TWI421058B - 小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之定量方法 - Google Patents

小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之定量方法 Download PDF

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Description

小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之定量方法
本發明為有關檢體中之小粒子低密度脂蛋白(以下簡稱sdLDL)中之膽固醇(以下簡稱sdLDL－C)之定量方法及定量用套組。
血液中存在之脂蛋白依其比重而分為高密度脂蛋白(以下簡稱HDL)、低密度脂蛋白(以下簡稱LDL)、超低密度脂蛋白(以下簡稱VLDL)、及乳糜微粒(以下簡稱CM)之4大類。各脂蛋白所構成之脂質組成也相異，又依構成各脂蛋白之脫輔基蛋白(apoprotein)之種類之相異而於活體中之功能大異其趣。又於由VLDL至LDL代謝之過程中生成之脂蛋白雖也有VLDL與LDL中間之密度之中間密度脂蛋白(以下簡稱IDL)存在，但此也廣義分類為LDL。
臨床檢査中，作為動脈硬化診斷之篩選標幟，使用總膽固醇、總三酸甘油酯、HDL中膽固醇、LDL中膽固醇、脫輔基脂蛋白AI、脫輔基脂蛋白B等。尤其與動脈硬化形成極強關連之LDL中之膽固醇頻繁被測定。一方面，LDL中之膽固醇雖不高，但具有冠狀動脈硬化病變者也不少。此病態中增加小型而高密度之LDL(該LDL稱為sdLDL)，也有sdLDL－C比LDL－C更與冠狀動脈疾病有關係之報告[參照Arteriosclerosis Thrombosis,and Vascular Biology,2004年，第24卷,p.558－563]。
測定sdLDL之方法已知有電泳法、超離心法、劃份法等。電泳法為使用2~16%非變性梯度凝膠施行電泳、染色來測定LDL之粒子大小之方法，但操作煩雜而泛用性低劣。又依此方法雖可測定LDL之粒子大小，但不能定量sdLDL。又依離子強度之差，將sdLDL混濁或溶解而由吸光度之差測定sdLDL之方法(參照專利文獻1)。但依此方法因測定濁度，故特異性和精度不充分，更依此方法雖可測定sdLDL量，但不能測定sdLDL－C。
定量sdLDL－C之方法有超離心法、劃份法等。超離心法為用超離心分離機分取相當於檢體中之sdLDL之比重領域，而測定該比重領域中膽固醇之方法，可成為sdLDL－C定量之標準法之方法。但此方法必須高價設備，測定須非常長時間，且手技須熟練。
劃份法可於第一工程用聚陽離子與2價陽離子或1價陽離子之組合，或聚乙二醇使檢體中之HDL及sdLDL以外之脂蛋白凝集，由離心分離或過濾器過濾而去除凝集物，分離HDL及sdLDL，由第二工程分離之含有HDL及sdLDL之試料定量sdLDL－C之方法(參照專利文獻2)。此方法雖比超離心法操作簡便化，但須用劃份操作，故測定須要時間。
於界面活性劑之存在下，將膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶，與由HDL、LDL、VLDL及CM而成之群選擇之一或複數特定之脂蛋白特異地作用，而測定應測定之脂蛋白中之膽固醇之方法有多數報告。最近，於聚氧乙烯－聚氧丙烯共聚物或其衍生物之存在下，於檢體添加膽固醇測定用酵素，令聚氧乙烯－聚氧丙烯共聚物或其衍生物與sdLDL選擇性地作用，而測定生成之膽固醇量為特徵之sdLDL－C之定量法之報告(專利文獻3)。
【專利文獻1】特開2003－28882號公報【專利文獻2】國際公開第2004/053500號小冊【專利文獻3】國際公開第2007/026829號小冊
本發明之目的為提供簡便且正確地定量檢體中sdLDL－C之方法及套組。
本發明為有關以下之[1]~[12]。
[1]一種檢體中之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL－C)之定量方法，包括下述工程(i)、(ii)及(iii)：(i)在含有與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之高密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱HDL－C)、超低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱VLDL－C)、乳糜微粒中之膽固醇(以下簡稱CM－C)及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱LgLDL－C)之反應比較，優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之sdLDL－C之反應之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑A)之反應液中，令檢體與該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶、或該膽固醇酯水解酶、該膽固醇脫氫酶及氧化型輔酶作用，以去除該檢體中之HDL－C、VLDL－C、CM－C及LgLDL－C之工程，(ii)添加於含有前述工程(i)之界面活性劑A之反應液中殘存之sdLDL-C之由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶引起反應之試藥，來生成過氧化氫或還原型輔酶，而測定生成之過氧化氫或還原型輔酶之工程，(iii)用含有已知濃度之sdLDL-C之標準檢體，施行前述(i)及(ii)之工程來生成過氧化氫或還原型輔酶，而測定生成之過氧化氫或還原型輔酶，將sdLDL-C濃度與係屬過氧化氫或還原型輔酶之測定值予以關連，而決定該檢體中之sdLDL-C濃度之工程
[2]如[1]記載之方法，於含有工程(i)之界面活性劑A之反應液殘存之sdLDL-C之由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶引起反應之試藥為解除抑制sdLDL-C之膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶之反應之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑B)。
[3]如[1]或[2]記載之方法，其中界面活性劑A為由聚氧乙烯烷胺、胺氧化物類、烷基甜菜鹼、烷銨基-1-丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、聚氧乙烯苄基-烷基4級銨鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺、聚氧乙烯多環苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷胺硫酸酯鹽、N-醯基牛膽磺酸鹽(N-acyl taurine salt)、N-醯胺基酸鹽、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、不含聚乙二醇之聚丙二醇衍生物、如下式(I)HO－(C 3 H 6 O) a －(C 2 H 4 O) b －(C 3 H 6 O) c －H (I) (式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數9以下之烷基)而成之群選擇之界面活性劑。
[4]如[1]~[3]之任一記載之方法，其中界面活性劑B為由聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數10以上之烷基)、聚氧乙烯烷基苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基苯醚、聚氧乙烯多環苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基多環苯醚、如下式(II)HO－(C 2 H 4 O) d －(C 3 H 6 O) e －(C 2 H 4 O) f －H (II) (式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷胺而成之群選擇之界面活性劑。
[5][1]~[4]之任一記載之方法，其中工程(i)於蛋白素(albumin)之存在下施行。
[6]一種檢體中之sdLDL－C定量用套組，其特徵為包括(a)含有與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之高密度脂蛋白中之膽固醇、超低密度脂蛋白中之膽固醇、乳糜微粒中之膽固醇及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之反應比較，優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶－該氧化型輔酶之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL－C)之反應之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑A)、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫去除試藥之第一試藥，和(b)含有於界面活性劑A共存下引起sdLDL－C之由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之反應之試藥、及過氧化氫測定試藥之第二試藥。
[7]一種檢體中之sdLDL－C定量用套組，其特徵為包括(a)含有與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之高密度脂蛋白中之膽固醇、超低密度脂蛋白中之膽固醇、乳糜微粒中之膽固醇及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之反應比較，優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶－該氧化型輔酶之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL－C)之反應之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑A)、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之第一試藥，和(b)含有於界面活性劑A共存下引起sdLDL－C之由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之反應之試藥第二試藥。
[8]如[6]或[7]記載之套組，其中於界面活性劑A共存下引起sdLDL－C之依膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之反應之試藥為sdLDL－C之解除抑制膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－該氧化型輔酶之之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑B)。
