WO2023190087A1 - クレアチニン高値検体測定時の正確性向上 - Google Patents

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WO2023190087A1
WO2023190087A1 PCT/JP2023/011657 JP2023011657W WO2023190087A1 WO 2023190087 A1 WO2023190087 A1 WO 2023190087A1 JP 2023011657 W JP2023011657 W JP 2023011657W WO 2023190087 A1 WO2023190087 A1 WO 2023190087A1
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creatinine
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azide
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美月 木内
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東洋紡株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine

Definitions

  • the present invention relates to a method for reducing measurement errors that occur when measuring a biological sample containing a high concentration of creatinine in creatinine measurement, and a reagent kit used in the method.
  • enzymatic measurement methods using enzymes with high substrate specificity for each component have been popular as a method for measuring biological components.
  • a method in which an oxidizing enzyme is caused to act on a biological component to be measured or a substance derived from a biological component and the generated hydrogen peroxide is measured is often used.
  • hydrogen peroxide generated after decomposing a substance other than the target component with the first reagent is decomposed into water by catalase, and then hydrogen peroxide is generated from the target component with an oxidase using the second reagent.
  • the coloring agent By reacting this hydrogen peroxide with a coloring agent (also called a chromogen) in the presence of peroxidase, the coloring agent is converted into a dye (e.g., quinone imine dye), and the absorbance of the dye is measured for colorimetric determination.
  • a coloring agent also called a chromogen
  • the coloring agent is converted into a dye (e.g., quinone imine dye), and the absorbance of the dye is measured for colorimetric determination.
  • a dye e.g., quinone imine dye
  • the target component in the specimen may be at a high concentration. This is because some subjects may exhibit abnormal values of biological components that exceed the normal range, and for example, components that are normally measured in serum or plasma samples may be measured in urine. It can happen in some cases. In such highly concentrated specimens, negative or positive errors occur due to insufficient reaction with the reaction components in the reagent or excessive reaction with the reaction components, which often leads to measurement value errors.
  • a subunit of 75 kDa or more may be used.
  • a method is also known in which measurement errors caused by catalase inhibition caused by azide that may be contained in the reagent are reduced by using catalase derived from a specific microorganism that has the following properties (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 the effectiveness of a reagent for measuring triglycerides has been confirmed, and a positive measurement error in which the elimination of endogenous free glycerol is disturbed due to inhibition of catalase and the measured value increases, has been confirmed by using a reagent for measuring triglycerides. It describes that the problem was solved by using . However, Patent Document 3 does not consider at all how to resolve measurement errors (especially negative measurement errors) that occur in the measurement of samples with high biological component values.
  • JP2011-257243A Japanese Patent Application Publication No. 2004-191332 JP2009-65883A
  • the present inventor has experienced that when measuring a sample with a high creatinine value, there are cases where the measurement cannot be performed correctly. They found that measurement errors that occur with high-value samples are more likely to occur when the reagent kit for measuring creatinine contains catalase.
  • the present invention solves this newly discovered problem and reduces measurement errors that occur when measuring creatinine in biological samples containing high concentrations of creatinine, thereby reducing, for example, creatinine in various biological samples.
  • the purpose is to expand the measurement range and provide an accurate method for detecting high concentrations of creatinine.
  • a typical present invention has the following configuration.
  • a method for reducing measurement errors occurring in creatinine measurement of a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or higher comprising the following steps: (1) a step of mixing and reacting with the biological sample a first reagent that eliminates at least one component selected from the group consisting of creatine and sarcosine present in the biological sample; and (2) a step of reacting with the biological sample. a step of mixing and reacting a second reagent for measuring creatinine with the reaction solution of step (1); wherein the first reagent contains catalase and the second reagent contains azide.
  • step (2) an oxidizing enzyme is allowed to act on creatinine or a substance derived from creatinine in the biological sample, and the generated hydrogen peroxide is reacted with a coloring agent in the presence of peroxidase to perform colorimetric determination.
  • [Item 5] The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the concentration of azide in the reaction solution after mixing the second reagent in step (2) is 0.001 to 0.2 w/v%.
  • [Item 6] The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the azide is sodium azide.
  • the concentration of catalase in the reaction solution after mixing the first reagent in step (1) is 10 to 500 KU/mL.
  • [Item 8] The method according to any one of Items 2 to 7, wherein the color former is a Trinder reagent.
  • [Item 9] The method according to any one of Items 1 to 8, which reduces negative measurement errors that occur in creatinine measurement.
  • a reagent kit for measuring creatinine which is used in the method according to any one of Items 1 to 9 and is capable of measuring a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or more, and which contains catalase.
  • a reagent kit comprising a first reagent containing an azide and a second reagent containing an azide.
