JP7437263B2

JP7437263B2 - 試薬組成物およびキット

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Publication number: JP7437263B2
Application number: JP2020130698A
Authority: JP
Inventors: 康樹伊藤
Original assignee: Denka Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2024-02-22
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: JP2022026970A

Description

本発明は、試薬組成物およびキットに関する。

ＬＤＬコレステロールの測定方法に関する技術として、特許文献１（特開２０００－３２５０９７号公報）に記載のものがある。同文献には、リポ蛋白質を含有する試料に、酵素と第１界面活性剤を加えることによりＨＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第１工程、次いで、第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第２工程、及び第１または第２工程において、酵素との反応により消費される化合物または生成される化合物を測定することにより、ＨＤＬコレステロール及び／またはＬＤＬコレステロールを測定することを含むリポ蛋白質コレステロールの測定方法について記載されており、かかる方法では、反応液の濁度を上昇させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせず、使用する酵素に制限がない上、ＬＤＬコレステロールを反応させる工程で新たに別の酵素を加える必要もなく、簡便でかつ安価にＬＤＬコレステロールを定量することができ、また必要に応じてＨＤＬコレステロールを光学的な測定を妨害するリポ蛋白質の凝集を形成することなく正確かつ安価に測定することができる測定方法及び測定試薬を提供することができるため、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野に有用であるとされている。

特開２０００－３２５０９７号公報

本発明者らは、ＬＤＬコレステロールの中でも、ｓｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を測定することを検討した。すると、特許文献１に記載の技術においては、測定の正確性の点で改善の余地があることが見出された。

本発明は、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供するものである。

本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量の正確性を向上すべく検討した。その結果、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる試薬組成物の接触角を特定の範囲とすることにより、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明によれば、以下の試薬組成物およびキットが提供される。
［１］第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
アニオン界面活性剤を含み、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からならる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、
以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である、試薬組成物。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロン（登録商標、以下同じ。）コート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
［２］当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、［１］に記載の試薬組成物。
［３］当該試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない、［１］または［２］に記載の試薬組成物。
［４］前記アニオン界面活性剤が硫酸エステル塩を含む、［１］乃至［３］いずれか１項に記載の試薬組成物。
［５］当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、［１］乃至［４］いずれか１項に記載の試薬組成物。
［６］以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、［１］乃至［５］いずれか１項に記載の試薬組成物。
（方法２－１）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［７］以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が０．８９ｍＰａ・ｓ以下である、［１］乃至［６］いずれか１項に記載の試薬組成物。
（方法２－２）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［８］［１］乃至［７］いずれか１項に記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
［９］前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、［８］に記載のキット。
［１０］前記第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、
前記第２試薬組成物が、前記水素供与体および前記カップラーの前記一方を含まず前記他方を含む、請求項［８］または［９］に記載のキット。

本発明によれば、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供することができる。

ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。

以下、実施の形態について説明する。本実施形態において、測定試薬等の組成物は、各成分を単独でまたは２種以上を組み合わせて含むことができる。また、本明細書において、数値範囲の「ｘ～ｙ」は「ｘ以上ｙ以下」を表し、下限値ｘおよび上限値ｙをいずれも含む。

はじめに、リポタンパク質について説明する。
リポタンパク質は、大きくVery Low Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh Density Lipoprotein（ＨＤＬ）の分画に分けられ、ＬＤＬはさらにsmall dense ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）とそれ以外の亜分画に分けられる。ｓｄＬＤＬを小粒子ＬＤＬ、small ＬＤＬ（ＳＬＤＬ）、dense ＬＤＬ、small, dense ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをlarge ＬＤＬ（ＬＬＤＬ）、Light ＬＤＬと呼ぶこともある。

これらのリポタンパク質の分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。
リポタンパク質の粒子サイズの直径については、報告者により異なるが、たとえば、ＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（または３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（または１９ｎｍ～３０ｎｍ）であり、ＨＤＬが７～１０ｎｍである。
リポタンパク質の比重については、たとえば、ＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１である。

