KR101586505B1 - 소입자 고비중 ｌｄｌ 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트 - Google Patents

소입자 고비중 ｌｄｌ 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 검체의 전처리 조작을 하지 않고, 신속하면서 간편한 특이성이 우수한 분석을 가능하게 하는, 자동 분석 장치 대응의 소입자 고비중 LDL의 분별 측정 방법 및 측정용 시약을 제공한다. 본 발명은 (1) 포스포리파아제의 존재하에서 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과, (2) 상기 공정 (1)에서 잔존하는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 피검체 시료 중의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법에 관한 것이다.

Description

소입자 고비중 ＬＤＬ 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR QUANTIFICATION OF small, dense LDL CHOLESTEROL}
본 발명은 동맥 경화의 진단에 중요한 소입자 고비중 LDL(small, dense LDL) 중의 콜레스테롤 측정 방법 및 시약에 관한 것이다.
콜레스테롤은 세포의 주요한 구성 성분의 하나이지만, 과잉의 콜레스테롤은 혈관의 내피 세포하에서 매크로파지에 저장됨으로써 포말 세포가 형성되고, 동맥 경화의 초기 병변을 나타내는 점에서 임상적으로 중요한 성분이다. 저비중 리포 단백(LDL)은 혈액 중에서의 콜레스테롤 운반의 주역이고, 동맥 경화성 질환의 위험 인자인데, LDL 중에서도 특히 입자 크기가 작아 평균적인 LDL보다 고비중인, 소입자 고비중 LDL은 동맥 경화 야기성이 통상의 LDL보다 수배 높은 것으로 알려져 있다. 소입자 고비중 LDL의 증가는 동맥 경화성 질환의 주요한 위험 인자의 하나이고, 분별 측정하는 것은 임상상 매우 중요하다.
종래의 소입자 고비중 LDL 측정법은, 초원심법, 전기 영동법, 고속 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법 등이 있는데, 이 방법은 고가의 설비를 필요료 하고, 측정에 많은 시간이 소요되기 때문에 간편하지 않다.
자동 분석 장치를 이용하여 소입자 고비중 LDL을 측정하는 방법으로서는, 이온 강도의 차에 따라 소입자 LDL을 혼탁 또는 용해시켜 흡광도의 차에 의해 소입자 LDL을 측정하는 방법(특허 문헌 1을 참조)이 있다. 그러나, 이 방법에서는 탁함에 의한 흡광도 차를 측정하기 때문에, 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 측정할 수 없고, 또한 특이성이나 정밀도가 불충분하였다.
또한, 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤이나 중성 지방을, 폴리음이온과 이가 양이온으로 이루어지는 분리제와 자동 분석 장치 대응의 시약을 조합하여 측정하는 방법(특허 문헌 2를 참조)이 알려져 있다. 이 방법에서는 초원심법이나 전기 영동법에 비하여 간편하게 소입자 고비중 LDL 중의 지질 성분을 측정할 수 있어 특이성이나 정밀도가 우수하지만, 검체를 전처리하여 LDL을 소입자 고비중 LDL과 그 이외의 LDL로 분리하는 조작이 필요하였다.
특허 문헌 1:일본특허공개 제2003-28882호 공보 특허 문헌 2:국제공개 WO2004/053500호 공보
본 발명의 목적은 검체의 전처리 조작을 하지 않고, 신속하면서 간편한 특이성이 우수한 분석을 가능하게 하는, 자동 분석 장치 대응의 소입자 고비중 LDL의 분별 측정 방법 및 측정용 시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 예의 연구의 결과, 신규한 소입자 고비중 LDL의 측정법을 완성하였다. 즉, 여러 리포 단백을 함유하는 피검체 시료 중의 콜레스테롤을 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제 혹은 콜레스테롤디히드로게나아제로 측정할 때, 특정의 기질에 특이적으로 반응하는 포스포리파아제를 이용함으로써, 소입자 고비중 LDL에 대한 효소의 반응 속도에 대하여 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL에 대한 효소의 반응 속도가 증가하고, 카탈라아제나 4 아미노안티피린에 의해 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도할 수 있었다. 이후에 콜레스테롤 측정용 효소를 이용한 효소 반응을 행함으로써, LDL 중에서도 소입자 고비중 LDL의 콜레스테롤을 측정할 수 있었다. 또한 HDL이나 VLDL 등의 LDL 이외의 리포 단백에 반응하는 특정의 계면활성제를 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL을 반응계 외로 유도하는 반응의 전 또는 후에 첨가하면, 상기 특정 계면활성제와 LDL 이외의 HDL이나 VLDL 등의 리포 단백이 반응하고, 카탈라아제나 4 아미노안티피린에 의해 HDL이나 VLDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도할 수 있었다. 이 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL을 소거하는 반응과, HDL이나 VLDL 등의 리포 단백을 특정의 계면활성제와 반응시켜 HDL이나 VLDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 반응을 함께 행함으로써, 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백을 소거하여 반응계 외로 유도할 수 있었다. 그리고 남은 소입자 고비중 LDL을 콜레스테롤 측정용 효소와 반응시킴으로써 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤만을 분별 측정하는 데 성공하였다. 또한, 추가로 계면활성제의 종류나 효소 농도를 특정함으로써, 상기 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백을 소거하여 반응계 외로 유도하는 반응과 HDL이나 VLDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 반응을 동일 용매 중에서 동시에 행하는 데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] (1) 포스포리파아제의 존재하에서 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과, (2) 이어서, 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 피검체 시료 중의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[2] 공정 (1)에서 이용하는 포스포리파아제가 리포 단백 중에 존재하는 인지질 중 적어도 스핑고미엘린 및/또는 포스파티딜이노시톨에 대한 반응성이 높은 것을 특징으로 하는 [1]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[3] 공정 (1)에서 이용하는 포스포리파아제의 농도가 0.1∼100U/mL인 것을 특징으로 하는 [1] 또는 [2]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[4] 공정 (2)에서, 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는 계면활성제의 존재하에 콜레스테롤 측정용 효소가 첨가되는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[5] 공정 (2)에서 이용되는 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는 계면활성제가 모든 리포 단백에 작용하는 계면활성제인 것을 특징으로 하는 [4]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[6] 공정 (2)에서 이용되는 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는 계면활성제가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 혹은 그의 유도체, 또는 HLB가 11 이상 14 미만인 폴리옥시에틸렌 유도체인 것을 특징으로 하는 [4] 또는 [5]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[7] 공정 (2)의 전으로서, 공정 (1)과 동시에 또는 공정 (1)의 전 혹은 후에, (a) 콜레스테롤에스테라아제의 존재하에서 피검체 시료 중의 LDL 이외의 리포 단백 중 콜레스테롤을 소거하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[8] 공정 (a)에서 이용하는 콜레스테롤에스테라아제의 농도가 0.01∼10U/mL인 것을 특징으로 하는 [7]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[9] 공정 (a)에서, LDL 이외의 리포 단백에 작용하는 계면활성제를 더 첨가하는 [7] 또는 [8]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[10] 공정 (a)에서 이용하는 계면활성제의 농도가 0.05∼1.0%인 것을 특징으로 하는 [9]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[11] 공정 (a)에서, 콜레스테롤옥시다아제 및 카탈라아제를 더 첨가하는 [7] 내지 [10] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[12] 공정 (a)에서, 4 아미노안티피린을 더 첨가하는 [7] 내지 [10] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[13] 공정 (a) 및 공정 (1)의 반응이 동일한 용액 중에서 동시에 행해지는 것을 특징으로 하는 [7] 내지 [12] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[14] 공정 (a)에서 이용하는 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 [7] 내지 [13] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
[15] 적어도 이하의 2종류의 시약 조성물을 포함하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트:
(ⅰ) 적어도 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL에 반응하는 포스포리파아제가 포함되고, 피검체 중의 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하기 위한 시약 조성물;
(ⅱ) 소입자 고비중 LDL을 측정하기 위한 소입자 고비중 LDL에만 반응하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 혹은 그의 유도체인 계면활성제, 또는 HLB가 11 이상 14 미만인 폴리옥시에틸렌 유도체인 계면활성제, 4 아미노안티피린 및 퍼옥시다아제를 포함하는 시약 조성물.
