JP2003028882A - ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン
抵抗性を生じている２型糖尿病の診断に有用な、検体中
のSmall dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し
得るSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供すること。 【解決手段】０を超えて３１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にあ
る１価のカチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏ
ｌ／Ｌの範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンと
を存在させることを特徴とするSmall dense ＬＤＬの測
定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体中のSmall dense
ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得るSmall dens
e ＬＤＬの測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血液中における脂質は、リポ蛋白の形で
存在し、生体内組織間で輸送されている。リポ蛋白は、
その比重からカイロミクロン、超低比重リポ蛋白（ＶＬ
ＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白
（ＨＤＬ）に大別される。

【０００３】各リポ蛋白の機能としては、カイロミクロ
ンは、腸管から吸収した中性脂肪を肝に運搬し、肝で生
成されたＶＬＤＬは、中性脂肪を末梢組織に運搬しなが
らＬＤＬへと変化し、コレステロールを多く含むＬＤＬ
は、末梢組織において吸収される。これに対し、肝で生
成されたＨＤＬは、末梢組織のコレステロールを逆に肝
へと運搬する役目を果たし、末梢組織への脂質蓄積を促
す低比重リポ蛋白群とは明らかに異なった機能を有す
る。

【０００４】低比重リポ蛋白群のＬＤＬ、ＶＬＤＬは、
起源は一であるが、生体内の代謝機能の変化または疾病
によりいずれかまたは両者の血中濃度の上昇が認めら
れ、動脈硬化性疾患との関連が指摘されている。

【０００５】従来、リポ蛋白の分画法としては、超遠心
法と電気泳動法以外には有効な方法は無かったが、１９
７２年にScholnickらによりヘパリンおよび塩化カルシ
ウム、塩化マグネシウムおよび塩化ナトリウムによりカ
イロミクロン＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを濁らせる試薬と、カ
イロミクロン＋ＶＬＤＬを濁らせる試薬と、カイロミク
ロンだけを濁らせる試薬とが調製可能であることが報告
されている（Fluids,19:289,1972)。

【０００６】その後、小出らによりヘパリンと、塩化カ
ルシウムおよび塩化ナトリウムとを適当な濃度を選択す
ることにより同様の試薬が調製できるだけでなく、その
濁りの差によりＬＤＬ、ＶＬＤＬが定量可能であること
が報告されている（臨床病理、臨時増刊特集第21号：8
2,1975)。

【０００７】本発明者も、動物由来のヘパリンに代えて
合成可能な硫酸デキストランを用い、この硫酸デキスト
ランと、一価のカチオンおよび／または二価のカチオン
との量を変えることによりリポ蛋白分画を段階的に混濁
させる血清リポ蛋白分画の測定法を提案している（特開
平７−２９４５３２号公報）。

【０００８】ところで、ＬＤＬは、比重１．００６〜
１．０６３の幅広いリポ蛋白の集合であり、粒子サイズ
の異なる亜分画より構成される。このうち比重１．０４
４〜１．０６０の亜分画はSmall dense ＬＤＬと呼ばれ
ている（Progress in Medicine19:1854-1859,1999）。
また、本出願においては、比重１．００６〜１．０４４
の亜分画をLarge ＬＤＬと呼ぶことにする。

【０００９】ＬＤＬ亜分画のうち、小型で比重の重いSm
all dense ＬＤＬが主として出現しているヒトは、Larg
e ＬＤＬが出現しているヒトに比べて冠状動脈硬化性心
疾患やインスリン抵抗性を生じている２型糖尿病が高頻
度で出現していることが報告されている（ＪＡＭＡ 26
0:1917-1921,1988)。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このようにSmall dens
e ＬＤＬは、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性
を生じている２型糖尿病の鋭敏なマーカーとなり得るた
め、それらの診断法の確立が強く期待されている。

【００１１】従って本発明は、このような従来の課題に
着目してなされたものであって、ＬＤＬのうち、Small
dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体
中のSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供することを目
的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、特定の濃度の１価のカ
チオンおよび／または２価のカチオンと、ポリアニオン
との存在下で、Smalldense ＬＤＬを特異的且つ高感度
に測定できることを見出し、本発明を完成した。