リポタンパク質のうち、ＬＤＬ粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS:TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定できる。また、比重は、たとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。

本実施形態において、測定しようとするｓｄＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０～約２５．５ｎｍの亜分画、または、比重１．０４０～１．０６３の亜分画を指す。
ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものがとりわけ悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０～１．０６３という値もｓｄＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９～１．０６３を中央点で分けた高比重側の値である。たとえば、ｓｄＬＤＬの比重について、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のｓｄＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。

本明細書において、ｓｄＬＤＬという場合、具体的には、ＬＤＬのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいものをいう。また、ｓｄＬＤＬは、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より高い比重範囲に属するもの、より好ましくは比重１．０４４～１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。また、ＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、ＶＬＤＬまたはＨＤＬを指し、さらにカイロミクロン、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）またはＶＨＤＬ（very high density lipoprotein）を含めることもある。

（試薬組成物（第１試薬組成物））
本実施形態において、試薬組成物は、第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、第１試薬組成物を試料に作用させる工程の後、ｓｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、を含む、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の第１試薬組成物として用いられる試薬組成物である。
以下、第１試薬組成物として用いられる試薬組成物を、単に「第１試薬組成物」とも呼ぶ。
第１試薬組成物は、アニオン界面活性剤を含み、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。そして、以下の方法１により測定される、第１試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である。

（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
上記（２）では、ＰＥＴ基材の塵などを測定前に拭き取る。静電気は接触角に影響するため、極力摩擦などが発生しないよう拭き取り、その後５分以内に測定を実施する。
本実施形態において、接触角は、具体的にはたとえば協和界面化学社製ＤＭｏ－９０１、７０１、６０１、５０１、ＤＭＣ－ＭＣ３等により測定される静的接触角である。

本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物とＰＥＴ基材との屈折率を特定の範囲とすることにより、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、たとえば、第１試薬組成物は試薬ボトル（ＰＥＴなど）に入った状態で生化学自動分析装置にセットされ、測定される。測定の際には試薬プローブが一定量の第１試薬組成物を吸い込み反応セル内に吐出する。ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する工程に用いる第１試薬組成物の接触角（ぬれ性）を制御することにより試薬の液離れを適切に制御できるため、試薬ボトルへの試薬成分の吸着、プローブからの吐出、反応セル内での吸着などを制御することができ、その結果、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを測定できると考えられる。

試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、６５°以上であり、好ましくは６６°以上、より好ましくは６７°以上である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、７７°以下であり、好ましくは７６°以下、より好ましくは７５°以下である。

本実施形態では、たとえば第１試薬組成物に含まれる各成分の種類、組み合わせ、配合量等を適切に選択することにより、ＰＥＴ基材との接触角を制御することが可能である。これらの中でも、たとえば界面活性剤の種類や配合量、タンパク質の種類や配合量を調整すること等が、ＰＥＴ基材との接触角を所望の数値範囲とするための要素として挙げられる。

第１試薬組成物は、アニオン界面活性剤を含むとともに、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用して消去することができる。また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。

ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポタンパク質を分解し、リポタンパク質中のコレステロールが遊離することをいう。たとえば、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がｓｄＬＤＬに全く作用しないことは要求されず、主にｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を分解し、その分解産物であるこれらリポタンパク質中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。

「反応系外に導く」とは、具体的には、ＨＤＬやＶＬＤＬ、ＬＬＤＬなどに含まれるコレステロールがｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に影響を及ぼさないように、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＬＤＬなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりすることをいう。

また、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、具体的には、コレステロールエステラーゼが存在し、コレステロールエステラーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性等の他の酵素活性についても同様である。

以下、第１試薬組成物に含まれる成分をさらに具体的に説明する。

（アニオン界面活性剤）
第１試薬組成物は、少なくともアニオン界面活性剤を含む。アニオン界面活性剤は、具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤であり、より好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用するとともにｓｄＬＤＬに作用しない界面活性剤である。

