WO2021049518A1 - ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット - Google Patents

ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット Download PDF

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WO2021049518A1
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cholesterol
reagent composition
activity
small
dense ldl
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康樹 伊藤
謙亨 佐藤
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デンカ株式会社
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
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    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Definitions

  • the present invention relates to a method and reagent for measuring cholesterol in small, dense LDL.
  • LDL Low-density lipoprotein
  • the lipid component in small, dense LDL can be measured more easily than by ultracentrifugation or electrophoresis, and it is excellent in specificity and accuracy.
  • the sample is pretreated and LDL is changed to small, dense LDL. It was necessary to separate it into LDL other than.
  • a step of removing cholesterol in lipoproteins other than small, dense LDL and a reaction solution in a reaction solution that suppresses the reaction of cholesterol in small, dense LDL is a method for measuring cholesterol in small, dense LDL remaining in (see Patent Document 3), a step of eliminating cholesterol in LDL other than small, dense LDL in the presence of sphingomyelinase in the first step, and a first step.
  • a method for quantifying cholesterol in lipoprotein remaining in one step see Patent Document 4), in the presence of cholesterol esterase and a surfactant that acts on lipoproteins other than small and dense LDL, 0.05 to 1.0 g / L.
  • Small, small, in the sample sample including a first step of erasing lipoproteins other than small, dense LDL in the sample sample, and then a second step of quantifying cholesterol in small, dense LDL remaining in the first step.
  • a method for quantifying cholesterol in dense LDL see Patent Document 5).
  • sphingomyelinase is used in the first step, and a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer or its derivative or a polyoxyethylene derivative having an HLB of 11 or more and less than 14 is used in the second step.
  • a reagent composition containing a surfactant, 4-aminoantipyrine and peroxidase see Patent Document 6).
  • the method of quantifying cholesterol in small, dense LDL using an automatic analyzer without performing these sample pretreatments has a problem that the second reagent naturally develops a yellow color over time. There was a problem with the storage stability of the reagent.
  • An object of the present invention is a method for suppressing the natural color development of a reagent during storage in a method for quantifying cholesterol in small, dense LDL in two steps using an automatic analyzer without pretreatment of a sample. And to provide a quantification kit used in this method, as well as a preparation method.
  • the present inventors control the combination of each component of the enzyme, electron donor, coupler, and iron complex contained in the first reagent used in the first step and the second reagent used in the second step. As a result, it was found that the natural color development in the reagent was suppressed and the reagent stability was improved.
  • the coupler, iron complex, and peroxidase have the same reagent composition. Suppressing the natural color development of reagents by allowing the above components to exist separately in the two reagent compositions without coexisting in the product, in particular, without coexisting the coupler and the iron complex in the same reagent composition. And have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] Used in a method for quantifying cholesterol in small, dense LDL in two steps: (1) Cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, sphingomyelinase activity, cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, sphingomyelinase A first reagent composition for guiding cholesterol in lipoproteins other than small, dense LDL to the outside of the reaction system in the presence of activity, and (2) A second reagent composition for quantifying cholesterol in small, dense LDL, and A small, dense LDL cholesterol quantification kit in a sample of a subject comprising, in any of the reagent compositions of the first reagent composition and the second reagent composition, a coupler, an iron complex, and a peroxidase in the same reagent composition.
  • a kit featuring that [3] The kit of [1] or [2], wherein the first reagent composition comprises catalase activity and a coupler, and the second reagent composition comprises electron donor, iron complex and peroxidase activity. [4] The kit of [1] or [2], wherein the first reagent composition comprises a peroxidase activity and a coupler, and the second reagent composition comprises an electron donor and an iron complex. [5] The kit of [1], wherein the first reagent composition contains catalase activity, a coupler and an iron complex, and the second reagent composition contains an electron donor and peroxidase activity.
  • the first reagent composition further contains a surfactant that acts on lipoproteins other than small, dense LDL
  • the second reagent composition further contains a surfactant that acts on at least small, dense LDL.
  • a kit according to any one of [1] to [9] as a feature. [11] The kit of [10], wherein the surfactant contained in the first reagent composition contains polyoxyethylene polycyclic phenyl ether.
  • the polyoxyethylene polycyclic phenyl ether contains a polyoxyethylene benzyl phenyl ether derivative and / or a polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative.
  • a method for quantifying cholesterol in small, dense LDL in two steps (1) The first step of guiding cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL to the outside of the reaction system in the presence of cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, and sphingolipiderinase activity. (2) The second step of quantifying cholesterol in the lipoprotein remaining in the first step, A method for quantifying small, dense LDL cholesterol in a sample, which comprises the above, wherein the coupler, iron complex, and peroxidase are not used at the same time in any of the steps (1) or (2). [14] A method for quantifying cholesterol in small, dense LDL in two steps.
  • the second step of quantifying cholesterol in the lipoprotein remaining in the first step A method for quantifying small, dense LDL cholesterol in a sample of a sample containing the above, which comprises not using a coupler and an iron complex at the same time in any of the steps (1) and (2).
  • the first step is characterized by further using a surfactant that acts on lipoproteins other than small and dense LDL
  • the second step is further using a surfactant that acts on at least small and dense LDL.
  • the quantification method according to any one of [13] to [21].
  • the present invention when cholesterol in small, dense LDL is separately measured from other cholesterol, spontaneous color development during storage of the two reagents is suppressed, stability is improved, and cholesterol in small, dense LDL is stably measured.
  • a method for quantification, a quantification kit used for this method, and a manufacturing method for carrying out this method are provided.
  • FIG. It is a figure which shows the absorption spectrum immediately after preparation and after storage of the 1st reagent composition in Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the absorption spectrum immediately after preparation and after storage of the 2nd reagent composition in Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the absorption spectrum immediately after preparation and after storage of the 1st reagent composition in Example 4.
  • FIG. It is a figure which shows the absorption spectrum immediately after preparation and after storage of the 2nd reagent composition in Example 4.
  • FIG. It is a figure which shows the absorption spectrum immediately after preparation and after storage of the 1st reagent composition in Example 5.
  • Lipoproteins are broadly divided into VLDL, LDL and HDL fractions, and LDL is further divided into small, dense LDL and other subfractions.
  • Small, dense LDL may be called small particle LDL, SLDL (small LDL), dense LDL, sd LDL, and other LDLs may be called L LDL (large LDL), Light LDL.
  • These fractions and subfractions can be distinguished by particle size or specific gravity. The diameter of the particle size varies depending on the reporter, but VLDL is 30 nm to 80 nm (30 nm to 75 nm), LDL is 22 nm to 28 nm (19 nm to 30 nm), and HDL is 7 to 10 nm in diameter.
  • the specific gravity is 1.006 or less for VLDL, 1.019 to 1.063 for LDL, and 1.063 to 1.21 for HDL.
  • LDL particle diameter is gradient gel electrophoresis (GGE) (JAMA, 260, p.1917-21, 1988), NMR (HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition, Nader Rifai et al., P.609-623, AACC PRESS: The Fats of It can be measured by Life Summer 2002, L VDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No.3, p.15-16), and the specific gravity is analyzed by ultracentrifugation (Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, It can be determined based on p.59, 1990).
  • the small, dense LDL to be measured by the method of the present invention generally refers to a subfraction having a diameter of about 22.0 to about 25.5 nm and a specific gravity of 1.040 to 1.063 among the LDL fractions.
  • the reason why LDL is divided into subfractions according to size is that the smaller particle size of LDL is more prone to arteriosclerosis and the higher malignancy of LDL, so the smaller one of LDL is separately measured. Because it was necessary.
  • the diameter distribution and specific gravity distribution are continuous in LDL, and it is not possible to clearly distinguish those with a specific gravity of what degree or higher as having a particularly high degree of malignancy.
  • the above value of specific gravity 1.040 to 1.063 is not established as a characteristic of small, dense LDL, but the specific gravity range 1.019 to 1.063 of LDL, which is widely used and can be said to be an established value, is divided by the central point. .. For example, another report fractionates it from 1.044 to 1.060 (Atherosclerosis: 106 241-253 1994).
  • the range of the specific gravity of small, dense LDL varies slightly depending on the reporter, but the presence of small, dense LDL when sorted within that range is associated with clinical malignancy. ..
  • small, dense LDL refers to LDL having a smaller specific gravity and clinically having a higher arteriosclerosis-inducing property than other LDL, preferably from the center point of the specific gravity range of LDL. Those belonging to the above specific gravity range, more preferably LDL belonging to the specific gravity range of 1.044 to 1.063.
  • lipoproteins other than LDL refer to VLDL and HDL, and may also include chylomicrons, IDL (intermediate density lipoprotein), and VHDL (very high density lipoprotein).
  • the quantification kit of the present invention is used in a method for quantifying cholesterol in small and dense LDL in two steps.
  • the first reagent composition is used in the first step
  • the second reagent composition is used in the second step.
  • the first reagent composition in the small, dense LDL cholesterol quantification kit of the present invention contains cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and sphingomyelinase, and in the presence of cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, and sphingomyelinase activity, small, Dense Cholesterol in lipoproteins other than LDL is guided out of the reaction system.
