JPH09288111A - 生体試料の濁りを除去するための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清あるいは血漿中のリピドフラクション中
に含有されるコレステロールを測定するとき、生体試料
の濁りの影響を受けない試薬を提供する。 【解決手段】 血清あるいは血漿中のリピドフラクショ
ン中に含有されるコレステロールを測定する試薬におい
て、生体試料の濁りを除去するためにリパーゼを含有さ
せて測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体試料の濁りの影響
を受けない血清あるいは血漿中のリピドフラクション中
に含有されるコレステロール測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床診断分析において、疾病の診断や治
療経過の観察のために、生体試料（血液、尿等）に含ま
れる特定の指標物質を検出することが行われている。例
えば、血漿又は血清中の各リピドフラクション中に含有
されるコレステロールは、近年アテローム性動脈硬化症
や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要視されて
いる。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂質複合体
粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用した分離
法である超遠心法に従って、カイロミクロン、超低密度
リポプロテイン（Very low density lipoprotein；以下
ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン（Low dens
ity lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、及び高密度
リポプロテイン（High density lipoprotein；以下ＨＤ
Ｌともいう）の４種類に分別されている。各リピドフラ
クションは、アポリポタンパク質と脂質に大別され、脂
質は更に遊離型コレステロール、エステル型コレステロ
ール、トリグリセリド及びリン脂質から構成されてい
る。このため、コレステロールの測定は遊離型とエステ
ル型の両者について行われている。

【０００３】しかし、試料としてあらゆる組織の変化等
を反映している血液は、最も重要な分析試料であるが、
血液は数百種類の成分から成る複雑な組成を有している
ため、対象者（患者等）毎にそれら成分の含量が大幅に
異なり、目的とする指標の検出を妨害する場合がある。
中でも、血液（血清、血漿）の濁り（乳びともいう）
は、分析結果の誤差を招来する大きな要因の１つであ
り、各リピドフラクション中に含有されるコレステロー
ルを測定する場合にも同様に大きな問題点となってい
る。試料の濁りの主原因は、リポタンパク質の一種であ
るカイロミクロンやＶＬＤＬである。即ち、カイロミク
ロンやＶＬＤＬは他のリポタンパクに比べ粒子径が大き
く、非極性の脂質であるトリグリセリドの割合が多い
為、水溶液中で濁りやすく、臨床検査では測定値に誤差
を与えることが多かった。

【０００４】従来は、種々の界面活性剤によりカイロミ
クロンやＶＬＤＬを可溶化し、測定値への影響を回避し
ていた（例えば、特開昭５９−１６２４５４号公報、特
公平０４−７８３２公報には、特定の界面活性剤で指定
範囲のＨＬＢ下で生物試料の濁りを効果的に除去するこ
とが報告されている）。乳びの組成物は化学組成上変化
を起こすことなく、界面活性剤により包み込まれ、ミセ
ルを形成して透明化する。界面活性剤の種類によっても
透明化する為の至適濃度は異なりるため、目的とする濁
りや沈殿を完全に消去するために、高濃度の界面活性剤
を必要とすることも少なくない。高濃度の界面活性剤を
試薬組成物に添加した場合、他の成分（例えば、反応に
必要な酵素や基質等）の保存安定性や、目的とする反応
自体に影響を与えることもある。血清や血漿中の脂質の
測定において、一般的に、測定対象の脂質を分解する酵
素を賦活化するために界面活性剤を必要とする場合が多
いが、乳び消去のための界面活性剤の必要量と酵素の賦
活化、安定化のため至適量が異なることが多く、主とし
て界面活性剤によって乳びを消去する場合、問題点が多
いのが実状である。