  • the measurement error when measuring creatinine contained in biological samples such as serum, plasma, or urine using an enzymatic method, the measurement error can be reduced to a high degree (for example, less than ⁇ 10%) even when measuring a sample with a high creatinine value of 120 mg/dL or more. ) can be suppressed. Therefore, the present invention enables expansion of the creatinine measurement range and/or accurate measurement of biological components containing high concentrations of creatinine.
  • the present invention provides a method for reducing measurement errors that occur when measuring creatinine in a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or higher, the method comprising at least the following steps: (1) A step of mixing and reacting a first reagent that eliminates at least one component selected from the group consisting of creatine and sarcosine present in a biological sample with a biological sample (hereinafter, the reaction in this step is referred to as "first reagent"). (2) A step of mixing and reacting a second reagent for measuring creatinine present in a biological sample with the reaction solution of step (1) (hereinafter referred to as "reaction of this step”).
  • the above method of the present invention it may be possible to accurately quantify even a specimen with a high creatinine value. Therefore, the above method of the present invention can be said to be a method for expanding the measurement range of creatinine in various biological samples in the sense that it is possible to measure creatinine up to a high concentration range, and it can also be said to be a method for accurately detecting high concentrations of creatinine. can.
  • Azide has conventionally been used as a preservative in reagents for measuring biological components such as creatinine, and has generally been known as a component that can cause measurement errors in measuring biological components (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 it is completely unexpected that in a specific situation in which a sample with a high creatinine concentration of 120 mg/dL or more is measured, azide, which has been known to be a component that can cause measurement errors, is used in the prescribed method. This is based on the discovery that it has the effect of reducing measurement errors.
  • step (1) In creatinine measurement, measurement errors may occur due to components similar to creatinine (e.g., creatine, etc.) that may be contained in biological samples, or reaction intermediates when a several-step coupled reaction is designed. Therefore, in the method of the present invention described above, in step (1), a first reaction (also referred to as an elimination reaction or the like) is first performed to eliminate components other than creatinine that cause such measurement errors.
  • a first reaction also referred to as an elimination reaction or the like
  • creatine and/or sarcosine are eliminated as components that may cause measurement errors, such as biological components similar in structure and/or properties to creatinine or reaction intermediates thereof.
  • creatine is decomposed and sarcosine is also decomposed to eliminate both components. Further, in this first reaction, components other than creatine and/or sarcosine may also be eliminated.
  • the first reaction may be performed by mixing a first reagent that eliminates creatine and/or sarcosine present in the biological sample with the biological sample and reacting the mixture.
  • a first reagent that eliminates creatine and/or sarcosine present in the biological sample for example, an enzyme other than the enzyme that directly acts on creatinine may be allowed to act on the biological sample to produce hydrogen peroxide, and the reaction intermediate may be eliminated with catalase.
  • an enzyme other than creatinine amide hydrolase for example, creatinine amidinohydrolase and/or sarcosine oxidase, etc.
  • examples include methods.
  • the first reagent may be a single reagent or a combination of two or more reagents (for example, a combination of a reagent containing creatinamidinohydrolase and a reagent containing sarcosine oxidase), which is used in the first reaction. They may be configured to be mixed with the biological sample at the same time or one after the other.
  • the method of the present invention is characterized in that the first reagent used in the first reaction contains catalase.
  • the first reagent is a combination of multiple reagents, any of the reagents may contain catalase.
  • Catalase (EC1.11.1.6) is a heme protein having protoheme, and is an enzyme that catalyzes a reaction that decomposes hydrogen peroxide.
  • the present invention is based on the discovery that when catalase is present in the first reagent used in the first reaction, measurement errors are likely to occur when measuring a sample with a high creatinine value. Since the enzymatic reaction that directly acts on creatinine will occur in the second reaction described below, it was completely unexpected that components in the first reagent of the first reaction that do not directly act on creatinine would have an effect.
  • the catalase that can be used in the first reagent in the method of the present invention is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, and catalase derived from any microorganism (fungi, bacteria, archaea, etc.) can be used.
  • the catalase used in the present invention includes the genus Podospora, the genus Neurospora, the genus Cladosporium, the genus Emericella, the genus Pleurotus, the genus Deinococcus, and the genus Deinococcus.
  • the catalase may be derived from a microorganism of the genus Arthrobacter, but is not limited thereto. From the viewpoint of more easily achieving the effects of the present invention, it is preferable to use catalase derived from a microorganism of the genus Corynebacterium or the genus Arthrobacter.
  • the catalase used in the present invention may be a catalase of any size, for example, a catalase having a molecular weight (Mw) of about 50,000 to 90,000.