  • the components of the first reagent composition for example, albumin, a buffer solution, a surfactant, a catalase, a peroxidase, a surfactant composed of a polyoxyethylene derivative, an electron donor, and the like can be used, but the components thereof are not limited thereto. ..
  • the second reagent composition in the small, dense LDL cholesterol quantification kit of the present invention contains a component for quantifying cholesterol in small, dense LDL.
  • the components of the second reagent composition differ depending on the first reagent composition, but are not particularly limited as long as they are components capable of quantifying cholesterol in small, dense LDL, and known substances can be used.
  • the second reagent composition for example, peroxidase, a polyoxyethylene derivative, and a coupler can be used, but the components are not limited thereto.
  • the method of the present invention consists of two steps, and in the first step, a surfactant that acts on LDL other than small, dense LDL (hereinafter sometimes referred to as Large LDL or LLDL) and other lipoproteins such as VLDL and HDL.
  • LDL small, dense LDL
  • LLDL Large LDL
  • VLDL and HDL lipoproteins
  • Is allowed to act on a sample sample in the presence of sphingomyelinase and cholesterol esterase, and cholesterol generated by release from lipoprotein is reacted with cholesterol oxidase to lead it out of the reaction system.
  • cholesterol in small, dense LDL remaining unreacted in the first step is quantified.
  • the method of the present invention is usually performed in an automated analyzer.
  • the electron donor and the coupler are coupled in the presence of peroxidase activity, and the absorbance at a specific wavelength is measured by the produced dye.
  • an iron complex is used as a reaction accelerator.
  • the coupler, the peroxidase activity, and the iron complex are present in the same reagent, there is a problem that the reagent gradually develops a natural color and affects the quantification of small and dense LDL cholesterol.
  • peroxidase activity is present means that peroxidase is present and a reaction catalyzed by peroxidase can occur.
  • peroxidase activity is present can also be referred to as “peroxidase is present”. The same applies to cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, catalase activity and sphingomyelinase activity.
  • the coupler, the peroxidase activity, and the iron complex are separately present in the first reagent composition used in the first step and in the second reagent composition used in the second step as follows.
  • the coupler is present in the first reagent composition used in the first step, and the peroxidase activity and the iron complex are present in the second reagent composition used in the second step.
  • the coupler and peroxidase activity are present in the first reagent composition, and the iron complex is present in the second reagent composition.
  • Peroxidase activity is present in the first reagent composition, and the coupler and iron complex are present in the second reagent composition.
  • the coupler and the iron complex are present in the first reagent composition, and the peroxidase activity is present in the second reagent composition.
  • Peroxidase activity and iron complex are present in the first reagent composition, and the coupler is present in the second reagent composition.
  • the iron complex is present in the first reagent composition, and the peroxidase activity and coupler are present in the second reagent composition. Further, preferably, the coupler and the electron donor are present separately in separate reagent compositions.
  • the kit of the present invention produces a first reagent product used in the step of guiding cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL to the outside of the reaction system, and a second reagent product used in the step of measuring cholesterol in small and dense LDL. Including things. In the step of guiding cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL to the outside of the reaction system, cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL is eliminated and the cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL is aggregated. Alternatively, known techniques such as inhibiting the reaction in a later step can be used.
  • the first step of scavenging cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL and leading it out of the reaction system is performed by any of the following methods.
  • Hydrogen peroxide generated by cholesterol esterase activity and cholesterol oxidase activity, and a method of forming colorless quinone in the presence of a coupler or an electron donor and (3) Decomposing hydrogen peroxide in the presence of catalase activity. , And at the same time forming a colorless quinone in the presence of a coupler or electron donor.
  • the catalase activity needs to be present in the first reagent composition for which the first step is carried out. Further, in the method (2) for forming a colorless quinone, at least one of a coupler and an electron donor needs to be present in the first reagent composition, and further, peroxidase activity is present in the first reagent composition. Must be. In the method (3) in which hydrogen peroxide is decomposed by the catalase activity and at the same time colorless quinone is formed in the presence of a coupler or an electron donor, the catalase activity and the peroxidase activity and the coupler or the electron donor are the first reagent composition. Must be present in the object.
  • the coupler used for the coupling reaction used in the present invention for example, 4-aminoantipyrine, aminoantipyrine derivative, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone, sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone and the like can be used. Not limited to these.
  • the electron donor used in the present invention is preferably an aniline derivative, and the aniline derivative is N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- ( 2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3- Examples include sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N- (3-sulfopropyl) aniline (HALPS), N- (3-sulfopropyl) -3-methoxy-5-aniline (HMMPS), etc. ..
  • the concentration of the electron donor used is preferably 0.1 to 8 mmol / L at the final concentration in the reaction solution.
  • iron complex used in the present invention examples include potassium ferrocyanide, sodium ferrocyanide, porphyrin iron complex, EDTA-iron complex and the like.
  • concentration of the iron complex is preferably 0.001 to 0.05 mmol / L.
  • sphingomyelinase include, but are not limited to, SPC (manufactured by Asahi Kasei Corporation), Sphingomyelinase from bacillus cereus, Sphingomyelinase from staphylococcus aureus (manufactured by SIGMA), and the like.
  • lipoproteins such as LLDL, VLDL, and HDL other than small and dense LDL
  • a surfactant that acts on lipoproteins other than small and dense LDL but does not react with small and dense LDL.
  • surfactants that act and react with lipoproteins other than small, density LDL include polyoxyethylene derivatives. Examples of the derivative include a nonionic surfactant selected from polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene polycyclic phenyl ether.
  • polyoxyethylene polycyclic phenyl ether examples include a polyoxyethylene benzyl phenyl derivative, a polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative, and a special phenol ethoxylate.
  • polyoxyethylene polycyclic phenyl ethers include Emulgen A-60, Emargen A-500, Emargen B-66, Emargen A-90 (manufactured by Kao Corporation), Newcol 703, Newcol 704, Newcol 706, New Call 707, New Call 708, New Call 709, New Call 710, New Call 711, New Call 712, New Call 714, New Call 719, New Call 723, New Call 729, New Call 733, New Call 740, New Call 747, New Call 780, New Call 610, New Call 2604, New Call 2607, New Call 2609, New Call 2614 (manufactured by Nippon Embroidery Co., Ltd.), Neugen EA-87, Neugen EA-137, Neugen EA-157, Neugen EA -167, Neugen EA-177, Neugen EA-197D, Neugen EA-207D (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Brown
  • the concentration of the surfactant in the reagent is preferably 0.3 to 5% (w / v), more preferably 0.5 to 3% (w / v).
  • the concentration in the reaction solution at the time of reaction is preferably 0.15 to 5%, more preferably 0.25 to 3% (w / v).
  • the surfactant in the reagent can be identified by a method of analyzing in combination with IR, NMR, LC-MS and the like. Examples of the method for confirming the ionicity (nonionic, anionic, cationic) of the surfactant include an extraction method using an organic solvent under acidic or alkaline conditions and a solid-phase extraction method. Examples of the method for determining the structure of the surfactant include a method of analysis using LC-MSMS and NMR.
  • cholesterol esterase is LDL, etc. in the presence of sphingomyelinase and a surfactant that reacts with lipoproteins other than small, dense LDL.
  • Cholesterol in these lipoproteins is guided to the outside of the reaction system by reacting and eliminating the generated cholesterol in the presence of an enzyme that reacts with cholesterol such as cholesterol oxidase.
  • the surfactant acts (reacts) means that the surfactant decomposes the lipoprotein and the cholesterol in the lipoprotein is released.
  • a surfactant that acts (reacts) on lipoproteins other than small and dense LDL it is not required that the surfactant does not act on small and dense LDL at all, and mainly lipo other than small and dense LDL. It only has to act on the protein.
  • "Erasing” means decomposing a substance in a sample to be sampled so that the decomposed product is not detected in the next step. That is, "to eliminate cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL” means to decompose lipoproteins other than small and dense LDL in the sample sample, and the cholesterol in these lipoproteins, which is the decomposition product, is used. It means that it is not detected in the subsequent process.
  • leading to the outside of the reaction system means HDL, VLDL, LLDL, etc. so that cholesterol contained in HDL, VLDL, LLDL, etc. does not affect the determination of cholesterol in small, dense LDL. It refers to eliminating and aggregating the contained cholesterol, and inhibiting it from reacting in a later step.
  • Cholesterol esterase and cholesterol oxidase are allowed to act in the presence of the above-mentioned surfactant to generate hydrogen peroxide from cholesterol, and the generated hydrogen peroxide is eliminated.
  • the cholesterol esterase concentration in the reaction solution is preferably about 0.010 to 10 U / mL.
  • cholesterol oxidase derived from bacteria or yeast can be used, and the concentration of cholesterol oxidase in the reaction solution is preferably about 0.1 to 0.7 U / mL.
  • the concentration of catalase in the reaction solution is preferably about 40 to 2500 U / mL.
  • the concentration of peroxidase in the reaction solution when converting hydrogen peroxide to colorless quinone is preferably 0.4 to 2.0 U / mL.
  • cholesterol in lipoproteins other than small, dense LDL reacts with cholesterol-reactive enzymes such as cholesterol oxidase and leads to the outside of the reaction system.
  • cholesterol-reactive enzymes such as cholesterol oxidase and leads to the outside of the reaction system.
