CN107505470A - 稳定的肌酐检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明稳定的肌酐检测试剂盒及其使用方法涉及生化检测领域。其目的是为了提供一种毒性低、稳定性高、检测灵敏准确的肌酐检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括试剂1:HEPES缓冲液;乙二胺四乙酸;肌酸酶;肌氨酸氧化酶;红霉素;PEG8000;吐温20;TOOS;复合稳定剂;proclin系列防腐剂;试剂2:HEPES缓冲液;过氧化氢酶;肌酐酶;4‑氨基安替比林;壬基酚聚氧乙烯醚;高铁氰化钾;氯化钠;乙二醇等。本发明的试剂盒相容性好,具有较好的稳定性和低毒性,并且可以抗胆红素以及金属离子的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域,特别是涉及一种借助于测定材料的化学物理性质来测定材料的试剂盒。
背景技术
肌酐(creatinine,Cr)是肌肉在人体内代谢的产物,每20g肌肉代谢可产生1mg肌酐。血中肌酐来自外源性和内源性两种,外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物;内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。在肉类食物摄入量稳定时,身体的肌肉代谢又没有大的变化,肌酐的生成就会比较恒定。
在肌肉中,肌酸主要通过不可逆的非酶脱水反应缓缓地形成肌酐,再释放到血液中,随尿排泄。因此血肌酐与体内肌肉总量关系密切,不易受饮食影响。肌酐是小分子物质,通过肾小球滤过排出体外。在肾小管内很少吸收,每日体内产生的肌酐,几乎全部随尿排出,一般不受尿量影响。肾功能不全时,肾小球过滤降低,造成血清肌酐水平增加在体内蓄积成为对人体有害的毒素。血浆肌酐的正常上限值为100μmol/L左右。
肾单位时间内,把若干毫升血浆中的内生肌酐全部清除出去,称为内生肌酐清除率(Ccr)。临床上检测血肌酐,计算内生肌酐清除率,可反映肾小球滤过功能和粗略估计有效肾单位的数量,因其操作方法简便,干扰因素较少,敏感性较高,为目前临床常用的较好的肾功能试验之一。
血清肌酐含量的测定方法有很多,现有技术中主要有酶比色法和Jaffe氏苦味酸测定法。酶比色法的反应原理是以肌酐作为底物,经肌酐脱氨酶催化脱氨生成甲基乙内酰脲,氨与α-酮戊二酸和NADH在谷氨酸脱氢酶的作用生成谷氨酸,NAD和水,在340nm波长下测定NADH的吸光度变化率,计算其含量。虽然酶比色法广泛应用于肌酐测定,但是酶比色法试剂稳定性不好,检测结果重复性差,且价格昂贵。
Jaffe氏苦味酸法的反应原理是样品中的肌酐在碱性环境与苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)反应生成橙红色的复合物,将反应液置于紫外/可见光分析仪下或半、全自动生化分析仪下,检测在主波长510nm处吸光度上升的速度,通过吸光度变化值,测算样品中肌酐的活性。然而现有的Jaffe氏苦味酸法试剂稳定性不好,2,4,6-三硝基苯酚与碱性缓冲溶液混合后24h内就明显变红,致使检测结果偏高,检测准确性降低。
发明内容
本发明是为了解决以上技术问题,而提供了一种毒性低、稳定性高、检测灵敏准确的肌酐检测试剂盒及其使用方法。
本发明涉及一种稳定的肌酐检测试剂盒,所述试剂盒包括试剂1;所述试剂1包括肌酸酶、肌氨酸氧化酶和防腐剂;
所述防腐剂包括:红霉素和proclin系列防腐剂(西宝生物科技(上海)股份有限公司产品)。
优选地,所述试剂1中肌酸酶>50U/mL;肌氨酸氧化酶>10U/mL。
优选地,所述试剂盒还包括试剂2;
所述试剂1包括:
所述试剂2包括:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
优选地,所述复合稳定剂包括吐温80 10~13g/L,谷氨酸20~30g/L,谷胱甘肽1~3g/L,海藻糖50~60g/L,十二烷基二甲基甜菜碱2~6g/L,卵磷脂3~6g/L,缓冲液100~120mmol/L;其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。
本试剂盒采用氧化酶二步酶法测定血清中肌酐含量。反应第一步,利用过氧化氢酶分解样本中的内源性肌酸,以H2O和O2的形式被清除;反应第二步,样本中的肌酐在酶的作用下生成H2O2,过氧化氢酶在过氧化氢酶抑制剂作用下失活,生成的H2O2参与Trinder反应并显色。具体如下:
1、第1反应:
H2O2被过氧化氢酶消除。
2、第2反应:
优选地,所述试剂1包括:
所述试剂2包括:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