  • Mw molecular weight
  • the catalase used in the present invention may have a molecular weight of less than 75,000, may have a molecular weight of 65,000 or less, and may further have a molecular weight of 60,000 or less.
  • the concentration of catalase in the first reagent is not particularly limited.
  • the first reagent is such that the concentration of catalase in the reaction solution after mixing the first reagent in step (1) is 10 to 500 KU/mL, preferably 15 to 370 KU/mL.
  • Catalase is contained in an amount adjusted to be more preferably 50 to 350 KU/mL, and still more preferably 100 to 300 KU/mL.
  • the concentration of catalase in the first reagent may be doubled. Even when catalase is used in the first reaction at such a concentration, according to the present invention, measurement errors that may be caused by catalase when measuring a sample with a high creatinine value can be effectively suppressed.
  • the first reaction in step (1) is performed by mixing a first reagent containing catalase with a biological sample and reacting for a certain period of time.
  • the reaction conditions for the first reaction vary depending on the type and amount of reaction components such as enzymes used, but for example, after mixing the first reagent containing catalase with the biological sample, for 1 to 10 minutes (for example, 5 minutes). (minutes)).
  • the reaction temperature is not particularly limited, it is preferable to carry out the reaction under conditions of, for example, 20 to 40°C (for example, 37°C).
  • a second reagent for measuring creatinine is added to the reaction system and a second reaction is performed.
  • the second reagent used here contains an enzyme etc. that directly acts on creatinine, and by acting with these enzymes etc. (including oxidase etc.), creatinine in the biological sample or creatinine-derived Creatinine can be measured by generating hydrogen peroxide from a substance, reacting the generated hydrogen peroxide with a coloring agent in the presence of peroxidase, and performing colorimetric determination.
  • creatinine is reacted with creatine amidinohydrolase to produce sarcosine.
  • Creatinine can be measured by designing a so-called coupled reaction in which sarcosine oxidase (oxidase) is reacted with hydrogen peroxide to produce hydrogen peroxide.
  • Components other than creatinine amide hydrolase to be acted on in this second reaction may be contained in the first reagent added to the reaction system in the first reaction, or in the second reagent added to the reaction system in the second reaction.
  • Creatinine amide hydrolase which acts directly on creatinine, is preferably included in the second reagent because if it is included in the first reagent, creatinine will be degraded in the elimination system of the first reaction, causing measurement errors.
  • a person skilled in the art should select a component that acts directly on the creatinine substrate and a component that acts in a coupled reaction system other than that, and should include these components in the first reagent and/or the second reagent. can be designed as appropriate.
  • the second reagent may also be a single reagent or a combination of two or more reagents, which may be used in the second reaction at the same time or before and after each other in the reaction solution of the first reaction. It may be configured to be mixed.
  • the method of the present invention described above is characterized in that the second reagent used in the second reaction contains an azide.
  • the second reagent is a combination of multiple reagents, any of the reagents may contain an azide.
  • the action of catalase carried over from the first reaction can be substantially stopped.
  • measurement errors occur at least in part due to insufficient deactivation of catalase brought in from the first reaction when measuring samples with high creatinine values.
  • the azide that can be used as the second reagent in the method of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • metal salts of azide are preferred, more preferably alkali metal salts and alkaline earth metal salts of azide, still more preferably alkali metal salts of azide. (eg, sodium azide, potassium azide, lithium azide).
  • the concentration of azide in the second reagent is not particularly limited.
  • the second reagent is preferably 0.003 to 0.003% so that the azide concentration in the reaction solution after mixing the second reagent in step (2) is 0.001 to 0.2 w/v%.
  • azide in an amount adjusted to 0.17 w/v%, more preferably 0.005 to 0.15 w/v%, even more preferably 0.01 to 0.13 w/v%. contains.
  • the second reagent is adjusted so that the concentration of azide in the reaction solution after mixing the second reagent in step (2) is 0.001 to 0.015 w/v%. It may contain azide in a certain amount.
  • the concentration of azide in the second reagent should be four times the amount.
  • the second reaction in step (2) is performed by mixing the second reagent containing an azide with the reaction solution after the first reaction and reacting for a certain period of time.
  • the reaction conditions for the second reaction vary depending on the type and amount of reaction components such as enzymes used, but for example, after mixing the second reagent containing an azide with the reaction solution after the first reaction, This can be carried out by reacting for 10 minutes (eg 5 minutes).
  • the reaction temperature is not particularly limited, it is preferable to carry out the reaction under conditions of, for example, 20 to 40°C (for example, 37°C).