  • cholesterol in lipoproteins such as VLDL and HDL other than LLDL and LDL is guided to the outside of the reaction system, and in the subsequent steps, only small and dense LDLs are contained in the reaction solution. Will remain.
  • cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL does not have to be completely eliminated. In that case, cholesterol in small and dense LDL is quantified.
  • a surfactant may be used so that cholesterol in small and dense LDL can be selectively measured.
  • the concentration in the reaction solution of the step of scavenging cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL of cholesterol esterase and leading it to the outside of the reaction system is preferably 0.01 U / mL to 10.0 U / mL, preferably 0.3 U / mL to 2.5 U / mL. Is more preferable, and 0.6 U / mL to 2.0 U / mL is particularly preferable.
  • the cholesterol esterase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that hydrolyzes cholesterol ester, and an animal or microorganism-derived cholesterol esterase can be used.
  • lipoprotein degrading enzyme can be optionally added to the reaction solution in the step of scavenging cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL.
  • lipoprotein lipase can be used as the lipoprotein degrading enzyme.
  • the lipoprotein lipase is not particularly limited as long as it is an enzyme having an ability to decompose lipoprotein, and lipoprotein lipase derived from an animal or a microorganism can be used.
  • the concentration of lipoprotein lipase in the reaction solution is preferably 0.01 to 10 U / mL, more preferably 0.01 to 5 U / mL, and particularly preferably 0.01 to 1 U / mL.
  • a conventionally used LDL quantification method can be used. For example, a method of quantifying the content of LDL-specific aggregates formed by adding an LDL flocculant by turbidimetric measurement, a method of using an antigen-antibody reaction with an LDL-specific antibody, and a method of quantifying degradation products using an enzyme. There is a way to do it. Of these, a method of quantifying decomposition products using an enzyme is preferable.
  • cholesterol measuring enzymes such as cholesterol esterase and cholesterol oxidase are added to release and decompose small, dense LDL cholesterol, and the reaction product is quantified.
  • a surfactant that acts on small, dense LDL may be used.
  • At least the surfactant that acts on small, dense LDL may be a surfactant that acts only on small, dense LDL, a surfactant that acts on other lipoproteins in addition to small, dense LDL, and all lipoproteins. It may be a surfactant that acts on.
  • a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer or a derivative thereof can be preferably used as a surfactant that acts only on small and dense LDL.
  • a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer or a derivative thereof for example, Pluronic 17R-4, Pluronic L-64, Pluronic PE3100, Pluronic P-85, Pluronic F-88, Pluronic P-103, Pluronic F-127, etc.
  • Pluronic (registered trademark) -based surfactants BASF, ADEKA
  • surfactant that acts on all lipoproteins examples include polyoxyethylene derivatives, and any surfactant used in commercially available reagents for measuring total cholesterol or the like can be used. Specific examples thereof include polyoxyethylene alkyl phenyl ether (Emargen 909 (Kao Corporation), TritonX100), polyoxyethylene alkyl ether (Emargen 707 (Kao Corporation), Emargen 709 (Kao Corporation)), and the like. Be done.
  • the concentration of the surfactant used in the step of quantifying small, dense LDL in the reaction solution is preferably about 0.01 to 10% (w / v), more preferably about 0.1 to 5% (w / v). Is.
  • the cholesterol esterase activity, cholesterol oxidase activity, sphingomyelinase activity, peroxidase activity, and catalase activity used in the present invention can be measured by the following methods.
  • a 6 mM cholesterol solution dissolved in isopropanol
  • a substrate solution dissolved in isopropanol
  • Add a diluent 0.1 M phosphate buffer, TritonX100, pH 7.0
  • heat 3 mL of the diluted solution at 37 ° C for 5 minutes and then add 0.05 mL of the substrate solution. ..
  • the mixed solution is reacted at 37 ° C.
  • the amount of change in absorbance at a wavelength of 240 nm is measured.
  • the amount of change in absorbance from 2 minutes to 7 minutes after the reaction at 37 ° C. was measured, and the cholesterol oxidase activity was calculated. If the enzyme activity per unit amount converted from the amount of change in absorbance measured as described above is 3 U / L or more, it can be said that the measurement target has cholesterol oxidase activity, in other words, it can be said that "cholesterol oxidase" is contained. ..
  • substrate 0.04% cholesterol linolenate, 1% TritonX100, 0.6% sodium cholate solution
  • enzyme diluent 20 mM phosphate buffer, 0.5 mM EDTA ⁇ 2Na, 2 mM) MgCl 2 , 0.2% BSA, pH 7.5
  • reaction solution 0.06% 4 aminoantipyrine, 0.4% phenol, 7.5 KU / L peroxidase
  • the measurement target After heating at 37 ° C for 2 minutes, add 0.1 mL of the measurement target diluted with the diluent, react the mixed solution at 37 ° C, and measure the amount of change in absorbance at a wavelength of 500 nm.
  • the amount of change in absorbance from 0 minute to 3.5 minutes was measured to calculate the cholesterol esterase activity. If the enzyme activity per unit amount converted from the amount of change in absorbance measured as described above is 8 U / L or more, it can be said that the measurement target has cholesterol esterase activity, in other words, it can be said that "cholesterol esterase" is contained. ..
  • reaction solution 0.008% sphingomyelin, 0.05% TritonX100 solution, 10U / mL alkaline phosphatase, 10U / mL cholesterol oxidase, 2U / mL peroxidase, 0.02% 4aminoantipyrine, 0.02% TODB mixture
  • reaction terminator 1% sodium dodecyl sulfate solution
  • a diluent 10 mM Tris buffer, 0.1% TritonX100, pH 8.0.
  • the reaction solution Mix 0.08 mL of the reaction solution and 0.003 mL of the measurement target diluted with the diluent, heat at 37 ° C for 5 minutes, and then add 0.16 mL of the reaction stop solution. After the reaction was stopped, the amount of change in absorbance at the main wavelength of 546 nm and the sub-wavelength of 700 nm was measured, and the sphingomyelinase activity was calculated. If the enzyme activity per unit amount converted from the amount of change in absorbance measured as described above is 2 U / L or more, it can be said that the measurement target has sphingomyelinase activity, in other words, "sphingomyelinase" is contained. It can be said that.
  • reaction solution 1 1.5 mM HDAOS, 0.05% TritonX100, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0
  • reaction solution 2 5 mM 4 aminoantipyrine, 0.05% TritonX100, 1% hydrogen peroxide, 50 mM phosphate buffer) Liquid, pH 7.0
  • dilute solution 50 mM phosphate buffer, pH 7.0
  • the peroxidase activity was calculated by measuring the amount of change in absorbance from 2 minutes to 5 minutes after the reaction at 37 ° C. If the enzyme activity per unit amount converted from the amount of change in absorbance measured as described above is 10 U / L or more, it can be said that the measurement target has peroxidase activity, in other words, it can be said that "peroxidase" is contained.
  • a substrate (0.06% hydrogen peroxide, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) is used for catalase activity measurement. After preheating 2.9 mL of the substrate solution at 25 ° C., it was mixed with 0.1 mL of the measurement target, and the amount of change in absorbance at 240 nm was measured. In the present invention, after the reaction at 25 ° C., the amount of change in absorbance from 0 to 3 minutes was measured to calculate the catalase activity. If the enzyme activity per unit amount converted from the amount of change in absorbance measured as described above is 100 U / L or more, it can be said that the measurement target has catalase activity, in other words, it can be said that "catalase" is contained.
  • monovalent cations and / or divalent cations or salts thereof are further added as an ionic strength modifier.
  • an ionic strength regulator small, dense LDL and LLDL can be easily differentiated.
  • sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, calcium chloride, lithium chloride, ammonium chloride, magnesium sulfate, potassium sulfate, lithium sulfate, ammonium sulfate, magnesium acetate and the like can be used.
  • the concentration of the ionic strength modifier during the reaction is preferably 0 to 100 mmol / L.
  • the step of scavenging cholesterol in LLDL and leading it to the outside of the reaction system and the reaction of scavenging cholesterol in lipoprotein other than LDL can also be added in the step of leading to the outside of the system.
  • polyanion to be added heparin, phosphotungstic acid, dextran sulfuric acid and the like can be preferably used.
  • the concentration of polyanion in the reagent is preferably 10 to 250 U / mL for heparin, 0.02 to 1.25% (w / v) for phosphotungstic acid, and 0.02 to 1.25% (w / v) for dextran sulfuric acid.
  • the concentrations in the reaction solution are preferably 5 to 250 U / mL, 0.01 to 1.25% (w / v), and 0.01 to 1.25% (w / v), respectively.
  • the enzyme in the reagent can also be identified by the following method. That is, the fragment peptide obtained by degrading the sample containing the target enzyme with trypsin is detected by a hybrid mass spectrometer. Proteins can be obtained by searching the database (for example, Mascot search) for the mass of the peptide obtained by mass spectrometry and the spectrum (MS / MS data) of fragment ions obtained by colliding with argon gas in the mass spectrometer. Can be identified. If the sequence of the fragment peptide derived from the amino acid sequence in the sample matches the amino acid sequence registered in the database as a unique sequence, it can be considered to contain the target enzyme.
  • a hybrid mass spectrometer for example, Mascot search
  • MS / MS data spectrum of fragment ions obtained by colliding with argon gas in the mass spectrometer.