[16] (ⅲ) 적어도 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제가 포함되고, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하기 위한 시약 조성물을 더 포함하여, 적어도 3개의 시약 조성물을 포함하는 [15]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트.
[17] (ⅰ)의 시약 조성물에 적어도 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제가 더 포함되고, (ⅰ)의 시약 조성물에 의해 피검체 중의 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤이 소거되는 [15]의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트.
[18] 포스포리파아제가 리포 단백 중에 존재하는 인지질 중의 적어도 스핑고미엘린 및/또는 포스파티딜이노시톨에 대한 반응성이 높은 포스포리파아제인 [15] 내지 [17] 중 어느 하나의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트.
본 발명의 특정 계면활성제, 포스포리파아제를 포함하는 시약을 리포 단백질을 포함하는 피검체 시료에 첨가함으로써, 리포 단백 중의 소입자 고비중 LDL을 필터나 원심 분리를 이용한 분리 조작을 하지 않고, 직접, 선택적으로 측정할 수 있다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본특허출원 제2007-264908호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
도 1은 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 포스포리파아제 A2를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 2는 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 포스포리파아제 C를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 3은 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 포스포리파아제 D를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 4는 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 리조포스포리파아제를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 5는 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 글리세로포스포리피드에 특이적인 포스포리파아제를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 6은 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 7은 LDL 중 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정이 최초의 공정인 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 8은 2개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하고, 계면활성제로서 에마르겐 B-66 및 에마르겐 A-90을 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 9는 3개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하고, 계면활성제로서 에마르겐 B-66을 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 10은 2개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하고, 계면활성제로서 에마르겐 A-90을 이용하는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
도 11은 2개의 공정을 포함하고, 포스포리파아제로서 스핑고미엘리나아제를 이용하고, 계면활성제를 이용하지 않는 본 발명의 방법과 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법의 상관을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
리포 단백은 크게 VLDL, LDL 및 HDL의 분획으로 나누어지고, LDL은 소입자 고비중 LDL(small, dense LDL)과 그 이외의 아분획으로 더 나누어진다. 소입자 고비중 LDL을 소입자 LDL, SLDL(small LDL), dense LDL, sd LDL이라고 부르는 경우도 있고, 또한 그 이외의 LDL을 L LDL(large LDL), Light LDL이라고 부르는 경우도 있다. 이들 분획 및 아분획은 입자 크기 또는 비중에 따라 구별할 수 있다. 그 입자 크기의 직경은 보고자에 따라 다르지만 VLDL이 30㎚∼80㎚(30㎚∼75㎚)이고, LDL이 22㎚∼28㎚(19㎚∼30㎚), HDL이 직경 7∼10㎚이다. 비중은 VLDL이 1.006 이하, LDL이 1.019∼1.063, HDL이 1.063∼1.21이다. LDL 입자 직경은 그라디언트 겔 전기 영동(GGE)(JAMA, 260, p.1917-21, 1988), NMR(HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition, Nader Rifai 외 편, p.609-623, AACC PRESS:The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No.3, p.15-16)에 의해 측정할 수 있고, 비중은 초원심 분리에 의한 분석(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994:Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)에 기초하여 결정할 수 있다.
본 발명의 방법으로 측정하고자 하는 소입자 고비중 LDL은 일반적으로는 LDL 분획 중 직경 약 22.0∼약 25.5㎚인 아분획, 비중 1.040∼1.063인 아분획을 가르킨다. LDL을 크기에 따라 아분획으로 나누고 있는 것은, LDL 중 입자경이 작은 것이 동맥 경화 야기성이 높고, LDL 중에서도 악성도가 높기 때문에, LDL 중에서도 작은 것을 분별 측정할 필요가 있었기 때문이다. LDL 내에서 직경 분포나 비중 분포는 연속적이어서 비중이 어느 정도 이상인 것이 특히 악성도가 높다라고 명확하게 구별할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 상기의 비중 1.040∼1.063이라는 값도 소입자 고비중 LDL의 특성으로서 확립된 것은 아니고, 널리 이용되고 있어 확립된 값이라고 할 수 있는 LDL의 비중 범위 1.019∼1.063을 중앙점으로 나눈 것이다. 예를 들면, 별도의 보고에서는 1.044∼1.060으로 분획된다(Atherosclerosis:106 241-253 1994). 소입자 고비중 LDL의 비중을 어느 범위로 할지는 보고자에 따라 약간의 차이가 있지만, 모두 그 범위에서 분별한 경우의 소입자 고비중 LDL의 존재가 임상적인 악성도와 관련되어 있다.
본 발명에 있어서 소입자 고비중 LDL이라고 하는 경우, LDL 중 비중이 큰 것으로서, 임상적으로 동맥 경화 야기성이 그 이외의 LDL보다 큰 것, 바람직하게는 LDL의 비중 범위 중 중앙점보다 위의 비중 범위에 속하는 것, 더 바람직하게는 비중 1.044∼1.063의 범위에 속하는 LDL을 말한다. 또한, LDL 이외의 리포 단백이라고 하는 경우, VLDL, HDL을 가르키고, 추가로 카이로미크론, IDL(intermediate density lipoprotein), VHDL(very high density lipoprotein)을 포함시키는 경우도 있다.
