CN107446989B - 测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种测定样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂，其特征在于：(1)在胆固醇酯酶和离子选择剂的存在下，先消除样本中除sdLDL‑C以外的脂蛋白中的胆固醇；(2)定量检测步骤(1)处理后剩余的sdLDL‑C。利用离子选择剂来选择性消除小而密低密度脂蛋白胆固醇以外的脂蛋白，进而检测小而密低密度脂蛋白胆固醇。

Description

测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂。
背景技术
众所周知，按照脂蛋白的分类，可以将脂蛋白分为乳糜微粒(CM)，极低密度脂蛋白(VLDL)，中间密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。临床上，通常测定各类脂蛋白的胆固醇含量，用于指导诊断。其中低密度脂蛋白胆固醇是动脉粥样硬化的危险因素，已广泛地用于临床检测。但越来越多的研究表面，低密度脂蛋白具有异质性，其中一部分密度较大体积较小的部分称为小而密低密度脂蛋白(sdLDL)，另一部分密度较小体积较大的部分称为大而轻低密度脂蛋白(LLDL)，这两类脂蛋白对引发动脉硬化的能力不同。其中sdLDL具有更高的致动脉硬化的风险，因此在临床上对于该小而密LDL 的分级测定具有重要意义。由于临床上检测脂蛋白时，经常检测的是脂蛋白中的胆固醇，因此有价值的检测对象应该为小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)。
目前，用于sdLDL-C测定的方法有超速离心法、电泳法、HPLC法。然而超速离心法虽然检测结果准确，但需要特殊设备，且操作时间长，不适合常规临床实验室应用；电泳法的分辨率有限，且操作步骤较多，亦不适合常规检测；HPLC法需要特殊设备，且分辨率不高，测试时间也不短，因此也不适合用于常规检测。
此外，已经有关于利用生化仪进行均相检测sdLDL-C的报道，如电化生研株式会社的均相法检测(CN200880013083.0，CN200880121086.6)，是利用表面活性剂和磷脂酶先选择性消除sdLDL-C以外的脂蛋白，再对剩余的sdLDL-C进行反应，进而检测sdLDL-C含量。而本发明则提供了另外一种技术手段，即利用离子选择剂来选择性消除sdLDL-C以外的脂蛋白，进而检测sdLDL-C。
发明内容
本发明提供一种采用利用离子选择剂来选择性消除小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)以外的脂蛋白(or脂蛋白胆固醇)，进而检测小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法。
离子选择剂：是指由阴阳离子所构成，对某种物质具有选择性的物质，包括离子液体和离子聚合物。
离子液体：离子液体就是完全由离子组成的液体，是低温(<100℃)下呈液态的盐，也称为低温熔融盐，它一般由有机阳离子和无机阴离子或有机阴离子所组成。离子液体的种类很多，大多数是由含氮的有机杂环阳离子和无机或有机阴离子构成。
离子聚合物：是一类在酸性或碱性介质中可产生解离，形成带正电荷或负电荷的高分子材料，又称聚电解质。
本发明人发现，当有离子选择剂存在的条件下时，能够提高胆固醇酯酶的底物催化特异性，使得对sdLDL-C以外的脂蛋白的反应速率明显大于sdLDL-C的反应速率，因此可以通过调节离子选择剂的浓度和胆固醇酯酶的用量，使sdLDL-C以外的脂蛋白胆固醇优先反应掉，并清除反应产物，再与sdLDL-C反应，从而检测出样本中sdLDL-C的含量。
因此，申请人基于上述创造性的技术成果，获得一种用于检测样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于，方法包括：
(1)在胆固醇酯酶和离子选择剂的存在下，先消除样本中除sdLDL-C以外脂蛋白中的胆固醇(除sdLDL-C以外脂蛋白中的胆固醇具体包括HDL-C、VLDL-C、CM-C以及大而轻LDL-C)；
(2)定量检测步骤(1)处理后剩余的sdLDL-C。
本发明离子选择剂为选自以下类型的物质：
a)一种离子液体，其阳离子部分选自以下类型中的阳离子部分：咪唑鎓盐，吡啶，吡咯烷鎓，季膦盐，铵盐基，硫嗡盐；其阴离子部分选自以下类型：烷基硫酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，双(三氟甲基磺酰)酰亚胺，六氟磷酸盐，四氟硼酸盐，卤化物；
或者
b)一种离子聚合物，其选自以下类型：嵌段PEG共聚的聚赖氨酸阳离子，嵌段PEG共聚的聚天冬酸阴离子。
作为优选，当离子液体的阳离子部分选自咪唑鎓盐时，具有以下结构的通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000021
其中，
R1＝(CH2)n-H，1<n<12，
R2＝(CH2)n-H，0<n<2，
R3＝(CH2)n-H，0<n<5。
作为优选，当离子液体的阳离子部分选自吡啶时，具有以下结构的通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000031
其中，
R1＝(CH2)n-H，0<n<12
R2＝(CH2)n-H，0<n<5
R3＝(CH2)n-H，0<n<5
R4＝(CH2)n-H，0<n<5。
作为优选，当离子液体的阴离子部分选自烷基磺酸盐时，具有以下通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000032
