JPH119300A - 低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法 - Google Patents
低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法Info
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- JPH119300A JPH119300A JP17891497A JP17891497A JPH119300A JP H119300 A JPH119300 A JP H119300A JP 17891497 A JP17891497 A JP 17891497A JP 17891497 A JP17891497 A JP 17891497A JP H119300 A JPH119300 A JP H119300A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体試料の分離分画操作を行うことなく、簡
便な操作が可能なＬＤＬコレステロールの特異的測定方
法及び測定用組成物、並びにＬＤＬ／ＨＤＬコレステロ
ールの特異的測定方法を提供する。 【解決手段】 ＬＤＬコレステロール測定方法は、生体
試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の
０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条
件下で接触させ、次に、微生物由来コレステロールエス
テラーゼと接触させ、ＬＤＬコレステロールと微生物由
来コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキ
シダーゼとが関与する酵素反応により消費される化合物
又は生成される化合物を測定する。
便な操作が可能なＬＤＬコレステロールの特異的測定方
法及び測定用組成物、並びにＬＤＬ／ＨＤＬコレステロ
ールの特異的測定方法を提供する。 【解決手段】 ＬＤＬコレステロール測定方法は、生体
試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の
０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条
件下で接触させ、次に、微生物由来コレステロールエス
テラーゼと接触させ、ＬＤＬコレステロールと微生物由
来コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキ
シダーゼとが関与する酵素反応により消費される化合物
又は生成される化合物を測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、低密度リポタンパ
ク質（ＬＤＬ）コレステロールの特異的測定方法及び測
定用組成物、並びに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コ
レステロールと高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレス
テロールとを同時に特異的に測定する方法に関する。
ク質（ＬＤＬ）コレステロールの特異的測定方法及び測
定用組成物、並びに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コ
レステロールと高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレス
テロールとを同時に特異的に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿又は血清中の各リピドフラクション
中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動
脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要
視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂
質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用
した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、
超低密度リポプロテイン（Ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓ
ｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＶＬＤＬとも称
する）、低密度リポプロテイン（Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔ
ｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＬＤＬとも称す
る）、及び高密度リポプロテイン（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓ
ｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＨＤＬとも称す
る）の４種類に分別されている。各リピドフラクション
は、アポリポタンパク質と脂質とに大別され、脂質は更
に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、
トリグリセリド、及びリン脂質から構成されている。こ
のため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の
両者について行われている。
中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動
脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要
視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂
質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用
した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、
超低密度リポプロテイン（Ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓ
ｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＶＬＤＬとも称
する）、低密度リポプロテイン（Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔ
ｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＬＤＬとも称す
る）、及び高密度リポプロテイン（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓ
ｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＨＤＬとも称す
る）の４種類に分別されている。各リピドフラクション
は、アポリポタンパク質と脂質とに大別され、脂質は更
に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、
トリグリセリド、及びリン脂質から構成されている。こ
のため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の
両者について行われている。
【０００３】日常的な臨床検査では、自動分析装置を使
用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行わ
れている。リピドフラクションについては、最近、ＨＤ
Ｌコレステロールの酵素法による自動分析測定（自動
化）が、総コレステロールと同様に、可能となった。他
方、ＬＤＬコレステロールの測定については、試料の前
処理（分画、及び分離操作）を行うことが必要なため、
酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れてい
た。
用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行わ
れている。リピドフラクションについては、最近、ＨＤ
Ｌコレステロールの酵素法による自動分析測定（自動
化）が、総コレステロールと同様に、可能となった。他
方、ＬＤＬコレステロールの測定については、試料の前
処理（分画、及び分離操作）を行うことが必要なため、
酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れてい
た。
【０００４】このＬＤＬコレステロール測定用試料の前
処理方法としては、種々の沈殿法が報告されている。例
えば、特開昭５８−７０１８０号公報には、血漿又は血
清試料中に抗ＨＤＬ抗体を添加し、抗原抗体反応を利用
してＨＤＬを不溶化して沈殿させる前処理方法が記載さ
れている。また、特開昭５９−２２３１３０号公報に
は、抗ＨＤＬ抗体に加えて、更に、ポリアニオンと２価
のカチオンとの混合物を添加した後、不溶物を分離する
前処理方法が記載されている。前記のいずれの特許公報
にも、残留物に対して、総コレステロール測定用の酵素
試薬を用いた自動分析システムによる測定が可能になる
ものと記載されている。
処理方法としては、種々の沈殿法が報告されている。例
えば、特開昭５８−７０１８０号公報には、血漿又は血
清試料中に抗ＨＤＬ抗体を添加し、抗原抗体反応を利用
してＨＤＬを不溶化して沈殿させる前処理方法が記載さ
れている。また、特開昭５９−２２３１３０号公報に
は、抗ＨＤＬ抗体に加えて、更に、ポリアニオンと２価
のカチオンとの混合物を添加した後、不溶物を分離する
前処理方法が記載されている。前記のいずれの特許公報
にも、残留物に対して、総コレステロール測定用の酵素
試薬を用いた自動分析システムによる測定が可能になる
ものと記載されている。
【０００５】ＨＤＬを不溶化する前記の前処理方法とは
逆に、ＬＤＬを特異的に不溶化させる前処理方法も報告
されている。例えば、特表昭５４−５０００６９号公報
には、ＬＤＬと植物レクチンとの特異的凝集反応によっ
て集合体を形成させ、ＬＤＬを沈殿させた後、ＨＤＬを
選択的に消費する酵素を加えることによってＨＤＬを消
費させる前処理方法が記載されている。また、特表平７
−５０１９４５号公報には、ＬＤＬと、多価陰イオン化
合物、２価金属塩及び造核粒子とで集合体を形成させて
ＬＤＬを沈殿させ、ＨＤＬを選択的に消費する酵素を加
えてＨＤＬを消費させた後、集合体を再溶解することに
より得られる残留分中のコレステロールを、前記と同様
に、総コレステロール測定用の酵素試薬を用いた自動分
析システムによって測定する方法が記載されている。し
かしながら、これらの方法には、多くの工程と時間とを
要するという欠点があり、均一な溶液反応系を用いて実
施されている通常の自動化測定には本質的に不向きなこ
とは明らかである。
逆に、ＬＤＬを特異的に不溶化させる前処理方法も報告
されている。例えば、特表昭５４−５０００６９号公報
には、ＬＤＬと植物レクチンとの特異的凝集反応によっ
て集合体を形成させ、ＬＤＬを沈殿させた後、ＨＤＬを
選択的に消費する酵素を加えることによってＨＤＬを消
費させる前処理方法が記載されている。また、特表平７
−５０１９４５号公報には、ＬＤＬと、多価陰イオン化
合物、２価金属塩及び造核粒子とで集合体を形成させて
ＬＤＬを沈殿させ、ＨＤＬを選択的に消費する酵素を加
えてＨＤＬを消費させた後、集合体を再溶解することに
より得られる残留分中のコレステロールを、前記と同様
に、総コレステロール測定用の酵素試薬を用いた自動分
析システムによって測定する方法が記載されている。し
かしながら、これらの方法には、多くの工程と時間とを
要するという欠点があり、均一な溶液反応系を用いて実
施されている通常の自動化測定には本質的に不向きなこ
とは明らかである。
【０００６】更に近年では、同様のリピドフラクション
前処理を目的とする乾燥試験具（Ｄｒｙ ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）による測定方法が報告されている。例えば、特
開平７−５５８１２号公報には、多孔質シリカ又はシリ
ケートなどからなる種々のマトリックスなどを組み合わ
せて多層構造物を形成し、その多層構造物中に試料を通
過させることにより、リピドフラクションの分離分画を
行う方法が記載されている。しかしながら、この方法
も、リピドフラクション前処理を行わずにＬＤＬコレス
テロールを測定するものではない。
前処理を目的とする乾燥試験具（Ｄｒｙ ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）による測定方法が報告されている。例えば、特
開平７−５５８１２号公報には、多孔質シリカ又はシリ
ケートなどからなる種々のマトリックスなどを組み合わ
せて多層構造物を形成し、その多層構造物中に試料を通
過させることにより、リピドフラクションの分離分画を
行う方法が記載されている。しかしながら、この方法
も、リピドフラクション前処理を行わずにＬＤＬコレス
テロールを測定するものではない。
