CN112941144B - 小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中第一试剂为含有凝集素、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、胆固醇酯酶和4‑氨基安替比林，将上述组分分散在缓冲液中；第二试剂含有二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‑甲氧基聚乙二醇2000和N‑乙基‑N‑(3‑磺丙基)苯胺钠盐，将上述组分分散在缓冲液中。本发明所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒抗干扰性强，特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。

Description

小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，特别是涉及一种基于过氧化物酶法的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用。

背景技术

低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是独立的致动脉粥样硬化危险因素,而小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)作为LDL的主要组分，相对与大而轻低密度脂蛋白(LLDL)而言，由于其对血管壁的高侵入性，与LDL受体的低亲和性、更长的血浆半衰期且对于氧化应激的低耐受性，导致sdLDL-C更容易致动脉粥样硬化。

最近有研究表明，sdLDL-C是心血管病的一个重要标志物，可以预测冠心病的风险。小而密低密度脂蛋白胆固醇的临床意义在国内外很早就已被发现，早在2007年的中国成人血脂异常防治指南中亦有指出，其作为低密度脂蛋白胆固醇的亚组分之一，更容易导致动脉粥样硬化，但受于方法学限制，使得临床检测并未广泛开展，随着科学的不断发展进步，其临床检测的方法也不断的在更新。

目前针对小而密低密度脂蛋白胆固醇的测定方法主要有核磁共振光谱法、分子筛色谱法、电子显微镜技术、动态光散射法、微流控芯片毛细管电泳法。其中常用的有：(1)密度梯度超速离心法，是一种扩展型脂质特征测定产品，可报告22种血液胆固醇成分(包括对非空腹LDL亚型及脂蛋白所有子类的直接测定)，是目前国际上小而密低密度脂蛋白胆固醇测定的参考方法。(2)管式凝胶电泳：采用管式聚丙烯酰氨凝胶电泳原理，可完全分离鉴定所有脂蛋白(含7种LDL亚型，10种HDL亚型)。但上述两种检测方法均需要特殊实验设备，并且耗时久，操作复杂，并不适合临床常规检测。(3)过氧化物酶法：在国际上，日本电化生研公司最先推出了适用于临床常规开展的均相酶法，在中国与九强生物和生研技术合作，开发出了过氧化物酶法检测sdLDL-C的方法，在所有临床实验室应用当前设备都可以进行检测，也使得小而密低密度脂蛋白胆固醇作为冠心病的一个标志物将可能具有更广泛的临床实用性。

对于过氧化物酶法，主要包括以下两步：第一步：在胆固醇脂酶(CHE)、胆固醇氧化酶(CO)、磷脂酶和过氧化氢酶(catalase)的作用下，先清除非sdLDL-C成份，即：乳糜微粒(Chylomicron,CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL),LLDL和高密度脂蛋白(HDL)中包含的胆固醇。第二步：在试剂二中叠氮钠的作用下，过氧化氢酶被抑制，而在特殊表面活性剂的作用下，sd LDL-C被释放出来，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶作用下，生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与色原生成紫红色的醌类物质，进而检测sdLDL-C的浓度。

基于过氧化物酶法的测试原理，需要在试剂一种提供选择性保护sd LDL-C，而后又需要再试剂二中需要将sd LDL-C释放出来。然而，现有技术存在目前国内有关sdLDL-C检测试剂盒中的保护剂，基本上是非离子型表面活性剂，这些非离子表面活性剂保护小而密低密度脂蛋白胆固醇的原理是降低酶对其的反应性，但不能完全抑制，上述这种情况，相对应的酶不能加太多，太多的话，低值样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇有可能被消耗完，从而导致结果偏低，若酶量不足，一般正常样本没有影响，但是在检测普通低密度脂蛋白胆固醇高值样本时，非小而密低密度脂蛋白胆固醇无法完全消耗完，会导致结果偏高的问题。同样，目前测定低密度脂蛋白胆固醇的稳定剂多种多样，稳定性效果不一，会出现因为试剂不稳定而出现假阳性的情况。

因此，提供一种抗干扰能力强、检测值范围宽且稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，是满足临床开展小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的迫切需求，同时也为动脉硬化性心血管疾病(ASCVD)的防控和危险评估领域的发展提供支持。

发明内容

基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于一种抗干扰能力强、检测值范围宽且稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其特征在于：

其中第一试剂为含有凝集素、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、胆固醇酯酶和4-氨基安替比林，将上述组分分散在缓冲液中；

所述第二试剂含有二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，将上述组分分散在缓冲液中。

本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原理：首先本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒第一试剂中的凝集素，在反应第一步可以起到保护sdLDL-C的作用，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化氢酶将未被凝集素保护起来的非小而密低密度脂蛋白胆固醇作为底物清除。第二试剂中加入样本中，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇将被保护的sd LDL-C解除保护，进而在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶作用下，生成过氧化氢，然后过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与4-氨基安替比林发生显色反应，然后通过比色法进行测定。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中还包括小而密低密度脂蛋白胆固醇的标准品缓冲溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第二试剂不含有叠氮盐。本发明即使不使用叠氮盐，也能够提高试剂盒的稳定性。