本发明还涉及一种稳定的肌酐检测试剂盒的使用方法,所述方法包括以下步骤:
该检测试剂盒的测定方法为两点终点法;
(1)将240份试剂1和4份待测样品混合均匀,37℃孵育后得到反应液1;
(2)然后加入80份试剂2混合均匀,得到反应液2,测定反应液2的吸光度A1;
(3)5min后再次测反应液2的吸光度A2,测定主波长为548nm、副波长为700nm;
(4)用步骤(1)-(3)的操作对肌酐标准液的吸光度进行测定,分别得到吸光度A3和A4;
(5)用吸光度差值进行计算,根据式1计算血清总肌酐浓度;
式1:
肌酐浓度=△A样品/ΔA标准液×标准液浓度;
△A样品=A2-A1;
ΔA标准液=A4-A3;
上述份数均为体积份数。
本发明稳定的肌酐检测试剂盒及其使用方法与现有技术不同之处在于:
1、本发明的试剂盒反应第一步需要抑制过氧化氢酶的活性,添加的叠氮钠是蛋白抑制剂,可以起到抑制作用。加入的proclin系列是一种新型的生物防腐剂,与多种酶具有良好的相容性,具有较好的稳定性和低毒性,维持试剂的稳定性。高铁氰化钾可以起到去除样本中的胆红素干扰。红霉素属于抗生素一类,可以发挥抑菌作用,维持试剂稳定性,延长有效期。
2、本发明的试剂盒中乙二胺四乙酸是一种金属螯合剂,能够与某些金属离子结合,从而避免金属离子干扰。表面活性剂聚乙二醇8000和吐温充当助溶剂,发挥良好的增溶效果。本试剂盒以4-AAP为显色底物,与TOOS偶联发生显色反应,试剂1中仅加入4-4-AAP,无显色反应,试剂2中TOOS发生显色反应,然后通过比色法进行测定。
附图说明
图1为本发明稳定的肌酐检测试剂盒和对照试剂盒线性相关性图;
图2为本发明稳定的肌酐检测试剂盒稳定性结果分析图;
图3为对照试剂盒室温开瓶稳定性测试结果分析图;
图4为本发明稳定的肌酐检测试剂盒室温开瓶稳定性测试结果分析图;
图5为对照试剂盒2-8℃开瓶稳定性测试结果分析图;
图6为本发明稳定的肌酐检测试剂盒2-8℃开瓶稳定性测试结果分析图;
图7为对照试剂盒室温未开瓶稳定性测试结果分析图;
图8为本发明稳定的肌酐检测试剂盒室温未开瓶稳定性测试结果分析图。
具体实施方式
通过以下实施例和验证试验对本发明的稳定的肌酐检测试剂盒及其使用方法作进一步的说明。
实施例1
本实施例的稳定的肌酐检测试剂盒原料及配比如下:
试剂1如下:
试剂2如下:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
实施例2
本实施例的稳定的肌酐检测试剂盒原料及配比如下:
试剂1如下:
试剂2如下:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
实施例3
本实施例的稳定的肌酐检测试剂盒原料及配比如下:
试剂1如下:
试剂2如下:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
实施例4
本试剂盒适用于各类型全自动生化仪,以贝克曼AU480全自动生化仪为例,测定方法采用两点终点法,采用实施例1-3制得的产品对样品中肌酐进行检测,步骤如下:
(1)将240份试剂1和4份待测样品混合均匀,37℃孵育后得到反应液1;
(2)然后加入80份试剂2混合均匀,得到反应液2,测定反应液2的吸光度A1;
(3)5min后再次测反应液2的吸光度A2,测定主波长为548nm、副波长为700nm;
(4)用步骤(1)-(3)的操作对肌酐标准液的吸光度进行测定,分别得到吸光度A3和A4;
(5)用吸光度差值进行计算,根据式1计算血清总肌酐浓度;
式1:
肌酐浓度=△A样品/ΔA标准液×标准液浓度;
△A样品=A2-A1;
ΔA标准液=A4-A3;
上述份数均为体积份数。
验证试验
对上述实施例1~3中的产品进行测试,并与其他公司同类型产品进行对比,结果如表1所示。
表1本发明试剂盒与对照试剂盒参数对比
线性范围(μmol/L) | 准确度 | 精密度(μmol/L) | |
对照试剂盒 | 0-800 | ≦±10% | CV≦10% |
本发明试剂盒 | 30-1500 | ≦±10% | CV≦5% |
对照试剂盒为一国内市售的肌酐检测试剂盒,其成分及配方为:试剂1包含:HEPES缓冲液、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、TOOS;试剂2包含:HEPES缓冲液、肌酐酶、4-AAP。
测试1
以本试剂盒和对照试剂盒为材料,采用贝克曼AU480全自动生化分析仪对40份血清样本进行测试,分析相关性,结果如表2所示。
表2线性相关性对比
由结果可以看出:两种试剂的线性回归方程为y=0.9984x+3.2693,相关系数R2=0.999,本试剂与对照试剂相关性较好,如图1所示。
测试2