【０００５】また、一方では生体試料中の蛋白を測定す
る試薬において、特定の界面活性剤と酵素によって、生
体試料の濁りを除去すること（特公平０４−７４０００
号公報）が報告されている。酵素によって乳びの原因と
なる物質、例えばカイロミクロン、ＶＬＤＬ中のコレス
テロールエステルやトリグリセリドを分解し、濁りを消
去する方法は以前より行われていたが、酵素を用いて試
料中の乳びを除去しようとした場合、測定対象物質が該
酵素によって分解されない（あるいは、危険性が少な
い）物質であることが前提である。従って、本願のよう
な血清あるいは血漿中のリピドフラクション中に含有さ
れるコレステロールを測定する系においては、試料中の
乳びを除去する手段は、界面活性剤による方法が用いら
れてきた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上述べたとおり、血
清あるいは血漿の濁りを消去・防止するために、従来多
用されていた界面活性剤の添加は、本来目的とする反応
系に与える影響（酵素反応の阻害や酵素の安定性等）が
大きいことを鑑み、界面活性剤の添加に依存せず、血清
あるいは血漿の濁りを回避できる方法を提供することを
目的として、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、血清
あるいは血漿中のリピドフラクション中に含有されるコ
レステロールを測定する試薬において、生体試料の濁り
を除去するためにリパーゼを含有させることを特徴とす
る各リピドフラクション中に含有されるコレステロール
測定用試薬、に関する。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【０００８】先に述べたように、本願のような血清ある
いは血漿中のリピドフラクション中に含有されるコレス
テロールを測定する系においては、試料中の乳びを除去
する手段は、界面活性剤による方法が用いられてきた。
乳びの原因がトリグリセリドのみであれば、脂質分解酵
素としてリパーゼを用いれば、少なくともトリグリセリ
ドによる濁りは消去される。しかしながら、リパーゼは
コレステロールエステラーゼ活性も有しているため、特
に、リピドフラクション中に含有されるコレステロール
を測定する系においては、ＬＤＬ中のコレステロールエ
ステルやＨＤＬ中のコレステロールエステルへの影響が
当然憂慮される。

【０００９】しかしながら、 ＨＤＬ−コレステロール
を含有する試料に、ＨＤＬ−コレステロール以外のリポ
蛋白をポリアニオン及び２価の金属塩からなる凝集試薬
によって凝集させ、ＨＤＬ−コレステロール以外のリポ
蛋白とコレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼとの
反応を阻害させる反応系に、試料の乳びを除去するため
にリパーゼを適用すると、驚くべきことに、ＨＤＬ−コ
レステロールの測定値には全く影響することなく、高ト
リグリセリドを主体とする試料中のカイロミクロン性の
濁りを消去できることを見出した。本発明は、係る知見
を基本とするものである。

【００１０】より詳細には、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝
集させてＨＤＬ−コレステロールを測定する反応系、具
体的には、ＨＤＬ以外のリポ蛋白であるＬＤＬ、ＶＬＤ
Ｌおよびカイロミクロンを凝集させる凝集試薬、すなわ
ちポリアニオンと２価の金属塩からなる凝集試薬、具体
的には、少なくとも、デキストラン硫酸またはその塩、
ポリエチレングリコール、へパリンまたはその塩、リン
タングステン酸またはその塩もしくはこれらの組み合わ
せ及び２価の金属塩からなる凝集試薬、コレステロール
エステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼまたはコ
レステロールデヒドロゲナーゼからなる試薬を用いてＨ
ＤＬ−コレステロールを測定する系において、リパーゼ
を用いて高トリグリセリドを主体とする試料中のカイロ
ミクロン性の濁りを消去することができる。

【００１１】本発明において使用されるリパーゼとして
は、リポプロテインリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ
等を用いることができ、リパーゼの由来は特に限定され
ず、例えば、膵リパーゼ、肝リパーゼ、ヒト由来あるい
はクロモバクテリウム由来、シュードモナス属由来のリ
ポプロテインリパーゼを使用することができる。クロモ
バクテリウム由来のリパーゼは、リパーゼ活性のみなら
ず、コレステロールエステラーゼ活性も有しているもの
の、ＨＤＬ−コレステロール測定系に適用できる。

【００１２】上記酵素の添加量は、特に限定されない
が、例えば、最終濃度が１ｕ／ｍｌ〜１０００ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは１０ｕ／ｍｌ〜１００ｕ／ｍｌとなるよ
うに、試薬中に適宜含ませれば良い。

【００１３】その他の組成物は、コレステロールエステ
ラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼを作用させてＨＤＬ−コレステロ
ールを測定する試薬を適用することが可能である。具体
的には、例えばＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤ
Ｌ−コレステロールを測定する試薬においては、ＨＤＬ
以外のリポ蛋白を凝集させる凝集試薬、すなわちポリア
ニオンと２価の金属塩からなる凝集試薬、具体的には、
デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコー
ル、へパリンまたはその塩、リンタングステン酸または
その塩もしくはこれらの組み合わせ及び２価の金属塩か
らなる凝集試薬、更に非イオン性界面活性剤、コレステ
ロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまた
はコレステロールデヒドロゲナーゼ、酵素反応によって
消費される物質（例えば、補酵素）又は生成される物質
（例えば、過酸化水素）を検出するための組成物であ
る。