アニオン界面活性剤として、具体的には、硫酸塩型アニオン界面活性剤、スルホン酸塩型アニオン界面活性剤、リン酸塩型アニオン界面活性剤、カルボン酸型アニオン界面活性剤、アミノ酸系界面活性剤が挙げられる。

ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、アニオン界面活性剤は、好ましくは硫酸塩型アニオン界面活性剤を含み、より好ましくは硫酸エステル塩を含む。硫酸エステル塩は、具体的には、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アミドエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩およびポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩からなる群から選択される１種または２種以上であり、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩およびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩からなる群から選択される１種または２種以上であり、さらに好ましくはポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩から選択される１種または２種以上である。

他のアニオン界面活性剤については、スルホン酸塩型アニオン界面活性は、具体的には、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩からなる群から選択される１種または２種以上である。
また、アミノ酸系界面活性剤は、具体的には、アルキルタウリン酸塩等のＮ－アシルアミノ酸塩型アニオン界面活性剤である。

また、アニオン界面活性剤において、塩を構成するカチオンの具体例として、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン；
マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；
アンモニウムが挙げられる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、塩を構成するカチオンは、好ましくはアルカリ金属イオンおよびアンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つであり、より好ましくはアルカリ金属イオンであり、さらに好ましくはナトリウムイオンである。

第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の濃度は、アニオン界面活性剤をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．００７％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．００９％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．０１０％（ｗ／ｖ）以上である。
また、第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは０．０４５％（ｗ／ｖ）以下であり、さらに好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは０．０３５％（ｗ／ｖ）以下、よりいっそう好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以下、さらにまた好ましくは０．０２８％（ｗ／ｖ）以下である。

なお、第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤は、たとえば、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の構造を決定する方法としてはＬＣ－ＭＳＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。

（酵素）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）活性、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ）活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。これにより、第１試薬組成物をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質により安定的に作用させそのコレステロールを反応形外に導くことができる。
また、第１試薬組成物は、具体的には、コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素とコレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素とを含み、さらに、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素およびカタラーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。第１試薬組成物は、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼの少なくとも１つと、を含み、好ましくはコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含む。
コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼとして、それぞれ、たとえば細菌や菌類由来のものや、植物由来のものを用いることができる。

第１試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは５０Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは４００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは３５０Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは３００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば１５０Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば１８０Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
同様の観点から、第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性は、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１５０Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは８００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは７５０Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは７００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば２００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば２５０Ｕ／Ｌ以下であってもよい。

第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは３００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２５００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば２０００Ｕ／Ｌ以下であることも好ましい。また、第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば５０００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば４０００Ｕ／Ｌ以下であってもよい。

第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、試料に第１試薬組成物を適用した際に生じる過酸化水素を安定的に除去する観点、および、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１００Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１０００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは８００Ｕ／ｍＬ以下である。

第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性、コレステロールエステラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性およびカラターゼ活性は、それぞれ、たとえば、以下の方法にて測定できる。

コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として６ｍＭコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を２～４Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．０）を加え、希釈後の溶液３ｍＬを３７℃５分加温後に基質液０．０５ｍＬを加える。その後、混合液を３７℃で反応させ波長２４０ｎｍ吸光度変化量を測定する。３７℃にて反応後、２分から７分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールオキシダーゼが含まれているといえる。

コレステロールエステラーゼ活性の測定では、基質（０．０４％リノレン酸コレステロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．６％コール酸ナトリウム溶液）、３００Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）、反応液（０．０６％４－アミノアンチピリン、０．４％フェノール、７．５ＫＵ／Ｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））を用いる。反応液１．７５ｍＬと基質液１．０ｍＬを混合後、３７℃で５分加温し、０．１ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。３７℃、２分加温後に希釈液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加え、混合液を３７℃で反応させ、波長５００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が８Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼが含まれているといえる。

第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液１（１．５ｍＭＨＤＡＯＳ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、および、反応液２（５ｍＭ４－アミノアンチピリン、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、希釈液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。０．３ｍＬの反応液１と希釈液で希釈した測定対象０．０８ｍＬを混合し、３７℃で５分加温する。その後０．１ｍＬの反応液２を加え、３７℃で反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、２分から５分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、ペルオキシダーゼが含まれているといえる。