  • the enzyme in the reagent can be identified by the following quantification. That is, among the fragment peptides obtained by degrading the target enzyme with trypsin, a peptide that is specific to the target enzyme and that gives a strong signal in mass spectrometry is selected as the peptide to be quantified. For the peptide to be quantified, an unlabeled peptide and a peptide labeled with a stable isotope as an internal standard are prepared by chemical synthesis.
  • a sample containing the target enzyme was completely digested with trypsin, a known amount of stable isotope-labeled peptide was added, and MRM mode (LC-MS / MS) was used by a triple quadrupole mass spectrometer (LC-MS / MS) connected to HPLC. Measure in multiple reaction monitoring mode).
  • MRM mode LC-MS / MS
  • LC-MS / MS triple quadrupole mass spectrometer
  • the reaction temperature in each step of the present invention is preferably 2 ° C to 45 ° C, more preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the reaction time is preferably 1 to 10 minutes for each step, and more preferably 3 to 7 minutes.
  • Serum and plasma can be used as the sample sample of the present invention, but the sample is not limited thereto.
  • Examples of the automatic analyzer used in the present invention include TBA-120FR / 200FR (Toshiba), JCA-BM1250 / 1650/2250 (JEOL), HITACHI7180 / 7170 (Hitachi), AU2700 / 5800/680 (OLYMPUS), cobas c501. ⁇ 701 (Roche) etc. can be mentioned.
  • the reaction is to eliminate cholesterol in lipoprotein other than small and dense LDL.
  • Reagents used in the step of leading to the outside of the system include sphingomyelinase that reacts with lipoproteins other than small and dense LDL.
  • hydrogen peroxide is further eliminated by either an enzyme that decomposes cholesterol such as cholesterol catalase or cholesterol oxidase, an electron donor or a coupler. Catalase or the like may be included.
  • Reagents used in the process of measuring small, dense LDL include surfactants that react only with small, dense LDL, surfactants that act on all lipoproteins, electron donors, or lipos other than small, dense LDL with couplers.
  • One that is not used in the step of scavenging cholesterol in the protein and leading it out of the reaction system can be included.
  • monovalent cations, divalent cations or salts thereof, or polyanions may be added to the first reagent or the second reagent, if necessary.
  • serum albumin may be contained in the first reagent or the second reagent.
  • the pH of each reagent composition is near neutral, for example, pH 6 to pH 8, preferably pH 6.5 to 7.5, and the pH may be adjusted by adding a buffer solution.
  • the method of the present invention is carried out in the order of the step of erasing cholesterol in lipoproteins other than small and dense LDL and leading it out of the reaction system, and the step of measuring small and dense LDL, lipo other than small and dense LDL is applied to the sample.
  • a reagent composition for scavenging cholesterol in protein may be added and reacted, then a reagent composition for measuring small, dense LDL may be added and reacted, and the absorbance may be measured.
  • the amount of the sample to be sample and the amount of each reagent composition are not limited and can be appropriately determined in consideration of the concentration of the reagent in each reagent composition, etc., but the amount is within a range applicable to the automatic analyzer. For example, 1 to 10 ⁇ L of the sample sample, 50 to 300 ⁇ L of the first reagent, and 25 to 200 ⁇ L of the second reagent may be used.
  • Comparative Example 1 A second reagent composition for performing the second step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. was prepared as follows.
  • Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L Coupler (4 aminoantipyrine) 4.0 mmol / L Peroxidase 5.0 U / mL Potassium ferrocyanide 0.11 mmol / L Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the second reagent composition was acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of the natural color development during storage was measured at a wavelength of 320 nm to 480 nm.
  • FIG. 1 shows absorption spectra immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks.
  • the reagent after accelerated storage at 37 ° C. for 1 to 2 weeks had a peak showing maximum absorption near 360 nm (the reagent was pale yellow).
  • 1 week of storage was equivalent to 1.5 years of refrigeration.
  • Comparative Example 2 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. was prepared as follows.
  • the first reagent composition was acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of the natural color development during storage was measured at a wavelength of 320 nm to 480 nm.
  • FIG. 2 shows the absorption spectra immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks. As shown in FIG. 2, the reagent after storage at 37 ° C. had a peak showing maximum absorption near 360 nm (the reagent was pale yellow).
  • Example 1 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. , And a second reagent composition for performing the second step was prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL Catalase 1200 U / mL 4-Aminoantipyrine 1.3 mmol / L Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 03% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L TOOS 6.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.11 mM Peroxidase 5.0 U / mL Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 3a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 3b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 2 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. , And a second reagent composition for performing the second step was prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL Peroxidase 1.7U / mL 4-Aminoantipyrine 1.3 mmol / L Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L TOOS 6.0 mmol / L Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v) Potassium ferrocyanide 0.11 mmol / L
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 4a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 4b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 3 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. , And a second reagent composition for performing the second step was prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL 4-Aminoantipyrine 1.3 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.04 mM Catalase 1200 U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L TOOS 6.0 mmol / L Sodium azide 0.05% (w / v) Peroxidase 5.0 U / mL Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 5a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 5b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 4 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. , And a second reagent composition for performing the second step was prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL Peroxidase 1.7U / mL TOOS 2.0 mmol / L Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v)
  • Second reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L 4-Aminoantipyrine 4.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.11 mM Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 5 A first reagent composition for performing the first step in a reagent for measuring small, dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small, dense LDL and the second step of measuring small, dense LDL cholesterol. , And a second reagent composition for performing the second step was prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL TOOS 2.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.04 mM Catalase 1200 U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L 4-Aminoantipyrine 4.0 mmol / L Peroxidase 5.0 U / mL Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • FIG. 7a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 7b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL TOOS 2.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.04 mM Peroxidase 1.7U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L 4-Aminoantipyrine 4.0 mmol / L Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 8a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 8b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 7 In the reagent composition for measuring small and dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small and dense LDL and the second step of measuring small and dense LDL cholesterol, the first reagent for performing the first step.
  • the composition and the second reagent composition for carrying out the second step were prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL 4-Aminoantipyrine 1.3 mmol / L Peroxidase 1.7U / mL Catalase 1200 U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L TOOS 6.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.11 mM Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 9a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 9b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 8 In the reagent composition for measuring small and dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small and dense LDL and the second step of measuring small and dense LDL cholesterol, the first reagent for performing the first step.
  • the composition and the second reagent composition for carrying out the second step were prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL TOOS 2.0 mmol / L Peroxidase 1.7U / mL Catalase 1200 U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L 4-Aminoantipyrine 4.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.11 mM Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 10a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 10b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 9 In the reagent composition for measuring small and dense LDL by the first step of eliminating cholesterol in lipoprotein other than small and dense LDL and the second step of measuring small and dense LDL cholesterol, the first reagent for performing the first step.
  • the composition and the second reagent composition for carrying out the second step were prepared as follows.
  • First reagent composition PIPES buffer pH 7.0 50 mmol / L Sphingolipiderinase 2.7 U / mL Cholesterol esterase 0.6U / mL Cholesterol oxidase 0.5U / mL TOOS 2.0 mmol / L Potassium ferrocyanide 0.04 mM Peroxidase 1.7U / mL Catalase 1200 U / mL Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether [Made by Kao] 0.3% (w / v) Second reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L 4-Aminoantipyrine 4.0 mmol / L Sodium azide 0.05% (w / v) Polyoxyethylene alkyl ether [Made by Kao] 1.0% (w / v)
  • the first reagent composition and the second reagent composition were acceleratedly stored at 37 ° C. for 1 or 2 weeks, and the absorption spectrum of 320 nm to 480 nm was measured for the natural color development during storage and compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 11a shows the absorption spectrum of the first reagent immediately after preparation and after accelerated storage at 37 ° C. for 1 or 2 weeks
  • FIG. 11b shows the absorption spectrum of the second reagent.
  • the peak showing the maximum absorption near 360 nm decreased and disappeared as compared with Comparative Examples 1 and 2.
  • the method of this example showed a good correlation with the method using small, density LDL cholesterol measurement reagent sd LDL-C "Seiken”.