其中
R＝(CH2)n-H，0<n<20。
本发明所述离子液体，具体的可以选自以下类型物质：1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、 1-正己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-1甲基吡咯烷溴盐、三己基十四烷基六氟磷酸磷、四丁基甲磺酸铵、三乙基硫双(三氟甲基磺酰)亚胺、1-乙基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐。
本发明在步骤(1)消除sdLDL-C以外的脂蛋白时还添加了胆固醇氧化酶、过氧化物酶、 4氨基安替比林或Emulgen B66中的一种或者多种的混合。
本发明在步骤(1)消除sdLDL-C以外的脂蛋白时还添加了牛血清白蛋白、磷脂酶D或抗维生素C氧化酶中的一种或者多种的混合。
本发明在步骤(2)与sdLDL-C反应时还添加了作用于sdLDL-C的表面活性剂曲拉通X-100。
本发明在步骤(2)与sdLDL-C反应时还添加了TOOS，牛血清白蛋白。
本发明在步骤(1)及步骤(2)反应中还添加了缓冲液、防腐剂或保护剂中的一种或者多种的混合。
本发明还提供一种用于检测样本中sdLDL-C的试剂，该试剂包括第一试剂组合物和第二试剂组合物，其中第一试剂组合物包括胆固醇酯酶和离子选择剂，所述离子选择剂用于消除样本中的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及大而轻LDL-C；第二试剂组合物包括曲拉通X100。
本发明上述用于检测样本中sdLDL-C的试剂，其中的离子选择剂具体可以选自以下类型的物质：
a)一种离子液体，其阳离子部分选自以下类型：咪唑鎓盐，吡啶，吡咯烷鎓，季膦盐，铵盐基，硫嗡盐，其阴离子部分选自以下类型：烷基硫酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，双(三氟甲基磺酰)酰亚胺，六氟磷酸盐，四氟硼酸盐，卤化物；
或者
b)一种离子聚合物，其选自以下类型：嵌段PEG共聚的聚赖氨酸阳离子，嵌段PEG共聚的聚天冬酸阴离子。
本发明上述用于检测样本中sdLDL-C的试剂，离子液体的阳离子部分选自咪唑鎓盐时，具有以下通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000041
其中，
R1＝(CH2)n-H，1<n<12
R2＝(CH2)n-H，0<n<2
R3＝(CH2)n-H，0<n<5。
本发明上述用于检测样本中sdLDL-C的试剂，离子液体的阳离子部分选自吡啶时，且具有以下通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000051
其中，
R1＝(CH2)n-H，0<n<12
R2＝(CH2)n-H，0<n<5
R3＝(CH2)n-H，0<n<5
R4＝(CH2)n-H，0<n<5。
本发明上述用于检测样本中sdLDL-C的试剂，离子液体的阴离子部分选自烷基磺酸盐时，具有以下通式：
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000052
其中
R＝(CH2)n-H，0<n<20。
本发明上述用于检测样本中sdLDL-C的试剂，所述离子液体具体的可以选自以下类型的物质：1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-正己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基 -4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-1甲基吡咯烷溴盐、三己基十四烷基六氟磷酸磷、四丁基甲磺酸铵、三乙基硫双(三氟甲基磺酰)亚胺、1-乙基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐。
本发明所述的用于检测样本中sdLDL-C的试剂，所述胆固醇酯酶含量为0.1-50KU/L，优选1-5KU/L，更优选为3KU/L；所述离子选择剂的含量为0.01％-1％，优选为0.02％-0.5％，更优选为0.1％；所述曲拉通X-100含量为0.01％-5％，优选为0.1％-3％，更优选为1％。
本发明所述的用于检测样本中sdLDL-C的试剂，第一试剂组合物还添加了胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4氨基安替比林或Emulgen B66；其中胆固醇氧化酶含量为0.1-50KU/L，优选 1-5KU/L，更优选为3KU/L；其中过氧化物酶含量为0.1-10KU/L，优选1-5KU/L，更优选为 2KU/L；其中4-氨基安替比林(4氨基安替比林)含量为0.05-10mM，优选0.3-2mM，更优选0.8mM；其中Emulgen B66的含量为0.01％-5％，优选0.1％-1％，更优选0.5％。
本发明用于检测样本中sdLDL-C的试剂，，第一试剂组合物还添加了牛血清白蛋白、磷脂酶D或抗维生素C氧化酶；其中牛血清白蛋白含量为0.05-50g/L，优选0.5-5g/L，更优选 1.5g/L；磷脂酶D的含量为0.1-50KU/L，优选0.5-10KU/L，更优选2.5KU/L；抗维生素C氧化酶的含量为0.1-50KU/L，优选0.5-5KU/L，更优选1KU/L。