第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、カタラーゼ活性測定では基質（０．０６％過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。基質溶液２．０ｍＬを２５℃で予備加温後、測定対象０．１ｍＬと混合し、２４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。たとえば２５℃反応後、０分から３分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が５０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、カタラーゼが含まれているといえる。

第１試薬組成物は、他の酵素活性をさらに有してもよく、具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼ活性およびリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）活性からなる群から選択される１または２以上の酵素活性をさらに有してもよい。
また、第１試薬組成物は、たとえばアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素およびリポプロテインリパーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される１または２以上の酵素活性を有する酵素を含んでもよく、さらに具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼおよびリポプロテインリパーゼからなる群から選択される１または２以上の酵素を含む。

第１試薬組成物は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有し、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する。
同様の観点から、第１試薬組成物は、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素を含み、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼを含む。

第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１５Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下である。
第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定では基質（１０ｍＭアスコルビン酸溶液、０．１％メタクリン酸）を用いる。緩衝液（１００ｍＭジメチルグリチル酸ｐＨ６．５を３．０ｍＬと１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０）で希釈した測定対象０．２５ｍＬを混合し３７℃で２分間予備加温後、基質液０．０７５ｍＬを加え、３７℃で反応させ２４５ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。たとえば３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定しアスコルビン酸オキシダーゼ活性を算出する。たとえば吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はアスコルビン酸オキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、「アスコルビン酸オキシダーゼ」が含まれているといえる。

第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくは２Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５０Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは３００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬ以下である。
第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、リポプロテインリパーゼ活性の測定では、基質液としてオリーブ油エマルジョン溶液（オリーブ油５ｇ、エタノール２ｍＬに５．０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００５ｍＬを加え２０分間超音波処理し、その後４％ＢＳＡ２５ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０１５ｍＬを加え室温で１～２時間攪拌したもの）を用いる。３７℃、５分間予備加温した基質液に、０．９～１．６Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ７．５）を加え、希釈した検体０．２ｍＬを加え、３７℃１５分加温後に反応停止液（０．２Ｍトリクロル酢酸）２．０ｍＬを加える。その後、濾過（東洋濾紙No. 131またはWhatman No. 42）を行い、濾液を回収する。濾液０．０５ｍＬに発色試薬（５０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液２００ｍＬ、５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００４ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｍ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ４０μＬ、４アミノアンチピリン４ｍｇ、ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ₂Ｏ２４．２ｍｇ、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ４０．７ｍｇ、グリセロールキナーゼ２００Ｕ、Ｌαグリセロリン酸オキシダーゼ５００Ｕ、ペルオキシダーゼ３００Ｕ）３．０ｍＬを加え、混合液を３７℃で１５分間反応させ波長５４５ｎｍ吸光度を測定すし、リポプロテインリパーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はリポプロテインリパーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、リポプロテインリパーゼが含まれているといえる。
リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。

また、第１試薬組成物は、測定対象物であるｓｄＬＤＬ－Ｃを、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く工程（後述の第１工程）中で過剰に消去しない観点から、好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない。同様の観点から、第１試薬組成物は、好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まず、より好ましくはスフィンゴミエリナーゼを実質的に含まない。
ここで、スフィンゴミエリナーゼ活性を有しないとは、具体的には、以下の方法で測定されるスフィンゴミエリナーゼ活性が２Ｕ／Ｌ未満であることをいい、より好ましくは１Ｕ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは０Ｕ／Ｌである。
また、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素およびスフィンゴミエリナーゼを実質的に含まないとは、具体的には、第１試薬組成物において後述の方法で同定されるこれらの酵素が検出限界以下であることをいう。