[9]如[6]~[8]之任一記載之套組，其中界面活性劑A為由聚氧乙烯烷胺、胺氧化物類、烷基甜菜鹼、烷銨基－1－丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、聚氧乙烯苄基－烷基4級銨鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺、聚氧乙烯多環苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷胺硫酸酯鹽、N－醯基牛膽磺酸鹽、N－醯胺基酸鹽、乙二胺－聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、不含聚乙二醇之聚丙二醇衍生物、如下式(I)HO－(C 3 H 6 O) a －(C 2 H 4 O) b －(C 3 H 6 O) c －H (I) (式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數9以下之烷基)而成之群選擇之界面活性劑。
[10]如[6]~[9]之任一記載之套組，其中界面活性劑B為由聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數10以上之烷基)、聚氧乙烯烷基苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基苯醚、聚氧乙烯多環苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基多環苯醚、如下式(II)HO－(C 2 H 4 O) d －(C 3 H 6 O) e －(C 2 H 4 O) f －H (II) (式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷胺而成之群選擇之界面活性劑。
[11]如[6]~[10]之任一記載之套組，其中至少於第一試藥含有蛋白素(albumin)。
[12]如[6]~[11]之任一記載之套組，其中含有作為第三試藥之含有已知濃度之sdLDL之標準品。
本發明提供簡便且正確地定量檢體中sdLDL－C之方法及套組。
 實施發明之最佳形態
HDL－C、VLDL－C及CM－C為將各HDL、VLDL及CM中之游離型膽固醇和酯型膽固醇合倂者。
本發明之測定方法中所用檢體可為例如全血、血漿、血清、髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等、以血漿及血清較佳。
本發明中膽固醇酯水解酶只要具有膽固醇酯水解能力之酵素則無特限，例如動物、植物或微生物由來之膽固醇解酯酶、脂蛋白解脂酶之外，也可用依基因工程手法製造之膽固醇解酯酶、脂蛋白解脂酶等。
膽固醇酯水解酶可用無修飾之膽固醇酯水解酶，也可用化學修飾之膽固醇酯水解酶。又膽固醇酯水解酶也可用市售品。
市售之膽固醇酯水解酶可為膽固醇解酯酶(cholesterol esterase)“Amano”2(CHE2；天野酵素公司製)、膽固醇解酯酶“Amano”3(CHE3；天野酵素公司製)、脂蛋白解脂酶(lipoprotein lipase)“Amano”3(LPL3；天野酵素公司製)、脂蛋白解脂酶(LPL－311；東洋紡績公司製)、脂蛋白解脂酶(LPL－312；東洋紡績公司製)、膽固醇解酯酶(COE－301；東洋紡績公司製)、脂蛋白解脂酶(LPBP；旭化成公司製)、膽固醇解酯酶(CEBP－M；旭化成公司製)、膽固醇解酯酶(CEN；旭化成公司製)、解脂酶(LP；旭化成公司製)、解脂酶(LPM；旭化成公司製)、解脂酶(LPAP；旭化成公司製)、解脂酶(LIPS；旭化成公司製)、膽固醇解酯酶(CHE－BE；龜甲萬公司製)等。又本發明中，也可組合2種以上之膽固醇酯水解酶使用。
化學修飾之膽固醇酯水解酶中，修飾膽固醇酯水解酶之基(化學修飾基)，可例如以聚乙二醇為主成分之基、以聚丙二醇為主成分之基、具有聚丙二醇和聚乙二醇之共聚物之基、含有水溶性多糖類之基、磺酸丙基、磺酸丁基、聚胺甲酸酯基、具有螯合機能之基等，唯以聚乙二醇為主成分之基較佳。水溶性多糖類可為例如聚葡萄糖、聚三葡萄糖、可溶性澱粉等。
將膽固醇酯水解酶化學修飾之試藥(化學修飾劑)可為兼具上述化學修飾基能與酵素之胺基、羧基、硫醯烴基等反應之官能基或構造之化合物等。能與酵素中之胺基反應之官能基或構造可為例如羧基、活性酯基(N－羥基丁二醯亞胺基等)、酸酐、醯氯、醛、環氧化物基、1,3－丙烷氯苯二磺醯胺、1,4－丁烷氯苯二磺醯胺等。能與酵素中之羧基反應之官能基或構造可為例如胺基等。能與酵素中之硫醯烴基反應之基或構造可為例如馬來醯亞胺基、二硫化物、α－鹵酯(α－碘酯等)等。
化學修飾劑也可用市售品。市售之化學修飾劑可為具有以聚乙二醇為主成分之基和N－羥基丁二醯亞胺基之sunbright VFM－4101、sunbright ME－050AS、sunbright DE－030AS(皆為日本油脂公司製)、具有以聚乙二醇或聚丙二醇等聚烷二醇為主成分之基和酸酐構造之sunbright AKM系列(例如sunbright AKM－1510等)、sunbright ADM系列、sunbright ACM系列(皆為日本油脂公司製)、具有以聚乙二醇為主成分之基和環氧化物基之EPOX－3400、M－EPOX－5000(皆為Sheawater Polymers公司製)、具有螯合機能之基和酸酐構造之二伸乙基三胺－N,N,N’,N’’,N’’－五乙酐(DTPA酐；同仁化學硏究所公司製)等。
膽固醇酯水解酶之化學修飾可例如依如下方法施行，惟本方法不受此限定。先將膽固醇酯水解酶以pH8.0以上之緩衝液{例如2－〔4－(2－羥乙基)－1－哌基〕乙磺酸(HEPES)緩衝液}溶解，於0~55℃添加0.01~500倍莫耳量之化學修飾劑，予以5分~5小時之攪拌。實際之酵素反應中，化學修飾之膽固醇酯水解酶不僅此反應液其本身，必要時也可用依超濾膜等去除未反應之化學修飾劑等者。
本反應之方法所用膽固醇酯水解酶之濃度只要為可定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，惟反應液中以0.001~2000U/mL之濃度較佳，以0.005~1000U/mL更佳。
本發明中膽固醇氧化酶只要為具有將膽固醇氧化而生成過氧化氫之能力之酵素則無特限，例如除動物、植物或微生物由來之膽固醇氧化酶之外，也可用依基因工程手法製造之膽固醇氧化酶等，也可用膽固醇氧化酶“Amano”1(CHOD 1；天野酵素公司製)、膽固醇氧化酶(CHO－PEL；龜甲萬公司製)、膽固醇氧化酶(CHO－PEWL；龜甲萬公司製)、膽固醇氧化酶(CHO－CE；龜甲萬公司製)膽固醇氧化酶(COO321；東洋紡績公司製)、膽固醇氧化酶(COO－322；東洋紡績公司製)等市售品。又本發明中可將2種以上之膽固醇氧化酶組合使用。
膽固醇氧化酶可為無修飾之酵素，也可為化學修飾之酵素。化學修飾之膽固醇氧化酶可用例如前述化學修飾劑，依前述化學修飾方法來製作。
本反應之方法所用膽固醇氧化酶之濃度只要為能定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，反應液中以0.001~2000U/mL之濃度較佳，以0.005~1000U/mL之濃度更佳。
本發明中膽固醇脫氫酶只要為於氧化型輔酶之存在下具有能將膽固醇氧化而生成還原型輔酶之能力之酵素則無特限，例如除動物、植物或微生物由來之膽固醇脫氫酶之外，也可用依基因工程手法製造之膽固醇脫氫酶等。也可用膽固醇脫氫酶“Amano”5(CHDH5；天野酵素公司製)等市售品。又本發明中可將2種以上之膽固醇脫氫酶組合使用。
膽固醇脫氫酶可為無修飾之酵素，也可為化學修飾之酵素。化學修飾之膽固醇脫氫酶可用例如前述化學修飾劑，依前述化學修飾方法製作。
本反應之方法所用膽固醇脫氫酶之濃度只要為能定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，反應液中以0.001~2000U/mL之濃度較佳，以0.005~1000U/mL之濃度更佳。
用膽固醇脫氫酶之定量中使用之氧化型輔酶可為例如NAD(P)＋ 、thio－NAD(P)＋ 等。於氧化型輔酶共存下之膽固醇脫氫酶與脂蛋白中之膽固醇之反應生成之還原型輔酶可為例如NAD(P)H、thio－NAD(P)H等。
依本發明之方法所用氧化型輔酶之濃度只要為能定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，反應液中以0.01~400mmol/L之濃度較佳，以0.1~100mmol/L之濃度更佳。
本發明之sdLDL－C之定量方法中，也可用還原型輔酶氧化酶。在此，還原型輔酶氧化酶為與膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶一起使用，將依氧化型輔酶共存下之膽固醇脫氫酶與脂蛋白中之膽固醇之反應而生成之還原型輔酶轉換為過氧化氫。還原型輔酶氧化酶可為例如NAD(P)H氧化酶等。還原型輔酶氧化酶也可市售品。市售之還原型輔酶氧化酶可為NADH氧化酶(宇宙生技公司製)等。
本發明之方法所用還原型輔酶氧化酶之濃度只要為能定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，反應液中以0.01~400U/mL之濃度較佳，以0.02~200U/mL之濃度更佳。
本發明中使用之蛋白素只要為能定量本發明之sdLDL－C之蛋白素則無特限，例如牛、馬、綿羊、人由來之蛋白素等，以牛血清蛋白素(BSA)較佳。又也可用依基因工程手法製造之蛋白素。本發明中也可將2種以上之蛋白素組合使用。本發明之sdLDL－C之定量中蛋白素之濃度只要為能定量本發明之sdLDL－C之濃度則無特限，反應液中之濃度以0.001~10%較佳，以0.01~5%更佳。
本發明中界面活性劑A為具有抑制依膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之sdLDL－C之反應，而施行LgLDL－C之反應之性質。具體而言，與依膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之HDL－C、VLDL－C、CM－C及LgLDL－C之反應比較，優先抑制依該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之sdLDL－C之反應之界面活性劑，工程(i)中，sdLDL－C以外之亦即HDL－C、VLDL－C、CM－C及LgLDL－C之去除所用之界面活性劑。以下有時將HDL－C、VLDL－C、CM－C及LgLDL－C總稱為sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇。
界面活性劑A可為例如聚氧乙烯烷胺(以下簡稱POE烷胺)、胺氧化物類、烷基甜菜鹼、烷銨基－1－丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、聚氧乙烯苄基－烷基4級銨鹽(以下簡稱POE苄基－烷基4級銨鹽)、聚氧乙烯脂肪醯胺(以下簡稱POE脂肪醯胺)、聚氧乙烯多環苯醚硫酸酯鹽(以下簡稱POE多環苯醚硫酸酯鹽)、聚氧乙烯烷基苯醚硫酸酯鹽(以下簡稱POE烷基苯醚硫酸酯鹽)、聚氧乙烯脂肪醯胺硫酸酯鹽(以下簡稱POE脂肪醯胺硫酸酯鹽)、聚氧乙烯烷胺硫酸酯鹽(以下簡稱POE烷胺硫酸酯鹽)、N－醯基牛膽磺酸鹽、N－醯胺基酸鹽、乙二胺－聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物(以下簡稱乙二胺－POE．POP縮合物)、不含聚乙二醇之聚丙二醇衍生物(以下簡稱PPG衍生物)、如下式(I)HO－(C 3 H 6 O) a －(C 2 H 4 O) b －(C 3 H 6 O) c －H (I) (式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物(以下簡稱POE．POP縮合物)、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數9以下之烷基)(以下簡稱C9以下之POE．POA烷基醚)等。