在本发明的一个优选实施方式中，所述凝集素选择花生凝集素和/或大豆凝集素。对于凝集素而言，本发明一方面优选采用花生凝集素，有助于提高试剂盒的抗干扰性。本发明另一方面优选采用大豆凝集素，有助于提高试剂盒的准确度和精密度。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂中的缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸缓冲液，pH为6.5-7.0。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第二试剂中的缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸缓冲液，pH为6.5-7.0。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂中凝集素的量为60-100mg/L。当凝集素的含量在本发明的优选范围时，其更有利于提供对小而密低密度脂蛋白胆固醇的保护，以提高试剂盒的抗干扰性等。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第二试剂中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的量为40-60mg/L。当小而密低密度脂蛋白胆固醇的量在本发明的优选范围时，其有利于解除对小而密低密度脂蛋白胆固醇的保护等。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂中胆固醇氧化酶、过氧化物酶、胆固醇酯酶、4-氨基安替比林的浓度分别为：500～1500U/L：1000～2000KU/L：1000～2000U/L：0.6-2.0mmol/L。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第二试剂中N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐的浓度分别为1～3mmol/L

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用。

有益效果

本发明小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒可通过定量客观反映小而密低密度脂蛋白胆固醇的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本发明所提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒抗干扰性强，特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

(1)制备第一试剂：以80mg/L花生凝集素、1000U/L胆固醇氧化酶、1500KU/L过氧化物酶、1500U/L胆固醇酯酶、1mmol/L4-氨基安替比林，将其分散在2-吗啉乙磺酸缓冲液中，pH为6.7；

(2)制备第二试剂：以50mg/L二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、2mmol/L N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，将其分散在2-吗啉乙磺酸缓冲液，pH为6.7；

(3)制备校准品：浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/LsdLDL-C的PBS缓冲溶液；

(3)上机检测：采用该试剂盒进行检测，采用具有500nm～700nm波长的全自动生化分析仪(日立7080型)，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，37℃恒温检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标。

实施例2:

与实施例1相同，其区别在于采用大豆凝集素代替花生凝集素。

比较例1

与实施例1相同，其区别在于制备第一试剂时采用吐温80代替花生凝集素。

比较例2：

与实施例1相同，其区别在于制备第二试剂时采用聚乙二醇2000代替二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000。

实施例3：抗干扰试验

取健康人的血清样本，每份标本单独做一种干扰物质(血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯、总胆红素)的试验，将每份标本再分作十份，分别添加不同浓度的干扰成份，然后使用实施例1、实施例2、对比例1、2的试剂盒在规定参数下对含有不同浓度梯度的常见干扰物质的标本进行测定，测定结果与未加干扰物质的标本比较，干扰率≤±5％则可判断被评价干扰物对被评价方法无干扰。反之则认为被评价干扰物对被评价方法有明显干扰作用。结果如表1所示

干扰率(％)判断计算公式如下：

干扰值＝干扰样品测定值-基础样品测定值

干扰率(％)＝干扰样品测定值/基础样品测定值×100

表1：抗干扰实验结果

由表可得出，实施例1的小而密低密度脂蛋白胆固醇的抗干扰能力最强，实施例2次之，不加入凝集素的比较例1最差检测试剂在血红蛋白≤5.0g/L、甘油三酯≤18.2mmol/L、抗坏血酸≤55mg/dL、总胆红素≤250μmol/L。

实施例5：

将实施例1～2和比较例1～2试剂盒用于标准样品的检测，采用行业通用的方式对上述试剂盒进行性能评价，结果如下：

(1)、最低检测限

检测方法：取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合如下条件，即可得到空白限和检出限的范围；低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。

检测结果：sdLDL-C的最低检测限≤0.20mmol/L。

(2)、准确度

检测方法：根据线性区间，用sdLDL-C配置制成已知3个浓度企业参考品作为样本进行检测，每个样本重复测定10次，计算10次检测结果的均值以及相对偏差。

检测结果：用sdLDL-C配置成已知浓度作为样本进行检测，测定值与理论值的相对偏差不超过±15％。

(3)、线性

sdLDL-C在[0.2，2.60]mmol/L线性区间内，拟合曲线的线性相关系数(r)应不小于0.9900。

(4)、精密度

sdLDL-C：平行检测32ng/mL的参考品10次，检测结果的变异系数应不大于5％。

表2为实施例和比较例的评估结果对比，测定结果表明本发明的实施例和比较例的相关系数≥0.99；但本发明实施例在检测限、准确度以及精密度方面具有更为显著的优势。

表2：实施例和比较例的试剂盒评估结果对比

试剂盒	检测限(mmol/L)	准确度	线性相关系数	精密度
					实施例1	0.1	±2.9％	0.9993	±3.6％
实施例2	0.1	±2.4％	0.9995	±2.8％
					比较例1	0.2	±4.8％	0.990	±12.9％
比较例2	0.3	±5.8％	0.990	±13.7％

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (6)

1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其特征在于：

其中第一试剂为由凝集素、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、胆固醇酯酶和4-氨基安替比林分散在缓冲液中形成，所述第一试剂中凝集素的量为60-100mg/L，所述凝集素选择花生凝集素；

所述第二试剂由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐分散在缓冲液中形成，所述第二试剂中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的量为40-60mg/L；

所述第一试剂中胆固醇氧化酶、过氧化物酶、胆固醇酯酶、4-氨基安替比林的浓度为：500~1500U/L：1000~2000KU/L：1000~2000U/L：0.6-2.0mmol/L。

2.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述试剂盒中还包括小而密低密度脂蛋白胆固醇的标准品缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述第一试剂中的缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸缓冲液，pH为6.5-7.0。

4.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述第二试剂中的缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸缓冲液，pH为6.5-7.0。

5.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述第二试剂中N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐的浓度为1~3mmol/L。

6.权利要求1~5任意一项所述试剂盒在制备定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用。