第１試薬組成物のスフィンゴミエリナーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液（０．００８％スフィンゴミエリン、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液、１０Ｕ／ｍＬアルカリ性フォスファターゼ、１０Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ、０．０２％４－アミノアンチピリン、０．０２％ＴＯＤＢ混合液）、反応停止液（１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（１０ｍＭトリス緩衝液、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いる。反応液０．０８ｍＬと希釈液で希釈した測定対象０．００３ｍＬを混合し３７℃で５分加温後に反応停止液０．１６ｍＬを加える。反応停止後に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が２Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、スフィンゴミエリナーゼが含まれているといえる。

また、本実施形態において、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、まず、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳデータ）をデータベース検索（たとえば、Ｍａｓｃｏｔサーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試薬組成物中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいるとみなせる。

また、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素はたとえば以下の定量でも同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、ＨＰＬＣに接続した三連四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＭＲＭモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。

（その他の成分）
第１試薬組成物は、上述の成分以外の成分を含んでもよい。他の成分として、たとえば、緩衝液、塩、酵素作用を有しないタンパク質、防腐剤、水素供与体、カップラーが挙げられる。

緩衝液の種類は、たとえば適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
緩衝液の濃度は、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下であり、好ましくは２００ｍＭ以下、さらに好ましくは１５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００ｍＭ以下である。

塩は、具体的には、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤として配合される。塩の具体例として、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム等のナトリウム塩；水酸化カリウム等のカリウム塩；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩等の塩基性物質が挙げられる。また、第１試薬組成物が１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩を含むことにより、ｓｄＬＤＬとＬＬＤＬの分別がさらに容易となる。
第１試薬組成物中の塩濃度は、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤としてより安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下である。

第１試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８以下であり、より好ましくは７．５以下である。

酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、ＢＳＡ等のアルブミンが挙げられる。
第１試薬組成物中のＢＳＡ等のアルブミン濃度は、第１試薬組成物中の酵素を安定化させる観点から、またｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く第１工程を安定化させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。

第１試薬組成物は、好ましくは水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む。このとき、水素供与体およびカップラーのいずれか一方は、第１工程でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導くために使用される。さらに具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼを作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で無色キノンに転化させるために水素供与体およびカップラーのいずれか一方が用いられる。

水素供与体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ'－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等のアニリン誘導体が挙げられる。
第１試薬組成物中の水素供与体の試薬中濃度は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは１．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは５ｍＭ以下であり、より好ましくは３ｍＭ以下である。

また、水素供与体が後述の第２試薬組成物で用いられる場合、カップリング反応に用いるカップラーが第１試薬組成物中に用いられる。カップラーとしては、たとえば、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン等を用いることができるが、これらに限定されない。

次に、第１試薬組成物の物性を説明する。
第１試薬組成物の性状は、具体的には液体である。

第１試薬組成物の５℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、第１試薬組成物の５℃における粘度は、たとえば３．０ｍＰａ・ｓ以下であってよく、好ましくは２．０ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは１．９ｍＰａ・ｓ以下である。
また、第１試薬組成物の５℃における粘度は、たとえば１．４ｍＰａ・ｓ以上であってよく、また、たとえば１．５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。

第１試薬組成物の３７℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、第１試薬組成物の５℃における粘度は、好ましくは０．８９ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは０．８７ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは０．８５ｍＰａ・ｓ以下であり、また、０．８０ｍＰａ・ｓ以下または０．７５ｍＰａ以下であることも好ましい。
また、第１試薬組成物の３７℃における粘度は、たとえば０．５ｍＰａ・ｓ以上であってよい。

ここで、各温度における第１試薬組成物の粘度は、以下の方法２により測定される。方法２において、測定温度を５℃とするのが方法２－１であり、３７℃とするのが方法２－２である。
（方法２）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃（方法２－１）および３７℃（方法２－２）、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
本実施形態において、粘度は、たとえば京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００等により測定される。

本発明者らは、またｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物の粘度を特定の範囲とすることにより、さらに正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、測定の際には試薬プローブが一定量の第１試薬組成物を吸い込み反応セル内に吐出する。ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する工程に用いる第１試薬組成物の粘度が高すぎる場合、粘性により吐出量が変わり消去量が変動する可能性があるが、粘度を的確に制御することにより試薬の液離れを適切に制御できるため、その結果、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを測定できると考えられる。