  • kits and methods of the present invention allow the determination of cholesterol in small, dense LDL without compromising reagent stability. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

検体の前処理操作をすることなしに、自動分析装置を用いてsmall,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において、保管時の試薬の自然発色を抑える方法、およびこの方法に用いられる定量キット、ならびに調製方法の提供。　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、 （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、 （２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、 を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットであって、第１試薬組成物または第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼ活性を共存させないことを特徴とするキット。

Description

ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット
　本発明は、small,dense LDL中のコレステロール測定方法および試薬に関する。
　コレステロールは細胞の主要な構成成分の１つだが、過剰なコレステロールは血管の内皮細胞下でマクロファージに取り込まれることにより泡沫細胞が形成され、動脈硬化の初期病変を呈することから臨床的に重要な成分である。低比重リポ蛋白（LDL）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なLDLより高比重な、小粒子高比重LDLコレステロール（small,dense LDL中コレステロール）が特に重要であると言われている。血液中のsmall,dense LDL中コレステロール濃度が高い場合、一見すると外見上は健常人と全く変わらなく現状の健康状態を把握することは困難だが、10年後に心筋梗塞や脳卒中といったような重篤な動脈硬化性疾患を引き起こすリスクが高くなる。従って、将来重篤な動脈硬化性疾患を引き起こすリスクを予見するためsmall,dense LDL中コレステロールを分別測定することは極めて重要である。
　従来のsmall,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではない。NMRを用いてLDL粒子数やsd LDL-C粒子数を測定する方法があるが、NMR装置を必要とするため一般の病院検査室や検診センターにて測定することは難しい。
　自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子LDLを測定する方法（特許文献１を参照）がある。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、small,dense LDL中のコレステロールを測定することが出来ず、また特異性や精度が不十分であった。また、small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリアニオンと二価陽イオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬を組み合わせて測定する方法（特許文献２を参照）が知られている。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便にsmall,dense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れているが、検体を前処理しLDLをsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに分離する操作が必要であった。
　さらに自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としてsmall,dense LDL中のコレステロールの反応を抑制する反応液中で、small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを除去する工程と反応液に残存するsmall,dense LDL中のコレステロールを測定する方法（特許文献３を参照）、第１工程でスフィンゴミエリナーゼの存在下でsmall，dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去する工程と、第１工程で残存するリポ蛋白中のコレステロールを定量する方法（特許文献４を参照）、コレステロールエステラーゼおよびsmall，dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05～1.0g/Lの存在下で被検体試料中のsmall，dense LDL以外のリポ蛋白を消去する第１工程と、次いで前記第１工程で残存したsmall,dense LDL中コレステロールを定量する第２工程を含む、被検体試料中のsmall,dense LDL中コレステロール定量方法（特許文献５を参照）がある。
　small,dense LDL中コレステロールの測定キットとしては、第１工程でスフィンゴミエリナーゼ、第２工程でポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体またはHLBが11以上14未満のポリオキシエチレン誘導体である界面活性剤、４アミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼを含む試薬組成物がある（特許文献６を参照）。
　しかしながら、これらの検体前処理を行わずに自動分析装置を用いてsmall,dense LDL中コレステロールを定量する方法では第二試薬が時間の経過とともに自然に黄色に発色してくるという問題があり、そのため試薬の保存安定性に問題があった。
特開2003-28882号公報 国際公開第WO2004/053500号パンフレット 特許第5111389号公報 特許第5450080号公報 特許第5325093号公報 特許第5450080号公報
　本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、自動分析装置を用いてsmall,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において、保管時の試薬の自然発色を抑える方法、およびこの方法に用いられる定量キット、ならびに調製方法を提供することである。
　本発明者らは鋭意研究の結果、第１工程で用いる第一試薬、および第２工程で用いる第二試薬中に含まれる酵素、電子供与体、カップラー、鉄錯体の各成分の組み合わせをコントロールすることにより特に試薬中の自然発色を抑え試薬安定性が改善されることを見いだした。
　すなわち、small,dense LDL以外のLDL中のコレステロールを消去する第１の試薬組成物、およびsmall,dense LDL中コレステロールを定量する第２の試薬組成物において、カップラー、鉄錯体、ペルオキシダーゼを同一試薬組成物中に共存させることなく、特に、カップラーと鉄錯体を同一試薬組成物中に共存させることなく前記の成分を２つの試薬組成物中に分けて存在させることにより、試薬の自然発色を抑えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、
（２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、
を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットであって、第１試薬組成物および第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを共存させないことを特徴とするキット。
［２］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、
（２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、  
を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットであって、第１試薬組成物および第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラーおよび鉄錯体を共存させないことを特徴とするキット。
［３］第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびカップラーを含み、第２試薬組成物が、電子供与体、鉄錯体およびペルオキシダーゼ活性を含むことを特徴とする[１]または[２]のキット。
［４］第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性およびカップラーを含み、第２試薬組成物が、電子供与体および鉄錯体を含むことを特徴とする[１] または[２]のキット。
［５］第１試薬組成物がカタラーゼ活性、カップラーおよび鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、電子供与体およびペルオキシダーゼ活性を含むことを特徴とする[１]のキット。
［６］第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性および電子供与体を含み、第２試薬組成物が、カップラーおよび鉄錯体を含むことを特徴とする[１]のキット。
［７］第１試薬組成物がカタラーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカップラーを含むことを特徴とする[１]または[２]のキット。
［８］第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、カップラーを含むことを特徴とする[１]または[２]のキット。
［９］第１試薬組成物が、さらにカタラーゼ活性を含むことを特徴とする[４]、[６]および[８]のいずれかのキット。
［１０］第１試薬組成物が、さらにsmall,dense LDL以外のリポタンパクに作用する界面活性剤を含み、第２試薬組成物がさらに少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を含むことを特徴とする[１]から[９]のいずれかのキット。
［１１］第１試薬組成物に含まれる界面活性剤がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルを含むことを特徴とする［１０］のキット。
［１２］ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルがポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体および/またはポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体を含むことを特徴とする［１１］のキット。
［１３］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法であって、
（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導く第１工程と、
（２）前記第１工程で残存するリポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程、
を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量方法であって、（１）または（２）いずれかの工程においてカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを同時に用いないことを特徴とする定量方法。
［１４］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法であって、
（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導く第１工程と、
（２）前記第１工程で残存するリポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程、
を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量方法であって、（１）または（２）いずれかの工程においてカップラーおよび鉄錯体を同時に用いないことを特徴とする定量方法。
［１５］第１工程でカタラーゼ活性およびカップラーを用い、第２工程で、電子供与体、鉄錯体およびペルオキシダーゼ活性を用いることを特徴とする[１３]または[１４]の定量方法。
［１６］第１工程でペルオキシダーゼ活性およびカップラーを用い、第２工程で、電子供与体および鉄錯体を用いることを特徴とする[１３] または[１４]の定量方法。
［１７］第１工程でカタラーゼ活性、カップラーおよび鉄錯体を用い、第２工程で、電子供与体およびペルオキシダーゼ活性を用いることを特徴とする[１３]の定量方法。
［１８］第１工程でペルオキシダーゼ活性および電子供与体を用い、第２工程で、カップラーおよび鉄錯体を用いることを特徴とする[１３]の定量方法。
［１９］第１工程でカタラーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を用い、第２工程で、ペルオキシダーゼ活性およびカップラーを用いることを特徴とする[１３]または[１４]の定量方法。
［２０］第１工程でペルオキシダーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を用い、第２工程で、カップラーを用いることを特徴とする[１３]または[１４]の定量方法。
［２１］第１工程でさらにカタラーゼ活性を用いることを特徴とする[１４]、[１８]および[２０]のいずれかの定量方法。
［２２］第１工程で、さらにsmall,dense LDL以外のリポタンパクに作用する界面活性剤を用い、第２工程で、さらに少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を用いることを特徴とする[１３]から[２１]のいずれかの定量方法。
［２３］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を含む第１試薬組成物と、
（２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、の
被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットの製造における使用であって、第１試薬組成物または第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを共存させないことを特徴とする、使用。
［２４］small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
（１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を含む第１試薬組成物と、
（２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、の
被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットの製造における使用であって、第１試薬組成物または第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラーおよび鉄錯体を共存させないことを特徴とする、使用。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-164403号の開示内容を包含する。
　本発明により、small,dense LDL中コレステロールを他のコレステロールと分けて分別測定する場合において、２つの試薬の保存中の自然発色を抑え、安定性が改善され安定してsmall,dense LDL中コレステロールを定量する方法、およびこの方法に用いられる定量キットおよびこの方法を実施するための製造方法が提供される。
比較例１における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 比較例２における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例１における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例１における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例２における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例２における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例３における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例３における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例４における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例４における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例５における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例５における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例６における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例６における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例７における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例７における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例８における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例８における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例９における第１試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。 実施例９における第２試薬組成物の調製直後および保存後の吸収スペクトルを示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　リポ蛋白は大きくVLDL、LDLおよびHDLの分画に分けられ、LDLはさらにsmall,dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。small,dense LDLを小粒子LDL 、SLDL(small LDL)、dense LDL、sd LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外のLDLをL LDL(large LDL)、Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm～80nm（30nm～75nm）で、LDLが22nm～28nm(19nm～30nm)、HDLが直径７～10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019～1.063、HDLが1.063～1.21である。LDL粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（GGE）(JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、NMR（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、 Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS：The Fats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重は超遠心分離による分析(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。