本发明所述的sdLDL-C检测试剂，第二试剂组合物还添加了Trinder色原物质或牛血清白蛋白；其中Trinder色原物质包括TODB、TOOS、ADPS、ALPS，含量为0.01-10mM，优选0.05-5mM，更优选2mM；牛血清白蛋白含量为0.05-50g/L，优选0.5-5g/L，更优选1.5g/L。
本发明所述的sdLDL-C检测试剂，第一步及第二步反应中还添加了缓冲液、保护剂或防腐剂。
本发明所述的sdLDL-C检测试剂，所述缓冲液pH范围为4.5-9.0，优选5.5-8.0，更优选为7.0，缓冲液的种类为PIPES，HEPES，MES，Tris，Tricine，磷酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液等，浓度为1-500mM，优选10-100mM，更优选50mM；所述保护剂为海藻糖、甘露醇、甘油、蔗糖，浓度为0.01％-10％，优选0.1％-5％，更优选为2％；所述防腐剂为PC300，叠氮钠，浓度为0.005％-1％，优选为0.02％-0.1％，更优选为0.05％。
众所周知，自上世纪90年代以来，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的检测已经成为一种常规检测，究其原因主要是因为均相检测技术的发明，使得其可以在生化仪上检测，作为常规技术。其主要的技术原理是，利用胆固醇酯酶和Emulgen B66(聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚)的作用，将LDL-C以外的脂蛋白，如HDL-C等首先反应清除掉，再与剩余的LDL-C反应，进而进行检测(第一化学专利：CN97195028)。由于sdLDL-C是LDL-C的其中一种组分，因此，本发明人考虑，如果在此基础上，能够选择性地区分LDL-C中的sdLDL-C与 LLDL-C，则有可能建立一种用于检测sdLDL-C的均相检测方法。
通过大量实验发现，离子选择剂具有这种功能，包括离子液体或者离子聚合物。其中离子液体的阳离子可以是咪唑鎓盐，吡啶，吡咯烷鎓，季膦盐，铵盐基，硫嗡盐，其阴离子部分可以是烷基硫酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，双(三氟甲基磺酰)酰亚胺，六氟磷酸盐，四氟硼酸盐，卤化物。这类离子液体种类繁多，具体的包括以下，1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-正己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-辛己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-葵基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基 -3-乙基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰)亚胺盐、 1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲苯磺酸盐、1-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-葵基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-2-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-3-丁基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-2，3，4-三甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-4-甲基吡啶溴盐、1-丁基-1甲基吡咯烷溴盐、1-丁基-1甲基吡咯烷氯盐、1-丁基-1甲基吡咯烷四氢硼酸盐、1-丁基-1甲基吡咯双(三氟甲基磺酰)亚胺盐、三己基十四烷基六氟磷酸磷、三己基十四烷基四氟硼酸磷、甲基三异丁基膦甲苯磺酸盐、三己基十四烷基氯化膦、苯甲酸四丁基铵、四丁基甲磺酸铵、四氟硼酸四己基铵、四辛基氯化铵、四戊基硫氰酸铵、四乙基三氟乙酸铵、三乙基硫双(三氟甲基磺酰)亚胺、1-乙基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-乙基-3- 甲基咪唑乙磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑丙磺酸盐、1-乙基-3-咪唑丁磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑辛基磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑葵基磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、1-乙基 -3-甲基咪唑十八烷基磺酸盐。而上述离子液体在合理的范围内应当认为是有效的，一般认为在0.01％-1％范围内是有效的，优选为0.02％-0.5％范围内效果更佳，更优选为0.1％。以上离子液体均为商业化的产品，可通过常规商业途径购买。值得指出的是，此处只是列举了部分较有代表性的离子液体，并不是对本发明的限制。
除离子液体对提高sdLDL-C和LLDL-C的选择性有一定作用外，还发现，离子聚合物也具有类似功能，包括嵌段PEG共聚的聚赖氨酸阳离子，嵌段PEG共聚的聚天冬酸阴离子。一般认为在0.01％-1％范围内是有效的，优选为0.02％-0.5％范围内效果更佳，更优选为0.1％。典型的例子比如：聚赖氨酸聚乙二醇共聚物(聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物)，Mr：2000；聚赖氨酸聚乙二醇共聚物，Mr：5000；该聚合物可购自美国nanocs公司。得指出的是，此处只是列举了部分较有代表性的离子聚合物，并不是对本发明的限制。