본 발명의 방법은 LDL 중 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정을 포함한다.
상기 LDL 중 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정에서는, 각각 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤이나 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 대신에, 그들을 반응계 외로 유도하기 위한 바람직한 기술을 이용할 수도 있다. 구체적으로는 HDL이나 VLDL, L LDL 등에 포함되는 콜레스테롤이 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤의 정량에 영향을 미치지 않도록 HDL, VLDL, L LDL 등에 포함되는 콜레스테롤을 응집시키거나, 후의 공정에서 반응하지 않도록 저해하거나 하는 등의 공지의 기술을 이용하여 반응계 외로 유도하는 것이 가능하다.
LDL 중 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤을 반응계 외로 유도하는 공정에서는, 동 공정의 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(L LDL) 중의 콜레스테롤이 반응계 외로 유도되는 반응과는 별도의 반응이 일어나는 경우가 고려된다. 상기 별도의 반응이 본 발명의 목적인 소입자 고비중 LDL의 분별 측정에 영향을 미치지 않는 것이라면, 본 발명의 방법에서 그 별도의 반응은 허용할 수 있다. 별도의 반응으로서는, 예를 들면 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤이 반응계 외로 유도되는 반응이 있는데, 이는 통상 소입자 고비중 LDL의 분별 측정에 영향을 미치지 않기 때문에 허용될 수 있다.
본 발명의 방법은 통상 자동 분석 장치 내에서 행해진다.
본 발명의 방법의 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL(Large LDL;L LDL) 중의 콜레스테롤을 소거하고, 반응계 외로 유도하기 위한 공정에서는 포스포리파아제를 이용한다. 포스포리파아제와 L LDL의 반응 속도는 소입자 고비중 LDL과의 반응 속도보다 크기 때문에, 포스포리파아제는 LDL 중 L LDL을 기질로 한 경우의 효소 반응 속도를 선택적으로 상승시킨다. 포스포리파아제란 인지질에 반응하는 효소의 총칭으로, 포스포리파아제 A2, 포스포리파아제 C, 포스포리파아제 D 등이 존재하는데, 본 발명에서는 어느 포스포리파아제나 이용할 수 있다. 또한 본 발명에서는 인지질 중에서도 스핑고미엘린에 대한 반응성(스핑고미엘리나아제 활성)이 높은 포스포리파아제(스핑고미엘리나아제), 포스파티딜이노시톨에 대한 반응성이 높은 포스포리파아제 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 상기 스핑고미엘린에 대한 반응성(스핑고미엘리나아제 활성)이 높은 포스포리파아제, 포스파티딜이노시톨에 대한 반응성이 높은 포스포리파아제 등은, 그 외의 인지질인 포스파티딜콜린 등에 대한 활성을 가지고 있을 수 있다. 상기 포스포리파아제의 시약 중 농도는 0.1∼100U/mL가 바람직하고, 0.2∼20U/mL가 더 바람직하다. 반응시의 반응액 중의 농도는 0.05∼100U/mL가 바람직하고, 0.1∼20U/mL가 더 바람직하다. 또한, 스핑고미엘리나아제 활성이 높은 포스포리파아제 및/또는 포스파티딜이노시톨에 대한 반응성이 높은 포스포리파아제에 더하여, 포스포리파아제 A2, 포스포리파아제 D, 리조포스포리파아제 등의 다른 포스포리파아제를 함께 이용할 수 있다. 상기 포스포리파아제로서는 스핑고미엘린에 대한 특이성이 높은 포스포리파아제, 포스파티딜이노시톨에 대한 특이성이 높은 포스포리파아제를 바람직하게 이용할 수 있다. 포스포리파아제는 세균이나 효모, 또는 인간 태반 유래의 것을 이용하는 것이 바람직하다. 포스포리파아제의 바람직한 구체예로서는 PLA2, PLC, PLD, LYPL, PLDP, SPC, PI-PLC(아사히카세이사 제조), 바실루스 세레우스 유래 스핑고미엘리나아제(Sphingomyelinase from bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스 유래 스핑고미엘리나아제(Sphingomyelinase from staphylococcus aureus), 포스포리파아제 C, 바실루스 세레우스 유래 포스파티딜이노시톨 특이(Phosphatidylinositol-specific from bacillus cereus)(SIGMA사 제조) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에는 계면활성제를 이용할 수도 이용하지 않을 수도 있다. 바람직한 계면활성제를 이용하면 L LDL 중의 콜레스테롤의 소거를 촉진할 수 있다. 계면활성제를 이용하는 경우에는, 하기의 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서 이용하는 계면활성제와 동일한 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 그와는 상이한 바람직한 계면활성제를 첨가할 수도 있다.
LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정이 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 앞서 실시되는 경우에는, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서의 각 성분이 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 그대로 넘어오기 때문에, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하기 위해서 이용한 계면활성제를 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서도 사용할 수 있다.
상기 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서는, 포스포리파아제의 존재하에서 콜레스테롤에스테라아제가 L LDL에 작용하고, 발생한 콜레스테롤을 콜레스테롤옥시다아제, 콜레스테롤디히드로게나아제 등의 콜레스테롤과 반응하는 효소의 존재하에서 반응시켜 소거함으로써, L LDL 중 콜레스테롤을 반응계 외로 유도한다. L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 계면활성제를 이용하는 경우에는, 포스포리파아제의 존재하에서 콜레스테롤에스테라아제 및 계면활성제가 L LDL에 작용하고, 발생한 콜레스테롤을 콜레스테롤옥시다아제, 콜레스테롤디히드로게나아제 등의 콜레스테롤과 반응하는 효소의 존재하에서 반응시켜 소거함으로써, L LDL 중 콜레스테롤을 반응계 외로 유도한다. 여기서, 「계면활성제가 작용(반응)한다」란, 계면활성제가 리포 단백에 결합하여 변성, 분해 등을 일으켜, 리포 단백 중의 콜레스테롤이 유리되는 것을 말한다. 예를 들면 「LDL 이외의 리포 단백에 작용(반응)하는 계면활성제」라고 하는 경우, 계면활성제가 LDL에 전혀 작용하지 않는 것은 요구되지 않고, 주로 LDL 이외의 리포 단백에 작용하면 된다. 예를 들면, 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백에 작용하는 계면활성제는 소입자 고비중 LDL에의 작용이 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백보다 작다. 「소거」란, 피검체 시료 중의 물질을 분해하고, 그 분해물이 다음 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. 즉, 「L LDL의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거한다」란, 피검체 시료 중의 L LDL을 분해하고, 그 분해 산물인 L LDL 중의 콜레스테롤이 그 후의 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 말한다. 소거하기 위한 방법으로서는 콜레스테롤에스테라아제, 콜레스테롤옥시다아제를 작용시켜 발생하는 과산화수소를 카탈라아제를 이용하여 물과 산소로 분해하는 방법, 및 퍼옥시다아제를 이용하여 수소 공여체와 과산화수소를 반응시켜 무색 퀴논으로 전환시키는 방법을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 「반응계 외로 유도한다」란, HDL 이나 VLDL, L LDL 등에 포함되는 콜레스테롤이 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤의 정량에 영향을 미치지 않도록 HDL, VLDL, L LDL 등에 포함되는 콜레스테롤을 소거, 응집시키거나, 후의 공정에서 반응하지 않도록 저해하거나 하는 등의 것을 말한다.