本実施形態において、第１試薬組成物は、特定の成分を含むとともに接触角が特定の範囲にあるため、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に好適に用いることができ、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定の正確性を優れたものとすることができる。
たとえば、第１試薬組成物は、後述する第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられる。

（キット）
本実施形態において、キットは、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるものであり、上述の第１試薬組成物と、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を含む。
また、キットは、具体的には２以上の工程を含むｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
以下、第２試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。

（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、具体的には、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。

第２試薬組成物に含まれる成分の具体例として、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤、酵素作用を有しないタンパク質、防腐剤、ならびに、水素受供与体およびカップラーのいずれか一方が挙げられる。
また、キットの好ましい構成においては、第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、第２試薬組成物が、水素供与体およびカップラーの一方を含まず他方を含む。

酵素として、たとえば、ペルオキシダーゼが挙げられる。また、第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する。第２試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、第２工程でｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定する観点から、好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下である。ただし、第１試薬組成中にペルオキシダーゼ活性が含まれる場合は、第２工程にもペルオキシダーゼ活性が持ち越されるため、第２試薬中の濃度を減量する、あるいは含まなくすることもできる。

緩衝液および塩の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。

第２試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８以下であり、より好ましくは７．５以下である。

界面活性剤として、たとえばｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、好ましくはｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む。
ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤は、ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤等のｓｄＬＤＬに選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。

第２試薬組成物中の界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレン誘導体をあげることができ、また、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤を使用することができる。かかる界面活性剤として、たとえば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（たとえば、エマルゲン９０９（花王社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（たとえばエマルゲン７０７、エマルゲン７０９（以上、花王社製））が挙げられる。

第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第２試薬組成物添加後の混合溶液に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以上である。
また、同様の観点から、第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは２．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以下である。

第２試薬組成物がカップラーを含むとき、カップラーは、好ましくは４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンからなる群から選択される１または２以上の化合物である。
第２試薬組成物中のカップラーの濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１．０ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。

一方、カップラーが第１試薬組成物中に含まれる場合、水素供与体は好ましくは第２試薬組成物中に含まれる。この場合の水素供与体の試薬中濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは３ｍＭ以上であり、より好ましくは４．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１２ｍＭ以下である。

酵素作用を有しないタンパク質および防腐剤の具体例としては、それぞれ、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。

（方法）
本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。かかる方法において、本実施形態における第１試薬組成物を用いることにより、正確性に優れた測定をおこなうことができるため、たとえば、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い正確性で安定的に定量することも可能となる。

また、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法は、たとえば試料（被検体試料）に第１試薬組成物を添加し反応させ、次いで第２試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することによりおこなえばよい。
被検体試料は、たとえば血清、血漿等の血液由来試料であり、好ましくは血清である。
第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬５０～３００μＬ、第２試薬２５～２００μＬを用いればよい。
以下、各工程をさらに具体的に説明する。

（第１工程）
第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
さらに具体的には、第１工程では、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、コレステロールエステラーゼの存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。

第１試薬組成物が電子供与体を有するとき、第１工程において、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質から生じたコレステロールを消去し反応系外に導く工程は、たとえば、第１試薬組成物におけるコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびに、電子供与体の存在下で無色キノンを形成させることを含んでもよい。

また、第１工程においては、イオン強度調整剤として１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩をさらに反応液に添加して用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、ｓｄＬＤＬとＬＬＤＬを差別化しやすくなる。

（第２工程）
第２工程では、第１工程を経て残存したｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する。第２工程には、従来から用いられているＬＤＬの定量方法を用いることができる。たとえば、ＬＤＬ凝集剤を添加して形成されたＬＤＬ特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、ＬＤＬ特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。定量方法は、たとえば第２試薬組成物に含まれる成分や組成に応じて選択される。

第２試薬組成物が酵素を含むとき、酵素を用い分解生成物を定量する方法とすることができる。具体的には、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてｓｄＬＤＬ－Ｃを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。