利用离子选择剂和胆固醇酯酶可以选择性的与LDL-C中的LLDL-C优先反应。对于先反应的LLDL-C部分，可以用不同的方法除去，比如用胆固醇氧化酶进行氧化反应，生成的过氧化氢可以在过氧化物酶或过氧化氢酶的作用下反应生成水和氧气，进而被清除掉，不会干扰第二步反应的进行；也可以用胆固醇脱氢酶，将胆固醇脱氢生成7-脱氢胆固醇和NADH，从而清除LLDL-C，不会对第二步检测sdLDL-C造成干扰。对于酶的用量，则主要是遵守足量原则即可，一般而已，在反应过程中，无论是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者是胆固醇脱氢酶，在0.1-50KU/L的范围内是满足要求的，更高的酶用量理论上也是可行的，但从经济实用的角度考虑，加过多的酶只会增加成本，更加常用的是1-5KU/L的范围，即符合经济实用，又有足够量的酶保证反应的充分进行，常规情况下，2KU/L，3KU/L，4KU/L等都是常用的酶量。而对于过氧化物酶或过氧化氢酶，这种酶被常规应用于许多诊断试剂盒中，其用量基本没有特殊限制，0.1-10KU/L的量即可，优选地1-5KU/L，更优选地2KU/L。对于酶的来源，并没有太多的限制，可以是微生物来源，如假单胞菌来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，也可以是植物来源，如，来自于辣根的辣根过氧化物酶。这些酶基本上已经实现商业化，可以直接购买。常见的厂家如东洋纺、旭化成等。
如果用胆固醇氧化酶，生成过氧化氢这条路线，则需要选择合适的色原物质，过氧化氢检测的物质很多，可以利用Trinder试剂与4-氨基安替比林(4-AAP)或3-甲基苯并噻唑砜腙 (MBTH)氧化耦合反应过程中，形成非常稳定的紫色或蓝色染料。Trinder试剂的类型很多，包括传统的苯酚、4-氯酚，新型的高水溶性苯胺类似物，如同仁化学的N-乙基-N-(3-磺丙基) -3-甲氧基苯胺钠盐(ADPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐(ALPS)，N-乙基-N(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)、N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)。对于Tinder试剂和4-AAP的用量没有特别限制，合理的范围为0.01-10mM，优选0.05-10mM，更优选0.05-5mM，常用的可以是0.1mm，0.3mM，0.5mM， 0.8mM，1mM，2mM，4mM等。若配制的试剂为双试剂，则Trinder试剂可以与4-AAP分开分别加入R1，R2，也可以一起加入在R1中或R2中。
由已公开的专利文献可知，Emulgen B66可以清除LDL-C以外的脂蛋白，如HDL-C，VLDL-C，CM-C等。由此可以与上述离子选择剂选择性清除LLDL-C结合，在血清样本中，利用胆固醇酯酶，离子选择剂，Emulgen B66的共同作用，消除sdLDL-C以外的其它脂蛋白，包括HDL-C，VLDL-C，CM-C，LLDL-C等。对于Emulgen B66的有效含量，一般在0.01％-5％的范围内是合适的，优选地是0.1％-1％的范围内，常用的浓度可以是0.1％，0.2％，0.5％，0.8％等。
对于双试剂法检测sdLDL-C时，第一步反应是去除sdLDL-C以外的脂蛋白胆固醇，第二步反应是与剩余的sdLDL-C反应，因此，在第二步反应中需要添加与sdLDL-C反应的表面活性剂，只要这种表面活性剂可以与sdLDL-C较彻底反应即可，也可以是与所有脂蛋白胆固醇都反应的表面活性剂，因为除sdLDL-C以外的其它脂蛋白早已在第一步被反应完了，并不会干扰第二步的检测，常用的表面活性剂有曲拉通X-100，吐温20，NP-10等。对于其含量并无特别要求，一般为0.01％-5％，优选0.1％-3％，常用的浓度为0.2％，0.5％，0.8％，1％， 2％等。
牛血清白蛋白(BSA)，是一种常用物质，在免疫反应中可以作为封闭剂，也可以作为半抗原的偶联载体，在试剂中也经常作为一种保护剂。在本发明中，BSA的添加不仅可以作为保护剂，提高试剂的稳定性，还可以提高试剂抗乳糜干扰的能力。从而提升试剂的整体性能，更大程度地免受脂浊样本的干扰，有助于临床应用。本发明人发现，其有效范围为0.05-50g/L，优选0.5-5g/L，常用的量为1g/L，1.5g/L，2g/L，3g/L。在本发明中，该BSA可以加在R1试剂中，也可以加在R2试剂中，当然也可以R1和R2试剂中都加。
磷脂酶D是一类作用于磷脂的酶，水解产生胆碱或丝氨酸或乙醇胺。由于乳糜的颗粒较大，其外壳含有较多的磷脂，因此，当磷脂酶D作用与乳糜时，能够比较容易地水解乳糜，从而消除乳糜对于样本检测的干扰。本发明人发现，其有效范围为0.1-50KU/L，优选0.5-10KU/L，比较常用的量有1KU/L，2.5KU/L，5KU/L，8KU/L等。
由于目前很多人都在补充维生素C，这类人的血清中往往含有较高浓度的维生素C，而维生素C是一种具有还原性的物质，该物质的存在会严重影响氧化还原反应的进行，sdLDL-C 的检测是靠胆固醇氧化酶的氧化生成过氧化氢来实现，因此，也容易受到维生素C的干扰，导致检测结果的不准确。为此，可在试剂中添加抗坏血酸氧化酶，该酶可以将维生素C氧化成不具还原性的物质，从而不会干扰sdLDL-C的检测。其有效的范围为0.1-50KU/L，优选0.5-5KU/L，比较常用的量有0.5KU/L，1KU/L，2.5KU/L，5KU/L等。