【０００７】以上のように、個々のリピドフラクション
を測定する従来法では、酵素法による検出処理を実施す
る前に、測定対象の脂質複合体粒子を予め分離分画して
から、その分離分画された個々のリピドフラクションに
おける総コレステロール量を酵素法によって測定するも
のであり、その際に使用される酵素は、リピドフラクシ
ョン全体に対して作用する酵素であり、分離分画された
特定のリピドフラクションに対して特異性を有する酵素
ではなかった。
を測定する従来法では、酵素法による検出処理を実施す
る前に、測定対象の脂質複合体粒子を予め分離分画して
から、その分離分画された個々のリピドフラクションに
おける総コレステロール量を酵素法によって測定するも
のであり、その際に使用される酵素は、リピドフラクシ
ョン全体に対して作用する酵素であり、分離分画された
特定のリピドフラクションに対して特異性を有する酵素
ではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、現在の
臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装
置による測定が主流である点に鑑み、ＬＤＬコレステロ
ールの測定方法において、試料（例えば、血清又は血
漿）の遠心操作など種々の分離分画操作を行うことな
く、簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方
法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＬＤＬ
コレステロールの測定方法において利用する酵素（コレ
ステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応
に関して、ＬＤＬフラクションのコレステロールとの反
応には影響しないが、ＨＤＬ及びＶＬＤＬフラクション
のコレステロールとの反応を抑制する化合物が存在する
ことを見出し、これらの化合物を用いることにより、試
料（例えば、血清又は血漿）の分画操作を行うことな
く、簡便な操作で、ＬＤＬコレステロールを高精度に測
定することができることを見出した。本発明は、こうし
た知見に基づくものである。
臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装
置による測定が主流である点に鑑み、ＬＤＬコレステロ
ールの測定方法において、試料（例えば、血清又は血
漿）の遠心操作など種々の分離分画操作を行うことな
く、簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方
法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＬＤＬ
コレステロールの測定方法において利用する酵素（コレ
ステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応
に関して、ＬＤＬフラクションのコレステロールとの反
応には影響しないが、ＨＤＬ及びＶＬＤＬフラクション
のコレステロールとの反応を抑制する化合物が存在する
ことを見出し、これらの化合物を用いることにより、試
料（例えば、血清又は血漿）の分画操作を行うことな
く、簡便な操作で、ＬＤＬコレステロールを高精度に測
定することができることを見出した。本発明は、こうし
た知見に基づくものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、生体
試料と、膵臓由来コレステロールエステラーゼと、コレ
ステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体
の０．０１重量％以上存在する条件下、及び胆汁酸又は
その塩の存在下で接触させ、次いで、こうして処理した
生体試料と微生物由来コレステロールエステラーゼとを
接触させ、低密度リポタンパク質コレステロールと微生
物由来コレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼとが関与する酵素反応により消費される化
合物又は生成される化合物を測定することを特徴とす
る、低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定
方法に関する。また、本発明は、（１）膵臓由来コレス
テロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
アルブミン、及び胆汁酸又はその塩を含有する第１試薬
と、（２）微生物由来コレステロールエステラーゼを含
有する第２試薬とを含むことを特徴とする、低密度リポ
タンパク質コレステロールの特異的測定用試薬にも関す
る。更に、本発明は、生体試料と、膵臓由来コレステロ
ールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと
を、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上存在
する条件下、及び胆汁酸又はその塩の存在下で接触さ
せ、高密度リポタンパク質コレステロールと膵臓由来コ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼとが関与する酵素反応により消費される化合物又は
生成される化合物を測定し、続いて、こうして処理した
生体試料と微生物由来コレステロールエステラーゼとを
接触させ、低密度リポタンパク質コレステロールと微生
物由来コレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼとが関与する酵素反応により消費される化
合物又は生成される化合物を測定することを特徴とす
る、高密度リポタンパク質コレステロール及び低密度リ
ポタンパク質コレステロールの特異的測定方法にも関す
る。
試料と、膵臓由来コレステロールエステラーゼと、コレ
ステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体
の０．０１重量％以上存在する条件下、及び胆汁酸又は
その塩の存在下で接触させ、次いで、こうして処理した
生体試料と微生物由来コレステロールエステラーゼとを
接触させ、低密度リポタンパク質コレステロールと微生
物由来コレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼとが関与する酵素反応により消費される化
合物又は生成される化合物を測定することを特徴とす
る、低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定
方法に関する。また、本発明は、（１）膵臓由来コレス
テロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
アルブミン、及び胆汁酸又はその塩を含有する第１試薬
と、（２）微生物由来コレステロールエステラーゼを含
有する第２試薬とを含むことを特徴とする、低密度リポ
タンパク質コレステロールの特異的測定用試薬にも関す
る。更に、本発明は、生体試料と、膵臓由来コレステロ
ールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと
を、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上存在
する条件下、及び胆汁酸又はその塩の存在下で接触さ
せ、高密度リポタンパク質コレステロールと膵臓由来コ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼとが関与する酵素反応により消費される化合物又は
生成される化合物を測定し、続いて、こうして処理した
生体試料と微生物由来コレステロールエステラーゼとを
接触させ、低密度リポタンパク質コレステロールと微生
物由来コレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼとが関与する酵素反応により消費される化
合物又は生成される化合物を測定することを特徴とす
る、高密度リポタンパク質コレステロール及び低密度リ
ポタンパク質コレステロールの特異的測定方法にも関す
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明においては、生体試料とし
て、特に哺乳動物（特にヒト）の血液試料、例えば血清
試料又は血漿試料をそのまま用いることができる。すな
わち、血清又は血漿を分離分画処理したり、抗体で処理
する必要がない。本発明においては、前記の生体試料を
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシ
ダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＬＤＬコレス
テロールとの反応には影響を与えないが、それらの酵素
とＨＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと
の反応を抑制する化合物、すなわち、抑制剤として、ア
ルブミンを用いる。アルブミンの濃度は、測定系におい
て、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは
０．０１〜３０重量％、最も好ましくは０．０３〜１５
重量％である。アルブミンの濃度が、測定系において、
０．０１重量％未満になると、酵素反応の特異性が減少
することがあり、１５重量％を越えると反応量が減少す
ることがある。
て、特に哺乳動物（特にヒト）の血液試料、例えば血清
試料又は血漿試料をそのまま用いることができる。すな
わち、血清又は血漿を分離分画処理したり、抗体で処理
する必要がない。本発明においては、前記の生体試料を
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシ
ダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＬＤＬコレス
テロールとの反応には影響を与えないが、それらの酵素
とＨＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと
の反応を抑制する化合物、すなわち、抑制剤として、ア
ルブミンを用いる。アルブミンの濃度は、測定系におい
て、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは
０．０１〜３０重量％、最も好ましくは０．０３〜１５
重量％である。アルブミンの濃度が、測定系において、
０．０１重量％未満になると、酵素反応の特異性が減少
することがあり、１５重量％を越えると反応量が減少す
ることがある。
【００１１】本発明において用いる被検試料が血液（血
清又は血漿）由来の場合には、被検試料内に既にアルブ
ミンが含まれている。しかしながら、試薬溶液へ添加さ
れた被検試料の終濃度が低い場合には、被検試料由来の
アルブミンだけでは、目的とする抑制効果を充分に得る
ことができない。一般に、測定用試薬と被検試料との混
合比は、被検試料中の測定対象物質（本発明ではＬＤＬ
コレステロール）の濃度と検出系の感度（例えば、発色
反応の場合は、発色剤のモル分子吸光係数）とによって
決められるので、高感度の検出系を用いる場合には、被
検試料の使用量（添加量）が少量でもよいことになり、
測定系における被検試料の終濃度は低くなる。また、一
般的な血液試料（血清又は血漿試料）中のアルブミン濃
度は、一般的に１〜５％であるが、極端な場合では、無
アルブミン症患者由来の血液試料（血清又は血漿試料）
のように、アルブミンが実質的に存在しない例もある。
清又は血漿）由来の場合には、被検試料内に既にアルブ
ミンが含まれている。しかしながら、試薬溶液へ添加さ
れた被検試料の終濃度が低い場合には、被検試料由来の
アルブミンだけでは、目的とする抑制効果を充分に得る
ことができない。一般に、測定用試薬と被検試料との混
合比は、被検試料中の測定対象物質（本発明ではＬＤＬ
コレステロール）の濃度と検出系の感度（例えば、発色
反応の場合は、発色剤のモル分子吸光係数）とによって
決められるので、高感度の検出系を用いる場合には、被
検試料の使用量（添加量）が少量でもよいことになり、
測定系における被検試料の終濃度は低くなる。また、一
般的な血液試料（血清又は血漿試料）中のアルブミン濃
度は、一般的に１〜５％であるが、極端な場合では、無
アルブミン症患者由来の血液試料（血清又は血漿試料）
のように、アルブミンが実質的に存在しない例もある。
【００１２】従って、本発明においては、被検試料中に
存在するアルブミンに依存せずに、常に安定した測定を
可能にするために、試薬から供給されるアルブミンのみ
でも、測定系でのアルブミン濃度が、好ましくは０．０
１重量％以上、より好ましくは０．０３重量％以上とな
るようにする。測定系でのアルブミン濃度が、試薬から
供給されるアルブミンと被検試料中に存在するアルブミ
ンとによって、０．０１重量％以上、又は０．０３重量
％以上となっても全く問題はない。また、被検試料とし
て、アルブミンを含まない精製リピドフラクションや他
の生体試料（例えば、組織抽出液）を用いる場合には、
アルブミンを添加して共存させることが必要である。こ
の場合のアルブミン濃度は、前記のとおり、測定系に
て、好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは
０．０３〜１５重量％である。本発明において試薬から