【００１３】本発明のSmall dense ＬＤＬの測定方法
は、０を超えて３１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にある１価の
カチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの
範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンとを存在さ
せることを特徴とする。以下、本発明について更に詳細
に説明する。

【００１４】１価のカチオンは、イオン強度の調整に用
いられるため、イオンの活量係数の高い化合物から選択
することが好ましい。このような１価のカチオンとして
は、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、およびＬｉ⁺から成る群から選択され
る少なくとも１種が挙げられる。

【００１５】この１価のカチオンの濃度は、０を超えて
３１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１５０〜２２
０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。１価のカチオンの濃度が
３１０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、Small dense ＬＤＬ分
別定量が困難になる。また、１価のカチオン濃度は使用
するポリアニオンの種類や濃度によりその使用量が変動
するので、至適濃度を限定することはできない。

【００１６】２価のカチオンは、公知のカチオンの中か
ら適宜選択すれば良い。その具体例としては、Ｃａ²⁺、
Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、およびＳｒ²⁺から成る群から
選択される少なくとも１種が挙げられる。

【００１７】この２価のカチオンの濃度は、０．１〜５
００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜２００ｍｍ
ｏｌ／Ｌの範囲である。２価のカチオンの濃度が０．１
ｍｍｏｌ／Ｌ未満になると、十分な感度が得られない。
一方、２価のカチオン濃度は、一定濃度以上あれば良
く、上限濃度は規定されないが、溶解度を考慮すると、
濃度は５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。また、２価
のカチオン濃度は、使用するポリアニオンの種類や濃度
によりその使用量が変動するので、その至適濃度を限定
することはできない。

【００１８】本発明に使用されるポリアニオンも、公知
のポリアニオンの中から適宜選択することができる。そ
の具体例としては、硫酸多糖類、硫酸アミロペクチン、
およびリンタングステン酸から成る群から選択される少
なくとも１種が挙げられる。

【００１９】上記硫酸多糖類としては、硫酸デキストラ
ン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸が挙げられ、その中
でも、特に原料入手の容易さや価格の面から硫酸デキス
トランが好ましい。その分子量は、５，０００〜５０，
０００の範囲内が好ましい。

【００２０】本発明の実施の態様としては、所定量の一
価のカチオン、好ましくはナトリウムイオンを含有する
第１試薬と検体を混合後、一回目の測定を行い、次いで
第２試薬で一価のカチオンの濃度を減少させて、２回目
の測定を行い、その吸光度の増加からSmall dense ＬＤ
Ｌの量を求める方法が挙げられる。具体的には、一価の
カチオンを含む第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋
Large ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で一価のカチ
オンを減少させて、Smalldense ＬＤＬを混濁させ、吸
光度の増加としてSmall dense ＬＤＬを測定する。

【００２１】本発明の別の態様としては、第１試薬でカ
イロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense
ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で一価のカチオン濃
度を増加させることにより、Small dense ＬＤＬのみを
溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense ＬＤＬを
特異的に測定する方法が挙げられる。

【００２２】本発明におけるSmall dense ＬＤＬの測定
には、透過光による比濁法や散乱光による比ろう法があ
り、いずれも広く普及している。本発明に係るSmall de
nse ＬＤＬとポリアニオンとは、均質な混濁を形成する
ため、いずれの測定法を用いても正確な測定値が得られ
る。

【００２３】

【発明の効果】本発明は、Small dense ＬＤＬのみを特
異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense ＬＤ
Ｌの測定方法を提供する。従って、本発明の測定法によ
れば、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じ
ている２型糖尿病を精度良く診断することができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。

【００２５】実施例１ （１）各リポ蛋白の分離 新生化学実験講座 脂質Ｉ（１９９３）に基づいて、超
遠心法によりヒト血清を下記のような３つの各リポ蛋白
質に分画したものを試料として実験に用いた。 d＜１．００６(Chylomicron,ＶＬＤＬ) １．００６＜ｄ＜１．０４４(Large ＬＤＬ) １．０４４＜ｄ＜１．０６０(Small dense ＬＤＬ)