【００１４】ポリアニオンとしては、デキストラン硫酸
またはその塩、ポリエチレングリコール、へパリンまた
はその塩、リンタングステン酸またはその塩が用いら
れ、その最終濃度が１μＭ〜５ｍＭ、好ましくは５．０
μＭ〜１ｍＭとなるように試薬中に含有させる。２価の
金属塩としてはマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガ
ン塩であり、塩としては、水溶性無機塩、例えば、ハロ
ゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、又はヨウ化物）又
は硫酸化物、あるいは、水溶性有機塩、例えば、酢酸塩
又はクエン酸塩として用いることができる。その最終濃
度が１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの量とな
るように試薬中に含有させる。

【００１５】必要に応じて、非イオン性界面活性剤を添
加しても良く、ポリオキシエチレン誘導体、高級アルコ
ール類等公知の非イオン性界面活性剤全般を使用するこ
とができる。また、ｎ−オクチル−β−グルコシド、ｎ
−オクチル−β−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β−
チオグルコシド等の糖を骨格とする界面活性剤も使用で
きる。その最終濃度が０．０１〜１０．０％、好ましく
は０．１〜５．０％となるように試薬中に含ませる。あ
るいは、これらを前記濃度範囲内で混合して使用しても
良い。

【００１６】また、コール酸、デオキシコール酸、タウ
ロコール酸等の胆汁酸またはそれらの塩を添加しても良
い。更に、本測定系にアルブミンを添加し、コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたは
コレステロールデヒドロゲナーゼとＨＤＬ−コレステロ
ール以外のリポ蛋白との反応を効果的に阻害することも
できる。

【００１７】コレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼ等の酵素としては、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、
又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることがで
きる。酵素の由来も限定されず、コレステロールエステ
ラーゼとしては、例えば、シュードモナス属の微生物
や、牛又は豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼ
を用いることができる。また、コレステロールオキシダ
ーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカ
ルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼ
を用いることができる。コレステロールデヒドロゲナー
ゼについても同様であり、例えば、微生物由来のものを
使用することができる。それらの酵素の添加量も特に限
定されないが、例えば、０．１ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍｌ〜１０ｕ／ｍｌであ
る。

【００１８】コレステロールエステラーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナー
ゼを作用させ、ＨＤＬ−コレステロールのみと前記各酵
素との酵素反応により消費される物質（例えば、補酵
素）又は生成される物質（例えば、過酸化水素）を検出
するには、公知の組成物を用いれば良い。例えば、過酸
化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペ
ルオキシダーゼの存在下に生成する過酸化水素を発色さ
せて、分光学的に比色測定ができ、例えば、適当な被酸
化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発
色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−
ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックア
シド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリ
ン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは
０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは
０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させること
ができる。

【００１９】本発明のＨＤＬ−コレステロール測定用試
薬は、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２
試薬系にすることができる。この場合、第一試薬にリパ
ーゼ、ポリアニオン、２価金属塩、非イオン性界面活性
剤を含有させ、第二試薬にコレステロールエステラーゼ
及びコレステロールオキシダーゼまたはコレステロール
デヒドロゲナーゼを含有させる。第一試薬及び第二試薬
の緩衝剤としては、リン酸緩衝液、ＢＥＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、トリス緩衝液、イ
ミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩衝液の
濃度としては、１０〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜
５００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、
５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲
内で適宜選択することができる。

【００２０】

【作用】以下の説明に限定されるものではないが、リピ
ドフラクション中に含有されるコレステロールの測定に
おいて、ある条件では、リパーゼの共存下でもＨＤＬ−
コレステロールには影響無く、乳びの原因となるリポ蛋
白質のカイロミクロンやＶＬＤＬ中に含有されるトリグ
リセリドがリパーゼにより選択的に引き抜かれ分解され
るものと考えられる。これにより、カイロミクロンやＶ
ＬＤＬの粒子径が小さくなり、親水性が高くなること
で、効果的に濁りを消去することができるものと思われ
る。