供給するアルブミンの由来は特に限定されず、例えば、
ウシ、ヒト、ヒツジ、又はウマ等の哺乳動物由来のアル
ブミンを使用することができ、遺伝子工学的に産生され
たアルブミンも使用することができる。
存在するアルブミンに依存せずに、常に安定した測定を
可能にするために、試薬から供給されるアルブミンのみ
でも、測定系でのアルブミン濃度が、好ましくは０．０
１重量％以上、より好ましくは０．０３重量％以上とな
るようにする。測定系でのアルブミン濃度が、試薬から
供給されるアルブミンと被検試料中に存在するアルブミ
ンとによって、０．０１重量％以上、又は０．０３重量
％以上となっても全く問題はない。また、被検試料とし
て、アルブミンを含まない精製リピドフラクションや他
の生体試料（例えば、組織抽出液）を用いる場合には、
アルブミンを添加して共存させることが必要である。こ
の場合のアルブミン濃度は、前記のとおり、測定系に
て、好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは
０．０３〜１５重量％である。本発明において試薬から
供給するアルブミンの由来は特に限定されず、例えば、
ウシ、ヒト、ヒツジ、又はウマ等の哺乳動物由来のアル
ブミンを使用することができ、遺伝子工学的に産生され
たアルブミンも使用することができる。
【００１３】本発明においては、ＨＤＬコレステロール
との反応には膵臓由来コレステロールエステラーゼを使
用し、ＬＤＬコレステロールとの反応には微生物由来コ
レステロールエステラーゼを使用する。膵臓由来コレス
テロールエステラーゼとしては、例えば、ウシ又はブタ
など哺乳動物の膵臓由来の酵素を用いることができ、微
生物由来コレステロールエステラーゼとしては、例え
ば、シュードモナス属に属する微生物又はキャンディダ
属に属する微生物由来の酵素を用いることができる。こ
れらの膵臓由来コレステロールエステラーゼ及び微生物
由来のコレステロールエステラーゼは、いずれもポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させる化学修飾の
有無に関わらず使用することができる。
との反応には膵臓由来コレステロールエステラーゼを使
用し、ＬＤＬコレステロールとの反応には微生物由来コ
レステロールエステラーゼを使用する。膵臓由来コレス
テロールエステラーゼとしては、例えば、ウシ又はブタ
など哺乳動物の膵臓由来の酵素を用いることができ、微
生物由来コレステロールエステラーゼとしては、例え
ば、シュードモナス属に属する微生物又はキャンディダ
属に属する微生物由来の酵素を用いることができる。こ
れらの膵臓由来コレステロールエステラーゼ及び微生物
由来のコレステロールエステラーゼは、いずれもポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させる化学修飾の
有無に関わらず使用することができる。
【００１４】本発明方法によれば、被検試料（例えば、
血清試料又は血漿試料）について測定前に予め遠心分離
等のリピドフラクション分画操作を行わなくても、最初
に第１工程として、アルブミン（抑制剤）の存在下で、
前記被検試料と、膵臓由来コレステロールエステラーゼ
と、コレステロールオキシダーゼとを接触（共存）させ
ることによって、被検試料中のＬＤＬコレステロール及
びＶＬＤＬコレステロールと前記膵臓由来コレステロー
ルエステラーゼとの反応を抑制すると共に、ＨＤＬコレ
ステロールと前記膵臓由来コレステロールエステラーゼ
との反応を抑制せずに進行させ、被検試料中のコレステ
ロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合
物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過
酸化水素）を、公知の手段により検出するかあるいは消
去する。すなわち、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレ
ステロールとの同時測定の場合には、前記各酵素との酵
素反応により消費される化合物又は生成される化合物を
検出し、ＬＤＬコレステロールの単独測定の場合の場合
には、前記各酵素との酵素反応により消費される化合物
又は生成される化合物を検出する必要はなく、消去する
ことができる。
血清試料又は血漿試料）について測定前に予め遠心分離
等のリピドフラクション分画操作を行わなくても、最初
に第１工程として、アルブミン（抑制剤）の存在下で、
前記被検試料と、膵臓由来コレステロールエステラーゼ
と、コレステロールオキシダーゼとを接触（共存）させ
ることによって、被検試料中のＬＤＬコレステロール及
びＶＬＤＬコレステロールと前記膵臓由来コレステロー
ルエステラーゼとの反応を抑制すると共に、ＨＤＬコレ
ステロールと前記膵臓由来コレステロールエステラーゼ
との反応を抑制せずに進行させ、被検試料中のコレステ
ロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合
物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過
酸化水素）を、公知の手段により検出するかあるいは消
去する。すなわち、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレ
ステロールとの同時測定の場合には、前記各酵素との酵
素反応により消費される化合物又は生成される化合物を
検出し、ＬＤＬコレステロールの単独測定の場合の場合
には、前記各酵素との酵素反応により消費される化合物
又は生成される化合物を検出する必要はなく、消去する
ことができる。
【００１５】前記の第１工程においては、膵臓由来コレ
ステロールエステラーゼを、測定系において、好ましく
は０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２
０ｕ／ｍｌの量で存在させる。また、コレステロールオ
キシダーゼを、測定系において、好ましくは０．０５〜
９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌの
量で存在させる。コレステロールオキシダーゼとして
は、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物又は
ノカルディア属に属する微生物に由来する酵素を用いる
ことができる。前記酵素の使用量が０．０５ｕ／ｍｌ未
満になると、反応量が低下することがあり、９０ｕ／ｍ
ｌを越えると、特異性が減少することがある。
ステロールエステラーゼを、測定系において、好ましく
は０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２
０ｕ／ｍｌの量で存在させる。また、コレステロールオ
キシダーゼを、測定系において、好ましくは０．０５〜
９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌの
量で存在させる。コレステロールオキシダーゼとして
は、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物又は
ノカルディア属に属する微生物に由来する酵素を用いる
ことができる。前記酵素の使用量が０．０５ｕ／ｍｌ未
満になると、反応量が低下することがあり、９０ｕ／ｍ
ｌを越えると、特異性が減少することがある。
【００１６】本発明方法において、膵臓由来のコレステ
ロールエステラーゼを用いる前記第１工程においては、
胆汁酸又はその塩を同時に用いる。この胆汁酸は、前記
酵素の活性発現への関与が知られており（Ｊ．Ｈｙｎｎ
ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２４４，１９３７，１９６
９；及びＫ．Ｂ．Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６８，５
７，１９７５）、活性発現に必須である。この場合、胆
汁酸又はその塩の濃度は、測定系において、好ましくは
０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜３ｍＭで
ある。胆汁酸又はその塩の濃度が０．０５ｍＭ未満にな
ると反応量が低下することがあり、４ｍＭを越えると特
異性が減少することがある。前記胆汁酸又はその塩の種
類は、特に限定されることはないが、胆汁酸としては、
例えば、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、
ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、又はリトコ
ール酸などを挙げることができ、その塩としては、例え
ば、ナトリウム塩などを挙げることができる。水溶性が
高い点で、胆汁酸塩、例えば、コール酸ナトリウム、グ
リココール酸ナトリウム、又はデオキシコール酸ナトリ
ウムを使用することが好ましい。
ロールエステラーゼを用いる前記第１工程においては、
胆汁酸又はその塩を同時に用いる。この胆汁酸は、前記
酵素の活性発現への関与が知られており（Ｊ．Ｈｙｎｎ
ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２４４，１９３７，１９６
９；及びＫ．Ｂ．Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６８，５
７，１９７５）、活性発現に必須である。この場合、胆
汁酸又はその塩の濃度は、測定系において、好ましくは
０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜３ｍＭで
ある。胆汁酸又はその塩の濃度が０．０５ｍＭ未満にな
ると反応量が低下することがあり、４ｍＭを越えると特
異性が減少することがある。前記胆汁酸又はその塩の種
類は、特に限定されることはないが、胆汁酸としては、
例えば、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、
ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、又はリトコ
ール酸などを挙げることができ、その塩としては、例え
ば、ナトリウム塩などを挙げることができる。水溶性が
高い点で、胆汁酸塩、例えば、コール酸ナトリウム、グ
リココール酸ナトリウム、又はデオキシコール酸ナトリ
ウムを使用することが好ましい。
【００１７】本発明方法において、膵臓由来のコレステ
ロールエステラーゼを用いる前記第１工程においては、
前記抑制剤としてのアルブミンに加えて、補助抑制剤と
して、一般式（Ｉ）： Ａ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＣＨ3 （Ｉ） （式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュー
クロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミ
ドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で
表わされる化合物、又は一般式（II）： Ｂ−ＣＨ2 −ＣＨ（Ｒ1 ）−ＣＨ2 −ＳＯ3 - （II） （式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基で
ある）で表わされる化合物の少なくとも１種を共存させ
ることが好ましい。
ロールエステラーゼを用いる前記第１工程においては、
前記抑制剤としてのアルブミンに加えて、補助抑制剤と
して、一般式（Ｉ）： Ａ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＣＨ3 （Ｉ） （式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュー
クロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミ
ドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で
表わされる化合物、又は一般式（II）： Ｂ−ＣＨ2 −ＣＨ（Ｒ1 ）−ＣＨ2 −ＳＯ3 - （II） （式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基で
ある）で表わされる化合物の少なくとも１種を共存させ
ることが好ましい。
【００１８】前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物にお
いて、Ａがグルコシド基又はチオグルコシド基である場
合には、ｎは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８
である。グルコシド基は、好ましくはグルコピラノシド
基、より好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシド基であ
る。チオグルコシド基も、好ましくはチオグルコピラノ
シド基、より好ましくはβ−Ｄ−チオグルコピラノシド
基である。Ａがグルコシド基である場合の化合物として
は、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド
（以下、ｎ−ＯＤＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β
−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＨＤＧとも称する）を挙
げることができる。また、Ａがチオグルコシド基である
場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β
−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＯＴＧとも称する）
及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ
−ＨＴＧとも称する）を挙げることができる。
いて、Ａがグルコシド基又はチオグルコシド基である場
合には、ｎは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８
である。グルコシド基は、好ましくはグルコピラノシド
基、より好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシド基であ
る。チオグルコシド基も、好ましくはチオグルコピラノ
シド基、より好ましくはβ−Ｄ−チオグルコピラノシド
基である。Ａがグルコシド基である場合の化合物として
は、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド
（以下、ｎ−ＯＤＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β
−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＨＤＧとも称する）を挙
げることができる。また、Ａがチオグルコシド基である
場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β
−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＯＴＧとも称する）
及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ
−ＨＴＧとも称する）を挙げることができる。
【００１９】前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物にお
いて、Ａがシュークロースオキシカルボニル基である場
合には、好ましくは６〜１０、より好ましくは７〜９で
あり、この場合の化合物としては、具体的には、シュー
クロースモノカプレート（以下、ＳＭ−１０００とも称
する）を挙げることができる。前記一般式（Ｉ）で表わ
される化合物において、ＡがＮ−メチルグルカミドカル
ボニル基である場合には、ｎは好ましくは５〜９であ
る。ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合
の化合物としては、具体的には、オクタノイル−Ｎ−メ
チルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−８とも称する）、ノ
ナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−９
とも称する）、及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド
（以下、ＭＥＧＡ−１０とも称する）を挙げることがで
きる。
いて、Ａがシュークロースオキシカルボニル基である場
合には、好ましくは６〜１０、より好ましくは７〜９で
あり、この場合の化合物としては、具体的には、シュー
クロースモノカプレート（以下、ＳＭ−１０００とも称
する）を挙げることができる。前記一般式（Ｉ）で表わ
される化合物において、ＡがＮ−メチルグルカミドカル
ボニル基である場合には、ｎは好ましくは５〜９であ
る。ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合
の化合物としては、具体的には、オクタノイル−Ｎ−メ
チルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−８とも称する）、ノ
ナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−９
とも称する）、及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド
（以下、ＭＥＧＡ−１０とも称する）を挙げることがで
きる。
【００２０】前記一般式（II）で表わされる化合物とし
ては、具体的には、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以
下、ＣＨＡＰＳとも称する）及び３−［（３−コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１
−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯとも称す
る）を挙げることができる。
ては、具体的には、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以
下、ＣＨＡＰＳとも称する）及び３−［（３−コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１
−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯとも称す
る）を挙げることができる。
【００２１】本発明においては、補助抑制剤は、水溶液
として用いるのが好ましい。補助抑制剤の濃度は、測定
系において、好ましくは、０．０１〜２．０重量％、よ
り好ましくは０．０２〜１．０重量％、最も好ましくは
０．０３〜０．５％重量％である。補助抑制剤の濃度が
０．０１重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラ
クションのコレステロールとの酵素反応に対する抑制効
果が見られないことがあり、正確な測定を行うことがで
きないことがある。逆に、２．０重量％を越える濃度で
は、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対す
る特異性が全く見られなくなることがあり、また補助抑
制剤の溶解性の点においても不都合が生じることがあ
る。
として用いるのが好ましい。補助抑制剤の濃度は、測定
系において、好ましくは、０．０１〜２．０重量％、よ
り好ましくは０．０２〜１．０重量％、最も好ましくは
０．０３〜０．５％重量％である。補助抑制剤の濃度が
０．０１重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラ
クションのコレステロールとの酵素反応に対する抑制効
果が見られないことがあり、正確な測定を行うことがで
きないことがある。逆に、２．０重量％を越える濃度で
は、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対す
る特異性が全く見られなくなることがあり、また補助抑
制剤の溶解性の点においても不都合が生じることがあ
る。
【００２２】本発明方法によってＨＤＬコレステロール
とＬＤＬコレステロールとの同時測定を行う場合には、
前記の第１工程での吸光度変化量によりＨＤＬコレステ
ロールの検出を行う。例えば、過酸化水素を検出する場
合には、ＨＤＬコレステロールとの反応に由来するＨ2
Ｏ2 を、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性発色剤
の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させて、
分光学的に比色測定することができる。被酸化性発色剤
としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨード
安息香酸（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチ
ピリン（４−ＡＰ）が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡ
やＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして
４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有
させることができる。自動分析装置による測定では、波
長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４
６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測
定することができる。なお、本発明方法によってＬＤＬ
コレステロールの単独測定を行う場合には、例えば、前
記の過酸化水素を適当な被酸化性発色剤少なくとも１種
の存在下にペルオキシダーゼ反応を進行させることによ
って消失させる。
とＬＤＬコレステロールとの同時測定を行う場合には、
前記の第１工程での吸光度変化量によりＨＤＬコレステ
ロールの検出を行う。例えば、過酸化水素を検出する場
合には、ＨＤＬコレステロールとの反応に由来するＨ2
Ｏ2 を、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性発色剤
の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させて、
分光学的に比色測定することができる。被酸化性発色剤
としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨード
安息香酸（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチ
ピリン（４−ＡＰ）が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡ
やＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして
４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有
させることができる。自動分析装置による測定では、波
長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４
６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測
定することができる。なお、本発明方法によってＬＤＬ
コレステロールの単独測定を行う場合には、例えば、前
記の過酸化水素を適当な被酸化性発色剤少なくとも１種
の存在下にペルオキシダーゼ反応を進行させることによ
って消失させる。
【００２３】本発明方法においては、前記の第１工程に
続いて、微生物由来コレステロールエステラーゼを使用
する第２工程を実施する。この第２工程は、前記第１工
程に使用した被検試料をそのまま使用して実施すること
ができる。この場合には、前記の第１工程において被検
試料に添加したアルブミン及び胆汁酸又はその塩、更に
は、場合により添加した補助抑制剤がそのまま残留して
いる。また、酵素、すなわち、膵臓由来コレステロール
エステラーゼも残留するが、続く第２工程への影響はほ
とんどなく、他方、残留するコレステロールオキシダー
ゼは、第２工程でのＬＤＬコレステロールとの反応でイ
ンディケーター酵素として働くことができる。
続いて、微生物由来コレステロールエステラーゼを使用
する第２工程を実施する。この第２工程は、前記第１工
程に使用した被検試料をそのまま使用して実施すること
ができる。この場合には、前記の第１工程において被検
試料に添加したアルブミン及び胆汁酸又はその塩、更に
は、場合により添加した補助抑制剤がそのまま残留して
いる。また、酵素、すなわち、膵臓由来コレステロール
エステラーゼも残留するが、続く第２工程への影響はほ
とんどなく、他方、残留するコレステロールオキシダー
ゼは、第２工程でのＬＤＬコレステロールとの反応でイ
ンディケーター酵素として働くことができる。
【００２４】前記第１工程に使用した被検試料をそのま
ま使用して第２工程を実施する場合には、被検試料に、
微生物由来コレステロールエステラーゼを添加する。こ
の第２工程においては、微生物由来コレステロールエス
テラーゼを、測定系において、好ましくは０．０５〜９
０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌの量
で存在させる。前記酵素の使用量が０．０５ｕ／ｍｌ未
満になると、反応量が低下することがあり、９０ｕ／ｍ
ｌを越えると、特異性が減少することがある。
ま使用して第２工程を実施する場合には、被検試料に、
微生物由来コレステロールエステラーゼを添加する。こ
の第２工程においては、微生物由来コレステロールエス
テラーゼを、測定系において、好ましくは０．０５〜９
０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌの量
で存在させる。前記酵素の使用量が０．０５ｕ／ｍｌ未
満になると、反応量が低下することがあり、９０ｕ／ｍ
ｌを越えると、特異性が減少することがある。
【００２５】この第２工程においては、ＶＬＤＬコレス
テロールと前記各酵素との反応が抑制された状態で、Ｌ