37℃热稳定性测试:以对照试剂和本试剂为材料,各取一瓶封闭放置于37℃恒温水浴锅中,每2天检测1次,每次检测两个质控水平,连续检测5次,每次检测完毕后封口放回37℃恒温水浴锅中,测试结果如表3。
表3稳定性测试结果
数据分析如图2所示,系列1对照试剂盒质控1、系列2对照试剂盒质控2、系列3本试剂盒质控1、系列4为本试剂盒质控2。由结果可以看出:本试剂盒与对照试剂盒测定曲线整体保持平稳,波动较小。说明本试剂盒与对照试剂盒一样具有稳定性。
测试3
稳定性测试:以对照试剂和本试剂为材料,设置3组试验,分别为室温开瓶、2-8℃开瓶、室温未开瓶;每2天检测1次,每次检测1个质控水平,连续检测15天。
室温开瓶结果如图3、图4,图3为对照试剂盒,图4为本发明试剂盒。
2-8℃开瓶结果如图5、图6,图5为对照试剂盒,图6为本发明试剂盒。
室温未开瓶结果如图7、图8,图7为对照试剂盒,图8为本发明试剂盒。
由结果可以看出:
1、室温开瓶测试:对照试剂盒的测定曲线波动较大,测定第5天后,测定值开始大幅上升,而本试剂盒测定值基本保持稳定。
2、2-8℃开瓶测试:对照试剂盒和本试剂盒的测定曲线波动较小,基本保持稳定。
3、室温未开瓶测试:对照试剂盒在测定7天以后,测定值呈先上升后下降趋势,而本试剂盒仍保持稳定。
测试4
重复性测试:以血清样本为待测样品,用贝克曼AU480全自动生化分析仪重复测定10次,与对照试剂盒相比较,结果如表4。
表4重复性测试结果(μmol/L)
测定次数 | 对照试剂盒 | 本试剂盒 |
1 | 101.97 | 100.69 |
2 | 101.16 | 102.09 |
3 | 102.51 | 100.93 |
4 | 99.82 | 102.01 |
5 | 101.97 | 103.04 |
6 | 98.76 | 99.89 |
7 | 99.23 | 102.56 |
8 | 98.28 | 102.78 |
9 | 99.43 | 101.56 |
10 | 101.15 | 101.89 |
平均值 | 100.43 | 101.74 |
SD | 1.50 | 0.99 |
CV% | 1.50% | 0.98% |
由结果可以看出:本试剂盒测定的变异系数CV%=0.98%,小于5%,符合《体外诊断试剂通用技术要求》,且小于对照试剂盒的1.50%,表明本试剂盒的重复性更好。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这些仅是举例说明,本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式作出多种变更或修改,但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种稳定的肌酐检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括试剂1;所述试剂1包括肌酸酶、肌氨酸氧化酶和防腐剂;
所述防腐剂包括:红霉素和proclin系列防腐剂。
2.根据权利要求1所述的稳定的肌酐检测试剂盒,其特征在于:所述试剂1中肌酸酶>50U/mL;肌氨酸氧化酶>10U/mL。
3.根据权利要求1所述的稳定的肌酐检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括试剂2;
所述试剂1包括:
所述试剂2包括:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
4.根据权利要求1所述的稳定的肌酐检测试剂盒,其特征在于:所述复合稳定剂包括吐温80 10~13g/L,谷氨酸20~30g/L,谷胱甘肽1~3g/L,海藻糖50~60g/L,十二烷基二甲基甜菜碱2~6g/L,卵磷脂3~6g/L,缓冲液100~120mmol/L。
5.根据权利要求1所述的稳定的肌酐检测试剂盒,其特征在于:
所述试剂1包括:
所述试剂2包括:
其中HEPES缓冲液pH值为7.5。
6.一种稳定的肌酐检测试剂盒的使用方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
(1)将240份试剂1和4份待测样品混合均匀,37℃孵育后得到反应液1;
(2)然后加入80份试剂2混合均匀,得到反应液2,测定反应液2的吸光度A1;
(3)5min后再次测反应液2的吸光度A2,测定主波长为548nm、副波长为700nm;
(4)用步骤(1)-(3)的操作对肌酐标准液的吸光度进行测定,分别得到吸光度A3和A4;
(5)用吸光度差值进行计算,根据式1计算血清总肌酐浓度;
式1:
肌酐浓度=△A样品/ΔA标准液×标准液浓度;
△A样品=A2-A1;
ΔA标准液=A4-A3;
上述份数均为体积份数。
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