POE烷胺、烷基甜菜鹼、烷銨基－1－丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、POE烷基苯醚硫酸酯鹽、POE烷胺硫酸酯鹽中烷基可為碳數1~30之例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、二十一基、二十二基(山萮基)、二十三基、二十四基、二十五基、二十六基、二十七基、二十八基、二十九基、三十基等。
POE烷胺之市售品可為PioninD－3104、PioninD－3110、PioninD－3120(以上竹本油脂公司製)、naiminL－207(以上日本油脂公司製)、BLAUNON L－205(以上青木油脂公司製)等。
胺氧化物類可為例如烷胺氧化物、聚氧乙烯烷胺氧化物(以下簡稱POE烷胺氧化物)等。烷胺氧化物、POE烷胺氧化物中烷基可為例如取代或非取代之碳數1~30烷基等。該烷基可為前述之烷基等。該取代基可為例如羥基等。胺氧化物類之市售品可為unisafeA－LE、unisafeA－LM、unisafeA－LY(以上日本油脂公司製)等。
烷基甜菜鹼之市售品可為NISSAN ANON BL、NISSAN ANON BF(以上日本油脂公司製)、amphitol 24B、amphitol 86B(以上花王公司製)等。
烷銨基－1－丙磺酸鹽之市售品可為ZWITTERGENT3－10、ZWITTERGENT3－12(以上CALBIOCHEM公司製)等。
醯胺烷基甜菜鹼之市售品可為anonBDF－SF(日本油脂公司製)等。
POE苄基－烷基4級銨鹽之市售品可為BISUNORU SK(一方社公司製)等。
POE脂肪醯胺之市售品可為naimidMT－215(日本油脂公司製)、NikkorTAMDS15(日光Chemicals公司製)等。
POE多環苯醚硫酸酯鹽中多環苯基可為基內有1芳香環之基(取代基)2個以上取代之苯基、基內有2個以上芳香環之基(取代基)1個或複數取代之苯基等。基內有1芳香環之基可為例如苄基、1－(苯基)乙基等。基內有2個以上芳香環之基可為例如萘基等。POE多環苯醚硫酸酯鹽之市售品可為Newcor707－SF、Newcor707－SFC、Newcor707－SN、Newcor723－SF(以上日本乳化劑公司製)等。
POE烷基苯醚硫酸酯鹽之市售品可為HitenorN－07、HitenorN－08、HitenorN－17(以上第一工業藥品公司製)等。
POE脂肪醯胺硫酸酯鹽之市售品可為sunamideCF－3、sunamideCF－10(以上日本油脂公司製)等。
POE烷胺硫酸酯鹽之市售品可為Mignol PA－30(一方社公司製)等。
N－醯基牛膽磺酸鹽之市售品可為NikkorCMT－30、NikkorPMT(以上日光Chemicals公司製)、DAIYAPON T膏、DAIYAPON T粉、DAIYAPON K、DAIYAPON LM、DAIYAPON K－MG(以上日本油脂公司製)等。
N－醯胺基酸鹽中胺基酸可為肉胺酸、丙胺酸等。N－醯胺基酸鹽之市售品可為丁二酸酯LN－30、丁二酸酯CN－30、丁二酸酯LK－30、丙胺酸酯LN－30(以上日光Chemicals公司製)、FilletL(日本油脂公司製)等。
乙二胺－POE．POP縮合物之市售品可為ADEKAPURURONIKKU TR－701、ADEKAPURURONIKKU TR－702、ADEKAPURURONIKKU TR－704、ADEKAPURURONIKKU TR－913R(以上旭電化公司製)、YUNIRUBU 32TY－65BI(日本油脂公司製)等。
不含聚乙二醇之PPG衍生物可為聚丙二醇(以下簡稱PPG)、聚氧丙烯烷基醚(以下簡稱POP烷基醚)等。PPG以例如分子量1200以下之PPG較佳。分子量1200以下之PPG之市售品可為YUNIOL D－700(日本油脂公司製)、newpolPP－400(三洋化成公司製)等。POP烷基醚之市售品可為YUNIRUBU MB－2(日本油脂公司製)等。
如下式(I)HO－(C 3 H 6 O) a －(C 2 H 4 O) b －(C 3 H 6 O) c －H (I) (式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示POE．POP縮合物之市售品可為Pluronic 25R－1、Pluronic 25R－2(以上旭電化公司製)、BLAUNON EP－0480、BLAUNON EP－0670、BLAUNON EP－1461(以上青木油脂公司製)等。
C9以下之POE．POP烷基醚中烷基可為例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。C9以下之POE．POP烷基醚之市售品可為YUNIRUBU 50MB－26、YUNIRUBU 50MB－72(以上日本油脂公司製)等。
本發明中界面活性劑A不只1種，也可用2種以上之組合。
因本申請案，揭示由於膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶抑制sdLDL中膽固醇之反應，而呈示施行LgLDL中膽固醇反應作用之界面活性劑存在之當業者，除上述例示者以外，由下述判定也容易將本發明之界面活性劑A之具體例把握、選擇。由該方法選擇之界面活性劑也包含於本發明之界面活性劑A。
界面活性劑A之判定可依如下方法施行。
1)脂蛋白劃份之分離將血清中之HDL、VLDL、CM、LgLDL、sdLDL之各劃份依比重而分離精製。具體而言，依「新生化學實驗講座4」(東京化學同人)記載之超離心法，由人血清分取HDL(比重1.063以上)、sdLDL(比重1.044~1.063)、LgLDL(比重1.006~1.044)、VLDL及CM(比重1.006以下)之4個脂蛋白劃份。
2)界面活性劑A之判定用試藥例1 緩衝液，例如MOPS(pH7.0)膽固醇酯水解酶，例如LPL3膽固醇氧化酶，例如CHO－PEL過氧化氫測定試藥，例如過氧化酶、N－乙基－N－(3－甲基苯基)－N’－丁二醯基乙二胺(EMSE)及4－胺基安替比林(4－AA)應檢討之界面活性劑
例2 緩衝液，例如MOPS(pH7.0)膽固醇酯水解酶，例如LPL3膽固醇脫氫酶，例如CHDH5氧化型輔酶，例如NAD[必要時，還原型輔酶測定試藥，例如2－(4－碘苯基)－3－(2,4－二硝苯基)－5－(2,4－二磺酸苯基)－2H－四銼單鈉鹽(WST－3)]應檢討之界面活性劑
例3 緩衝液，例如MOPS(pH7.0)膽固醇酯水解酶，例如LPL3膽固醇脫氫酶，例如CHDH5氧化型輔酶，例如NAD還原型輔酶氧化酶，例如NADH氧化酶過氧化氫測定試藥，例如過氧化酶、EMSE及4－AA應檢討之界面活性劑
於上述各試藥必要時也可含有後述水性媒劑、安定化劑、防腐劑、影響物質消去劑、反應促進劑等。
3)界面活性劑A判定方法以各脂蛋白劃份為檢體添加於反應胞(2 μ L)，次添加上述2)記載之試藥(0.15mL)來開始反應，於37℃加溫5分，測定反應液之吸光度直線增加之時間，例如反應5分後之反應液之吸光度變化(△E脂蛋白劃份 )。
各脂蛋白劃份代之以生理食鹽水作為檢體，施行同樣測定，算出吸光度變化(△E空白 )，各脂蛋白劃份中「反應吸光度1」依下述(式1)算出。
反應吸光度1＝△E脂蛋白劃份 －△E空白 (式1)
就各脂蛋白劃份，用日立7170S形自動分析裝置，以屬總膽固醇定量用套組之測定機CTC(協和medex公司製)，同樣算出「反應吸光度2」。
繼將各脂蛋白劃份之反應率依下述(式2)算出。
sdLDL劃份中選擇反應率低，而LgLDL劃份中反應率高之界面活性劑，以選擇sdLDL劃份中反應率低HDL、VLDL、CM及LgLDL劃份中反應率高之界面活性劑為界面活性劑A較佳。
與依膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之HDL－C、VLDL－C、CM－C及LgLDL－C之反應比較，所謂優先抑制依該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之sdLDL－C之反應，乃指對HDL、VLDL、CM及LgLDL之各劃份中膽固醇反應率之sdLDL劃份中膽固醇反應率小，對HDL、VLDL、CM及LgLDL之各劃份中膽固醇反應率之sdLDL劃份中膽固醇反應率之比例較佳為50%以下，更佳為20%以下，特佳為10%以下。
雖有使用酵素之種類及濃度等反應條件相異，則界面活性劑之反應性相異之場合，但可依設定之條件判斷檢討對象之界面活性劑可否作為本發明之界面活性劑A使用。
本發明之sdLDL－C之定量方法中界面活性劑A之濃度較佳為sdLDL以外之脂蛋白，即以HDL、VLDL、CM及LgLDL中之膽固醇為優先去除之濃度，反應液中之濃度以0.0001~1%較佳，以0.0005~0.5%更佳。
引起本發明中sdLDL－C之反應試藥為將檢體與膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶於界面活性劑A之存在下反應，去除sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇後，可依反應液中殘存之sdLDL－C之膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶反應之試藥。具體而言，界面活性劑A之存在下，去除sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇所使用之解除依膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶－氧化型輔酶之抑制sdLDL－C之反應之界面活性劑(以下簡稱該界面活性劑為界面活性劑B)及界面活性劑A之存在下使與sdLDL－C之反應可能之酵素等。
本發明中界面活性劑B可為例如聚氧乙烯烷基醚(以下簡稱POE烷基醚)、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數10以上之烷基)(以下簡稱C10以上之POE．POA烷基醚)、聚氧乙烯烷基苯醚(以下簡稱POE烷基苯醚)、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基苯醚(以下簡稱POE．POA烷基苯醚)、聚氧乙烯多環苯醚(以下簡稱POE多環苯醚)、聚氧乙烯聚氧伸烷基多環苯醚(以下簡稱POE．POA多環苯醚)、如下式(II)HO－(C 2 H 4 O) d －(C 3 H 6 O) e －(C 2 H 4 O) f －H (II) (式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物(以下簡稱POE．POP縮合物)、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷胺(以下簡稱POE．POA烷胺)等。
POE烷基醚以HLB為15.0未滿之POE烷基醚(該烷基為碳數20以下之烷基)較佳。HLB為15.0未滿之POE烷基醚(該烷基為碳數20以下之烷基)中烷基可為例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、異癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、己基癸基、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、辛基十二基等。HLB為15.0未滿之POE烷基醚(該烷基為碳數20以下之烷基)之市售品可為MORINOL L－80(HLB13.1；碳數12)(MORIN化學公司製)、EMULUMIN NL－80(HLB13.1；碳數12)、EMULUMIN NL－90(HLB13.6；碳數12)、EMULUMIN NL－100(HLB14.0；碳數12)、EMULUMIN NL－110(HLB14.4；碳數12)(以上三洋化成公司製)、Neu Genn TDS－80(HLB13.3；碳數13)、Neu Genn TDS－120(HLB14.8；碳數13)(以上第一工業製藥公司製)、EMALEX 1615(HLB13.0；碳數16)、EMALEX 1820(HLB14.0；碳數18)、EMALEX OD－16(HLB12.0；碳數20)(以上日本乳化劑公司製)等。