본 발명에서는 상기 포스포리파아제의 존재하에서 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 추가하여, LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정을 함께 행할 수 있다. LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정은 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 전일 수도 있고, 후일 수도 있으며, 또는 동시일 수도 있다.
LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서는 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백에 작용하지만 LDL과는 반응하지 않는 계면활성제의 존재하에서 VLDL, HDL 중 콜레스테롤을 소거한다. LDL 이외의 VLDL, HDL 등에 작용 반응하는 계면활성제로서, HLB 값이 13 이상 15 이하인 폴리옥시에틸렌 유도체를 들 수 있다. 계면활성제의 시약 중 농도는 0.3∼5%(w/v)가 바람직하고, 0.5∼3%(w/v)가 더 바람직하다. 반응시의 반응액 중의 농도는 0.15∼5%(w/v)가 바람직하고, 0.25∼3%(w/v)가 더 바람직하다. 유도체의 예로서는 고급 알코올 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다. HLB 13 이상 15 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체의 바람직한 구체예로서는, 폴리옥시에틸렌라우일에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등으로 HLB 값이 13 이상 15 이하인 화합물을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 계면활성제의 구체예로서 에마르겐 B-66(폴리옥시에틸렌 유도체), 에마르겐 A-90(폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르) 등을 들 수 있다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 있어서, 소입자 고비중 LDL에는 반응하지 않고, L LDL에만 반응하는 계면활성제를 사용하는 경우에는, 계면활성제로서 HLB 값이 13 이상 15 이하인 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제를 첨가할 수도 있다. 구체예로서, 비이온 계면활성제로서는 에마르겐 B-66, 에마르겐 A-90, 에마르겐 120, 에마르겐 920(이상 카오사 제조), 노니온 HS-220, 노니온 HS-215, 노니온 K-230, 노니온 NS-220, 노니온 NS-230, 나이민 F-215, 나이민 L-207, 아데카톨 LB-1520(이상 아사히덴카사 제조), 음이온 계면활성제로서 에멀 20CM, 에멀 20T, 에멀 E27C, 레베놀 WX(이상 카오사 제조), 선아미드 CF-3, 선아미드 CF-10, 다이아폰 K, 다이아폰 F, 다이아폰 K-SF, 퍼소프트 EF, 퍼소프트 EFT, 퍼소프트 EL, 퍼소프트 EP, 퍼소프트 EK, 퍼소프트 SL, 폴리스타 OMP(NOF사 제조), 아데카콜 PS-440E, 트랙스 K-40(이상 아데카사 제조), 양이온 계면활성제로서 콜타민 24P(카오사 제조), 아데카민4 MAC-30(아데카사 제조), 양쪽성 계면활성제로서 안히톨 24B(카오사 제조), 닛산아논 LG, 닛산아논 BDF-R, 닛산아논 BF, 닛산아논 BL, 닛산아논 BL-SF, 닛산아논 GLM-R-LV 등을 들 수 있다. 상기 계면활성제의 시약 중 농도는 0.01∼1.0%(w/v) 정도가 바람직하고, 더 바람직하게는 0.10∼0.50%(w/v) 정도이다. 반응시의 반응액 중의 농도는 0.005∼1.0%(w/v) 정도가 바람직하고, 0.05∼0.50%(w/v) 정도가 더 바람직하다.
상기 계면활성제의 존재하에서 콜레스테롤에스테라아제, 콜레스테롤옥시다아제를 작용시켜 콜레스테롤로부터 과산화수소를 발생시키고, 발생한 과산화수소를 소거한다. 과산화수소를 소거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜 물과 산소로 분해하는 방법, 및 퍼옥시다아제를 이용하여 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과 과산화수소를 반응시켜 무색 퀴논으로 전환시키는 방법을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 반응액 중의 콜레스테롤에스테라아제 농도는 0.010∼10U/mL 정도가 바람직하다. 또한, 콜레스테롤옥시다아제는 세균이나 효모 유래의 것을 이용할 수 있고, 반응액 중의 콜레스테롤옥시다아제의 농도는 0.1∼0.7U/mL 정도가 바람직하다. 또한, 카탈라아제의 반응액 중의 농도는 40∼500U/mL 정도가 바람직하다. 또한, 과산화수소를 무색 퀴논으로 전환시키는 경우의 반응액 중의 퍼옥시다아제의 농도는 0.4∼1.0U/mL가 바람직하고, 반응액 중의 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 농도로서는 0.4∼0.8mmol/L가 바람직하다.
상기의 콜레스테롤옥시다아제, 카탈라아제, 퍼옥시다아제, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 등의 소거에 관한 성분은, L LDL을 소거하는 공정, LDL 이외의 HDL, VLDL 등을 소거하는 공정 중의 어느 하나의 공정에 들어 있으면 되고, 양쪽 모두의 공정에 들어 있어도 된다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 시약량과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 시약량은 각 성분의 농도 범위를 고려하여 결정하면 된다. 예를 들면, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약 중의 계면활성제 농도를 3g/L로 한다. 또한, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 계면활성제를 미첨가로 한다. 이 경우, 시약비를 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약:L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약을 1:1의 액량비로 하면, 피검체의 양이 적은 경우, 상기 공정 중의 계면활성제 농도는 약 1.5g/L로 된다. 이와 같이 반응시에 필요한 시약 농도를 고려하여 시약의 조성이나 첨가 시약량을 결정할 수 있다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 있어서, 상기 계면활성제 및 콜레스테롤에스테라아제와 작용·반응하는 리포 단백 중의 콜레스테롤은 콜레스테롤옥시다아제 또는 콜레스테롤디히드로게나아제 등의 콜레스테롤 반응 효소와 반응시켜 소거하고, 반응계 외로 유도할 수 있다. 이와 같은 반응에 의해, L LDL이나 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 반응계 외로 유도함으로써, 그 후의 공정에서는 반응액 중에 리포 단백으로서는 소입자 고비중 LDL만이 잔존하게 된다. 본 발명에서는 이와 같이 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백을 소거하여, 반응계 외로 유도하고, 그 후의 공정에서 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백의 콜레스테롤을 검출할 수 없도록 하는 것을 「소입자 고비중 LDL과 그 이외의 리포 단백을 차별화한다」라고 하는 경우가 있다.