对于一般的反应，都会选择比较合适的缓冲液条件下进行，这是因为大部分的酶需要一个合适的pH条件下才能够有效的发挥酶活，进行较快的催化反应，一旦pH条件不合适，则对酶的活性影响较大，甚至反应无法进行。本发明人发现，在pH4.5-9.0的范围内对于酶的催化是有效的，检测反应能够进行，优选地pH5.5-8.0，在此范围内，更加有利于酶活，对于检测sdLDL-C更加有利，更加常用的pH为6.0，6.5，7.0，7.5；对于缓冲液的种类而言，只要能够达到相应的pH范围内，具有一定的缓冲能力即可，缓冲液种类包括但不限于以下类型，哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)(PIPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐(HEPES)、2-吗啉乙磺酸(MES)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸(Tricine)、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、3-(N-吗非啉)乙磺酸(MOPS)等；缓冲液的浓度范围为1-500mM，优选10-100mM，常用的为25mM，50mM，75mM。
由于诊断试剂一般要求有效期至少为一年，因此需要保证在有效期内，该试剂仍能满足要求，故对防腐剂有一定的要求，通常情况下可选叠氮钠、PC300等作为防腐剂，这类防腐剂具有较好的防腐功能，能够避免试剂在长期的存储过程中产生杂菌，影响试剂性能。防腐剂的有效浓度一般为0.005％-1％，优选0.02％-0.1％，通常情况下添加的试剂中的浓度可以为 0.02％，0.05％，0.075％，0.1％等。
为了提高试剂的稳定性，减少在存储过程中的性能变化，还可以添加保护剂，所述保护剂通常为糖类物质，包括但不限于葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖等，也可以是甘油等其它保护剂，通常浓度为0.01％-10％，优选0.1％-5％，更常用的浓度为1％，2％，3％，4％，5％。
本发明上述涉及到的组分的百分比浓度，不做特殊说明均为质量百分含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细描述本发明，但是应到值得指出的是，以下只是对本发明的一个解释，并不是对本发明的限制。
实施例1
含有不同离子选择剂的试剂对sdLDL-C和LLDL-C的不同反应性。
首先用超速离心的方法，将sdLDL和LLDL分离纯化，具体如下：取无脂浊的血清混合，加入EDTA至终浓度为0.04％，加入NaN3至终浓度为0.05％，并用KBr调节密度至1.019，于40000rpm，20℃，离心28h(离心机：贝克曼Optima XE；转子：Type 70Ti)，离心后小心地弃去上层脂蛋白，包括乳糜，VLDL和IDL。将下层的密度用KBr调节至1.040，并于于 40000rpm，20℃，离心28h，离心后小心地收集上层脂蛋白，即密度为1.019-1.040的LLDL。再将下层的脂蛋白用KBr调节密度至1.063，并于40000rpm，20℃，离心28h，离心后小心地收集上层脂蛋白，即密度为1.040-1.063的sdLDL，将所得的LLDL-C，sdLDL-C稀释至浓度100mg/ml备用。
制备以下试剂A，用于考察不同离子选择剂对sdLDL-C和LLDL-C的不同反应性。
试剂A
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000101
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000111
其中胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶可以作用于胆固醇酯，并产生过氧化氢，进而在过氧化物酶的存在下，催化分解并与TOOS和4-氨基安替比林形成有色物质，进而可以通过分光光度计检测。
将试剂A或添加了不同离子选择剂的试剂A，分别与LLDL-C，sdLDL-C反应，其中样本试剂比例为5ul：300ul。部分不同的离子选择剂对两种脂蛋白的反应性能见表1：
表1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000112
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000121
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000131
表1显示了当采用不同的离子选择剂时，对于LLDL-C的反应性明显大于sdLDL-C。由上表可知，当为离子液体时，其中阳离子部分选自以下类型，咪唑鎓盐，吡啶，吡咯烷鎓，季膦盐，铵盐基，硫嗡盐，其阴离子部分选自以下类型：烷基硫酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，双(三氟甲基磺酰)酰亚胺，六氟磷酸盐，四氟硼酸盐，卤化物。此外，离子聚合物也具有类似的作用。由于离子液体和离子聚合物的种类繁多，不能一一列举，故本实施例只是选择了其中较有代表性的离子液体和离子聚合物用以说明。由此，可以利用离子选择剂，建立用于检测sdLDL-C的方法。
实施例2