C10以上之POE．POA烷基醚可為HLB為15.0未滿且烷基之碳數為10以上20以下之POE．POA烷基醚較佳。HLB為15.0未滿且烷基之碳數為10以上20以下之POE．POA烷基醚中烷基可為例如癸基、異癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、己基癸基、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、辛基十二基等。HLB為15.0未滿且烷基之碳數為10以上20以下之POE．POA烷基醚中聚氧伸烷基可為聚氧乙烯以外之例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。HLB為15.0未滿且烷基之碳數為10以上20以下之POE．POA烷基醚之市售品可為例如WONDERSURF ID－50(HLB10.5；碳數10)、WONDERSURF ID－70(HLB12.1；碳數10)、WONDERSURF ID－90(HLB13.3；碳數10)、WONDERSURF S－800(HLB12.3；碳數13)、WONDERSURF S－1000(HLB13.2；碳數13)、WONDERSURF S－1400(HLB14.4；碳數13)(以上青木油脂公司製)等。
POE烷基苯醚以HLB為16.0未滿之POE烷基苯醚較佳。HLB為16.0未滿之POE烷基苯醚中烷基可為碳數1~30之例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、二十一基、二十二基(山萮基)、二十三基、二十四基、二十五基、二十六基、二十七基、二十八基、二十九基、三十基等。HLB為16.0未滿之POE烷基苯醚之市售品可為NonionNS－210(HLB13.3)、NonionNS－212(HLB14.1)、NonionNS－215(HLB15.0)、NonionHS－210(HLB13.6)(以上日本油脂公司製)、EMULUGEN911(HLB13.7)、EMULUGEN913(HLB14.5)(以上花王公司製)等。
POE．POA烷基苯醚以HLB為16.0未滿之POE．POA烷基苯醚較佳。HLB為16.0未滿之POE．POA烷基苯醚中烷基可為碳數1~30之、例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、二十一基、二十二基(山萮基)、二十三基、二十四基、二十五基、二十六基、二十七基、二十八基、二十九基、三十基等。HLB為16.0未滿之POE．POA烷基苯醚中聚氧伸烷基可為聚氧乙烯以外之例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。HLB為16.0未滿之POE．POA烷基苯醚之市售品可為ACRONECES KP－189R、DISPANOL LS－100(以上日本油脂公司製)、EMULUGENL－40(花王公司製)等。
POE多環苯醚以HLB為13.0未滿之POE多環苯醚較佳。HLB為13.0未滿之POE多環苯醚中多環苯基可為基內有1芳香環之基(取代基)2個以上取代之苯基、基內有2個以上芳香環之基(取代基)1個或複數取代之苯基等。基內有1芳香環之基可為例如苄基、1－(苯基)乙基等。基內有2個以上芳香環之基可為例如萘基等。HLB為13.0未滿之POE多環苯醚之市售品可為EMULUGEN A－60(HLB12.8)(花王公司製)、BLAUNON DSP－9(HLB11.4)、BLAUNON DSP－12.5(HLB12.8)(以上青木油脂公司製)、Newcor2607(HLB11.8)(日本乳化劑公司製)等。
POE．POA多環苯醚以HLB為13.0未滿之POE．POA多環苯醚較佳。HLB為13.0未滿之POE．POA多環苯醚中多環苯基可為基內有1芳香環之基(取代基)2個以上取代之苯基、基內有2個以上芳香環之基(取代基)1個或複數取代之苯基等。基內有1芳香環之基可為例如苄基、1－(苯基)乙基等。基內有2個以上芳香環之基可為例如萘基等。HLB為13.0未滿之POE．POA多環苯醚中聚氧伸烷基可為聚氧乙烯以外之例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。HLB為13.0未滿之POE．POA多環苯醚之市售品可為Newcor707F(HLB12.4)(以上日本乳化劑公司製)等。
如下式(II)HO－(C 2 H 4 O) d －(C 3 H 6 O) e －(C 2 H 4 O) f －H (II) (式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示POE．POP縮合物以POP之分子量為1200以上且POE含量為60%以下之POE．POP縮合物較佳。POP之分子量為1200以上且POE含量為60%以下之POE．POP縮合物之市售品可為Pronon 204(POP之分子量：2000；POE含量：40%)(日本油脂公司製)、newpol PE－62(POP之分子量：1750；POE含量：20%)、newpol PE－64(POP之分子量：1750；POE含量：40%)、newpol PE－71(POP之分子量：2050；POE含量：10%)、newpol PE－75(POP之分子量：2050；POE含量：50%)(以上三洋化成公司製)、Pluronic P－84(POP之分子量：2250；POE含量：40%)、Pluronic P－85(POP之分子量：2250；POE含量：50%)、Pluronic P－103(POP之分子量：3250；POE含量：30%)(以上旭電化公司製)等。
POE．POA烷胺中烷基可為碳數1~30之例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基(月桂基)、十三基、十四基(肉豆蔻基)、十五基、十六基(鯨蠟基)、十七基、十八基(硬脂基)、十九基、二十基、二十一基、二十二基(山萮基)、二十三基、二十四基、二十五基、二十六基、二十七基、二十八基、二十九基、三十基等。POE．POA烷胺中聚氧伸烷基可為聚氧乙烯以外之例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。POE．POA烷胺之市售品可為BLAUNON LPE1007(青木油脂公司製)、烷基(C16)胺EO20PO10(日本油脂公司製)等。
本發明中界面活性劑B可不只1種，也可將2種以上組合使用。
當業者可依本發明之實施例2之方法等，將提高sdLDL劃份之反應率之界面活性劑作為界面活性劑B適宜把握．選擇。雖有使用酵素之種類及濃度等反應條件相異，則界面活性劑之反應性相異之場合，但可以設定之條件檢討對象之界面活性劑而判斷可否作為本發明界面活性劑B使用。
本發明之sdLDL－C之定量方法中界面活性劑B之濃度為使sdLDL－C之定量可能之濃度，反應液中之濃度以0.001~5%較佳，以0.01~0.5%更佳。
界面活性劑A之存在下與sdLDL－C之反應可能之酵素可為膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶等，惟以膽固醇酯水解酶較佳。膽固醇酯水解酶代替界面活性劑B使用之場合，該膽固醇酯水解酶可為與工程(i)使用之膽固醇酯水解酶同種之膽固醇酯水解酶，也可異種之膽固醇酯水解酶。使用同種之膽固醇酯水解酶之場合，工程(ii)中，添加可定量殘存sdLDL－C之量之膽固醇酯水解酶。又使用異種之膽固醇酯水解酶之場合，只要可定量殘存sdLDL－C之之膽固醇酯水解酶則無特限。
工程(ii)中，引起sdLDL－C之反應之試藥可為酵素與界面活性劑之組合。該組合只要為可定量去除sdLDL以外之脂蛋白後之反應液中殘存之sdLDL－C之組合則無特限。構成該組合之酵素及界面活性劑無須單獨可定量殘存之sdLDL－C之必要，只要組合使用則可定量殘存之sdLDL－C即可。
HLB乃指親水性－親油性均衡值。本發明所用界面活性劑例如POE多環苯醚之HLB為可依界面活性劑手冊(吉田 時行等著 工業圖書公司)或新界面活性劑(堀口 博著 三共出版公司)記載之方法算出。又該HLB可利用各種界面活性劑之製造廠商之型錄或小冊記載之HLB值。
(sdLDL－C定量方法)本發明之sdLDL－C定量方法為包括下述工程(i)~(iii之方法。
(i)於含有界面活性劑A之反應液中，令檢體與膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶、或膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶及氧化型輔酶作用，去除該檢體中之sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇之工程，(ii)添加引起前述工程(i)後反應液中殘存sdLDL－C之反應之試藥，生成過氧化氫或還原型輔酶，測定生成之過氧化氫或還原型輔酶之工程，(iii)用含有已知濃度之sdLDL－C之標準檢體，施行前述(i)及(ii)之工程而生成過氧化氫或還原型輔酶，測定生成之過氧化氫或還原型輔酶，將sdLDL－C濃度與係屬過氧化氫或還原型輔酶之測定值予以關連，而決定該檢體中之sdLDL－C濃度之工程，又不施行工程(iii)，而施行工程(i)及工程(ii)，也可作為檢體中之sdLDL－C之檢出方法。
工程(i)中檢體中之sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇之去除方法可為例如去除由該膽固醇轉換之過氧化氫、或由該膽固醇生成之還原型輔酶之方法。該去除方法以由該膽固醇生成過氧化氫，次去除該過氧化氫之方法較佳。
過氧化氫之去除可例如使用過氧化氫去除試藥來施行。過氧化氫去除方法以將過氧化氫與催化酶作用、或於過氧化氫將過氧化活性物質與氧化偶合發色反應所用之2個氧化偶合色原體之一方組合來作用之方法較佳。
還原型輔酶之去除可例如於還原型輔酶與還原型輔酶氧化酶作用，將生成之過氧化氫使用過氧化氫去除試藥而去除來施行。
過氧化氫去除試藥只要能將由sdLDL－C以外之脂蛋白之膽固醇生成之過氧化氫轉換為不影響測定由sdLDL－C生成過氧化氫之物質之試藥則無特限，例如含有催化酶之試藥、含有過氧化活性物質和氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方之試藥等。過氧化活性物質可為例如過氧化酶等。氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方，具體而言，可例示後述「氧化偶合發色型色原體」中偶合劑、或苯胺類或酚類。本說明書中，「另一方之氧化偶合型色原體」之用語乃與「氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方」之用語相對使用，例如前者乃指偶合劑之場合，後者乃示酚類或苯胺類，前者乃指酚類或苯胺類之場合，後者乃示偶合劑。
過氧化氫去除試藥若使用含有催化酶之試藥時，催化酶之濃度以0.001~5000kU/L較佳，以0.01~1000kU/L更佳。又本發明之工程(i)中，過氧化氫去除試藥使用催化酶時，以工程(ii)中有共存催化酶抑制劑較佳。催化酶抑制劑可為環偶氮化單鈉、H2 S、HCN、NH2 OH、3－胺基－1,2,4－三唑等，使用濃度只要抑制催化酶活性，不影響測定工程(ii)生成之過氧化氫之濃度則無特限，唯較佳為0.5~60mmol/L，更佳為1~30mmol/L。