또한, 상기 계면활성제의 존재하에서의 콜레스테롤에스테라아제의 농도를 조정함으로써, 콜레스테롤에스테라아제와 반응하는 리포 단백의 종류를 변경할 수 있고, 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백의 선택적 소거가 가능해진다. 반응시의 콜레스테롤에스테라아제의 농도가 상승함에 따라 최초에 LDL 중에서도 L LDL의 효소와의 반응성이 상승하여 반응계 외로 유도된다. 그러나, 농도가 그다지 높지 않은 범위에서는 소입자 고비중 LDL의 효소와의 반응성은 상승하지 않는다. 또한 콜레스테롤에스테라아제의 농도가 상승하면 소입자 고비중 LDL의 효소와의 반응성이 상승한다. 이와 같이 L LDL과 효소의 반응성이 높고, 소입자 고비중 LDL의 효소와의 반응성이 낮은 농도 범위로 콜레스테롤에스테라아제를 첨가하면 선택적으로 소입자 고비중 LDL을 측정할 수 있다. 따라서, 콜레스테롤에스테라아제의 농도를 특정 범위 내로 조정함으로써, 보다 선택적으로 소입자 고비중 LDL을 측정할 수 있다. 콜레스테롤에스테라아제의 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정의 반응액 중의 농도로서는 0.1U/mL∼3.0U/mL가 바람직하고, 0.3U/mL∼2.5U/mL가 더 바람직하고, 0.6U/mL∼2.0U/mL가 특히 바람직하다. 본 발명에 있어서의 콜레스테롤에스테라아제로서는 콜레스테롤에스테르를 가수분해하는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤에스테라아제를 이용할 수 있다.
콜레스테롤디히드로게나아제로서는 콜레스테롤을 산화하여 산화형 보효소를 환원하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤디히드로게나아제를 이용할 수 있다. 콜레스테롤디히드로게나아제의 반응액 중의 농도는 0.01∼200U/mL가 바람직하고, 0.1∼100U/mL가 특히 바람직하다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및/또는 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 반응액 중에는, 각종 리포 단백에 대한 작용을 조정하기 위해서 임의적으로 리포 단백 분해 효소를 첨가할 수도 있다. 리포 단백 분해 효소로서는 리포프로테인리파아제를 이용할 수 있다. 리포프로테인리파아제는 리포 단백질을 분해하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고 동물 또는 미생물 유래의 리포프로테인리파아제를 이용할 수 있다. 리포프로테인리파아제의 반응액 중의 농도는 0.01∼10U/mL가 바람직하고, 0.01∼5U/mL가 더 바람직하고, 0.01∼1U/mL가 특히 바람직하다.
본 발명의 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정은 동일한 시약 중에서 동시에 행할 수 있다. 이 경우, 반응액 중의 콜레스테롤에스테라아제의 농도는 0.5∼2.0U/mL가 바람직하다. 계면활성제는 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및/또는 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에서 이용되는 계면활성제를 그대로 사용할 수 있고, 반응액 중의 계면활성제 농도는 0.05∼0.3%(w/v)가 바람직하다. 또한, 반응액 중의 포스포리파아제의 농도는 0.1∼30U/mL가 바람직하다.
본 발명에서는 상기 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정의 어느 것에서도 반응하지 않고 잔존하는 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 그 후의 공정에서 정량한다. 그 정량 공정에서는 종래부터 이용되고 있는 LDL의 정량 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, LDL 응집제를 첨가하여 형성된 LDL 특이적 응집물의 함유량을 비탁 측정에 의해 정량하는 방법, LDL 특이적인 항체에 의한 항원 항체 반응을 이용하는 방법, 효소를 이용하여 분해 생성물을 정량하는 방법 등이 있다. 이들 중 효소를 이용하여 분해 생성물을 정량하는 방법이 바람직하다. 상기 방법에서는 콜레스테롤에스테라아제, 콜레스테롤옥시다아제 또는 콜레스테롤디히드로게나아제 등의 콜레스테롤 측정용 효소를 첨가하여 소입자 고비중 LDL의 콜레스테롤을 유리·분해하고, 이의 반응 생성물을 정량한다. 상기 정량 공정시에 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 정량하기 위해서 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는 계면활성제를 이용할 수 있다. 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는 계면활성제란 소입자 고비중 LDL에만 작용하는 계면활성제일 수도 있고, 소입자 고비중 LDL 이외에 다른 리포 단백에도 작용하는 계면활성제, 모든 리포 단백에 작용하는 계면활성제일 수도 있다.
소입자 고비중 LDL에만 작용하는 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 그의 유도체를 바람직하게 이용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 그의 유도체로서, 예를 들면 플루로닉 17R-4, 플루로닉 L-64, 플루로닉 PE3100, 플루로닉 P-85, 플루로닉 F-88, 플루로닉 P-103, 플루로닉 F-127 등의 플루로닉(등록 상표)계 계면활성제(바스프사, 아데카사) 등을 들 수 있다.
모든 리포 단백에 작용하는 계면활성제로서는, 시판되는 모든 콜레스테롤 측정용 시약 등에 이용되고 있는 계면활성제이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 바람직한 예로서 HLB가 11 이상 14 미만, 바람직하게는 12 이상 14 미만인 폴리옥시에틸렌 유도체를 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(에마르겐 909(카오사 제조)), 폴리옥시에틸렌알킬에테르(에마르겐 707(카오사 제조), 에마르겐 709(카오사 제조))를 들 수 있다.
소입자 고비중 LDL을 정량하는 공정에서 이용되는 계면활성제의 반응액 중의 농도는 바람직하게는 0.01∼10%(w/v) 정도이고, 더 바람직하게는 0.1∼5%(w/v) 정도이다.
소입자 고비중 LDL의 정량 공정에 있어서 콜레스테롤에 반응하는 콜레스테롤 측정용 효소로서 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 이용하는 경우, 효소 반응에 의해 과산화수소가 생성된다. 발생한 과산화수소로부터 퍼옥시다아제의 존재하에서 수소 공여체와 수소 수용체의 커플링 반응에 의해 색소(유색 퀴논)가 형성되고, 그 색소를 파장 400∼700㎚로 측정함으로써 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다.