ＤＬコレステロールとの反応が特異的に進行するので、
ＬＤＬコレステロールを定量することができる。第２工
程での吸光度変化量により、ＬＤＬコレステロール量の
測定を行う。例えば、過酸化水素を検出する場合には、
前記と同様に、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性
発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色さ
せることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイ
ドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ
Ａ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）
が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１
ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５
ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができ
る。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（Ｈ
ＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴ
を使用する場合）における吸光度を測定することができ
る。
テロールと前記各酵素との反応が抑制された状態で、Ｌ
ＤＬコレステロールとの反応が特異的に進行するので、
ＬＤＬコレステロールを定量することができる。第２工
程での吸光度変化量により、ＬＤＬコレステロール量の
測定を行う。例えば、過酸化水素を検出する場合には、
前記と同様に、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性
発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色さ
せることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイ
ドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ
Ａ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）
が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１
ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５
ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができ
る。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（Ｈ
ＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴ
を使用する場合）における吸光度を測定することができ
る。
【００２６】本発明によるＬＤＬコレステロール測定用
試薬は、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、
２試薬系として構成するのが好ましい。本発明試薬を用
いる場合には、最初に、被検試料と第１試薬とを接触さ
せて、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬ
コレステロールと酵素との反応を抑制しながら、ＨＤＬ
コレステロールと酵素との反応を進行させ、ＨＤＬコレ
ステロールの定量を行うか、あるいは被検試料中のＨＤ
Ｌコレステロールを消去する。
試薬は、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、
２試薬系として構成するのが好ましい。本発明試薬を用
いる場合には、最初に、被検試料と第１試薬とを接触さ
せて、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬ
コレステロールと酵素との反応を抑制しながら、ＨＤＬ
コレステロールと酵素との反応を進行させ、ＨＤＬコレ
ステロールの定量を行うか、あるいは被検試料中のＨＤ
Ｌコレステロールを消去する。
【００２７】従って、第１試薬は、膵臓由来コレステロ
ールエステラーゼ（好ましくは０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌ）、コレステ
ロールオキシダーゼ（好ましくは０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌ）、アルブミ
ン（好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは
０．０３〜１５重量％）、胆汁酸又はその塩（好ましく
は０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜３ｍ
Ｍ）、更には、場合により前記一般式（Ｉ）又は前記一
般式（II）で表わされる補助抑制剤（好ましくは０．０
１〜２．０重量％、より好ましくは０．０２〜１．０重
量％）を含有する。更に、ＨＤＬコレステロールの定量
を行うために、各酵素反応により消費される化合物の量
又は生成される化合物の量を測定する目的で、例えば、
被酸化性発色剤（例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴ、及
び４−アミノアンチピリン）を添加することができる。
ＨＤＬコレステロールの定量を行わない場合には、ＨＤ
Ｌコレステロールを消去する目的で、例えば、被酸化性
発色剤、例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴを添加するこ
ともできる。
ールエステラーゼ（好ましくは０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌ）、コレステ
ロールオキシダーゼ（好ましくは０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌ）、アルブミ
ン（好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは
０．０３〜１５重量％）、胆汁酸又はその塩（好ましく
は０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜３ｍ
Ｍ）、更には、場合により前記一般式（Ｉ）又は前記一
般式（II）で表わされる補助抑制剤（好ましくは０．０
１〜２．０重量％、より好ましくは０．０２〜１．０重
量％）を含有する。更に、ＨＤＬコレステロールの定量
を行うために、各酵素反応により消費される化合物の量
又は生成される化合物の量を測定する目的で、例えば、
被酸化性発色剤（例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴ、及
び４−アミノアンチピリン）を添加することができる。
ＨＤＬコレステロールの定量を行わない場合には、ＨＤ
Ｌコレステロールを消去する目的で、例えば、被酸化性
発色剤、例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴを添加するこ
ともできる。
【００２８】本発明によるＬＤＬコレステロール測定用
試薬の第２試薬を、前記の第１試薬によって処理した被
検試料と接触させて、ＶＬＤＬコレステロールと酵素と
の反応を抑制した状態で、ＬＤＬコレステロールとの反
応を特異的に進行させることができる。従って、第２試
薬は、微生物由来コレステロールエステラーゼ（好まし
くは０．１〜３５０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜
８０ｕ／ｍｌ）を含有する。更に、各酵素反応により消
費される化合物の量又は生成される化合物の量を測定す
ることのできる測定系試薬、例えば、被酸化性発色剤
（例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴ、及び４−アミノア
ンチピリン）（好ましくは０．１〜１０ｍＭ、より好ま
しくは０．１〜５ｍＭ）を含有することができる。ま
た、第２試薬に、場合により、コレステロールオキシダ
ーゼ、アルブミン、胆汁酸又はその塩、及び／又は補助
抑制剤を含有させることができる。この場合、第１試薬
及び第２試薬における各構成成分の合計量は、コレステ
ロールオキシダーゼについては０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、アルブミンについては０．０１〜３０重量％、胆汁
酸又はその塩については０．０５〜４ｍＭ、補助抑制剤
については０．０１〜２．０重量％であることができ
る。
試薬の第２試薬を、前記の第１試薬によって処理した被
検試料と接触させて、ＶＬＤＬコレステロールと酵素と
の反応を抑制した状態で、ＬＤＬコレステロールとの反
応を特異的に進行させることができる。従って、第２試
薬は、微生物由来コレステロールエステラーゼ（好まし
くは０．１〜３５０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜
８０ｕ／ｍｌ）を含有する。更に、各酵素反応により消
費される化合物の量又は生成される化合物の量を測定す
ることのできる測定系試薬、例えば、被酸化性発色剤
（例えば、ＨＴＩＢＡ又はＥＳＰＴ、及び４−アミノア
ンチピリン）（好ましくは０．１〜１０ｍＭ、より好ま
しくは０．１〜５ｍＭ）を含有することができる。ま
た、第２試薬に、場合により、コレステロールオキシダ
ーゼ、アルブミン、胆汁酸又はその塩、及び／又は補助
抑制剤を含有させることができる。この場合、第１試薬
及び第２試薬における各構成成分の合計量は、コレステ
ロールオキシダーゼについては０．０５〜９０ｕ／ｍ
ｌ、アルブミンについては０．０１〜３０重量％、胆汁
酸又はその塩については０．０５〜４ｍＭ、補助抑制剤
については０．０１〜２．０重量％であることができ
る。
【００２９】本発明においては、緩衝剤として、例え
ば、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、
ＭＯＰＳ、又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓなど）、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝
液等を使用することができる。緩衝液の濃度は、好まし
くは５〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜５００ｍ
Ｍ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭである。また、そ
れらの緩衝液のｐＨは、好ましくは４．５〜８．０、よ
り好ましくはＶＬＤＬのコレステロールと酵素との抑制
が良好なｐＨ５．５〜７．５の範囲で適宜選択すること
ができる。
ば、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、
ＭＯＰＳ、又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓなど）、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝
液等を使用することができる。緩衝液の濃度は、好まし
くは５〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜５００ｍ
Ｍ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭである。また、そ
れらの緩衝液のｐＨは、好ましくは４．５〜８．０、よ
り好ましくはＶＬＤＬのコレステロールと酵素との抑制
が良好なｐＨ５．５〜７．５の範囲で適宜選択すること
ができる。
【００３０】本発明試薬を用いて、ＬＤＬコレステロー
ルの単独測定を実施する場合の反応系を模式的に示せば
以下のとおりである。 反応特異性 第一反応（第１試薬：膵臓由来コレステロールエステラーゼ使用） 生体試料＋アルブミン＋胆汁酸又はその塩＋場合により補助抑制剤 ↓ＨＤＬコレステロール反応，ＬＤＬ及びＶＬＤＬの非基質化 第二反応（第２試薬：微生物由来コレステロールエステラーゼ使用） ↓ＬＤＬコレステロール反応
ルの単独測定を実施する場合の反応系を模式的に示せば
以下のとおりである。 反応特異性 第一反応（第１試薬：膵臓由来コレステロールエステラーゼ使用） 生体試料＋アルブミン＋胆汁酸又はその塩＋場合により補助抑制剤 ↓ＨＤＬコレステロール反応，ＬＤＬ及びＶＬＤＬの非基質化 第二反応（第２試薬：微生物由来コレステロールエステラーゼ使用） ↓ＬＤＬコレステロール反応
【００３１】本発明試薬を、ＨＤＬコレステロール及び
ＬＤＬコレステロールの同時定量用試薬として構成する
か、あるいはＬＤＬコレステロールの単独定量用試薬と
して構成することができる。ＬＤＬコレステロールの単
独定量用試薬の場合には、第１試薬の構成成分から、被
酸化性発色剤〔前記反応式（３）〕の内、例えば、４−