【００２１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。 実施例１：乳び検体中のＨＤＬ−コレステロールの測定 ＨＤＬ−コレステロール量既知の乳び検体３ｕｌに５０
ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中に２０
ｕ／ｍｌのシュードモナス属由来リポプロテインリパー
ゼ、０．５ｍＭのデキストラン硫酸、２０ｍＭの塩化マ
グネシウム、０．２％のｎ−オクチルグルコシド、１％
の牛血清アルブミン、１．０ｍＭのＥＳＰＴ、１０ＫＵ
／ｍｌのペルオキシダーゼを含む第一試薬２４０μｌを
攪拌混合し、３７℃で５分間加温し、５０ｍＭのＢｉｓ
−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中に１０Ｕ／ｍｌのシ
ュードモナス属由来コレステロールエステラーゼ、５Ｕ
／ｍｌのノカルディヤ属由来のコレステロールオキシダ
ーゼ、０．２ｍＭの４−アミノアンチピリンを含有する
第二試薬６０ｕｌを攪拌混合し、３７℃で５分間加温し
た後の波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。ＨＤ
Ｌ−コレステロール量は乳びのないＨＤＬ−コレステロ
ール量既知の管理血清を標準液として算出し、リポプロ
テインリパーゼを添加していないものを対照試薬として
用いた。結果を表１に示す。

【００２２】

【表１】 HDL-コレステロール 含量（mg／dl） 本 法（mg／dl） 対照法（mg／dl） Ａ ２４ ２１ １１ Ｂ ３８ ４５ ５ Ｃ ５１ ５５ ２４ Ｄ ８９ ８８ ６７ Ｅ １２５ １２２ ９２

【００２３】実施例１：乳び検体中のコレステロールの
測定 コレステロール量既知の乳び検体３ｕｌに５０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に２０ｕ／ｍｌのシュ
ードモナス属由来リポプロテインリパーゼ、０．１％ポ
リオキシエチレン高級アルコールエーテル［商品名：エ
マルゲン７０９、花王（株）］、１．０ｍＭのＥＳＰ
Ｔ、１０ＫＵ／ｍｌのペルオキシダーゼを含む第一試薬
２４０μｌを攪拌混合し、３７℃で５分間加温し、５０
ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に１０Ｕ／ｍ
ｌのシュードモナス属由来コレステロールエステラー
ゼ、５Ｕ／ｍｌのノカルディヤ属由来のコレステロール
オキシダーゼ、０．２ｍＭの４−アミノアンチピリンを
含有する第二試薬６０ｕｌを攪拌混合し、３７℃で５分
間加温した後の波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定し
た。コレステロール量は乳びのないコレステロール量既
知の管理血清を標準液として算出し、リポプロテインリ
パーゼを添加していないものを対照試薬として用いた。
結果を表２に示す。

【００２４】

【表２】コレステロール含量（mg／dl） 本 法（mg／dl） 対照法（mg／dl） Ａ １４６ １５２ ７４ Ｂ ２２２ ２１９ １４３ Ｃ ２９７ ２８７ １１６ Ｄ １８４ １７８ １０４ Ｅ ３２５ ３１８ １２３

【００２５】表１、２のように、本発明によれば、試料
の濁りの影響を受けずに、正確に、ＨＤＬ−コレステロ
ール等を測定することができる。

【００２６】

【発明の効果】リピドフラクション中に含有されるコレ
ステロールを測定するに際し、酵素活性への影響が多い
界面活性剤を用いることなく、リパーゼ等の脂質分解酵
素によって乳びの原因となる物質を効果的に消去でき、
且つ、目的とするリピドフラクション中に含有されるコ
レステロールを正確に測定できる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血清あるいは血漿中のリピドフラクショ
   ン中に含有されるコレステロールを測定する試薬におい
   て、生体試料の濁りを除去するためにリパーゼを含有さ
   せることを特徴とする各リピドフラクション中に含有さ
   れるコレステロール測定用試薬。
2. 【請求項２】 リピドフラクションが高密度リポプロテ
   インである請求項１に記載の測定用試薬。
3. 【請求項３】 ポリアニオン、２価の金属塩、非イオン
   性界面活性剤、コレステロールエステラーゼ、コレステ
   ロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナ
   ーゼ、消費される物質又は生成する物質を検出するため
   の組成物からなる試薬において、更にリパーゼを含有さ
   せた請求項１、２に記載の測定用試薬。