정량 공정에서 이용하는 수소 공여체로서 아닐린 유도체가 바람직하고, 아닐린 유도체로서는 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-(3-술포프로필)아닐린(HALPS), N-(3-술포프로필)-3-메톡시-5-아닐린(HMMPS) 등을 들 수 있다. 수소 공여체의 사용 농도는 반응액 중의 최종 농도로 0.1∼1.5mmol/L가 바람직하다.
수소 수용체로서는 4-아미노안티피린이나 메틸벤조티아졸론히드라존 등을 이용할 수 있다.
콜레스테롤 측정용 효소로서 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤디히드로게나아제를 이용하는 경우, 효소 반응에 의해 NAD(P)로부터 NAD(P)H가 발생한다. 발생한 NAD(P)H는 330∼400㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다.
본 발명의 방법의 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정에 있어서, 이온 강도 조정제로서 1가의 양이온 및/또는 2가의 양이온 또는 그들의 염을 이용할 수 있다. 이온 강도 조정제를 첨가함으로써, 소입자 고비중 LDL과 L LDL을 차별화하기 쉬워진다. 구체적으로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화망간, 염화칼슘, 염화리튬, 염화암모늄, 황산마그네슘, 황산칼륨, 황산리튬, 황산암모늄, 아세트산마그네슘 등을 이용할 수 있다. 이온 강도 조정제의 반응시의 농도는 0∼100mmol/L가 바람직하다.
또한 본 발명에서는 소입자 고비중 LDL과 L LDL에 대한 포스포리파아제의 촉매 활성을 조정하기 위해서 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정에 있어서 폴리음이온을 첨가할 수도 있다. 첨가하는 폴리음이온으로서는 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란황산 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 시약 중의 폴리음이온의 농도는 헤파린의 경우 10∼250U/mL, 인텅스텐산의 경우 0.02∼1.25%(w/v), 덱스트란황산의 경우 0.02∼1.25%(w/v)가 바람직하다. 반응액 중의 농도는 각각 5∼250U/mL, 0.01∼1.25%(w/v), 0.01∼1.25%(w/v)가 바람직하다.
본 발명의 각 공정에 있어서의 반응 온도는 2℃∼45℃에서 행하는 것이 바람직하고, 25℃∼40℃에서 행하는 것이 더 바람직하다.
반응 시간은 각 공정 모두 1∼10분간으로 행하는 것이 바람직하고, 3∼7분으로 행하는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 피검체 시료로서는 혈청, 혈장을 사용할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용하는 자동 분석 장치로서, 예를 들면 TBA-120FR·200FR(도시바), JCA-BM1250·1650·2250(닛폰덴시), HITACHI7180·7170(히타치), AU2700(올림푸스) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법을 실시할 때에 이용하는 시약을 복수의 시약 조성물로 나눌 수도 있다. 본 발명에서는 시약으로서는 L LDL이나 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백과 반응하는 계면활성제, 콜레스테롤에스테라아제나 콜레스테롤옥시다아제 등의 콜레스테롤 측정용 효소, 계면활성제, 과산화수소를 분해하는 카탈라아제, 과산화수소로부터 커플링 반응에 의해 색소를 형성시키기 위한 퍼옥시다아제, 수소 공여체, 완충액 등이 이용된다. 이들 시약의 각 시약 조성물에의 배분은 시약의 안정성 등을 고려하여 적당히 분배한다. 이용하는 시약 조성물의 수는 본 발명의 방법의 공정 수에 대응시키면 된다. 예를 들면, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정의 3가지 공정이 있는 경우, 각각의 공정을 행하기 위한 3종류의 시약 조성물을 제조한다. 또한, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 동시에 행하는 경우, 이 공정을 행하기 위한 시약 조성물과 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정을 행하기 위한 시약 조성물의 2종류의 시약 조성물을 제조한다.
LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정의 3가지 공정이 있는 경우, 각각의 공정에 대하여 시약 조성물 A(LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤 소거용 시약 조성물), 시약 조성물 B(L LDL 중의 콜레스테롤 소거용 시약 조성물) 및 시약 조성물 C(소입자 고비중 LDL 측정용 시약 조성물)를 이용한다. LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정에 이용하는 시약 조성물 A에는, 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백에 작용하는 계면활성제가 포함된다. L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정에 이용하는 시약 조성물 B에는 적어도 L LDL에 반응하는 포스포리파아제가 포함된다. 조성물 A 또는 조성물 B 중 최초에 행하는 공정에 첨가하는 시약 조성물은, 콜레스테롤에스테라아제나 콜레스테롤옥시다아제 등의 콜레스테롤을 분해하는 효소, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 최초에 행하고, 이어서 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 행하는 경우, 시약 조성물 A는 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백에 작용하는 계면활성제를 포함하고, 콜레스테롤에스테라아제나 콜레스테롤옥시다아제 등의 콜레스테롤을 분해하는 효소, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함한다. 시약 조성물 B는 적어도 L LDL에 반응하는 포스포리파아제를 포함하고, 필요에 따라 계면활성제를 첨가할 수도 있다. 한편, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 최초에 행하고, 이어서 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 행하는 경우, 시약 조성물 B는 적어도 L LDL에 반응하는 포스포리파아제를 포함하고, 콜레스테롤에스테라아제나 콜레스테롤옥시다아제 등의 콜레스테롤을 분해하는 효소, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함한다. 시약 조성물 A는 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백에 작용하는 계면활성제를 포함한다. 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정에 이용하는 시약 조성물 C는, 소입자 고비중 LDL에만 반응하는 계면활성제 혹은 모든 리포 단백에 작용하는 계면활성제, 4 아미노안티피린 등의 수소 공여체, 퍼옥시다아제 등을 포함할 수 있다. 이때, 시약 조성물 A 및 시약 조성물 B에는 필요에 따라 1가의 양이온, 2가의 양이온 혹은 그들의 염, 또는 폴리음이온을 첨가할 수도 있다. 또한, 시약 조성물 A 및 시약 조성물 B에는 혈청 알부민이 포함되어 있을 수도 있다. 각 시약 조성물의 pH는 중성 부근, 예를 들면 pH 6∼pH 8, 바람직하게는 pH 6.5∼7.5이고, 완충액을 첨가하여 pH를 조정할 수 있다.
본 발명의 방법을 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정의 3가지 공정을 이 순서대로 행하는 경우, 피검체 시료에 시약 조성물 A를 첨가하여 반응시키고, 이어서 시약 조성물 B를 첨가하여 반응시키고, 그 후 시약 조성물 C를 첨가하여 반응시키고, 흡광도를 측정함으로써 행할 수 있다.