　本発明の方法で測定しようとするsmall,dense LDLは、一般的にはLDL画分のうち直径が約22.0～約25.5nmの亜分画、比重1.040～1.063の亜分画を指す。LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、LDLの中でもより悪性度が高いので、LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重1.040～1.063という値もsmall,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるLDLの比重範囲1.019～1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では1.044～1.060に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のsmall,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。
　本発明において、small,dense LDLという場合、LDLのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のLDLよりも大きいもの、好ましくはLDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重1.044～1.063の範囲に属するLDLをいう。また、LDL以外のリポ蛋白という場合、VLDL、HDLを指し、さらにカイロミクロン、IDL(intermediate density lipoprotein)、VHDL(very high density lipoprotein)を含めることもある。
　本発明の定量キットは、small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いられる。本発明の定量キットにおいて、第１試薬組成物は第１工程に用いられ、第２試薬組成物は第２工程に用いられる。
　本発明のsmall,dense LDL中コレステロール定量キットにおける第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼを含み、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下で、small,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導く。
　第１試薬組成物の成分としては、例えばアルブミン、緩衝液、界面活性剤、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ポリオキシエチレン誘導体からなる界面活性剤、電子供与体、等を用いることができるが、これらに限定されない。
　本発明のsmall,dense LDL中コレステロール定量キットにおける第２試薬組成物は、small,dense LDL中コレステロールを定量するための成分を含む。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物によって異なるが、small,dense LDL中コレステロールを定量できる成分であれば特に限定されず、公知の物質を用いることができる。
　第２試薬組成物の成分としては、例えばペルオキシダーゼ、ポリオキシエチレン誘導体、カップラーを用いることができるが、これらに限定されない。
　本発明の方法は２工程からなり、第１工程において、small,dense LDL以外のLDL（以下Large LDL又はL LDLという場合がある）やその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤を、スフィンゴミエリナーゼおよびコレステロールエステラーゼの存在下で被検体試料に作用させ、リポ蛋白からの遊離により生じたコレステロールをコレステロールオキシダーゼと反応させ反応系外へ導く。さらに、第２工程において、第１工程で反応せずに残存したsmall,dense LDL中のコレステロールを定量する。
　本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。
　本発明の方法では、small, dense LDLコレステロールの濃度を定量する際に、電子供与体とカップラーをペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応させ、生成した色素により特定波長の吸光度を測定する。その際反応促進剤として鉄錯体が使用される。しかしながら、カップラーとペルオキシダーゼ活性、鉄錯体が同一試薬中に存在すると、試薬が徐々に自然発色し、small,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼすという問題があった。そこで、本発明ではカップラーとペルオキシダーゼ活性、鉄錯体のうち、いずれかを別の試薬に存在させることにより試薬の自然発色を抑え安定化させる事が可能となった。ここで、「ペルオキシダーゼ活性が存在する」とは、ペルオキシダーゼが存在し、ペルオキシダーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。「ペルオキシダーゼ活性が存在する」という語を「ペルオキシダーゼが存在する」ということもできる。コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性やスフィンゴミエリナーゼ活性についても同様である。
　本発明の方法においては、カップラー、ペルオキシダーゼ活性、および鉄錯体を第１工程で用いる第１試薬組成物中と第２工程で用いる第２試薬組成物中に以下のように分離して存在させる。
（１）第１工程で用いる第１試薬組成物中にカップラーを存在させ、ペルオキシダーゼ活性および鉄錯体を第２工程で用いる第２試薬組成物中に存在させる。
（２）第１試薬組成物中にカップラーおよびペルオキシダーゼ活性を存在させ、鉄錯体を第２試薬組成物中に存在させる。
（３）第１試薬組成物中にペルオキシダーゼ活性を存在させ、カップラーおよび鉄錯体を第２試薬組成物中に存在させる。
（４）第１試薬組成物中にカップラーおよび鉄錯体を存在させ、ペルオキシダーゼ活性を第２試薬組成物中に存在させる。
（５）第１試薬組成物中にペルオキシダーゼ活性および鉄錯体を存在させ、カップラーを第２試薬組成物中に存在させる。
（６）第１試薬組成物中に鉄錯体を存在させ、ペルオキシダーゼ活性およびカップラーを第２試薬組成物中に存在させる。
　さらに、好ましくは、カップラーと電子供与体は別々の試薬組成物中に分離して存在させる。
　以下各工程について詳述する。
　本発明のキットは、small, dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを反応系外に導く工程で用いる第１の試薬生成物、およびsmall,dense LDL中コレステロールを測定する工程で用いる第２試薬生成物を含む。
　small, dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを反応系外に導く工程では、small, dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く、small, dense LDL以外のリポ蛋白中を凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
　第１工程である、small, dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く工程は以下のいずれかの方法で行われる。
（１）これらのリポ蛋白中コレステロールよりコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により過酸化水素を生成させ、カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を水と酸素に分解させる方法、
（２）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびにカップラーもしくは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法、ならびに
（３)カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させ、かつ同時にカップラーまたは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法。
　（１）のカタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させる方法では第１工程を実施する第１試薬組成物中にカタラーゼ活性が存在する必要がある。また、（２）の無色キノンを形成させる方法では少なくともカップラー、電子供与体の一方が第１試薬組成物中に存在している必要があり、さらにペルオキシダーゼ活性が第１試薬組成物中に存在している必要がある。（３）のカタラーゼ活性により過酸化水素を分解させ、かつそれと同時にカップラーまたは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法では、カタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性ならびにカップラーもしくは電子供与体が第１試薬組成物中に存在している必要がある。
　本発明で用いるカップリング反応に用いるカップラーとしては例えば4－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン等を用いることができるが、これらに限定されない。
　本発明で用いる電子供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN－エチル－N－（2－ヒドロキシ－3－スルホプロピル）－3－メチルアニリン（TOOS）、N－エチル－N－（2－ヒドロキシ－3－スルホプロピル）－3，5－ジメチルアニリン（MAOS）、N－エチル－N－（3－スルホプロピル）－3－メチルアニリン（TOPS）、N－（2－ヒドロキシ－3－スルホプロピル）－3，5－ジメトキシアニリン（HDAOS）、N－（3－スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N－（3－スルホプロピル）－3－メトキシ－5－アニリン（HMMPS）等があげられる。電子供与体の使用濃度は反応液中の最終濃度で0.1～8mmol/Lが好ましい。
　本発明に用いる鉄錯体としてフェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、ポルフィリン鉄錯体、EDTA-鉄錯体等があげられる。鉄錯体の濃度としては0.001～0.05mmol/Lが望ましい。
　本発明の方法のsmall，dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去し、反応系外に導くための工程においてはスフィンゴミエリナーゼおよびポリオキシエチレン誘導体からなる界面活性剤を用いる。さらに本発明では、上記スフィンゴミエリナーゼ活性の試薬中濃度は0.1～100U/mLが好ましく、0.2～20U/mLがより好ましい。反応時の反応液中の濃度は、0.05～100U/mLが好ましく、0.1～20U/mLがより好ましい。スフィンゴミエリナーゼの好ましい具体例としては、SPC（旭化成社製）、Sphingomyelinase from bacillus cereus、Sphingomyelinase from staphylococcus aureus （SIGMA社製）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　small,dense LDL以外のL LDL、VLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを消去する工程ではsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用するがsmall,dense LDLとは反応しない界面活性剤の存在下でsmall,dense LDL以外のリポ蛋白コレステロールを消去する。small,dense LDL以外のリポタンパクに作用反応する界面活性剤として、ポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。誘導体の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、から選択される非イオン界面活性剤を挙げることができる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの好ましい例として、ポリオキシエチレンベンジルフェニル誘導体やポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体、特殊フェノールエトキシレートが挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの具体例として、エマルゲンA-60、エマルゲンA-500、エマルゲンB-66、エマルゲンA-90（以上花王社製）、ニューコール703、ニューコール704、ニューコール706、ニューコール707、ニューコール708、ニューコール709、ニューコール710、ニューコール711、ニューコール712、ニューコール714、ニューコール719、ニューコール723、ニューコール729、ニューコール733、ニューコール740、ニューコール747、ニューコール780、ニューコール610、ニューコール2604、ニューコール2607、ニューコール2609、ニューコール2614（以上日本乳化剤社製）、ノイゲンEA-87、ノイゲンEA-137、ノイゲンEA-157、ノイゲンEA-167、ノイゲンEA-177、ノイゲンEA-197D、ノイゲンEA-207D（以上第1工業製薬社製）、ブラウノンDSP-9、ブラウノンDSP-12.5、ブラウノンTSP-7.5、ブラウノンTSP-16、ブラウノンTSP-50（以上青木油脂社製）等があげられる。界面活性剤の試薬中濃度は0.3～5％(w/v)が好ましく、0.5～3％(w/v)がより好ましい。反応時の反応液中の濃度は、0.15～5％が好ましく、0.25～3％(w/v)がより好ましい。なお、試薬中の界面活性剤は、IR、NMR、LC-MS等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。界面活性剤のイオン性（非イオン性、陰イオン性、陽イオン性）を確認する方法としては、酸性またはアルカリ性条件での有機溶媒による抽出法、固相抽出法があげられる。界面活性剤の構造を決定する方法としてはLC-MSMS、NMRを用いて解析する方法があげられる。
　上記small，dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを消去する工程においては、スフィンゴミエリナーゼおよび前記small,dense LDL以外のリポタンパクに作用反応する界面活性剤の存在下で、コレステロールエステラーゼがL LDL等に作用し、生じたコレステロールを、コレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素の存在下で反応させ消去することにより、これらリポタンパク中のコレステロールを反応系外へ導く。ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポ蛋白を分解し、リポ蛋白中のコレステロールが遊離することをいう。例えば「small，dense LDL以外のリポ蛋白に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がsmall，dense LDLに全く作用しないことは要求されず、主にsmall，dense LDL以外のリポ蛋白に作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「small，dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のsmall，dense LDL以外のリポ蛋白を分解し、その分解産物であるこれらリポ蛋白中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。
　本発明において、「反応系外に導く」とは、HDLやVLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDL中コレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、L LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。
　上記界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させコレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素は消去される。反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は0.010～10U/mL程度が好ましい。また、コレステロールオキシダーゼは細菌や酵母由来のものを用いることができ、反応液中のコレステロールオキシダーゼの濃度は0.1～0.7U/mL程度が好ましい。さらに、カタラーゼの反応液中の濃度は40～2500U/mL程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合の反応液中のペルオキシダーゼの濃度は0.4～2.0U/mLが好ましい。