過氧化氫去除試藥使用過氧化活性物質和氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方時，過氧化活性物質為過氧化酶等。過氧化酶之濃度以0.01~500kU/L較佳，以1~100kU/L更佳。氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方之濃度以0.01~10g/L較佳。
本發明工程(i)中去除sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇為不僅止於將由該膽固醇生成之過氧化氫或還原型輔酶轉換為其他物質而消去。例如過氧化氫和還原型輔酶之分別測定可能時，無須由該膽固醇生成之過氧化氫或還原型輔酶轉換為其他物質之必要。例如於工程(i)由sdLDL以外之脂蛋白中膽固醇生成還原型輔酶，於工程(ii)由sdLDL中膽固醇生成過氧化氫時，無須將工程(i)生成之還原型輔酶轉換為其他物質之必要。本發明更也包含測定工程(i)生成之過氧化氫或還原型輔酶，而基於所得測定值算出工程(ii)生成之過氧化氫或還原型輔酶，來定量檢體中之sdLDL－C。
在此，過氧化氫之測定雖也可以例如過氧化氫電極或後述過氧化氫測定試藥來施行，惟以於過氧化氫與過氧化活性物質和氧化發色型色原體作用而生成色素，來測定該色素之吸光度之方法較佳。
還原型輔酶之測定可例如以還原型輔酶之吸收極大附近之波長之吸光度測定，或用後述還原型輔酶測定試藥之測定來施行。
過氧化氫測定用試藥為將生成之過氧化氫轉換為可檢出之物質之試藥。可檢出之物質可為例如色素、光等，惟以色素較佳。可檢出之物質為色素時，過氧化氫測定用試藥含有氧化發色型色原體及過氧化酶等過氧化活性物質。氧化發色型色原體可為例如後述氧化發色型色原體。可檢出物質為光時，過氧化氫測定用試藥含有化學發光物質。化學發光物質可為例如魯米諾(Luminol)、異魯米諾、光澤精、吖錠酯等。
過氧化氫測定用試藥使用含有氧化發色型色原體及過氧化活性物質之試藥時，過氧化氫於過氧化活性物質之存在下與氧化發色型色原體反應而生成色素，測定生成之色素，則可測定過氧化氫。又若使用含有化學發光物質之過氧化氫測定用試藥時，過氧化氫與化學發光物質反應而發生光，測定發生之光，則可測定過氧化氫。
氧化發色型色原體可為例如白型色原體、氧化偶合發色型色原體等。
白型色原體為於過氧化氫及過氧化活性物質之存在下，單獨轉換為色素之物質。具體而言，10－N－羧甲基胺甲醯基－3,7－雙(二甲胺基)－10H－啡噻(CCAP)、10－N－甲基胺甲醯基－3,7－雙(二甲胺基)－10H－啡噻(MCDP)、N－(羧甲基胺羰基)－4,4’－雙(二甲胺基)二苯基胺單鈉鹽(DA－64)、4,4’－雙(二甲胺基)二苯基胺、雙〔3－雙(4－氯苯基)甲基－4－二甲胺基苯基〕胺(BCMA)等。
氧化偶合發色型色原體為於過氧化氫及過氧化活性物質之存在下，2個化合物由氧化的偶合而生成色素之物質。
2個化合物之組合可為偶合劑與苯胺類之組合、偶合劑與酚類之組合等。
偶合劑可為例如4－胺基安替比林(4－AA)、3－甲基－2－苯并噻唑啉酮肼等。
苯胺類可為N－(3－磺酸丙基)苯胺、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－3－甲基苯胺(TOOS)、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－3,5－二甲基苯胺(MAOS)、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－3,5－二甲氧基苯胺(DAOS)、N－乙基－N－(3－磺酸丙基)－3－甲基苯胺(TOPS)、N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－3,5－二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N－二甲基－3－甲基苯胺、N,N－雙(3－磺酸丙基)－3,5－二甲氧基苯胺、N－乙基－N－(3－磺酸丙基)－3－甲氧基苯胺、N－乙基－N－(3－磺酸丙基)苯胺、N－乙基－N－(3－磺酸丙基)－3,5－二甲氧基苯胺、N－(3－磺酸丙基)－3,5－二甲氧基苯胺、N－乙基－N－(3－磺酸丙基)－3,5－二甲基苯胺、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－3－甲氧基苯胺、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)苯胺、N－乙基－N－(3－甲基苯基)－N’－丁二醯基乙二胺(EMSE)、N－乙基－N－(3－甲基苯基)－N’－乙醯基乙二胺、N－乙基－N－(2－羥基－3－磺酸丙基)－4－氟－3,5－二甲氧基苯胺(F－DAOS)等。
酚類可為酚、4－氯酚、3－甲基酚、3－羥基－2,4,6－三碘苯甲酸(HTIB)等。
還原型輔酶測定試藥為將生成之還原型輔酶轉換為可檢出之物質之試藥。可檢出之物質可為例如色素等。可檢出之物質為色素時，還原型輔酶測定試藥為含有還原發色型色原體。還原發色型色原體可為例如3－(4,5－二甲基－2－噻唑基)－2,5－二苯基－2H－溴化四銼(MTT)、2－(4－碘苯基)－3－(4－硝苯基)－5－(2,4－二磺酸苯基)－2H－四銼單鈉鹽(WST－1)、2－(4－碘苯基)－3－(2,4－二硝苯基)－5－(2,4－二磺酸苯基)－2H－四銼單鈉鹽(WST－3)等。
過氧化氫之測定中，過氧化活性物質可為例如過氧化酶等。過氧化活性物質之濃度只要為適合測定之濃度則無特限、過氧化活性物質使用過氧化酶時，以1~100kU/L較佳。又氧化發色型色原體之濃度只要為適合測定之濃度則無特限，以0.01~10g/L較佳。
本發明中，sdLDL－C之測定以於水性媒劑中施行較佳。水性媒劑可為例如脫離子水、蒸餾水、緩衝液等，以緩衝液較佳。於緩衝液使用之緩衝劑可為例如參(羥甲基)胺基甲烷緩衝劑、磷酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、古德之緩衝劑等。
古德之緩衝劑可為例如2－嗎啉基乙磺酸(MES)、雙(2－羥乙基)亞胺基參(羥甲基)甲烷(Bis－Tris)、N－(2－乙醯胺基)亞胺基二乙酸(ADA)、哌－N,N’－雙(2－乙磺酸)(PIPES)、N－(2－乙醯胺基)－2－胺基乙磺酸(ACES)、3－嗎啉基－2－羥基丙磺酸(MOPSO)、N,N－雙(2－羥乙基)－2－胺基乙磺酸(BES)、3－嗎啉基丙磺酸(MOPS)、N－〔參(羥甲基)甲基〕－2－胺基乙磺酸(TES)、2－〔4－(2－羥乙基)－1－哌基〕乙磺酸(HEPES)、3－〔N,N－雙(2－羥乙基)胺基〕－2－羥基丙磺酸(DIPSO)、N－〔參(羥甲基)甲基〕－2－羥基－3－胺基丙磺酸(TAPSO)、哌－N,N’－雙(2－羥基丙磺酸)(POPSO)、3－〔4－(2－羥乙基)－1－哌基〕－2－羥基丙磺酸(HEPPSO)、3－〔4－(2－羥乙基)－1－哌基〕丙磺酸〔(H)EPPS〕、N－〔參(羥甲基)甲基〕甘胺酸(Tricine)、N,N－雙(2－羥乙基)甘胺酸(Bicine)、N－參(羥甲基)甲基－3－胺基丙磺酸(TAPS)、N－環己基－2－胺基乙磺酸(CHES)、N－環己基－3－胺基－2－羥基丙磺酸(CAPSO)、N－環己基－3－胺基丙磺酸(CAPS)等。緩衝液之濃度只要為適合測定之濃度則無特限，以0.001~2.0mol/L較佳，以0.005~1.0mol/L更佳。
決定試料中之sdLDL－C濃度而使用之檢量線可用例如含有已知濃度之sdLDL－C之標準檢體，施行本發明之工程(i)及工程(ii)來生成過氧化氫或還原型輔酶，測定生成之過氧化氫或還原型輔酶，由其測定值和使用之sdLDL－C濃度來作成。
本發明之工程(i)及工程(ii)可例如於10~50℃，較佳為20~40℃，施行1~30分，較佳為2~15分。
(sdLDL－C定量用套組)本發明之sdLDL－C定量用套組可使用於本發明之sdLDL－C之定量方法。sdLDL－C定量用套組之形態只要為使本發明之sdLDL－C定量方法可能之形態則無特限，2試藥系、3試藥系等任何形態皆可，惟以2試藥系較佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組可為例如以下之套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫去除試藥之第一試藥，和含有引起sdLDL－C之反應之試藥及過氧化氫測定試藥之第二試藥為特徵之檢體之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之第一試藥，和含有引起sdLDL－C之反應之試藥之第二試藥為特徵之檢體之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶及還原型輔酶測定試藥之第一試藥，和含有引起sdLDL－C之反應之試藥之第二試藥為特徵之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶氧化酶及過氧化氫去除試藥素之第一試藥，和含有引起sdLDL－C之反應之試藥及過氧化氫測定試藥之第二試藥為特徵之檢體之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫去除試藥之第一試藥，和含有界面活性劑B及過氧化氫測定試藥之第二試藥為特徵之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之第一試藥，和含有界面活性劑B之第二試藥為特徵之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶及還原型輔酶測定試藥之第一試藥，和含有界面活性劑B之第二試藥為特徵之sdLDL－C定量用套組。
以包括含有界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶及過氧化氫去除試藥之第一試藥，和含有界面活性劑B及過氧化氫測定試藥之第二試藥為特徵之sdLDL－C定量用套組。
由第一試藥及第二試藥而成之2試藥系之sdLDL－C定量用套組中，膽固醇酯水解酶為含於第一試藥，惟也可含於第一及第二試藥雙方。膽固醇氧化酶為含於第一試藥，惟也可含於第一及第二試藥雙方。膽固醇脫氫酶為含於第一試藥，惟也可含於第一及第二試藥雙方。
界面活性劑A以含於第一試藥較佳。
氧化型輔酶為含於第一試藥，惟也可含於第一及第二試藥雙方。還原型輔酶氧化酶為含於第一試藥，惟也可含於第一及第二試藥雙方。
過氧化氫去除試藥為以含於第一試藥較佳。過氧化氫去除試藥使用催化酶時，催化酶為以含於第一試藥較佳，催化酶抑制劑為以含於第二試藥較佳。過氧化氫去除試藥使用過氧化酶和氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方之組合時，該組合以含於第一試藥較佳。
界面活性劑B為以含於第二試藥較佳。如前所述，也可使用定量去除sdLDL以外之脂蛋白中之膽固醇後之反應液中殘存sdLDL－C之酵素、或酵素與界面活性劑之組合取代界面活性劑B。
過氧化氫測定試藥使用含有過氧化酶和2個氧化偶合型色原體之試藥時，以2個氧化偶合型色原體各之試藥較佳。過氧化酶為含於第一、第二試藥之任何一方或雙方。過氧化氫去除試藥使用過氧化酶和氧化偶合型發色反應所用之2個氧化偶合型色原體之一方之組合時，可與該組合一起，又與另一方之偶合型色原體組合作為過氧化氫測定試藥。該另一方之偶合型色原體含在第二試藥。
蛋白素以含於第一試藥較佳，惟也可含於第一及第二試藥雙方。
本發明之sdLDL－C定量用套組可為例如以下之態樣之套組，但此等非為限定本發明之範圍者。
套組1 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、催化酶第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥
套組2 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方第二試藥界面活性劑B、另一方之氧化偶合型色原體
套組3 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體第二試藥界面活性劑B
套組4 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶第二試藥界面活性劑B
套組5 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶測定試藥第二試藥界面活性劑B
套組6 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、催化酶第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥
套組7 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方第二試藥界面活性劑B、另一方之氧化偶合型色原體
套組8 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、催化酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥
套組9 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方、蛋白素第二試藥界面活性劑B、另一方之氧化偶合型色原體
套組10 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體、蛋白素第二試藥界面活性劑B
套組11 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B
套組12 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶測定試藥、蛋白素第二試藥界面活性劑B
套組13 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、催化酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥
套組14 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方、蛋白素第二試藥界面活性劑B、另一方之氧化偶合型色原體
套組15 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、催化酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥、蛋白素
套組16 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方、蛋白素第二試藥界面活性劑B、蛋白素、另一方之氧化偶合型色原體
套組17 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體、蛋白素第二試藥界面活性劑B、蛋白素
套組18 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B、蛋白素
套組19 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶測定試藥、蛋白素第二試藥界面活性劑B、蛋白素
套組20 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、催化酶、蛋白素第二試藥界面活性劑B、催化酶抑制劑、過氧化氫測定試藥、蛋白素
套組21 第一試藥界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化酶、氧化偶合型色原體之一方、蛋白素第二試藥界面活性劑B、蛋白素、另一方之氧化偶合型色原體
本發明之sdLDL－C定量用套組所用之界面活性劑A、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化氫去除試藥、界面活性劑B、蛋白素、過氧化氫測定試藥可為各如前述者。
本發明之sdLDL－C定量用套組必要時也可含有水性媒劑、安定化劑、防腐劑、影響物質消去劑、反應促進劑等。水性媒劑可為例如前述之水性媒劑等。安定化劑可為例如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化鈣等。防腐劑可為例如環偶氮化單鈉、Bioace、抗生物質等。影響物質消去劑可為例如消去抗壞血酸之影響之抗壞血酸氧化酶等。反應促進劑可為例如輔解脂酶等酵素、硫酸鈉、氯化鈉等鹽類等。
本發明之sdLDL－C定量用套組可為凍乾狀態，也可為溶解於水性媒劑之狀態。使用凍乾狀態之試藥來定量檢體中之sdLDL－C時，該試藥為以水性媒劑溶解使用。
本發明之sdLDL－C定量用套組中膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶之含量以水性媒劑溶解狀態之濃度成0.001~2000U/mL之含量較佳，以0.005~1000U/mL之含量更佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組中膽固醇脫氫酶、還原型輔酶氧化酶之含量以水性媒劑溶解之狀態之濃度成0.001~2000U/mL含量較佳，以0.005~1000U/mL之含量更佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組中氧化型輔酶之含量以水性媒劑溶解狀態之濃度成0.01~500mmol/L之含量較佳，以成0.1~100mmol/L之含量更佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組中界面活性劑A之含量以水性媒劑溶解之狀態之濃度成0.0001~1%之含量較佳，以成0.0005~0.5%之含量更佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組中界面活性劑B之含量以水性媒劑溶解之狀態之濃度成0.001~5%含量較佳，以成0.01~0.5%之含量更佳。
本發明之sdLDL－C定量用套組中蛋白素含量以水性媒劑溶解之狀態之濃度成0.0001~10%較佳，以0.001~5%更佳。
以下舉實施例更詳細説明本發明，但此等非限定本發明之範圍。本實施例及參考例中使用下述廠商之試藥及酵素。
MOPS(同仁化學硏究所公司製)、EMSE(大東化學公司製)、硫酸鈉(關東化學公司製)、4－胺基安替比林(埼京化成公司製)、過氧化酶(東洋紡績公司製)、CHO－PEL(膽固醇氧化酶；龜甲萬公司製)、CHO－CE(膽固醇氧化酶；龜甲萬公司製)、COO－322(膽固醇氧化酶；東洋紡績公司製)、LPL3(膽固醇酯水解酶；天野酵素公司製)、LP(膽固醇酯水解酶；旭化成公司製)、LIPS(膽固醇酯水解酶；旭化成公司製)、LPAP(膽固醇酯水解酶；旭化成公司製)、過氧化酶(東洋紡績公司製)、BSA(Proliant公司製)。
PioninD－3110(竹本油脂公司製)、PioninD－3120(竹本油脂公司製)、naiminL－207(日本油脂公司製)、unisafeAL－E(日本油脂公司製)、ZWITTERGENT 3－10(CALBIOCHEM公司製)、NISSAN ANON BL(日本油脂公司製)、anonBDF－SF(日本油脂公司製)、BISUNORU SK(一方社公司製)、naimidMT－215(日本油脂公司製)、Newcor707－SF(日本乳化劑公司製)、Newcor723－SF(日本乳化劑公司製)、HitenorN－17(第一工業藥品公司製)、sunamideCF－10(日本油脂公司製)、Mignol PA－30(一方社公司製)、NikkorCMT－30(日光Chemicals公司製)、丁二酸酯LN－30(日光Chemicals公司製)、ADEKAPURURONIKKU TR－704(旭電化公司製)、YUNIOL D－700(日本油脂公司製)、Pluronic 25R－2(旭電化公司製)、YUNIRUBU 50MB－26(日本油脂公司製)。
Neu Genn TDS－80(第一工業藥品公司製)、Neu Genn TDS－120(第一工業藥品公司製)、EMALEX OD－16(日本乳化劑公司製)、WONDERSURF S－800(青木油脂公司製)、WONDERSURF S－1400(青木油脂公司製)、NonionNS－210(日本油脂公司製)、NonionNS－215(日本油脂公司製)、Newcor2607(日本乳化劑公司製)、EMULUGENA－60(花王公司製)、BLAUNONDSP－12.5(青木油脂公司製)、newpol PE－64(三洋化成公司製)、BLAUNONLPE1007(青木油脂公司製)。
[實施例1]
調製由以下之第一試藥及第二試藥而成之sdLDL－C定量用套組。用第1表所示界面活性劑A及界面活性劑B之套組作為實施例1(1)~1(34)之套組。
[實施例2]
依「新生化學實驗講座4」(東京化學同人)記載之超離心法，由人血清各分取HDL(比重1.063以上)、sdLDL(比重1.044~1.063)、LgLDL(比重1.006~1.044)、VLDL及CM(比重1.006以下)之4個脂蛋白劃份，用實施例1之套組算出各脂蛋白劃份中膽固醇之反應率。
(1)依各脂蛋白劃份中膽固醇和實施例1之套組之反應算出各脂蛋白劃份中「反應吸光度」用日立7170S形自動分析裝置，依以下之操作算出「反應吸光度」。
以各脂蛋白劃份為檢體添加於反應胞(2 μ L)，次添加各實施例1之套組之第一試藥(0.15mL)，開始反應(第一反應)，於37℃加溫5分，將反應5分後之反應液之吸光度(E1)以主波長600nm、副波長700nm測定。次於此反應液各添加實施例1(1)~1(34)之套組之第二試藥(0.05mL)，更於37℃加溫5分而施行反應(第二反應)，第二反應5分後之反應液之吸光度(E2)以主波長600nm、副波長700nm測定，由E2減去E1，算出吸光度變化(△E’脂蛋白劃份 )。又各脂蛋白劃份代之以生理食鹽水作為檢體，施行同樣之測定，算出吸光度變化(△E’空白 )。最後由下述(式3)，算出各脂蛋白劃份中「反應吸光度3」。
反應吸光度3＝△E’脂蛋白分劃 －△E’空白 (式3)
(2)各脂蛋白劃份中膽固醇之反應率之算出用日立7170S形自動分析裝置，以總膽固醇定量用套組之測定機CTC(協和medex公司製)取代實施例1之套組以外，仿(1)之方法算出「反應吸光度4」，依(式4)算出實施例1(1)~1(34)各套組之脂蛋白劃份中膽固醇之反應率(%)。
用測定機CTC之測定中算出之「反應吸光度4」為對象脂蛋白中之膽固醇皆反應時之「反應吸光度」。
至於實施例1(1)~1(34)各套組之脂蛋白劃份中膽固醇之反應率，反應率為0~10%以「－」、10~20%以「±」、20~50%以「＋」、50~80%以「＋＋」、80~100%以「＋＋＋」表示者如第2表所示。
如第2表所示，實施例1(1)~1(34)所示套組可用於sdLDL－C之定量。
[實施例3]
調製由以下之第一試藥及第二試藥而成之sdLDL－C定量用套組。用第3表所示界面活性劑A及界面活性劑B之套組作為實施例3(35)~3(44)之套組。
[實施例4]
用實施例3(35)~3(47)之套組，仿實施例2之(1)記載之測定方法，以日立7170S自動分析裝置，測定人血清24檢體各中反應吸光度。
次用該血清仿Journal of Lipid Research vol.44,p.2193－2201(2003)記載之超離心法離心分離該檢體中之sdLDL，所得sdLDL劃份中之膽固醇量用測定機L TCII(協和medex公司製)來測定。將用實施例3(35)~3(47)之套組之測定中測定值，與仿超離心法之測定值之相關係數如第4表。