【００２６】（２）試薬組成 硫酸デキストラン（特開平７−２９４５３２の実施例１
に記載のものと同じ）０．０２ｗ／ｖ％、塩化カルシウ
ム８０ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム７．７ｍｍｏｌ
／Ｌの溶液に、塩化ナトリウムを溶解してその濃度が０
〜４５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３１種類の試薬を調
製した。

【００２７】（３）測定法 日立７１７０型自動分析装置を用いて、上記のように塩
化ナトリウム濃度が異なる３１種類の試薬をＲ１にセッ
トし、分画した各リポ蛋白と血清を試料として吸光度を
測定した。すなわち、超遠心により分画した血清５μＬ
を反応セルに分注し、次いで試薬２００μＬを分注撹拌
し３７℃で反応させて、１０分後にその吸光度を主波長
６６０ｎｍで測定した。

【００２８】（４）結果 その結果を図１に示す。図１に示すように、Large ＬＤ
ＬとSmall dense ＬＤＬとは、塩化ナトリウム濃度によ
り濁度パターンが異なっている。すなわち、Large ＬＤ
Ｌは、塩化ナトリウム濃度０〜２８０ｍｍｏｌ／Ｌで一
定の濁度を示すが、これを超える濃度では、吸光度が低
下し、３５０ｍｍｏｌ／Ｌで澄明化する。これに対し
て、Small dense ＬＤＬは、塩化ナトリウム濃度２００
ｍｍｏｌ／Ｌのとき最も強い濁度を示し、これを超える
濃度では、吸光度が徐々に低下し、３００ｍｍｏｌ／Ｌ
で澄明になる。一方、カイロミクロン＋ＶＬＤＬは、塩
化ナトリウム濃度０〜３２５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で一定
の濁度を示す。また、データは省略したが、ＨＤＬはこ
の濃度範囲で混濁を生じない。従って塩化ナトリウム濃
度２００ｍｍｏｌ／Ｌのときの濁度は、カイロミクロン
＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬの合計
量の濁度を示す。これに対し、塩化ナトリウム２８０ｍ
ｍｏｌ／Ｌのときの濁度は、カイロミクロン＋ＶＬＤＬ
＋Large ＬＤＬの濁度の合計量を示す。従ってSmall de
nse ＬＤＬ量は、この２つの組成における吸光度の差と
して測定することができる。

【００２９】実施例２ 実施例１で示したように、塩化ナトリウム濃度が異なる
２種類の試薬を用いて濁度を測定し、この２つの試薬の
濁度の差からSmall dense ＬＤＬ量を測定することが可
能である。しかし、この方法では２つの試薬を自動分析
装置の２つのチャンネルにセットし、１検体を２回測定
するため、つまり２つのチャンネルで１項目を測定する
ため効率が悪い。本発明者らは、更に考えを進めて、１
チャンネルで測定できる方法を考案した。通常、自動分
析装置は、１つのチャンネルに第１試薬と第２試薬の２
試薬をセットできるので、すなわち、第１試薬と第２試
薬で塩化ナトリウム濃度を変化させることにより、自動
分析装置の１チャンネルで測定できることを見出した。
この方法は、臨床検査に必要な試薬チャンネルの使用が
少なく、かつ２チャンネルを使用しないため、演算が容
易である。

【００３０】すなわち、塩化ナトリウム濃度２８０ｍｍ
ｏｌ／Ｌを含む第１試薬と試料を混和後１回目の測光を
行い、次いで第２試薬により塩化ナトリウム濃度を２０
０ｍｍｏｌ／Ｌに希釈して２回目の測光を行い、液量補
正後その吸光度の増加量からSmall dense ＬＤＬ量を求
める方法である。つまり第１試薬でカイロミクロン＋Ｖ
ＬＤＬ＋Large ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬によ
り塩化ナトリウム濃度を減少させて、Small dense ＬＤ
Ｌを混濁させ、すなわち吸光度の増加としてSmall dens
e ＬＤＬを測定する方法である（以下、１チャンネル法
と呼ぶ）。