通过上述实施例发现，只要条件合适，就可以建立sdLDL-C的检测方法。因此，特配制以下试剂，用于sdLDL-C的检测。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000141
R2
PIPES缓冲液(pH7.0) 50mM
曲拉通X-100 1.0％
TOOS 2mM。
其中，样本试剂比例，样本：试剂R1：试剂R2＝3：150：50。在样本与试剂R1孵育5min后，加入R2，再反应5min，然后再600nm处测量吸光度。R1中的离子选择剂包括离子液体和离子聚合物，其中离子选择剂的阳离子部分选自以下类型：咪唑鎓盐，吡啶，吡咯烷鎓，季膦盐，铵盐基，硫嗡盐，阴离子部分选自以下类型：烷基硫酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，双(三氟甲基磺酰)酰亚胺，六氟磷酸盐，四氟硼酸盐，卤化物。表2选取了部分具有代表性的离子选择剂，对于检测结果的评估。选择样本值分别为0.5mM和1.5mM的样本用于精密度评价，用超速离心法作为对照，选择40份样本，评价两种方法间的相关性。
表2
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000142
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000151
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000161
由表2可知，选用不同的离子选择剂检测sdLDL-C时，都具有较好的精密度，且与超速离心法具有较高的相关性。由于离子液体和离子聚合物的种类繁多，不能一一列举，故本实施例只是选择了其中较有代表性的离子液体和离子聚合物用以说明，其实验结果表面当试剂中添加离子液体或离子聚合物时，能够准确地检测sdLDL-C。
实施例3
胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶的影响
由以下R1，R2试剂组成，并用表3中的胆固醇氧化酶(COO)，胆固醇酯酶(COE)，过氧化物酶(POD)。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000162
R2
PIPES缓冲液(pH7.0) 50mM
曲拉通X-100 1.0％
TOOS 2mM
表3
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000163
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000171
由表3可知，胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶的含量只要足够，本法即可有效的检测sdLDL-C。因此，胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶两种酶在0.1-50KU/L的范围内，即可有效检测sdLDL-C，优选1-5KU/L，而过氧化物酶在0.1-10KU/L的范围内即可有效检测 sdLDL-C，优选1-5KU/L。
实施例4
Emulgen B66和曲拉通X-100的影响
由以下R1，R2试剂组成，并用表4中的Emulgen B66和曲拉通X-100的浓度。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000172
R2
PIPES缓冲液(pH7.0) 50mM
曲拉通X-100 0.05％-5.0％
TOOS 2mM。
表4
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000173
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000181
由表4可知，Emulgen B66和曲拉通X-100的量对检测结果有一定的影响，但只要Emulgen B66的含量在0.01％-5％范围内，优选0.1％-1％范围内，曲拉通X-100的含量在0.05％-5.0％的范围内，优选0.1％-3％范围内，对于检测sdLDL-C而言是可以接受的。
实施例5
色原物质的影响
由以下R1，R2试剂组成，并用表5中的4-氨基安替比林(4-AAP)和 TOOS/TODB/ADPS/ALPS的浓度。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000182
R2
PIPES缓冲液(pH7.0) 50mM
曲拉通X-100 1％
TOOS/TODB/ADPS/ALPS 0.01-10mM
表5
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000183
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000191
由表5可知，色原物质含量的多少，对检测sdLDL-C的影响并不明显，只要有足够的色原物质即可，故当4-氨基安替比林在0.05-10mM范围内时，优选0.3-2mM， TOOS/TODB/ADPS/ALPS在0.01-10mM范围内时，优选0.05-5mM，检测sdLDL-C的结果符合要求。
实施例6
不同缓冲液的影响
由以下R1，R2试剂组成，并用表6中的缓冲液浓度和pH，考察不同缓冲液种类、浓度、 pH对试剂的影响。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000192
