CN114350744B - 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，属于生物检测技术领域。该小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒包括试剂A和试剂B；其中试剂A的组分为：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、缓冲液、稳定剂、第一表面活性剂和防腐剂；试剂B的组分为：4‑氨基安替比林、过氧化物酶、缓冲液、稳定剂、第二表面活性剂、防腐剂和反应促进剂。本发明的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒克服了现有的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒所存在的缺陷，具有抗干扰性强、特异性高、准确性高、线性范围宽以及开瓶稳定性好等优点，为小而密低密度脂蛋白胆固醇的检测提供了一种安全、快捷、准确、无污染的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。
背景技术
脂蛋白在人体中主要起到运输作用，将胆固醇传递到机体各组织器官发挥其相应的生理功能。乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)是人体血浆中的四类脂蛋白。
不同种类的脂蛋白胆固醇对于引起动脉粥样硬化的能力不同。临床诊断上检测较多的是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。高密度脂蛋白胆固醇对动脉血管有一定的保护作用，其含量高发生心血管疾病的风险就低，而低密度脂蛋白胆固醇则容易引起动脉粥样硬化，导致心血管疾病的发生。
低密度脂蛋白(LDL)具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成。将低密度脂蛋白亚组份中颗粒较小密度较大的低密度脂蛋白称为小而密低密度脂蛋白(small dense Low-Density Lipoprotein，简称sdLDL)，将颗粒较大密度较小的低密度脂蛋白称大而轻低密度脂蛋白，介于二者之间的亚组份称为中密度低密度脂蛋白。相比之下，小而密低密度脂蛋白致动脉粥样硬化的能力更强，容易引起心血管疾病的发生。
目前针对小而密低密度脂蛋白胆固醇的检测方法主要包括密度梯度超速离心法、化学沉淀法、分子色谱分析法、管式凝胶电泳法、核磁共振光谱法、指标评估法、动态光散射法、均相法等。但是传统方法存在操作较繁琐、分辨率和特异性均不高以及时间较长等缺点，其中均相法方法相对简单快捷，利用均相法，先对待检测样本中的sdLDL-C进行保护，而对待检测样本中除sdLDL-C以外的脂蛋白胆固醇进行充分的清除，然后再对样本中sdLDL-C进行特异性的检测，该方法操作简单，因此得到了很好的推广。
但是目前已有的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒存在抗干扰能力差、检测准确度和精密度不高以及开瓶稳定性差等问题。
因此，本发明提供一种抗干扰能力强、检测准确度和精密度高以及开瓶稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，可以满足临床开展小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的迫切需求，同时为动脉硬化性心血管疾病的防控和危险评估领域的发展提供支持。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种具有具有抗干扰性强、特异性高、准确性高、线性范围宽以及开瓶稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。
本发明通过以下技术方案实现：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂A和试剂B；
所述试剂A的组分及含量为：胆固醇酯酶1200-1500U/L、胆固醇氧化酶600-1200U/L、过氧化物酶1200-1500U/L、缓冲液20-100mM、稳定剂0.5-5g/L、第一表面活性剂0.5-3g/L、防腐剂0.5-1g/L；
所述试剂B的组分及含量为：4-氨基安替比林1-5g/L、过氧化物酶1200-1500U/L、缓冲液20-100mM、稳定剂0.5-5g/L、第二表面活性剂0.5-1.5g/L、防腐剂0.5-1g/L、反应促进剂0.1-0.5g/L。
进一步地，所述试剂A中的第一表面活性剂由十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯按照质量比0.5-3:1-4:1复配而成。
进一步地，所述试剂B中的第二表面活性剂为TritonX-100、TritonX-405、十二烷基苯磺酸钠中的一种。
进一步地，所述试剂B中的反应促进剂为辛基化二苯胺或N-苯基-N’-环己基对苯二胺。
进一步地，所述试剂A和试剂B中的防腐剂分别独自选自Proclin300、乙酸钠、苯甲酸钠、苯酚中的一种。
进一步地，所述试剂A和试剂B中的稳定剂分别独自选自海藻糖、谷氨酸钠、酪蛋白、牛血清白蛋白、甘露醇、丙三醇中的一种。
进一步地，所述试剂A和试剂B中的缓冲液分别独自选自MES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种。
本发明的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)清除非sdLDL-C：取血清样本，在血清样本加入试剂A，血清样本中的sdLDL-C在第一表面活性剂的作用下受到保护，并且sdLDL-C与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的反应受到抑制，而血清样本中非sdLDL-C成份如乳糜微粒、极低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白中包含的胆固醇更容易与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，其生成的过氧化氢与过氧化物酶进行反应，生成水和氧气而被清除；