アミノアンチピリンを除いておき、ＨＴＩＢＡ又はＥＳ
ＰＴのみを添加しておく。これにより、前記反応式
（２）によって生じたＨ2 Ｏ2 は、全く発色することな
く、第１試薬による反応を完結させることができる。次
いで、第２試薬の構成成分に４−アミノアンチピリンを
共存させておけば、酵素反応に伴う発色反応が進行し、
ＬＤＬコレステロールのみの測定を行うことができる。
ＬＤＬコレステロールの同時定量用試薬として構成する
か、あるいはＬＤＬコレステロールの単独定量用試薬と
して構成することができる。ＬＤＬコレステロールの単
独定量用試薬の場合には、第１試薬の構成成分から、被
酸化性発色剤〔前記反応式（３）〕の内、例えば、４−
アミノアンチピリンを除いておき、ＨＴＩＢＡ又はＥＳ
ＰＴのみを添加しておく。これにより、前記反応式
（２）によって生じたＨ2 Ｏ2 は、全く発色することな
く、第１試薬による反応を完結させることができる。次
いで、第２試薬の構成成分に４−アミノアンチピリンを
共存させておけば、酵素反応に伴う発色反応が進行し、
ＬＤＬコレステロールのみの測定を行うことができる。
【００３２】前記の説明では、吸光度測定を例として取
り上げたが、酵素反応による発色物を反射光強度の差と
して測定したり、発色以外にも電気化学的な酸化還元反
応量として測定することができる。例えば、前記反応式
（２）で生成するＨ2 Ｏ2 は、直接に白金電極を用いる
か、フェロセンなどの適当なメディエーターとペルオキ
シダーゼの存在下に反応させることにより、あるいは直
接コレステロールオキシダーゼ反応時にフェロシアン化
カリウムなどのメディエーターを介して、生成する酸化
還元電流の変化量を電気化学的に測定することもでき
る。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、
前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従
来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもでき
る。また、酵素反応により生成される化合物としては、
前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（２）
の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方
法で測定することもできる。
り上げたが、酵素反応による発色物を反射光強度の差と
して測定したり、発色以外にも電気化学的な酸化還元反
応量として測定することができる。例えば、前記反応式
（２）で生成するＨ2 Ｏ2 は、直接に白金電極を用いる
か、フェロセンなどの適当なメディエーターとペルオキ
シダーゼの存在下に反応させることにより、あるいは直
接コレステロールオキシダーゼ反応時にフェロシアン化
カリウムなどのメディエーターを介して、生成する酸化
還元電流の変化量を電気化学的に測定することもでき
る。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、
前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従
来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもでき
る。また、酵素反応により生成される化合物としては、
前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（２）
の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方
法で測定することもできる。
【００３３】
【作用】以下の説明に限定されるものでないが、本発明
は、ＬＤＬコレステロールの測定方法において、利用す
る酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロ
ールとの反応に際して、アルブミンを存在させ、しかも
由来の異なるコレステロールエステラーゼを用いると、
全く異なった反応特異性を示すという知見から導かれた
ものである。すなわち、微生物由来コレステロールエス
テラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、アルブミ
ンの共存下で、ＬＤＬコレステロールと反応するのに対
し、膵臓由来コレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼは、アルブミン及び胆汁酸又はその
塩、並びに場合により共存することのある前記補助抑制
剤の存在下で、ＨＤＬコレステロールと反応する。これ
らの現象は、簡単には、酵素とアルブミンという高分子
タンパク質及び各脂質粒子間で、直接リピドフラクショ
ンのアポリポタンパク質に酵素が親和性を示すか、ある
いは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵
素との反応時に、アルブミンが酵素と相互作用するもの
と考えられる。その相互作用の結果は、リピドフラクシ
ョン特異的な酵素活性の活性化も考えられるが、むしろ
リピドフラクション特異的な抑制効果の方が、主に生じ
ているものと考えられる。
は、ＬＤＬコレステロールの測定方法において、利用す
る酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロ
ールとの反応に際して、アルブミンを存在させ、しかも
由来の異なるコレステロールエステラーゼを用いると、
全く異なった反応特異性を示すという知見から導かれた
ものである。すなわち、微生物由来コレステロールエス
テラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、アルブミ
ンの共存下で、ＬＤＬコレステロールと反応するのに対
し、膵臓由来コレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼは、アルブミン及び胆汁酸又はその
塩、並びに場合により共存することのある前記補助抑制
剤の存在下で、ＨＤＬコレステロールと反応する。これ
らの現象は、簡単には、酵素とアルブミンという高分子
タンパク質及び各脂質粒子間で、直接リピドフラクショ
ンのアポリポタンパク質に酵素が親和性を示すか、ある
いは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵
素との反応時に、アルブミンが酵素と相互作用するもの
と考えられる。その相互作用の結果は、リピドフラクシ
ョン特異的な酵素活性の活性化も考えられるが、むしろ
リピドフラクション特異的な抑制効果の方が、主に生じ
ているものと考えられる。
【００３４】一般に、各リピドフラクションは、脂質と
アポタンパク質との脂質複合体からなり、その脂質構成
比の違いとアポタンパク質のタイプ（Ａ−Ｉ、Ａ−II、
Ｂ−１００、Ｂ−４８、Ｃ、又はＥなど）の差による物
理化学的性質（粒子サイズや等電点など）及び量的（各
フラクション中に含まれる量）な違いによって識別され
る。これら脂質粒子に対する酵素の反応は、界面活性剤
の共存により最大限に進行するが、このような界面活性
剤による脂質粒子の可溶化が有効に利用されている例と
して、例えば、総コレステロールの測定を挙げることが
できる。しかし、この場合、高濃度の界面活性剤の使用
は、酵素反応の代謝回転を大きくさせる効果がある反
面、脂質粒子の崩壊を招くことから、本発明のような高
分子間相互作用に関わるユニークな現象を観察すること
は不可能なことであった。リピドフラクション間で最も
大きく異なるアポタンパク質のタイプは、ＨＤＬフラク
ションでは、Ａ−Ｉ、及びＡ−IIであり、ＬＤＬフラク
ションでは、Ｂ−１００、ＶＬＤＬフラクションでは、
Ｂ−１００、Ｃ、及びＥである。従来、この違いに着目
して、アポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発
されてきた。この方法は、ＨＤＬ及びＶＬＤＬに対する
抗体を固定化した不溶性担体（例えば、ラテックス粒
子）と試料とを混和し、免疫複合体を形成させた後、遠
心分離し、上清に残った総コレステロールを測定するも
のである。しかし、この方法では自動化はもちろん、免
疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に
維持することは難しく、また、ＬＤＬ及びＶＬＤＬの両
者に含まれるアポタンパク質Ｂ−１００に対する抗体の
反応特異性を制御することは、基本的に困難を伴うもの
であった。これに対して、本発明では、抗体や金属イオ
ンによる錯体形成などの反応を利用する必要はなく、単
純で簡潔な試薬構成を用いることによって自動化が可能
となる。
アポタンパク質との脂質複合体からなり、その脂質構成
比の違いとアポタンパク質のタイプ（Ａ−Ｉ、Ａ−II、
Ｂ−１００、Ｂ−４８、Ｃ、又はＥなど）の差による物
理化学的性質（粒子サイズや等電点など）及び量的（各
フラクション中に含まれる量）な違いによって識別され
る。これら脂質粒子に対する酵素の反応は、界面活性剤
の共存により最大限に進行するが、このような界面活性
剤による脂質粒子の可溶化が有効に利用されている例と
して、例えば、総コレステロールの測定を挙げることが
できる。しかし、この場合、高濃度の界面活性剤の使用
は、酵素反応の代謝回転を大きくさせる効果がある反
面、脂質粒子の崩壊を招くことから、本発明のような高
分子間相互作用に関わるユニークな現象を観察すること
は不可能なことであった。リピドフラクション間で最も
大きく異なるアポタンパク質のタイプは、ＨＤＬフラク
ションでは、Ａ−Ｉ、及びＡ−IIであり、ＬＤＬフラク
ションでは、Ｂ−１００、ＶＬＤＬフラクションでは、
Ｂ−１００、Ｃ、及びＥである。従来、この違いに着目
して、アポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発
されてきた。この方法は、ＨＤＬ及びＶＬＤＬに対する
抗体を固定化した不溶性担体（例えば、ラテックス粒
子）と試料とを混和し、免疫複合体を形成させた後、遠
心分離し、上清に残った総コレステロールを測定するも
のである。しかし、この方法では自動化はもちろん、免
疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に
維持することは難しく、また、ＬＤＬ及びＶＬＤＬの両
者に含まれるアポタンパク質Ｂ−１００に対する抗体の
反応特異性を制御することは、基本的に困難を伴うもの
であった。これに対して、本発明では、抗体や金属イオ
ンによる錯体形成などの反応を利用する必要はなく、単
純で簡潔な試薬構成を用いることによって自動化が可能
となる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】本実施例では、超遠心法によるリピドフラ
クションの分画を行った。超遠心法による脂質フラクシ
ョンの分画は、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｋ．ら（Ｔｈｅ
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄＯｔｈｅｒ Ｌｉｐｉｄｓ，
ｖｏｌ．６，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９６
３，ｐ．２１６〜２５０）の方法に準じて行った。具体
的には、プール血清２０ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩
１ｍｇを加え溶解した。これとは別に二種類の比重液を
作成した。すなわち、比重１．１８２の比重液は、塩化
ナトリウム０．５７ｇと臭化ナトリウム１３．６５ｇと
を精製水５０ｍｌに溶解して調製した。比重１．４８３
の比重液は、塩化ナトリウム０．５７ｇと臭化ナトリウ
ム３９．１４ｇとを精製水５０ｍｌに溶解して調製し
た。３０ｍｌ容量の遠心管に上記の処理血清２０ｍｌを
入れ、１０℃で４００００ｒｐｍにて２４時間遠心し
た。遠心終了後、遠心管の最上層部の６．７ｍｌを回収
し、ＶＬＤＬ画分とした。次いで、この遠心管へ比重
１．１８２の比重液６．７ｍｌを加えてよく攪拌し、再
度、同じ条件で遠心した。遠心終了後、遠心管の最上層
部６．７ｍｌを回収し、これをＬＤＬ画分とした。更
に、この遠心管へ比重１．４８３の比重液６．７ｍｌを
添加し、よく攪拌した。これを再度、１０℃で４０００
０ｒｐｍにて２４時間遠心した。遠心終了後、同様に最
上層部より６．７ｍｌを回収し、これをＨＤＬ画分とし
た。各画分を生理的食塩水に一夜透析した後（冷蔵
下）、冷蔵保存し、測定に用いた。各画分中の総コレス
テロール濃度を酵素法（ヤトロン製）により測定したと
ころ、ＬＤＬはコレステロール１４０ｍｇ／ｄｌのコレ
ステロールを含み、ＶＬＤＬはコレステロール８０ｍｇ
／ｄｌを含み、そしてＨＤＬはコレステロール１００ｍ
ｇ／ｄｌを含んでいた。
クションの分画を行った。超遠心法による脂質フラクシ
ョンの分画は、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｋ．ら（Ｔｈｅ
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄＯｔｈｅｒ Ｌｉｐｉｄｓ，
ｖｏｌ．６，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９６