　small,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去する工程において、上記界面活性剤およびコレステロールエステラーゼと作用・反応したリポ蛋白中のコレステロールはコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール反応酵素と反応させ反応系外へ導くことができる。このような反応により、L LDLやLDL以外のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを反応系外へ導くことにより、その後の工程においては、反応液中にリポ蛋白としてはsmall,dense LDLのみが残存することになる。本発明においては、このようにsmall,dense LDL以外のリポ蛋白を消去し、反応系外へ導き、その後の工程でsmall,dense LDL以外のリポ蛋白のコレステロールを検出できないようにすることを、「small,dense LDLとそれ以外のリポ蛋白を差別化する」ということがある。
　またsmall,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去する工程ではsmall,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールが完全に消去されていなくても良いが、その場合はsmall,dense LDL中コレステロールを定量する工程において、small,dense LDL中コレステロールが選択的に測定されるような界面活性剤を用いれば良い。
　コレステロールエステラーゼのsmall,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去し反応系外に導く工程の反応液中の濃度として0.01 U/mL～10.0 U/mLが好ましく、0.3 U/mL～2.5U/mLがさらに好ましく、0.6 U/mL～2.0 U/mLが特に好ましい。本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。
　small,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去する工程の反応液中には、各種リポ蛋白に対する作用を調整するために、任意的にリポ蛋白分解酵素を加えることもできる。リポ蛋白分解酵素としては、リポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼの反応液中の濃度は0.01～10U/mLが好ましく、0.01～5U/mLがさらに好ましく、0.01～1U/mLが特に好ましい。
　本発明では上記small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを反応系外に導く工程において反応せずに残存したsmall,dense LDL中のコレステロールをその後の第２工程で定量する。この定量工程では従来から用いられているLDLの定量方法を用いることができる。例えば、LDL凝集剤を添加して形成されたLDL特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、LDL特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。
　該方法においては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素を加えてsmall,dense LDLのコレステロールを遊離・分解し、その反応生成物を定量する。この定量工程の際、small,dense LDL中のコレステロールを定量するために、少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を用いればよい。少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤とはsmall,dense LDLのみに作用する界面活性剤でもよいし、small,dense LDL以外に他のリポ蛋白にも作用する界面活性剤、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
　small,dense LDLのみに作用する界面活性剤としてはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を好適に用いることができる。ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプルロニック17R-4、プルロニックL-64、プルロニックPE3100、プルロニックP-85、プルロニックF-88、プルロニックP-103、プルロニックF-127等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（BASF社、ADEKA社）などが挙げられる。
　全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤としては、ポリオキシエチレン誘導体をあげることができ、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤であればどれでも使用することができる。具体的には、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（エマルゲン909（花王社製）、TritonX100）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（エマルゲン707（花王社製）、エマルゲン709（花王社製））、等が挙げられる。
　small,dense LDLを定量する工程で用いられる界面活性剤の反応液中の濃度は、好ましくは0.01～10％（w/v）程度であり、さらに好ましくは0.1～5%（w/v）程度である。
　本発明で用いるコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性は以下の方法にて測定できる。コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として6mMコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を2-4U/mLとなるように希釈液（0.1M リン酸緩衝液、TritonX100、pH7.0）を加え、希釈後の溶液3mLを37℃5分加温後に基質液0.05mLを加える。その後、混合液を37℃で反応させ波長240nm吸光度変化量を測定する。本発明では37℃反応後、2分から7分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出した。上記のとおり測定した吸光度変化量から換算した単位量あたりの酵素活性が3U/L以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在すると言え、言い換えれば、「コレステロールオキシダーゼ」が含まれているといえる。
　コレステロールエステラーゼ活性測定では、基質（0.04%リノレン酸コレステロール、1%TritonX100、0.6%コール酸ナトリウム溶液）、300U/mLコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（20mMリン酸緩衝液、0.5mM EDTA・2Na、2mM MgCl2、0.2% BSA、pH7.5）、反応液（0.06% 4アミノアンチピリン、0.4% フェノール、7.5KU/L ペルオキシダーゼ）を用いる。反応液1.75mLと基質液1.0mLを混合後、37℃で5分加温し、0.1mLコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。37℃、2分加温後に希釈液で希釈した測定対象0.1mLを加え、混合液を37℃で反応させ波長500nmの吸光度変化量を測定する。本発明では37℃反応後、0分から3.5分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出した。上記のとおり測定した吸光度変化量から換算した単位量あたりの酵素活性が8U/L以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在すると言え、言い換えれば、「コレステロールエステラーゼ」が含まれているといえる。
　スフィンゴミエリナーゼ活性測定では、反応液（0.008% スフィンゴミエリン、0.05% TritonX100溶液、10U/mL アルカリ性フォスファターゼ、10U/mL コレステロールオキシダーゼ、2U/mL ペルオキシダーゼ、0.02% 4アミノアンチピリン、0.02% TODB混合液）、反応停止液（1% ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（10mM トリス緩衝液、0.1% TritonX100、pH8.0）を用いる。反応液0.08mLと希釈液で希釈した測定対象0.003mL を混合し37℃で5分加温後に反応停止液0.16mLを加える。反応停止後に主波長546nm、副波長700nmの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出した。上記のとおり測定した吸光度変化量から換算した単位量あたりの酵素活性が2U/L以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在すると言え、言い換えれば、「スフィンゴミエリナーゼ」が含まれているといえる。
　ペルオキシダーゼ活性測定では反応液１（1.5mM HDAOS、0.05% TritonX100、50mM リン酸緩衝液、pH7.0）、反応液２（5mM 4アミノアンチピリン、0.05% TritonX100、1% 過酸化水素、50mMリン酸緩衝液、pH7.0）、希釈液（50mM リン酸緩衝液、pH7.0）を用いる。0.3mLの反応液１と希釈液で希釈した測定対象0.08mLを混合し37℃で5分加温する。その後0.1mLの反応液２を加え、37℃で反応させ主波長600nm、副波長700nmの吸光度変化量を測定する。本発明では37℃反応後、2分から5分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出した。上記のとおり測定した吸光度変化量から換算した単位量あたりの酵素活性が10U/L以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在すると言え、言い換えれば、「ペルオキシダーゼ」が含まれているといえる。
　カタラーゼ活性測定では基質（0.06% 過酸化水素、50mM リン酸緩衝液、pH7.0）を用いる。基質溶液2.9mLを25℃で予備加温後、測定対象0.1mLと混合し、240nmにおける吸光度変化量を測定した。本発明では25℃反応後、0分から3分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出した。上記のとおり測定した吸光度変化量から換算した単位量あたりの酵素活性が100U/L以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在すると言え、言い換えれば、「カタラーゼ」が含まれているといえる。
　本発明の方法のsmall,dense LDL以外のリポタンパク中コレステロールを消去し反応系外に導く工程において、イオン強度調整剤として1価の陽イオンおよび／または2価の陽イオンまたはそれらの塩をさらに用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、small,dense LDLとL LDLを差別化しやすくなる。具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。イオン強度調整剤の反応時の濃度は0～100mmol／Lが好ましい。
　さらに本発明ではsmall，dense LDLとL LDLに対するスフィンゴミエリナーゼの触媒活性を調整するためにL LDL中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程およびLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し反応系外に導く工程においてポリアニオンを添加することもできる。添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。試薬中のポリアニオンの濃度はヘパリンの場合10～250U/mL、リンタングステン酸の場合0.02～1.25%(w/v)、デキストラン硫酸の場合0.02～1.25%(w/v)が好ましい。反応液中の濃度は、それぞれ5～250U/mL、0.01～1.25%(w/v)、0.01～1.25%(w/v)が好ましい。
　なお、試薬中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（MS/MSデータ）をデータベース検索（例えばMascot サーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試料中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいると見なせる。
　また、試薬中の酵素は以下の定量で同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、HPLC に接続した三連四重極型質量分析計（LC-MS／MS）によりMRMモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。
　本発明の各工程における、反応温度は2℃～45℃で行うことが好ましく、25℃～40℃で行うことがさらに好ましい。
　反応時間は各工程とも1～10分間で行うことが好ましく、3～7分で行うことがさらに好ましい。
　本発明の被検体試料としては、血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明で用いる自動分析装置として、例えば、TBA-120FR・200FR(東芝)、JCA-BM1250・1650・2250（日本電子）、HITACHI7180・7170（日立）、AU2700・5800・680（OLYMPUS）、cobas c501・701（Roche）等が挙げられる。
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く工程、small,dense LDLを測定する工程の２つの工程がある場合、small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く工程に用いる試薬には、small,dense LDL以外のリポ蛋白に反応するスフィンゴミエリナーゼが含まれる。small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する試薬組成物には、さらに、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、電子供与体またはカップラーのいずれか一方、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含ませればよい。small,dense LDLを測定する工程に用いる試薬には、small,dense LDLのみに反応する界面活性剤もしくは全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤、電子供与体またはカップラーでsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く工程で用いられていない一方を含ませることができる。この際、第１試薬または第２試薬には、必要に応じて、１価の陽イオン、２価の陽イオンもしくはそれらの塩、またはポリアニオンを添加してもよい。また、第１試薬または第２試薬には、血清アルブミンが含まれていてもよい。各試薬組成物のpHは、中性付近、例えばpH6～pH8、好ましくはpH6.5～7.5であり、緩衝液を添加してpHを調整すればよい。
　本発明の方法をsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し反応系外に導く工程、small,dense LDLを測定する工程の順で行う場合、被検体試料にsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去させる試薬組成物を添加し反応させ、次いでsmall,dense LDLを測定させる試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することにより行えばよい。
　被検体試料の量、各試薬組成物の量は限定されず、各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。例えば、被検体試料１～10μL、第１試薬50～300μL、第２試薬25～200μLを用いればよい。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
　下記実施例および比較例で用いる成分は以下のとおりである。
　下記実施例および比較例において、吸収スペクトルの測定には、HITACHI 社製のU-3900を用いた。
比較例１
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
カップラー（4アミノアンチピリン）　　　　　　　　　　 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0U/mL
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mmol/L
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長320nm～480nmの吸収スペクトルを測定した。
　図１に調製直後、ならびにおよび３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す。図１に示すように３７℃にて1、２週間加速保存後の試薬は、360nm付近に極大吸収を示すピークが発生（試薬が淡黄色）した。37℃加速では１週間の保存が冷蔵1.5年間の保存と同等であった。
比較例２
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
カップラー（4アミノアンチピリン）　　　　　　　　　　 1.3mmol/L
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
フェロシアン化カリウム 　　　　　　　　　　　　　　　 0.04mmol/L
ポリオキシエチレン誘導体［花王製］　　　　　　　　　　0.3%(w/v)
　第１試薬組成物を３７℃にて1週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長320nm～480nmの吸収スペクトルを測定した。
　図２に調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す。図２に示すように、３７℃保存後の試薬は、360nm付近に極大吸収を示すピークが発生（試薬が淡黄色）した。
実施例１
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　1.3mmol/L
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　03%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mM
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0U/mL