(2)检测sdLDL-C：经过步骤(1)的反应后，血清样本中仅剩sdLDL-C，加入试剂B，在第二表面活性剂的作用下sdLDL-C被释放出来，在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用下，生成的过氧化氢，在过氧化物酶的作用下，与色原物质生成紫红色的醌类物质，进而检测出sdLDL-C的含量。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒克服了现有的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒所存在的缺陷，具有抗干扰性强、特异性高、准确性高、线性范围宽以及开瓶稳定性好等优点，为小而密低密度脂蛋白胆固醇的检测提供了一种安全、快捷、准确、无污染的检测手段。通过本发明的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，可定量客观反映出小而密低密度脂蛋白胆固醇的存在，为心血管疾病的临床诊断提供有力的试验诊断依据。
2、本发明的试剂A中的第一表面活性剂由十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯复配而成，可以有效地选择性保护待检测样本中的sdLDL-C，并能充分消除待检测样本中除sdLDL-C以外的脂蛋白胆固醇对sdLDL-C含量检测造成的影响，减少其对LDL-C含量检测的干扰；在第二表面活性剂的作用下，使得待测样本中被保护的sdLDL-C被释放，使得sdLDL-C被准确、特异、高效地检测出，进而使得sdLDL-C的检测结果客观、准确。
3、本发明的试剂B中的反应促进剂为辛基化二苯胺或N-苯基-N’-环己基对苯二胺，可以协助sdLDL-C与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，使得反应高效、快速。同时还能提高酶的稳定性，从而提高试剂的抗干扰能力以及稳定性。
4、本发明的试剂A中的第一表面活性剂中的十二烷基葡萄糖苷具有具有杀菌特性，在试剂A中的防腐剂的协同作用下，可以有效地延长试剂盒的有效期，本发明的试剂盒在2-8℃的储存条件下，至少稳定18个月。
5、本发明在试剂A和试剂B中均加入稳定剂，并严格控制稳定剂的含量，可以提高试剂盒的灵敏度以及准确度，并提高试剂盒的稳定性。
附图说明
图1为实施例1和对比例1-2在2-8℃条件下存储稳定性趋势图
图2为实施例1和对比例2定量限LOQ的对比图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的组成如下：
试剂A：
表中：十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯的质量比为3:2:1。
试剂B：
检测方法：检测方法为两点终点法，反应方向为升反应。
检测条件为：检测主波长为600nm，副波长为700nm，取待测样品3μL，加入150uL的试剂A，混匀，37℃恒温5min，读取吸光度值A1；然后再加入50μL试剂B，混匀，37℃恒温5min后，读取吸光度值A2，反应吸光度OA＝A2-A1。
sdLDL-C浓度(mmol/L)＝sdLDL-C校准品浓度×(OA测定/OA校准)。其中，OA测定为在待测样品中加入试剂A和试剂B后的吸光度的差值；OA校准为标准品加入试剂A和试剂B后的吸光度的差值。
实施例2
本实施例所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的组成如下：
试剂A：
表中：十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯的质量比为1.5:4:1。
试剂B：
本实施例的检测方法和检测条件同实施例1。
实施例3
本实施例所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的组成如下：
试剂A：
表中：十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯的质量比为3:1:1。
试剂B：
本实施例的检测方法和检测条件同实施例1。
实施例4
本实施例所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的组成如下：
试剂A：
表中：十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯的质量比为0.5:2.5:1。
试剂B：
本实施例的检测方法和检测条件同实施例1。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的试剂A中表面活性剂仅为月桂酸聚乙二醇甘油酯，其余均与实施例1的相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的试剂A中表面活性剂由十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯按照质量比0.05:0.1:1复配而成，其余均与实施例1的相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，对比3的试剂B中无反应促进剂，其余均与实施例1的相同。
性能评价
试验例1小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的线性范围试验
通过将高浓度样本与低浓度样本进行倍比稀释得到，配制方案如下表。每份样本的浓度与体积单位统一，在进行液体吸取时应选择精密度与准确性好的移液装置；制备时将样本完全混合并避免蒸发或其他使样本变质的情况。
分别采用实施例1-4以及对比例1-3的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒对其进行检测，检测结果如下表所示。
技术指标：在[0.2，2.6]mmol/L内，线性相关系数(r)应≥0.990；在[0.2，0.8]mmol/L范围内，线性绝对偏差应不超过±0.1mmol/L。在(0.8，2.6]mmol/L范围内，线性相对偏差应不超过±15％。
结果评价：实施例1-4试剂的线性范围结果满足技术指标的要求，对比例1-3试剂线性范围不合格，由于反应度过低，导致相对偏差过大。