３，ｐ．２１６〜２５０）の方法に準じて行った。具体
的には、プール血清２０ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩
１ｍｇを加え溶解した。これとは別に二種類の比重液を
作成した。すなわち、比重１．１８２の比重液は、塩化
ナトリウム０．５７ｇと臭化ナトリウム１３．６５ｇと
を精製水５０ｍｌに溶解して調製した。比重１．４８３
の比重液は、塩化ナトリウム０．５７ｇと臭化ナトリウ
ム３９．１４ｇとを精製水５０ｍｌに溶解して調製し
た。３０ｍｌ容量の遠心管に上記の処理血清２０ｍｌを
入れ、１０℃で４００００ｒｐｍにて２４時間遠心し
た。遠心終了後、遠心管の最上層部の６．７ｍｌを回収
し、ＶＬＤＬ画分とした。次いで、この遠心管へ比重
１．１８２の比重液６．７ｍｌを加えてよく攪拌し、再
度、同じ条件で遠心した。遠心終了後、遠心管の最上層
部６．７ｍｌを回収し、これをＬＤＬ画分とした。更
に、この遠心管へ比重１．４８３の比重液６．７ｍｌを
添加し、よく攪拌した。これを再度、１０℃で４０００
０ｒｐｍにて２４時間遠心した。遠心終了後、同様に最
上層部より６．７ｍｌを回収し、これをＨＤＬ画分とし
た。各画分を生理的食塩水に一夜透析した後（冷蔵
下）、冷蔵保存し、測定に用いた。各画分中の総コレス
テロール濃度を酵素法（ヤトロン製）により測定したと
ころ、ＬＤＬはコレステロール１４０ｍｇ／ｄｌのコレ
ステロールを含み、ＶＬＤＬはコレステロール８０ｍｇ
／ｄｌを含み、そしてＨＤＬはコレステロール１００ｍ
ｇ／ｄｌを含んでいた。
【００３６】
【実施例２】本実施例では、実施例１で精製した各脂質
フラクションを試料として用いて、各フラクションに対
する反応特異性及び反応経時変化を調べた。１ｍＭ Ｅ
ＳＰＴ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．３％牛ア
ルブミン、０．３７％ｎ−ＨＴＧ、０．７５ｍＭコール
酸ナトリウム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由来コレステロー
ルエステラーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレステロールオキ
シダーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）１ｍｌを３７℃で３分間予加温した。これ
に、各脂質フラクション試料１０μｌを添加し、３７℃
で５分間反応させた。更に、この反応液に０．２Ｍ ４
−ＡＰの３μｌと９３８ｕ／ｍｌシュードモナス属由来
コレステロールエステラーゼ２μｌとを加え、波長５４
６ｎｍでの発色反応を記録した。各脂質フラクションに
対する反応経時変化の結果を図１に示す。本発明方法
は、良好な反応特異性を示すことが明らかである。
フラクションを試料として用いて、各フラクションに対
する反応特異性及び反応経時変化を調べた。１ｍＭ Ｅ
ＳＰＴ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．３％牛ア
ルブミン、０．３７％ｎ−ＨＴＧ、０．７５ｍＭコール
酸ナトリウム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由来コレステロー
ルエステラーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレステロールオキ
シダーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）１ｍｌを３７℃で３分間予加温した。これ
に、各脂質フラクション試料１０μｌを添加し、３７℃
で５分間反応させた。更に、この反応液に０．２Ｍ ４
−ＡＰの３μｌと９３８ｕ／ｍｌシュードモナス属由来
コレステロールエステラーゼ２μｌとを加え、波長５４
６ｎｍでの発色反応を記録した。各脂質フラクションに
対する反応経時変化の結果を図１に示す。本発明方法
は、良好な反応特異性を示すことが明らかである。
【００３７】
【実施例３】本実施例では、自動分析機での測定を行っ
た。本発明の試薬組成物として、１ｍＭ ＥＳＰＴ、５
μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．３％牛アルブミン、
０．１％ｎ−ＯＴＧ、０．７５ｍＭコール酸ナトリウ
ム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由来コレステロールエステラ
ーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを
含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）
［試薬１］３００μｌと、２ｍＭ ４−ＡＰ、０．３％
牛アルブミン及び４ｕ／ｍｌシュードモナス属由来コレ
ステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒ
ｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）［試薬２］１００μｌとの二
試薬系の構成をとる試薬組成物を用い、血清試料４μｌ
を用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬
１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も
５分間とし、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍで
測定を行った。
た。本発明の試薬組成物として、１ｍＭ ＥＳＰＴ、５
μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．３％牛アルブミン、
０．１％ｎ−ＯＴＧ、０．７５ｍＭコール酸ナトリウ
ム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由来コレステロールエステラ
ーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを
含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）
［試薬１］３００μｌと、２ｍＭ ４−ＡＰ、０．３％
牛アルブミン及び４ｕ／ｍｌシュードモナス属由来コレ
ステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒ
ｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）［試薬２］１００μｌとの二
試薬系の構成をとる試薬組成物を用い、血清試料４μｌ
を用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬
１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も
５分間とし、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍで
測定を行った。
【００３８】比較対照方法としては、Ｆｒｉｅｄｅｗａ
ｌｄらの演算式を使ってＬＤＬコレステロール量の推定
を行った。この方法は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄらにより
提唱されたものである（Ｗ．Ｔ．Ｆｒｉｅｄｅｗａｌ
ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，４９９，１９７２）。すなわち、脂質関連
測定項目の内、総コレステロール、中性脂肪及びＨＤＬ
コレステロールの３種類の測定値からＬＤＬコレステロ
ール量を算出するものであり、この算出値は、直接測定
法の開発においても、比較対照としての有用性が示唆さ
れている（Ｐ．Ｓ．Ｂａｃｈｏｒｉｋ ａｎｄ Ｊ．
Ｗ．Ｒｏｓｓ，ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇ
ｒａｍ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，Ｃｌｉｎｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，１４１４，１９９
５）。具体的には、上記の本発明方法による測定を実施
した血清検体例について、予めＨＤＬコレステロール、
総コレステロール及び中性脂肪（ヤトロン製）の各項目
について測定し、それらの測定値からＬＤＬコレステロ
ール量を推定し、比較対照とした。また、標準物質とし
ては、予め既知濃度の精製ＬＤＬフラクションで値付け
したプール血清を用いた。両測定方法の相関関係を図２
に示した。本発明方法は、比較対照方法（Ｆｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄ）と良好な相関性を示し、ＬＤＬコレステロー
ルの測定が正確であることが確認された。
ｌｄらの演算式を使ってＬＤＬコレステロール量の推定
を行った。この方法は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄらにより
提唱されたものである（Ｗ．Ｔ．Ｆｒｉｅｄｅｗａｌ
ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，４９９，１９７２）。すなわち、脂質関連
測定項目の内、総コレステロール、中性脂肪及びＨＤＬ
コレステロールの３種類の測定値からＬＤＬコレステロ
ール量を算出するものであり、この算出値は、直接測定
法の開発においても、比較対照としての有用性が示唆さ
れている（Ｐ．Ｓ．Ｂａｃｈｏｒｉｋ ａｎｄ Ｊ．
Ｗ．Ｒｏｓｓ，ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇ
ｒａｍ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，Ｃｌｉｎｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，１４１４，１９９
５）。具体的には、上記の本発明方法による測定を実施
した血清検体例について、予めＨＤＬコレステロール、
総コレステロール及び中性脂肪（ヤトロン製）の各項目
について測定し、それらの測定値からＬＤＬコレステロ
ール量を推定し、比較対照とした。また、標準物質とし
ては、予め既知濃度の精製ＬＤＬフラクションで値付け
したプール血清を用いた。両測定方法の相関関係を図２
に示した。本発明方法は、比較対照方法（Ｆｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄ）と良好な相関性を示し、ＬＤＬコレステロー
ルの測定が正確であることが確認された。
【００３９】
【実施例４】本実施例では、自動分析機によって、ＨＤ
ＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとの同時測定
を行った。本発明の試薬組成物として、１ｍＭ ＥＳＰ
Ｔ、１ｍＭ ４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダー
ゼ、０．３％牛アルブミン、０．１％ｎ−ＯＴＧ、０．
７５ｍＭコール酸ナトリウム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由
来コレステロールエステラーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレ
ステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒ
ｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）［試薬１］３００μｌと、
０．１％牛アルブミン、０．７５ｍＭコール酸ナトリウ
ム及び７．５ｕ／ｍｌシュードモナス属由来コレステロ
ールエステラーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ６．８）［試薬２］１００μｌとの二試薬系
の構成をとる試薬組成物を用い、血清試料４μｌを用い
る条件で、自動分析装置［日立７０７０型自動分析装
置］を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間
で、続く試薬２との反応時間も５分間とした。対照試験
は、血清試料４μｌの代わりに精製水４μｌを用いて実
施した。主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定
を行った。また反応経時変化も併せて記録し、結果を図
３に示した。図３においてＡは精製水、Ｂは血清を各々
試料とした場合の結果であり、反応時間を２０秒／ポイ
ント（すなわち、２０秒毎に吸光度を測光した回数：図
３の●）で示した。試薬１での変化量（０〜１６ポイン
ト）は、ＨＤＬコレステロールとの反応であり、試薬２
の添加以降（１７〜３１ポイント）の変化量は、ＬＤＬ
コレステロールとの反応が認めれた。
ＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとの同時測定
を行った。本発明の試薬組成物として、１ｍＭ ＥＳＰ