피검체 시료의 양, 각 시약 조성물의 양은 한정되지 않고, 각 시약 조성물 중의 시약의 농도 등을 고려하여 적당히 결정할 수 있는데, 예를 들면 피검체 시료 1∼10μL, 시약 조성물 A 내지 C를 각각 25∼200μL 이용할 수 있다.
본 발명의 방법을 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정 및 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정의 3가지 공정을 이 순서대로 행하는 경우, 최초에 피검체 시료에 시약 조성물 B를 첨가하여 반응시키고, 이어서 시약 조성물 A를 첨가하여 반응시키고, 그 후 시약 조성물 C를 첨가하여 반응시키고, 흡광도를 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, L LDL 중의 콜레스테롤과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤이 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정에 선행하여 반응계 외로 유도함으로써 소입자 고비중 LDL을 측정할 수 있다. L LDL 중의 콜레스테롤과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 반응계 외로 유도하는 방법은 전술한 바와 같이 소거 외에 응집시키거나 저해하거나 하는 등의 공지의 기술을 이용할 수 있다. 또한, 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정에 2 이상의 공정을 선행시키는 경우에는, 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정의 직전의 공정에서 L LDL 중의 콜레스테롤과 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 반응계 외로 유도하는 반응이 완료되면 된다. 따라서, 어느 하나의 공정에서는 L LDL 중의 콜레스테롤에 포스포리파아제를 작용시키는 것만을 행하고, 그 산물의 소거는 후공정에서 행하거나, 어느 하나의 공정에서는 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 분해하는 것만을 행하고, 그 산물의 소거는 후공정에서 행하는 것 등도 가능하다. 각 공정의 산물은 동일 공정에서 소거하는 것도 가능하다.
LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정과 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하여 반응계 외로 유도하는 공정을 합하여 1개의 공정으로 하고, 그 공정 후에 소입자 고비중 LDL을 측정하는 공정을 행하는 2 공정에 의한 반응의 경우, 최초의 공정에서는 상기의 시약 조성물 A와 시약 조성물 B가 포함하는 시약을 포함하는 시약 조성물 AB와 시약 조성물 C를 이용할 수 있다. 즉, 시약 조성물 AB는 적어도 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백에 작용하는 계면활성제 및 L LDL에 반응하는 포스포리파아제를 포함한다. 이 경우, 피검체 시료에 시약 조성물 AB를 첨가하고, L LDL이나 LDL 이외의 VLDL, HDL 등의 리포 단백을 계면활성제에 작용시키고, 효소와 반응시키고, 이어서 시약 조성물 C를 첨가하여 소입자 고비중 LDL을 계면활성제에 작용시켜 효소와 반응시키고, 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 측정할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤을 측정하는 공정을 이 순서로 행하여 소입자 고비중 LDL을 측정하였다.
LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약 조성물 A, L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약 조성물 B, 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤을 측정하는 공정에 이용하는 시약 조성물 C를 이하와 같이 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
소 혈청 알부민 0.5%(w/v)
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
포스포리파아제 A2[아사히카세이사 제조 PLA2] 11.0U/mL
염화칼슘 100mmol/L
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
혈청 시료 2μL에 시약 조성물 A 75μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에, 시약 조성물 B 75μL를 첨가하여 5분간 반응시키고, 그 후 시약 조성물 C 50μL를 첨가하여 5분간 반응시키고 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
비교 대상법으로서, 덴카세이켄사 제조의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용하여 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 농도를 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 2
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 B 중 포스포리파아제를 포스포리파아제 C[PLC]로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
포스포리파아제 C[아사히카세이사 제조 PLC] 1.16U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 3
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 B 중 포스포리파아제를 포스포리파아제 D[PLD]로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
포스포리파아제 D[아사히카세이사 제조 PLD] 1.36U/mL
염화칼슘 1.0mmol/L
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 4
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 B 중 포스포리파아제를 리조포스포리파아제[LYPL]로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
리조포스포리파아제[아사히카세이사 제조 LYPL] 1.18U/mL
염화칼슘 2.0mmol/L
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 5
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 B 중 포스포리파아제를 글리세로포스포리피드에 특이적인 포스포리파아제[PLDP]로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
포스포리파아제[아사히카세이사 제조 PLDP] 7.5U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 6
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 B 중 포스포리파아제를 스핑고미엘리나아제[SPC]로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.03%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 0.97U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 7
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤을 측정하는 공정을 이 순서로 행하여 소입자 고비중 LDL을 측정하였다.
L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약 조성물 B, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정에 이용하는 시약 조성물 A, 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤을 측정하는 공정에 이용하는 시약 조성물 C를 이하와 같이 제조하였다.
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
소 혈청 알부민 0.5%(w/v)
TOOS 2.0mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 0.485U/mL
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.6%(w/v)
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
혈청 시료 2μL에 시약 조성물 B 75μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에, 시약 조성물 A 75μL를 첨가하여 5분간 반응시키고, 그 후 시약 조성물 C 50μL를 첨가하여 5분간 반응시키고 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
비교 대상법으로서, 덴카세이켄사 제조의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용하여 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 농도를 비교하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 8
본 실시예에서는 L LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정(즉 소입자 고비중 LDL 이외 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정)을 동시에 행하였다. L LDL을 소거하는 공정 및 LDL 이외의 리포 단백을 소거하는 공정(즉 소입자 고비중 LDL 이외를 소거하는 공정)에 이용하는 시약 조성물 AB, 및 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤을 측정하는 공정에 이용하는 시약 조성물 C를 이하와 같이 제조하였다.
시약 조성물 AB
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
소 혈청 알부민 0.5%(w/v)
TOOS 2.0mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 1.46U/mL
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.135%(w/v)
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.015%(w/v)
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
혈청 시료 2μL에 시약 조성물 AB 150μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에, 시약 조성물 C 50μL를 첨가하여 5분간 반응시키고 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
비교 대상법으로서, 덴카세이켄사 제조의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용하여 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 농도를 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 9
실시예 6에서 이용한 시약 조성물 A 중 계면활성제를 에마르겐 B-66의 1종류로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
폴리옥시에틸렌 유도체[카오 제조 에마르겐 B-66] 0.27%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 0.97U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 10
시약 조성물 AB 중 계면활성제를 에마르겐 A-90의 1종류로 한 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 AB
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 1.2U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
소 혈청 알부민 1.0%(w/v)
TOOS 2.0mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 3.0U/mL
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[카오 제조 에마르겐 A-90] 0.18%(w/v)
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 709] 1.0%(w/v)
혈청 시료 2μL에 시약 조성물 AB 150μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에, 시약 조성물 C 50μL를 첨가하여 5분간 반응시키고 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
비교 대상법으로서 초원심법을 이용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 11
시약 조성물 AB 중에 계면활성제를 이용하지 않는 시약 조성물을 제조하였다.
