CN102721684A - 血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂,利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢,进而由肌酐测定试剂的试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶,从而测定样本中肌酐含量。本发明具有可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,具体涉及一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂。
背景技术
肌酐(Cr)是一种低分子含氮化合物,相对分子质量116,000。Cr主要由肌肉产生,是肌酸的终末代谢产物,正常情况下,人体内Cr的含量基本稳定,一般维持在3~14mg/L,仅仅由肾小球排泄,不被肾小管重吸收,由于Cr是小分子物质不与血浆蛋白结合,所以测定血清Cr浓度及根据血清Cr与尿酐浓度计算所得的Cr清除率是既简单又可靠的肾小球滤过功能指标,深受临床重视。
临床实验室对于血和尿中Cr的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法),Jaffe法虽然试剂较便宜,但线性范围窄,易受血清中其他假性Cr物质的干扰,尤其是当血清胆红素值≥165.5μmol/L时开始出现负偏差,而且血清胆红素越高偏差越大。此外。Jaffe法受到酮体、乳糜血和溶血的严重干扰,头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结果出现较大干扰。
酶法利用Cr在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色),通过检测反应终点的吸光度来推算样品中Cr的含量,酶法不管是一步酶法或两步酶法,测定过程中Cr水解后产生的肌酸和内源性肌酸同时转化为醌亚胺,Cr测定结果包括了Cr和肌酸之和。正常男性血Cr参考范围为53~106μmol/L,女性44~88μmol/L;正常男性血肌酸参考范围为15~45μmol/L,女性为30~80μmol/L,当发生急性肌损伤、饥饿、糖尿病、营养不良、甲亢、发热时肌酸显著升高,对Cr造成的偏差更显著。
为解决内源性肌酸干扰,仅以肌酐酶为第二试剂的两步酶测定方法,由于第一步反应体系中有4-AAP和色原,肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺,肌酸被转化而被耗尽,当加入肌酐酶后启动Cr水解反应生成肌酸,再经肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺,反应过程如下:
第一步反应
第二步反应
内源性肌酸和Cr水解产生的肌酸先后呈色,仪器以第一步反应产生的醌亚胺为空白,仅以第二步产生的醌亚胺计算出肌酸的含量,以此去除内源性肌酸的影响,但由于正常情况下,内源性肌酸产生的吸收信号较低且不稳定,因此该法试剂准确度、精密度较差,临床结果重复性不好,无法满足常规检测要求。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足,提出一种可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的血清中肌酐的二步酶法测定方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种血清中肌酐的二步酶法测定方法,利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢,进而由肌酐测定试剂试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶,从而测定样本中肌酐含量的方法,其具体的反应过程如下:
第一步反应
第二步反应
抑制剂抑制过氧化氢酶活性 (4)
上述的肌酐测定试剂的试剂1中包含过氧化氢酶,肌酸酶,肌氨酸氧化酶和色原,试剂2中包含过氧化氢酶抑制剂,肌酐酶,过氧化物酶和4-氨基安替比林;其中过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物,羟胺,氟化物,醋酸盐,甲酸盐,乙醇、甲醇中的一种或几种。
本发明上述血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂由试剂1和试剂2组成,其中试剂1、2各组分及浓度范围为:
试剂可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以制成液体试剂,直接使用。
其中所述缓冲液可以是磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。
所述色原包括酚类化合物(如2-氯酚,2,4-二氯苯酚,4-氯酚,2,6-二氯苯酚),和/或苯胺类似物(如N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺,N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物),N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐,N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐,N-(2-羟基-3-磺丙基)-3 5-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐),3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸的一种,优选3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸。
所述去干扰剂亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶等中的一种或几种。
所述抑制剂为叠氮化物,羟胺,氟化物,醋酸盐,甲酸盐,乙醇、甲醇。优选叠氮化物。
所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂(如Proclin300)中的一种或几种。
所述稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
所述表面活性剂,优选地,所述表面活性剂为非离子表面活性剂,更优选地,所述非离子表面活性剂选自TWEEN系列(如Tween 80、Tween 20)、SPAN系列、TRITON系列(如Triton X-100)。
本发明的优点和有益效果:
本发明采用过氧化氢酶消除肌酸产生的过氧化氢,产生的水和氧气不会造成本底升高,试剂中的过氧化氢酶在检测反应时被抑制剂完全抑制,不会对反应造成影响,因此本法可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的问题。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明作出许多修改,这样的修改也落入本发明的保护范围。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
实施例1
试剂1和试剂2的配制方法为常规方法,即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
实施例2
试剂2:
实施例2试剂的制备方法同实施例1。
实施例3
实施例3试剂的制备方法同实施例1。
本发明试剂测定样本中Cr的测试条件如下:温度:37℃;比色杯光径为1.0cm。检测主波长546nm,副波长700nm。
应用本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的方法如下:样品(校准管以校准品做样品)加R1混匀,37℃孵育5min后加入R2混匀,记录吸光度A1,在37℃反应5min后,记录吸光度A2。其中样本用量8μl,试剂1用量200μl,试剂2用量100μl。
本发明试剂测定样本中Cr含量按以下公式进行计算:
得到本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的浓度。
对照例4
试剂测定样本中Cr的测试条件如下:温度:37℃;比色杯光径为1.0cm。检测主波长546nm,副波长700nm。
应用本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的方法如下:样品(校准管以校准品做样品)加R1混匀,37℃孵育5min后记录吸光度A1,加入R2混匀,在37℃反应5min后,记录吸光度A2。其中样本用量6μl,试剂1用量225μl,试剂2用量75μl。
对靶值为88.3(72.4—104.2)μmol/L的质控液Ⅰ和靶值为324(267—381)μmol/L的质控液Ⅱ在相同条件下,采用试剂对同一质控液的Cr浓度连续检测20次,将检测结果的平均值与靶值范围进行比较,以检测所述的试剂的准确性,同时比较每个测定的变异系数,以检测所述实施例试剂的精密度,结果如表1所示:
表1:
表1的结果表明:本发明试剂的准确度、精密度均较好。
Claims (10)
1.一种血清中肌酐的二步酶法测定方法,其特征在于:利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢,进而由肌酐测定试剂的试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶,从而测定样本中肌酐含量。
2.根据权利要求1所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法,其特征在于:所述的肌酐测定试剂的试剂1中包含过氧化氢酶,肌酸酶,肌氨酸氧化酶和色原,试剂2中包含过氧化氢酶抑制剂,肌酐酶,过氧化物酶和4-氨基安替比林;其中过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物,羟胺,氟化物,醋酸盐,甲酸盐,乙醇、甲醇中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述缓冲液为磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的色原为酚类化合物,和/或苯胺类似物,3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸的一种。
6.根据权利要求5所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的酚类化合物为2-氯酚,2,4-二氯苯酚,4-氯酚,2,6-二氯苯酚中的一种;所述的苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺,N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物),N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐,N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐,N-(2-羟基-3-磺丙基)-3 5-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐中的一种。
7.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的去干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种。
8.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂中的一种或几种。
9.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
10.根据权利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂,其特征在于:所述的表面活性剂为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中一种。
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