Ｔ、１ｍＭ ４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダー
ゼ、０．３％牛アルブミン、０．１％ｎ−ＯＴＧ、０．
７５ｍＭコール酸ナトリウム、０．３ｕ／ｍｌ牛膵臓由
来コレステロールエステラーゼ及び１．５ｕ／ｍｌコレ
ステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒ
ｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）［試薬１］３００μｌと、
０．１％牛アルブミン、０．７５ｍＭコール酸ナトリウ
ム及び７．５ｕ／ｍｌシュードモナス属由来コレステロ
ールエステラーゼを含む４０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ６．８）［試薬２］１００μｌとの二試薬系
の構成をとる試薬組成物を用い、血清試料４μｌを用い
る条件で、自動分析装置［日立７０７０型自動分析装
置］を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間
で、続く試薬２との反応時間も５分間とした。対照試験
は、血清試料４μｌの代わりに精製水４μｌを用いて実
施した。主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定
を行った。また反応経時変化も併せて記録し、結果を図
３に示した。図３においてＡは精製水、Ｂは血清を各々
試料とした場合の結果であり、反応時間を２０秒／ポイ
ント（すなわち、２０秒毎に吸光度を測光した回数：図
３の●）で示した。試薬１での変化量（０〜１６ポイン
ト）は、ＨＤＬコレステロールとの反応であり、試薬２
の添加以降（１７〜３１ポイント）の変化量は、ＬＤＬ
コレステロールとの反応が認めれた。
【００４０】また相関結果については、ＨＤＬコレステ
ロール量を、予め沈殿法（第一化学製）によって測定
し、比較対照方法とした。両測定法での標準物質として
は、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を
用いた。一方、ＬＤＬコレステロール量は実施例３と同
様にＦｒｉｅｄｅｗａｌｄらの演算式を使って推定し、
比較対象とした。また、標準物質としては、予め既知濃
度の精製ＬＤＬフラクションで値付けしたプール血清を
用いた。両測定方法の相関関係を図４（ＨＤＬコレステ
ロール）と図５（ＬＤＬコレステロール）に示した。本
発明方法は、比較対照方法（ＨＤＬコレステロール量は
沈殿法；ＬＤＬコレステロール量はＦｒｉｅｄｅｗａｌ
ｄ）と良好な相関性を示し、各々の測定値が正確である
ことが確認された。
ロール量を、予め沈殿法（第一化学製）によって測定
し、比較対照方法とした。両測定法での標準物質として
は、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を
用いた。一方、ＬＤＬコレステロール量は実施例３と同
様にＦｒｉｅｄｅｗａｌｄらの演算式を使って推定し、
比較対象とした。また、標準物質としては、予め既知濃
度の精製ＬＤＬフラクションで値付けしたプール血清を
用いた。両測定方法の相関関係を図４（ＨＤＬコレステ
ロール）と図５（ＬＤＬコレステロール）に示した。本
発明方法は、比較対照方法（ＨＤＬコレステロール量は
沈殿法；ＬＤＬコレステロール量はＦｒｉｅｄｅｗａｌ
ｄ）と良好な相関性を示し、各々の測定値が正確である
ことが確認された。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、生体試料（例えば、血
清又は血漿）の遠心操作などの種々の分離分画操作を行
うことなく、簡便な操作で、高精度のＬＤＬコレステロ
ール（及びＨＤＬコレステロール）の測定結果を得るこ
とができる。
清又は血漿）の遠心操作などの種々の分離分画操作を行
うことなく、簡便な操作で、高精度のＬＤＬコレステロ
ール（及びＨＤＬコレステロール）の測定結果を得るこ
とができる。
【図１】本発明方法の各脂質フラクションに対する反応
経時変化を示すグラフである。
経時変化を示すグラフである。
【図２】本発明方法と比較対照方法（Ｆｒｉｅｄｅｗａ
ｌｄ）との相関関係を示すグラフである。
ｌｄ）との相関関係を示すグラフである。
【図３】本発明方法により血清試料中のＨＤＬコレステ
ロールとＬＤＬコレステロールとを測定した場合の反応
経時変化を示すグラフである。
ロールとＬＤＬコレステロールとを測定した場合の反応
経時変化を示すグラフである。
【図４】本発明方法と比較対照方法（沈殿法）とのＨＤ
Ｌコレステロール測定結果の相関関係を示すグラフであ
る。
Ｌコレステロール測定結果の相関関係を示すグラフであ
る。
【図５】本発明方法と比較対照方法（Ｆｒｉｅｄｅｗａ
ｌｄ）とのＬＤＬコレステロール測定結果の相関関係を
示すグラフである。
ｌｄ）とのＬＤＬコレステロール測定結果の相関関係を
示すグラフである。
Claims (5)
- 【請求項１】 生体試料と、膵臓由来コレステロールエ
ステラーゼと、コレステロールオキシダーゼとを、アル
ブミンが測定系全体の０．０１重量％以上存在する条件
下、及び胆汁酸又はその塩の存在下で接触させ、次い
で、こうして処理した生体試料と微生物由来コレステロ
ールエステラーゼとを接触させ、低密度リポタンパク質
コレステロールと微生物由来コレステロールエステラー
ゼ及びコレステロールオキシダーゼとが関与する酵素反
応により消費される化合物又は生成される化合物を測定
することを特徴とする、低密度リポタンパク質コレステ
ロールの特異的測定方法。 - 【請求項２】 （１）一般式（Ｉ）： Ａ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＣＨ3 （Ｉ） （式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュー
クロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミ
ドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で
表される化合物、及び（２）一般式（II）： Ｂ−ＣＨ2 −ＣＨ（Ｒ1 ）−ＣＨ2 −ＳＯ3 - （II） 〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基で
ある〕で表される化合物からなる群から選んだ補助抑制
剤少なくとも１種の存在下で実施する、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 （１）膵臓由来コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルブミン、及び
胆汁酸又はその塩を含有する第１試薬と、（２）微生物
由来コレステロールエステラーゼを含有する第２試薬と
を含むことを特徴とする、低密度リポタンパク質コレス
テロールの特異的測定用試薬。 - 【請求項４】 前記第１試薬が、（１）一般式（Ｉ）： Ａ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＣＨ3 （Ｉ） （式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュー
クロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミ
ドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で
表される化合物、及び（２）一般式（II）： Ｂ−ＣＨ2 −ＣＨ（Ｒ1 ）−ＣＨ2 −ＳＯ3 - （II） 〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基で
ある〕で表される化合物からなる群から選んだ補助抑制
剤少なくとも１種を更に含有する、請求項３に記載の試
薬。 - 【請求項５】 生体試料と、膵臓由来コレステロールエ
ステラーゼと、コレステロールオキシダーゼとを、アル
ブミンが測定系全体の０．０１重量％以上存在する条件
下、及び胆汁酸又はその塩の存在下で接触させ、高密度
リポタンパク質コレステロールと膵臓由来コレステロー
ルエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとが関
与する酵素反応により消費される化合物又は生成される
化合物を測定し、続いて、こうして処理した生体試料と
微生物由来コレステロールエステラーゼとを接触させ、
低密度リポタンパク質コレステロールと微生物由来コレ
ステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼとが関与する酵素反応により消費される化合物又は生
成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リ
ポタンパク質コレステロール及び低密度リポタンパク質
コレステロールの特異的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17891497A JP4034851B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17891497A JP4034851B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119300A true JPH119300A (ja) | 1999-01-19 |
| JP4034851B2 JP4034851B2 (ja) | 2008-01-16 |
Family
ID=16056875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17891497A Expired - Lifetime JP4034851B2 (ja) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | 低密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4034851B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001224397A (ja) * | 2000-02-17 | 2001-08-21 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| WO2001094619A1 (fr) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | International Reagents Corporation | Methode d'analyse de composants dans des echantillons biologiques |
| WO2004035817A1 (ja) * | 2002-10-16 | 2004-04-29 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 |
| JP2010148526A (ja) * | 2010-04-05 | 2010-07-08 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
-
1997
- 1997-06-19 JP JP17891497A patent/JP4034851B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001224397A (ja) * | 2000-02-17 | 2001-08-21 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| JP4519239B2 (ja) * | 2000-02-17 | 2010-08-04 | デンカ生研株式会社 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| WO2001094619A1 (fr) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | International Reagents Corporation | Methode d'analyse de composants dans des echantillons biologiques |
| US6986998B2 (en) | 2000-06-07 | 2006-01-17 | International Reagents Corporation | Method of analyzing components in biological samples |
| WO2004035817A1 (ja) * | 2002-10-16 | 2004-04-29 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 |
| JP2010148526A (ja) * | 2010-04-05 | 2010-07-08 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4034851B2 (ja) | 2008-01-16 |
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