如第4表所示，由實施例3(35)~3(47)之套組之測定結果，與超離心法之測定結果呈示良好之相關。
又由用第一試藥含有BSA之實施例3(42)和3(43)之套組之測定，與用實施例3(35)和3(37)之套組之測定之比較，得知由用第一試藥含有BSA之套組，與用第一試藥不含有BSA之第一試藥之套組時比較，與超離心法之間之相關更良好。
[實施例5]
調製由以下第一試藥及第二試藥而成之sdLDL－C定量用套組。以用第5表所示界面活性劑A及界面活性劑B之套組作為實施例5(48)~5(57)之套組。
[實施例6]
用實施例3(43)，及實施例5(48)~5(57)之套組，仿實施例2之(1)記載之方法，以日立7170S自動分析裝置測定人血清25檢體中各反應吸光度。
次用該血清仿Journal of Lipid Research vol.44,p.2193－2201(2003)記載之超離心法來離心分離該檢體中之sdLDL，所得sdLDL劃份中之膽固醇量用測定機L TCII(協和medex公司製)測定。用實施例3(43)及實施例5(48)~5(57)之套組測定之測定值，與依超離心法之測定值之相關係數如第6表。
如第6表所示，用實施例3(43)及實施例5(48)~5(57)之套組測定結果，與依超離心法所得測定結果呈示良好相關。
[實施例7]
調製由以下第一試藥及第二試藥而成之sdLDL－C定量用套組。用第7表所示界面活性劑A及界面活性劑B之套組作為實施例7(58)~7(67)之套組。
[實施例8]
用實施例3(36)及實施例7(58)~5(67)之套組，仿實施例2之(1)記載之方法，測定人血清21檢體中各反應吸光度。
次用該血清仿Journal of Lipid Research vol.44,p.2193－2201(2003)記載之超離心法，離心分離該血清中之sdLDL，所得sdLDL劃份中之膽固醇量用測定機L TCII(協和medex公司製)測定。用各實施例及比較例之套組測定之測定值，與依超離心法之測定值之相關係數如第8表。
如第8表所示，用實施例3(36)及實施例7(58)~7(67)之套組測定結果，與依超離心法所得測定結果，呈示良好相關。
[實施例9]
檢體中之sdLDL－C之定量用超離心法及本發明之實施例3(36)及實施例3(44)之套組，就人新鮮血清2檢體，令各檢體中之sdLDL－C依以下方法定量。
(1)超離心法之人血清檢體中之sdLDL－C之定量用該人血清2檢體，依Journal of Lipid Research vol.44,p.2193－2201(2003)記載之超離心法，離心分離該血清中之sdLDL，所得sdLDL劃份中之膽固醇量用測定機L TCII(協和medex公司製)測定。
(2)檢量線之作成將依超離心法之測定得知sdLDL－C濃度為43.1mg/dL之血清標準液作為檢量線作成用樣品。仿實施例2之(1)記載之測定方法，以日立7170S自動分析裝置，用實施例3(36)及實施例3(44)之套組，測定檢量線作成用樣品檢體之反應吸光度，由該反應吸光度與檢量線作成用樣品中之sdLDL－C濃度之關係作成各套組之檢量線。
(3)人血清2檢體中之sdLDL－C之定量檢量線作成用樣品代之以人血清2檢體，仿上述(2)之方法，就該2檢體各施行反應，由反應後之反應液之吸光度與上述(2)作成之檢量線，就各套組決定各檢體中之sdLDL－C濃度。
就該2檢體，依上述(1)中超離心法決定之該檢體中之sdLDL－C濃度，與用上述(3)中實施例3(36)及實施例3(44)之套組測定來決定之該檢體中之sdLDL－C濃度如第9表所示。
第9表乃示用本發明之套組，依本發明之方法可正確定量人血清中之sdLDL－C。
【產業上之利用可能性】
依本發明提供對動脈硬化等冠狀動脈疾病之診斷有用之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之定量方法及定量用套組。

Claims (12)

  1. 一種檢體中之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL-C)之定量方法，包括下述工程(i)、(ii)及(iii)：(i)在含有界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑A)之反應液中，令檢體與該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶、或該膽固醇酯水解酶、該膽固醇脫氫酶及氧化型輔酶作用，以去除該檢體中之HDL-C、VLDL-C、CM-C及LgLDL-C之工程，其中界面活性劑A為與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之高密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱HDL-C)、超低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱VLDL-C)、乳糜微粒中之膽固醇(以下簡稱CM-C)及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱LgLDL-C)之反應比較，在含有優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之sdLDL-C之反應之界面活性劑，(ii)添加引起由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之於含有前述工程(i)之界面活性劑A的反應液中殘存的sdLDL-C之反應之試藥，來生成過氧化氫或還原型輔酶，而測定生成之過氧化氫或還原型輔酶之工程，(iii)使用含有已知濃度之sdLDL-C之標準檢體，進行前述(i)及(ii)之工程來生成過氧化氫或還原型輔酶，而測定 生成的過氧化氫或還原型輔酶，並將sdLDL-C濃度與有關過氧化氫或還原型輔酶之測定值予以關連，來確定該檢體中之sdLDL-C濃度之工程。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於含有工程(i)之界面活性劑A之反應液殘存之sdLDL-C之由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶引起反應之試藥為解除抑制sdLDL-C之膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶之反應之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑B)。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中界面活性劑A為由聚氧乙烯烷胺、胺氧化物類、烷基甜菜鹼、烷銨基-1-丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、聚氧乙烯苄基-烷基4級銨鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺、聚氧乙烯多環苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷胺硫酸酯鹽、N-醯基牛膽磺酸鹽(N-acyl taurine salt)、N-醯胺基酸鹽、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、不含聚乙二醇之聚丙二醇衍生物、如下式(I)HO-(Ca H6 O)a -(C2 H4 O)b -(Ca H6 O)c -H (I)(式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示之聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數9以下之烷基)而成之群組中選擇之界面活性劑。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中界面活性劑B為由聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數10以上之烷基)、聚氧乙烯烷基苯醚、聚氧乙烯聚氧 伸烷基烷基苯醚、聚氧乙烯多環苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基多環苯醚、如下式(II)HO-(C2 H4 O)d -(Ca H6 O)e -(C2 H4 O)f -H (II)(式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示之聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷胺而成之群組中選擇之界面活性劑。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中工程(i)於蛋白素之存在下進行。
  6. 一種檢體中之sdLDL-C定量用套組，其特徵為包括(a)第一試藥，其含有界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑A)、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫去除試藥，其中界面活性劑A為與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之高密度脂蛋白中之膽固醇、超低密度脂蛋白中之膽固醇、乳糜微粒中之膽固醇及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之反應比較，優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶-該氧化型輔酶所致之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL-C)之反應之界面活性劑，和(b)第二試藥，其含有於界面活性劑A共存下引起由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之sdLDL-C之反應之試藥、及過氧化氫測定試藥。
  7. 一種檢體中之sdLDL-C定量用套組，其特徵為包括(a)第一試藥，其含有界面活性劑(以下將該界面活性 劑簡稱界面活性劑A)、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，其中界面活性劑A為與由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之高密度脂蛋白中之膽固醇、超低密度脂蛋白中之膽固醇、乳糜微粒中之膽固醇及大粒子低密度脂蛋白中之膽固醇之反應比較，優先抑制由該膽固醇酯水解酶及該膽固醇氧化酶或該膽固醇脫氫酶-該氧化型輔酶所致之小粒子低密度脂蛋白中之膽固醇(以下簡稱sdLDL-C)之反應之界面活性劑，和(b)第二試藥，其含有於界面活性劑A共存下引起由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之sdLDL-C的反應之試藥。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之套組，其中於界面活性劑A共存下引起由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-氧化型輔酶所致之sdLDL-C之反應之試藥，為使由膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶-該氧化型輔酶所致之sdLDL-C之反應解除抑制之界面活性劑(以下將該界面活性劑簡稱界面活性劑B)。