【００３１】逆に、第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤ
Ｌ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬを混濁させ、第
２試薬で塩化ナトリウム濃度を増加させることにより、
Small dense ＬＤＬのみを溶解させて、吸光度の減少と
してSmall dense ＬＤＬを特異的に測定することも可能
である。

【００３２】実施例３ （１）公知の方法 文献（動脈硬化 Vol.25 No.1-2:67-70,1997)によれ
ば、ＬＤＬ粒子サイズがLipophor System(製造元：Quan
timetrix,CALIFORNIA,U.S.A. 輸入元：株式会社常光）
により、簡便に測定でき、ＬＤＬ-ＭＩ値（相対移動
度）が０．４０以上の場合、Small dense ＬＤＬが存在
することが示されている。そこで、本発明の測定法によ
る測定値とLipophor SystemによるＬＤＬ-ＭＩ値との相
関性について検討した。

【００３３】（２）本発明による測定 以下の試薬組成に基づいて１チャンネル法によりSmall
dense ＬＤＬを測定した。 試薬組成 第１試薬 硫酸デキストラン ０．０２ｗ／ｖ％ 塩化カルシウム ８０ｍｍｏｌ／Ｌ アジ化ナトリウム ７．７ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム ２８０ｍｍｏｌ／Ｌ 第２試薬 硫酸デキストラン ０．０２ｗ／ｖ％ 塩化カルシウム ８０ｍｍｏｌ／Ｌ アジ化ナトリウム ７．７ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム ６０ｍｍｏｌ／Ｌ

【００３４】（３）測定法 日立７１７０型自動分析装置のＲ１に第１試薬をセット
し、Ｒ３に第２試薬をセットし、ヒト血清３０例を測定
した。具体的には、まず検体７μＬを反応セルに分注
し、次に第１試薬１８０μＬを分注撹拌して３７℃で５
分間反応させ、更に第２試薬９０μＬを分注撹拌して５
分間反応させた後、その濁度を主波長６６０ｎｍで測定
した。

【００３５】（４）結果 上記ヒト血清をLipophor Systemにより電気泳動を行
い、動脈硬化Vol.25 No1-2:67-70,1997に従って、ＬＤ
Ｌ−ＭＩ値を算出した。その結果を図２に示す。図２に
示すように、本発明の測定法による測定値とLipophor S
ystemによるＬＤＬ−ＭＩ値とは、良好な相関性を示す
ことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】各リポ蛋白と血清の濁度を測定した結果を示す
グラフである。

【図２】本発明の測定法による測定値とLipophor Syste
mによるＬＤＬ−ＭＩ値との相関性を示すグラフであ
る。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BB50 CA26 DA64 FA11 GC10 2G054 AA07 AB05 CA21 EA04

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】０を超えて３１０ｍｍｏl／Ｌの範囲にあ
   る１価のカチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏ
   l／Ｌの範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンと
   を存在させることを特徴とする検体中のSmall dense Ｌ
   ＤＬの測定方法。
2. 【請求項２】１価のカチオンがＮａ⁺、Ｋ⁺、およびＬｉ
   ⁺から成る群から選択される少なくとも１種である請求
   項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】２価のカチオンがＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍ
   ｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、およびＳr²⁺から成る群から選択される
   少なくとも１種である請求項１記載の測定方法。
4. 【請求項４】ポリアニオンが硫酸多糖類、硫酸アミロペ
   クチン、およびリンタングステン酸から成る群から選択
   される少なくとも１種である請求項１記載の測定方法。
5. 【請求項５】硫酸多糖類が硫酸デキストラン、ヘパリ
   ン、コンドロイチン硫酸である請求項４記載の測定方
   法。
6. 【請求項６】第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋La
   rgeＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で一価のカチオ
   ン濃度を減少させて、Small dense ＬＤＬを混濁させ、
   吸光度の増加としてSmall dense ＬＤＬを測定する請求
   項１乃至５記載の方法。
7. 【請求項７】第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋La
   rge ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬを混濁させ、第２試薬
   で一価のカチオン濃度を増加させてSmall dense ＬＤＬ
   のみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall denseＬ
   ＤＬを測定する請求項１乃至５記載の方法。