 3— ( 3 —コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ基であ り、 R 2は、 水素原子または水酸基である] で表される化合物である請求項 3 7記載のキット。
39. 胆汁酸誘導体が、 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体 である請求項 2 5 〜 3 4のいずれかに記載のキット。
40. 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（I I )
Figure imgf000106_0001
(Xは、水素原子または水酸基を表し、 R3および R4は、 同一または異なつ て、 置換もしくは非置換のアルキル基、 または、 置換もしくは非置換のアル カノィル基を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （ I I I )
Figure imgf000106_0002
{式中、 X、 Υおよび Ζは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=0) 基を表し、 Qは、 酸素原子または ΝΗを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （ I V)
Figure imgf000107_0001
[式中、 X' 、 Y' および ζ' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物である請求項 3 9 記載のキット。
41. 一般式 （I I I)
Figure imgf000107_0002
{式中、 X、 Yおよび Zは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=〇） 基を表し、 Qは、 酸素原子または NHを表し、 Wは、 水素原 子、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （ I V)
Figure imgf000108_0001
[式中、 X' 、 Y' および Z' は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す } で表される化合物。
42. 一般式 （V)
Figure imgf000108_0002
[式中、 X、 Υおよび Ζは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=ο) 基を表す] で表される化合物と、 一般式 （V I )
Figure imgf000108_0003
(式中、 W' は、 水素原子、 アルキノレ基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シ ク口アルキル基、 シクロアルケニル基、 アル力ノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 または、 置換もしくは非置換のァリール基を表し、 ηは、 3〜400の整数を表す） で表される化合物、 または、 一般式 （V I I )
Figure imgf000109_0001
(式中、 Tは、 置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、 ηは、 3〜 400の整数を表す） で表される化合物とを、縮合剤の存在下に反応させる ことを特徴とする一般式 （I I I )
Figure imgf000109_0002
{式中、 X、 Υおよび Ζは、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基または ォキソ （=0) 基を表し、 Qは、 酸素原子または ΝΗを表し、 Wは、 水素原 子、 ァノレキル基、 ァノレケニノレ基、 ァノレキニノレ基、 シクロアノレキノレ基、 シクロ アルケニル基、 アルカノィル基、 アルケノィル基、 アルキノィル基、 置換も しくは非置換のァリール基、 置 もしくは非置換のアミノアルキル基、 また は、 一般式 （ I V)
Figure imgf000109_0003
[式中、 X' 、 Υ' および ζ， は、 同一または異なって、 水素原子、 水酸基 またはォキソ （=0) 基を表し、 mは、 0または 1を表す] で表される基を 表し、 nは、 3〜400の整数を表す} で表される化合物の製造方法。
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