  9. 如申請專利範圍第6或7項之套組，其中界面活性劑A為由聚氧乙烯烷胺、胺氧化物類、烷基甜菜鹼、烷銨基-1-丙磺酸鹽、醯胺烷基甜菜鹼、聚氧乙烯苄基-烷基4級銨鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺、聚氧乙烯多環苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基苯醚硫酸酯鹽、聚氧乙烯脂肪醯胺硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷胺硫酸酯鹽、N-醯基牛膽磺酸鹽、N-醯胺基酸鹽、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、不含聚乙二醇之聚丙二 醇衍生物、如下式(I)HO-(C3 H6 O)a -(C2 H4 O)b -(C3 H6 O)c -H (I)(式中a、b及c可相同或相異為1~200之整數)所示之聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數9以下之烷基)而成之群組中選擇之界面活性劑。
  10. 如申請專利範圍第6或7項之套組，其中界面活性劑B為由聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基醚(該烷基為碳數10以上之烷基)、聚氧乙烯烷基苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基苯醚、聚氧乙烯多環苯醚、聚氧乙烯聚氧伸烷基多環苯醚、如下式(II)HO-(C2 H4 O)d -(C3 H6 O)e -(C2 H4 O)f -H (II)(式中d、e及f可相同或相異為1~200之整數)所示之聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、及聚氧乙烯聚氧伸烷基烷胺而成之群組中選擇之界面活性劑。
  11. 如申請專利範圍第6或7項之套組，其至少於第一試藥中含有蛋白素。
  12. 如申請專利範圍第6或7項之套組，其含有作為第三試藥之含有已知濃度之sdLDL之標準品。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8088625B2 (en) * 2006-05-01 2012-01-03 Denka Seiken Co., Ltd. Method for detection of familial combined hyperlipidemia
AU2008220056B2 (en) * 2007-02-28 2014-05-01 Denka Company Limited Reagent for quantitative determination of small, dense LDLs
DK2208794T3 (en) 2007-10-10 2016-06-06 Denka Seiken Kk A method and kit for the quantification of small, closely-LDL cholesterol
JP5285000B2 (ja) * 2010-02-23 2013-09-11 富士フイルム株式会社 低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法
WO2011136316A1 (ja) * 2010-04-30 2011-11-03 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
JP5728490B2 (ja) * 2010-10-29 2015-06-03 アークレイ株式会社 低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
JP6047778B2 (ja) * 2012-01-12 2016-12-21 株式会社シノテスト 測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びにビリルビンに由来する影響の回避方法
CN104673879A (zh) * 2015-03-07 2015-06-03 王贤俊 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其制备
CN105385751B (zh) * 2015-12-24 2019-10-15 山东博科生物产业有限公司 一种准确度高、抗干扰能力强的总胆固醇检测试剂
CN105652021B (zh) * 2016-03-11 2018-01-02 上海练佰生物技术中心 一种测定小而密脂蛋白的试剂、方法和试剂盒
JP6829009B2 (ja) * 2016-05-24 2021-02-10 デンカ株式会社 トリグリセリドリッチリポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び定量試薬
CN107446989B (zh) * 2017-06-23 2020-07-14 美康生物科技股份有限公司 测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂
CN107505272B (zh) * 2017-08-10 2020-09-25 东软威特曼生物科技(南京)有限公司 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法
KR102524702B1 (ko) * 2017-09-01 2023-04-21 미나리스메디컬 가부시키가이샤 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트
CN110736846B (zh) * 2018-07-20 2023-07-14 上海微鸿企业管理有限公司 一种小而密脂蛋白的测定试剂、方法和试剂盒
JP6426873B1 (ja) * 2018-08-06 2018-11-21 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
CN111690715A (zh) * 2019-03-12 2020-09-22 程明 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其测定方法
JP6703175B1 (ja) * 2019-09-10 2020-06-03 デンカ生研株式会社 キットおよび方法
CN110564810A (zh) * 2019-09-19 2019-12-13 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种高性能小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
CN110791549B (zh) * 2019-12-03 2023-09-26 宁波普瑞柏生物技术股份有限公司 定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒
CN111269962B (zh) * 2020-03-18 2021-03-23 浙江夸克生物科技有限公司 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用
CN113495069B (zh) * 2021-04-19 2024-04-26 深圳市锦瑞生物科技股份有限公司 一种总胆固醇检测试剂及检测芯片
WO2023049473A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai System and method to determine the concentration of lipoprotein (a) cholesterol
CN114350744B (zh) * 2022-01-21 2023-03-24 广西康柏莱科技有限公司 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6794157B1 (en) * 1998-09-18 2004-09-21 Kyowa Medex Co., Ltd. Methods for fractional quatification of cholesterol in lipoproteins and quantification reagents

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000325097A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Showa Denko Kk リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬
JP2003028881A (ja) * 2001-07-10 2003-01-29 Orient Cancer Therary:Kk 難治性自己免疫疾患の測定方法
JP4593026B2 (ja) * 2001-07-18 2010-12-08 栄研化学株式会社 ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法
JP4476814B2 (ja) * 2002-12-06 2010-06-09 デンカ生研株式会社 小粒子低比重リポ蛋白の定量法
JP4606901B2 (ja) * 2005-02-18 2011-01-05 デンカ生研株式会社 動脈硬化の診断方法
WO2007001011A1 (ja) * 2005-06-28 2007-01-04 Denka Seiken Co., Ltd. 食後高脂血症診断のための測定試薬
EP1930442B1 (en) 2005-08-31 2010-11-03 DENKA SEIKEN Co., Ltd. Method and kit for quantitative determination of small, dense ldl cholesterol
JP5534644B2 (ja) 2005-12-09 2014-07-02 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット
US8785146B2 (en) * 2008-04-01 2014-07-22 Beijing Strong Biotechnologies, Inc. Method for quantitative measurements of HDL-C and LDL-C

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6794157B1 (en) * 1998-09-18 2004-09-21 Kyowa Medex Co., Ltd. Methods for fractional quatification of cholesterol in lipoproteins and quantification reagents

Also Published As

Publication number Publication date
US20100041080A1 (en) 2010-02-18
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KR20090079887A (ko) 2009-07-22
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