试验例2小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的精密度试验
分别采用实施例1-4以及对比例1-3的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒对浓度约为0.6mmol/L和1.8mmol/L的小而密低密度脂蛋白胆固醇血清样本进行检测10次，并计算平均值(M)、标准差(SD)以及变异系数(CV)，检测结果如下表所示。
技术指标：测量高低两个水平质控品，变异系数(CV)应不大于10％。
| 次数 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 1 | 1.84 | 1.83 | 1.85 | 1.84 | 2.25 | 1.89 | 1.63 |
| 2 | 1.81 | 1.85 | 1.84 | 1.81 | 1.94 | 1.76 | 1.86 |
| 3 | 1.84 | 1.82 | 1.82 | 1.84 | 1.82 | 1.83 | 1.80 |
| 4 | 1.82 | 1.84 | 1.85 | 1.83 | 1.83 | 1.94 | 1.60 |
| 5 | 1.84 | 1.81 | 1.84 | 1.85 | 2.20 | 2.00 | 1.95 |
| 6 | 1.83 | 1.85 | 1.82 | 1.81 | 2.05 | 1.80 | 1.77 |
| 7 | 1.81 | 1.83 | 1.84 | 1.81 | 1.92 | 1.92 | 1.53 |
| 8 | 1.82 | 1.83 | 1.82 | 1.82 | 1.96 | 1.90 | 1.51 |
| 9 | 1.81 | 1.81 | 1.84 | 1.83 | 2.18 | 1.55 | 1.99 |
| 10 | 1.83 | 1.81 | 1.85 | 1.83 | 2.02 | 1.50 | 1.91 |
| 平均值(M) | 1.75 | 1.84 | 1.94 | 2.02 | 2.29 | 2.19 | 2.23 |
| 标准差(SD) | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.15 | 0.17 | 0.18 |
| CV(％) | 0.57％ | 1.09％ | 0.52％ | 0.50％ | 6.55％ | 7.76％ | 8.07％ |
结果评价：测试两个水平的质控血清结果显示，实施例1-4的重复性都满足要求，而对比例1-3的低水平质控品重复性较差不满足要求。
试验例3小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的稳定性试验
在2-8℃的储存条件下，分别采用实施例1以及对比例1-2的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒于0月、3月、6月、9月、12月、15月以及18月后浓度为1.8mmol/L左右的小而密低密度脂蛋白胆固醇血清样本进行检测，每个样本检测5次，取平均值。检测结果如下表，稳定性趋势图1所示。
结果评价：实施例1和对比例1-2稳定性结果显示，实施例1试剂2-8℃储存14月，p＝0.397，p＞0.05，所以趋势不显著，即实施例1试剂2-8℃储存14月，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。而对比例1-2试剂p均小于0.05，其检测结果的变化趋势显著，处于不稳定状态，说明表面活性剂的加入对试剂稳定性至关重要。
试验例4小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的定量检出限LOQ验证试验
定量检出限LOQ是在规定可接受条件下，能定量检测出样本中分析物的最小量，对实施例1与对比例2试剂的LOQ进行验证比较，检测结果如下：
结果评价：通过验证实施例1和对比例2的定量限LOQ，对比图如图2所示，由图2可知，实施例1要比对比例2有更低的LOQ，证明实施例1具有很高的灵敏度，同时也说明对比例2由于试剂A中的第一表面活性剂中的十二烷基葡萄糖苷和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯加入的量少，在第一步反应中sdLDL-C无法被保护，损失了一部分，造成结果反应偏低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂A和试剂B；
所述试剂A的组分及含量为 ：胆固醇酯酶1200-1500 U/L、胆固醇氧化酶600-1200 U/L、过氧化物酶1200-1500 U/L、缓冲液20-100 mM、稳定剂0.5-5 g/L、第一表面活性剂0.5-3g/L、防腐剂0.5-1 g/L；所述试剂A中的第一表面活性剂由十二烷基葡萄糖苷、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯按照质量比0.5-3:1-4:1复配而成；
所述试剂B的组分及含量为：4-氨基安替比林1-5 g/L、过氧化物酶1200-1500 U/L、缓冲液20-100 mM、稳定剂0.5-5 g/L、第二表面活性剂0.5-1.5 g/L、防腐剂0.5-1 g/L、反应促进剂0.1-0.5 g/L；所述试剂B中的第二表面活性剂为TritonX-100、TritonX-405、十二烷基苯磺酸钠中的一种；所述试剂B中的反应促进剂为辛基化二苯胺或N-苯基-N’-环己基对苯二胺。
2.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A和试剂B中的防腐剂分别独自选自Proclin300、乙酸钠、苯甲酸钠、苯酚中的一种。
3.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A和试剂B中的稳定剂分别独自选自海藻糖、谷氨酸钠、酪蛋白、牛血清白蛋白、甘露醇、丙三醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A和试剂B中的缓冲液分别独自选自MES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种。
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