시약 조성물 AB
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.3U/mL
카탈라아제 1200U/mL
소 혈청 알부민 1.0%(w/v)
TOOS 2.0mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 1.6U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 709] 1.0%(w/v)
혈청 시료 2μL에 시약 조성물 AB 150μL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에, 시약 조성물 C 50μL를 첨가하여 5분간 반응시키고 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
비교 대상법으로서 초원심법을 이용하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 본 실시예의 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
실시예 12
실시예 1에서 이용한 시약 조성물 A에 여러 계면활성제를 첨가한 시약을 제조하였다. 첨가한 계면활성제는 노니온 HS215, 에마르겐 920, 노니온 NS220, 노니온 HS220, 노니온 NS230, 퍼소프트 EP 중의 어느 하나이고, 노니온 HS215, 에마르겐 920 또는 노니온 NS220은 0.03%(w/v)를 첨가하고, 노니온 HS220, 노니온 NS230 또는 퍼소프트 EP는 0.06%(w/v)를 첨가하였다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
콜레스테롤에스테라아제 0.6U/mL
콜레스테롤옥시다아제 0.5U/mL
카탈라아제 600U/mL
TOOS 2.0mmol/L
각종 계면활성제
에마르겐 B-66 0.27%(w/v)
노니온 HS215, 에마르겐 920, 노니온 NS220,
노니온 HS220, 노니온 NS230 또는 퍼소프트 EP
0.03(w/v)(노니온 HS215, 에마르겐 920, 노니온 NS220) 또는
0.06(w/v)(노니온 HS220, 노니온 NS230, 퍼소프트 EP)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
스핑고미엘리나아제[아사히카세이사 제조 SPC] 0.97U/mL
시약 조성물 C
PIPES 완충액, pH 7.0 50mmol/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 4.0단위/mL
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르[카오 제조 에마르겐 909] 1.0%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 순서로 측정을 행하고, sd LDL-C「세이켄」에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 시약 조성물 A에 계면활성제로서 에마르겐 B-66과 노니온 HS215, 에마르겐 920, 노니온 NS220, 노니온 HS220, 노니온 NS230, 퍼소프트 EP를 병용하여 이용한 방법은 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 sd LDL-C「세이켄」을 이용한 방법과 양호한 상관성을 나타내었다.
Figure 112010029512576-pct00001
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 참고로서 본 명세서에 도입된다.

Claims (18)

  1. (1) 스핑고미엘리나아제의 존재하에서 소입자 고비중 LDL(small, dense LDL) 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과,
    (2) 이어서, 잔존하는 소입자 고비중 LDL 중의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하고,
    공정 (2)의 전으로서, 공정 (1)과 동시에 또는 공정 (1)의 전 혹은 후에 수행하는,
    (a) 콜레스테롤에스테라아제의 존재하에서 피검체 시료 중의 LDL 이외의 리포 단백 중 콜레스테롤을 소거하는 공정을 더 포함하며,
    여기서, 공정 (a)에서, 폴리옥시에틸렌라우일에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는, HLB 값이 13 이상 15 이하의 LDL 이외의 리포 단백에 작용하는 계면활성제를 스핑고미엘리나아제의 존재하에서 더 첨가하거나,
    공정 (a)에서, 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제; 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제; 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제; 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제인, 소입자 고비중 LDL에는 반응하지 않고, L LDL에만 반응하는 계면활성제를 스핑고미엘리나아제의 존재하에서 더 첨가하며,
    공정 (2)에서, 소입자 고비중 LDL에만 반응하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 혹은 그의 유도체인 계면활성제, 또는 HLB가 11 이상 14 미만의 폴리옥시에틸렌 유도체인 계면활성제, 4 아미노안티피린 및 퍼옥시다아제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 피검체 시료 중의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 공정 (1)에서 이용하는 스핑고미엘리나아제의 농도가 0.1∼100U/mL인 것을 특징으로 하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  4. 제1항에 있어서, 공정 (2)에서, 적어도 소입자 고비중 LDL에 작용하는, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 HLB가 11 이상 14 미만의 폴리옥시에틸렌 유도체인 계면활성제의 존재하에 콜레스테롤 측정용 효소가 첨가되는 것을 특징으로 하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 공정 (a)에서 이용하는 콜레스테롤에스테라아제의 농도가 0.01∼10U/mL인 것을 특징으로 하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 공정 (a)에서 이용하는 계면활성제의 농도가 0.05∼1.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  11. 제1항에 있어서, 공정 (a)에서, 콜레스테롤옥시다아제 및 카탈라아제를 더 첨가하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  12. 제1항에 있어서, 공정 (a)에서, 콜레스테롤옥시다아제 및 4 아미노안티피린을 더 첨가하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  13. 제1항에 있어서, 공정 (a) 및 공정 (1)의 반응이 동일한 용액 중에서 동시에 행해지는 것을 특징으로 하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법.
  14. 삭제
  15. 적어도 이하의 2종류의 시약 조성물을 포함하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트:
    (ⅰ) 적어도 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL에 반응하는 스핑고미엘리나아제가 포함되고, 피검체 중의 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하기 위한 시약 조성물;
    (ⅱ) 소입자 고비중 LDL을 측정하기 위한 소입자 고비중 LDL에만 반응하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 혹은 그의 유도체인 계면활성제, 또는 HLB가 11 이상 14 미만의 폴리옥시에틸렌 유도체인 계면활성제, 4 아미노안티피린 및 퍼옥시다아제를 포함하는 시약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, (ⅲ) 적어도 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제가 포함되고, LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하기 위한 시약 조성물을 더 포함하여, 적어도 3개의 시약 조성물을 포함하는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트.
  17. 제15항에 있어서, (ⅰ)의 시약 조성물에 적어도 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬황산염, 아미드에테르황산염, 알킬타우린산염 및 인산에스테르형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음이온 계면활성제, 알킬메틸암모늄염, 제4급 암모늄염 및 모노 직쇄 알킬형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온 계면활성제, 또는 라우릴베타인, 디메틸알킬베타인, 이미다졸린형 및 알킬디아미노에틸글리신나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양쪽성 계면활성제가 더 포함되고, (ⅰ)의 시약 조성물에 의해 피검체 중의 소입자 고비중 LDL 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤이 소거되는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량용 키트.
  18. 삭제
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