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000201
R2
缓冲液(pH4.5-9) 1-500mM
曲拉通X-100 1％
TOOS 2mM
表6
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000202
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000211
缓冲液的作用是提供一个合适的缓冲环境，有利于反应的进行，因此只要是合适的缓冲液，合理的缓冲浓度和pH，均可以作为反应的缓冲液，由表6可知，在pH4.5-9.0范围内，优选5.5-8.0范围内，反应均可以进行，且缓冲液的浓度范围为1-500mM时，不影响反应，缓冲液的种类可以是PIPES、HEPES、Tris、PB、MES、Tricine、柠檬酸缓冲液等。
实施例7
磷脂酶D，BSA的添加可以提高乳糜抗干扰能力。
由以下R1，R2试剂组成，并用表7中的BSA和磷脂酶D浓度，检测样本为添加了1450或2900浊度的乳糜的血清样本，考察不同试剂配方对抗乳糜干扰能力的区别。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000212
R2
PIPES缓冲液(pH7.0) 50mM
曲拉通X-100 1％
TOOS 2mM
表7
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000221
由表7可知，BSA和磷脂酶D对于抗乳糜干扰的能力是有一定的提高作用的。当BSA在0.05-50g/L时具有一定作用，优选0.5-5g/L。当磷脂酶D在0.1-50KU/L时，对提高抗乳糜干扰能力具有一定作用，优选0.5-10KU/L。
实施例8
保护剂，防腐剂的添加可以提高试剂稳定性。
由以下R1，R2试剂组成，并用表8中的保护剂和防腐剂，其中R1和R2同时添加相同的保护剂和防腐剂，考察其对试剂稳定性的影响。
R1
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000231
R2
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000232
用sdLDL-C的含量为1.2mM的血清作为样本，检测试剂的吸光度变化，比较新鲜配制的试剂以及37℃留样一周后，检测该样本的吸光度变化，以此考察试剂盒的灵敏度的变化，用以评估试剂盒的稳定性。
表8
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000233
Figure DEST_PATH_GDA0001446924590000241
由表9可知，当试剂中添加合适浓度的保护剂和防腐剂后，其稳定性得到了提高。故保护剂可以为海藻糖、甘露醇、甘油，浓度为0.01％-10％，优选0.1％-5％，更优选为2％；所述防腐剂为PC300，叠氮钠，浓度为0.005％-1％，优选为0.02％-0.1％，更优选为0.05％。
应到值得指出的是，以上实施例只是对本发明的进一步解释，并不是对本发明的限制。

Claims (20)

1.一种测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于：
（1）在胆固醇酯酶和离子选择剂的存在下，先消除样本中除sdLDL-C以外的脂蛋白中的胆固醇；所述的步骤（1）中还添加了胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4氨基安替比林和EmulgenB66；其中胆固醇氧化酶含量为0.1-50KU/L；其中过氧化物酶含量为0.1-10KU/L；其中4氨基安替比林含量为0.05-10mM；其中Eugene B66的含量为0.01%-5%；
（2）定量检测步骤（1）处理后剩余的sdLDL-C；所述的步骤（2）中还添加了作用于sdLDL-C的表面活性剂曲拉通X-100；
所述的离子选择剂选自以下类型的物质：1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-正己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-1甲基吡咯烷溴盐、三己基十四烷基六氟磷酸磷、四丁基甲磺酸铵、三乙基硫双(三氟甲基磺酰)亚胺、1-乙基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、聚赖氨酸聚乙二醇共聚物。
2.根据权利要求1所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中还添加了牛血清白蛋白、磷脂酶D或抗维生素C氧化酶中的一种或者多种的混合。
3.根据权利要求1所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中还添加了TOOS，牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，其特征在于：所述的步骤（1）和步骤（2）中还添加了缓冲液、防腐剂或保护剂中的一种或者多种的混合。
5.一种测定样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：包括第一试剂组合物和第二试剂组合物，其中第一试剂组合物包括胆固醇酯酶和离子选择剂，还添加了胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4氨基安替比林和Emulgen B66；所述离子选择剂用于消除样本中的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及大而轻LDL-C；第二试剂组合物包括曲拉通X-100；