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図３aに調製直後、ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図３bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図３a、図３bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例２
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　1.3mmol/L
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6.0mmol/L
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mmol/L
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図４aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図４bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図４a、図４bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例３
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　1.3mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.04mM
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6.0mmol/L
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0U/mL
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図５aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図５bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図５a、図５bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例４
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.0mmol/L
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mM
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図６aに調製直後ならびに３７℃にて１週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図６bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図６a、図６bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例５
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.04mM
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0U/mL
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図７aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図７bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図７a、図７bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例６
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬組成物において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.04mM
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mmol/L
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図８aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図８bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図８a、図８bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例７
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬組成物において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　1.3mmol/L
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mM
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図９aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図９bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図９a、図９bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例８
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬組成物において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.0mmol/L
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.11mM
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図１０aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図１０bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図１０a、図１０bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
実施例９
　small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールを消去する第１工程、およびsmall，dense LDLコレステロールを測定する第２工程によりsmall,dense LDLを測定する試薬組成物において、第１工程を行う第１試薬組成物、および第２工程を行う第２試薬組成物を以下のように調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　2.7U/mL
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　0.5U/mL
TOOS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.0mmol/L
フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　0.04mM
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.7U/mL
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1200U/mL
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル［花王製］　　　0.3%(w/v)
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0　　　　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mmol/L
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05%(w/v)
ポリオキシエチレンアルキルエーテル［花王製］　　　　　1.0%(w/v)
　第１試薬組成物および第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について320nm～480nmの吸収スペクトルを測定し、比較例１、２と比較した。
　図１１aに調製直後ならびに３７℃にて1週間もしくは２週間加速保存した後の第１試薬の吸収スペクトルを、図１１bに第２試薬の吸収スペクトルを示す。図１１a、図１１bに示すように、比較例１、２に比べ360nm付近の極大吸収を示すピークが減少、消失した。
検証１
　実施例１から実施例９までの定量キットを用いてsmall，dense LDLコレステロールを測定した。比較対象法として、デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-EX「生研」を用いた。small,dense LDLコレステロール濃度を比較した。結果として、同じサンプルに対する、各実施例のsmall,dense LDL中コレステロールの測定結果とsd LDL-EX「生研」の測定結果の相関係数を表１に示す。
　表１に示すように、本実施例の方法はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬sd LDL-C「生研」を用いた方法と良好な相関関係を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この検証結果から、本発明の定量キットにより、ｓｄ ＬＤＬ中コレステロールが良好に検出できることが分かる。
　本発明のキットおよび方法により、試薬の安定性を損なうことなくsmall,dense LDL中コレステロールを定量することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (24)

  1. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、
    （２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、
    を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットであって、第１試薬組成物および第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを共存させないことを特徴とするキット。
  2. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、
    （２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、  
    を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットであって、第１試薬組成物および第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラーおよび鉄錯体を共存させないことを特徴とするキット。
  3. 　第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびカップラーを含み、第２試薬組成物が、電子供与体、鉄錯体およびペルオキシダーゼ活性を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  4. 　第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性およびカップラーを含み、第２試薬組成物が、電子供与体および鉄錯体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  5. 　第１試薬組成物がカタラーゼ活性、カップラーおよび鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、電子供与体およびペルオキシダーゼ活性を含むことを特徴とする請求項１記載のキット。
  6. 　第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性および電子供与体を含み、第２試薬組成物が、カップラーおよび鉄錯体を含むことを特徴とする請求項１記載のキット。
  7. 　第１試薬組成物がカタラーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカップラーを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  8. 　第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を含み、第２試薬組成物が、カップラーを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  9. 　第１試薬組成物が、さらにカタラーゼ活性を含むことを特徴とする請求項４、６および８のいずれか１項に記載のキット。
  10. 　第１試薬組成物が、さらにsmall,dense LDL以外のリポタンパクに作用する界面活性剤を含み、第２試薬組成物がさらに少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載のキット。
  11. 　第１試薬組成物に含まれる界面活性剤がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルを含むことを特徴とする請求項１０記載のキット。
  12. 　ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルがポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体および／またはポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体を含むことを特徴とする請求項１１記載のキット。
  13. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法であって、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導く第１工程と、
    （２）前記第１工程で残存するリポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程、
    を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量方法であって、（１）または（２）いずれかの工程においてカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを同時に用いないことを特徴とする定量方法。
  14. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法であって、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導く第１工程と、
    （２）前記第１工程で残存するリポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程、
    を含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量方法であって、（１）または（２）いずれかの工程においてカップラーおよび鉄錯体を同時に用いないことを特徴とする定量方法。
  15. 　第１工程でカタラーゼ活性およびカップラーを用い、第２工程で、電子供与体、鉄錯体およびペルオキシダーゼ活性を用いることを特徴とする請求項１３または１４に記載の定量方法。
  16. 　第１工程でペルオキシダーゼ活性およびカップラーを用い、第２工程で、電子供与体および鉄錯体を用いることを特徴とする請求項１３または１４に記載の定量方法。
  17. 　第１工程でカタラーゼ活性、カップラーおよび鉄錯体を用い、第２工程で、電子供与体およびペルオキシダーゼ活性を用いることを特徴とする請求項１３記載の定量方法。
  18. 　第１工程でペルオキシダーゼ活性および電子供与体を用い、第２工程で、カップラーおよび鉄錯体を用いることを特徴とする請求項１３記載の定量方法。
  19. 　第１工程でカタラーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を用い、第２工程で、ペルオキシダーゼ活性およびカップラーを用いることを特徴とする請求項１３または１４に記載の定量方法。
  20. 　第１工程でペルオキシダーゼ活性、電子供与体および鉄錯体を用い、第２工程で、カップラーを用いることを特徴とする請求項１３または１４に記載の定量方法。
  21. 　第１工程でさらにカタラーゼ活性を用いることを特徴とする請求項１４、１８および２０のいずれか１項に記載の定量方法。
  22. 　第１工程で、さらにsmall,dense LDL以外のリポタンパクに作用する界面活性剤を用い、第２工程で、さらに少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を用いることを特徴とする請求項１３から２１のいずれか１項に記載の定量方法。
  23. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を有し、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性の存在下でsmall,dense LDL以外のリポタンパク中のコレステロールを反応系外に導くための第１試薬組成物と、
    （２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、の
    被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットの製造における使用であって、第１試薬組成物または第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラー、鉄錯体、およびペルオキシダーゼを共存させないことを特徴とする、使用。
  24. 　small,dense LDL中コレステロールを２つの工程で定量する方法において用いる、
    （１）コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性を含む第１試薬組成物と、
    （２）small,dense LDL中コレステロールを定量するための第２試薬組成物と、の
    被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロール定量キットの製造における使用であって、第１試薬組成物または第２試薬組成物のいずれかの試薬組成物において同一試薬組成物中にカップラーおよび鉄錯体を共存させないことを特徴とする、使用。
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