本実施形態において、各工程における、反応温度は２℃～４５℃でおこなうことが好ましく、２５℃～４０℃でおこなうことがより好ましい。
反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。

ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓｃ５０１、ｃｏｂａｓｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられる。

ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量は、たとえば５８０～７２０ｎｍの波長域、好ましくは６００～７００ｎｍの波長域の吸光度測定によりおこなう。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

（実施例１～７、比較例１、２）
各例の第１試薬組成物を調製し、第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量をおこなった際の測定の正確性を評価した。

（試薬組成物の調製）
以下に示す各成分を以下の濃度で配合することにより、各例の第１試薬組成物および第２試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物については、牛血清アルブミンおよびアニオン界面活性剤の濃度を変えて、各例の組成物を調製した。

測定に用いた第１試薬組成物、第２試薬組成物の配合組成を以下に示す。
（第１試薬組成物）
ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ３００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ６００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ２５００Ｕ／Ｌ
牛血清アルブミン
ＴＯＯＳ２．０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ３．０Ｕ／ｍＬ
アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩）

（第２試薬組成物）
ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０５０ｍＭ
４－アミノアンチピリン４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ４０００Ｕ／Ｌ
アジ化ナトリウム０．０５％（ｗ／ｖ）
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル１％（ｗ／ｖ）

（接触角の測定方法）
ＰＥＴ基材として、目視にて透明なＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板（タキロンシーアイ社製、ＰＥＴ板（ペテック）品番６０１０、厚さ２ｍｍ）を用いた。未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取り、その後５分以内に測定を実施した。
接触角計（協和界面科学社製、ＤＭｏ－５０１）を用い、液滴法、θ／２法により、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬの条件で、滴下後１秒後に接触角の測定をおこなった。
各例について５回測定し、５回の平均値を算出した。測定結果を表１または表３に示す。

（粘度の測定方法）
実施例１～７について、ＥＭＳ粘度計（京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００）を用いて、電磁スピニング法により、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃および３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬとして各例の第１試薬組成物の粘度を測定した。各例について各温度で５回ずつ測定を実施し、５回の平均値を算出した。測定結果を表２または表３に示す。

（正確性試験）
各例の第１試薬組成物を用いて濃度既知のｓｄＬＤＬ－Ｃの測定をおこなった際の正確性を、比較対照法により評価した。具体的には、各例の、すなわち接触角の異なる第１試薬組成物、および、第２試薬組成物を調製した。血清試料２μＬに第１試薬組成物７５μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬組成物７５μＬを加え５分間反応させ主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍでの吸光度を測定した。
比較対照法として、デンカ生研社製のｓｄＬＤＬコレステロール測定用試薬ｓｄＬＤＬ－Ｃ「生研」を用いてｓｄＬＤＬコレステロール濃度を比較した。

評価結果を図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）に示す。図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）において、横軸は比較対照法によるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値（濃度）を表し、縦軸は比較対照法に対する比較例、実施例のバイアスを表す。あわせて、バイアスの平均値を表１および表３に示す。バイアスの平均値が±１５％以内であるものを合格とした。
図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）ならびに表１～表３より、各実施例では、正確性の高いｓｄＬＤＬ－Ｃが可能であった。

Claims

第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
アニオン界面活性剤を含み、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からならる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、
以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である、試薬組成物。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、請求項１に記載の試薬組成物。
当該試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない、請求項１または２に記載の試薬組成物。
前記アニオン界面活性剤が硫酸エステル塩を含む、請求項１乃至３いずれか１項に記載の試薬組成物。
当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、請求項１乃至４いずれか１項に記載の試薬組成物。
以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１乃至５いずれか１項に記載の試薬組成物。
（方法２－１）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が０．８９ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１乃至６いずれか１項に記載の試薬組成物。
（方法２－２）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
請求項１乃至７いずれか１項に記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、請求項８に記載のキット。
前記第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、
前記第２試薬組成物が、前記水素供与体および前記カップラーの前記一方を含まず前記他方を含む、請求項８または９に記載のキット。