所述的离子选择剂选自以下类型的物质：
1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-正己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1-丁基-1甲基吡咯烷溴盐、三己基十四烷基六氟磷酸磷、四丁基甲磺酸铵、三乙基硫双(三氟甲基磺酰)亚胺、1-乙基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、聚赖氨酸聚乙二醇共聚物。
6.根据权利要求5所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述胆固醇酯酶含量为0.1-50KU/L；所述离子选择剂的含量为0.01%-1%；所述曲拉通X-100含量为0.01%-5%。
7.根据权利要求6所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述胆固醇酯酶含量为1-5KU/L；所述离子选择剂的含量为0.02%-0.5%；所述曲拉通X-100含量为0.1%-3%。
8.根据权利要求7所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述胆固醇酯酶含量为3KU/L；所述离子选择剂的含量为0.1%；所述曲拉通X-100含量为1%。
9.根据权利要求5所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：其中胆固醇氧化酶含量为1-5KU/L；其中过氧化物酶含量为1-5KU/L；其中4氨基安替比林含量为0.3-2mM；其中Emulgen B66的含量为0.1%-1%。
10.根据权利要求9所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：其中胆固醇氧化酶含量为3KU/L；其中过氧化物酶含量为2KU/L；其中4氨基安替比林含量为0.8mM；其中Emulgen B66的含量为0.5%。
11.根据权利要求5所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的第一试剂组合物还添加了牛血清白蛋白、磷脂酶D或抗维生素C 氧化酶；其中牛血清白蛋白含量为0.05-50g/L；磷脂酶D 的含量为0.1-50KU/L；抗维生素C 氧化酶的含量为0.1-50KU/L。
12.根据权利要求11所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的牛血清白蛋白含量为0.5-5g/L；磷脂酶D的含量为0.5-10KU/L；抗维生素C 氧化酶的含量为0.5-5KU/L。
13.根据权利要求12所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的牛血清白蛋白含量为1.5g/L；磷脂酶D的含量为2.5KU/L；抗维生素C 氧化酶的含量为1KU/L。
14.根据权利要求5所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的第二试剂组合物还添加了Trinder 色原物质或牛血清白蛋白；其中Trinder色原物质包括TODB、TOOS、ADPS、ALPS，含量为0.01-10mM；牛血清白蛋白含量为0.05-50g/L。
15.根据权利要求14所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：其中Trinder色原物质含量为0.05-5mM；牛血清白蛋白含量为0.5-5g/L。
16.根据权利要求15所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：其中Trinder色原物质含量为2mM；牛血清白蛋白含量为1.5g/L。
17.根据权利要求5所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的sdLDL-C 检测试剂，第一步及第二步反应中还添加了缓冲液、保护剂或防腐剂。
18.根据权利要求17所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的缓冲液pH范围为4.5-9.0；所述的缓冲液为PIPES、HEPES、MES、Tris、Tricine、磷酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液，浓度为1-500mM；所述保护剂为海藻糖、甘露醇、甘油、蔗糖，浓度为0.01%-10%；所述防腐剂为PC300，叠氮钠，浓度为0.005%-1%。
19.根据权利要求18所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的缓冲液pH 范围为5.5-8.0，所述的缓冲液的浓度为10-100mM，所述保护剂为的浓度为0.1%-5%，所述防腐剂的浓度为0.02%-0.1%。
20.根据权利要求19所述的测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于：所述的缓冲液pH 范围为7，所述的缓冲液的浓度为50mM，所述保护剂为的浓度为2%，所述防腐剂的浓度为0.05%。
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