  • the method of the present invention is a method for reducing measurement errors (e.g., negative measurement errors) when measuring a high creatinine value sample in an enzymatic method using an oxidase-peroxidase-coloring agent system, or a method for reducing measurement errors (for example, negative measurement errors) when measuring a high creatinine value sample. It can also be referred to as a method for improving the accuracy of measured values.
  • the present invention is useful in any situation where a specimen with a high creatinine value is measured by an enzymatic method using an oxidase-peroxidase-coloring agent system.
  • a method for measuring creatinine using the principle of an enzymatic method using an oxidase-peroxidase-coloring agent system has already been established in the art. Therefore, the amount or concentration of creatinine can be measured by applying this knowledge to the present invention, and aspects such as the type and amount of enzyme used, the order and timing of addition of enzymes and coloring agents, etc. are not particularly limited.
  • a general-purpose automatic analyzer for example, Hitachi 7180 type automatic analyzer
  • the reagents may be prepared to constitute the first reagent and the second reagent so as to be applicable to such a general-purpose automatic analyzer.
  • the first reagent and the second reagent may be prepared and used as a liquid reagent (or kit), or a reagent (or kit) composed of a combination of a dry preparation manufactured by freeze-drying or other means and a dissolution solution.
  • a method of preparing and using it as a kit or sensor called a so-called dry system in which an enzyme or the like is supported on a suitable carrier.
  • it is a method of measuring with an automatic analyzer using one or more liquid reagents, and more preferably, a liquid reagent in which the first reagent and the second reagent are divided into two packages (hereinafter referred to as a two-reagent liquid).
  • a two-reagent liquid This is a method of analysis using an automatic analyzer using reagents (also called reagents).
  • first reagent a first type of reagent
  • second reagent a second type of reagent
  • the target component can be colorimetrically quantified by reacting for a certain period of time (this is referred to as the second reaction) and measuring the change in absorbance between the end of the first reaction and the end of the second reaction.
  • additional components useful in the measurement of creatinine or components that contribute to the stabilization of these components include peroxidase, color formers, buffer components, preservatives, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, salts, enzyme stabilizers, color former stabilizers, etc. but not limited to.
  • these components may be contained in either the first reagent and/or the second reagent. Even the components that act in the second reaction may be included in the first reagent because they can be brought in from the reaction solution of the first reaction mixed with the first reagent and act. Further, the first reagent and the second reagent may be added as different reagents.
  • peroxidase As the peroxidase used in the present invention, any type of enzyme may be used as long as it catalyzes the reaction between hydrogen peroxide and a coloring agent (also referred to as a redox coloring reagent), such as plant-derived or bacterial-derived enzymes. , peroxidase derived from basidiomycetes. Among these, peroxidase derived from horseradish, rice, and soybean is preferred, and peroxidase derived from horseradish is more preferred, for reasons such as purity, availability, and price.
  • a coloring agent also referred to as a redox coloring reagent
  • PEO-131 manufactured by Toyobo
  • PEO-301 manufactured by Toyobo
  • PEO-302 manufactured by Toyobo
  • the amount used and the form of addition are not particularly limited.
  • Peroxidase activity is defined in the following manner. After sequentially mixing 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% (W/V) pyrogallol aqueous solution, 1 mL of 0.147 M hydrogen peroxide solution, and 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0), preheating was performed at 20°C for 5 minutes. Then, add 1 mL of sample solution to start the enzyme reaction. After reacting for 20 seconds, the reaction is stopped by adding 1 mL of 2N sulfuric acid aqueous solution, and the produced purpurogalin is extracted five times with 15 mL of ether.
  • the total volume is adjusted to 100 mL, and the absorbance at a wavelength of 420 nm is measured ( ⁇ ODtest).
  • ⁇ ODtest the absorbance at a wavelength of 420 nm is measured.
  • 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% pyrogallol aqueous solution, 1 mL of 0.147 M hydrogen peroxide solution, and 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) were sequentially mixed, and then 1 mL of 2N sulfuric acid aqueous solution was added and mixed. , and then add 1 mL of the sample solution.
  • This liquid is subjected to ether extraction in the same manner as above, and the absorbance is measured ( ⁇ ODblank).
  • the amount of purprogalin produced is calculated from the difference in absorbance between ⁇ ODtest and ⁇ ODblank, and the peroxidase activity is calculated.
  • the amount of enzyme that produces 1.0 mg of purpurogalin in 20 seconds under the above conditions is defined as 1 purpurogalin unit (U).
  • the calculation formula is as shown below.
  • U/mg ⁇ U/mL ⁇ 1/C 0.117: Absorbance at 420 nm of 1 mg% purpurogalin ether solution
  • C Enzyme concentration at the time of dissolution (c mg/mL) (1 propulgarin unit corresponds to 13.5 international units (using o-dianisidine as a substrate and under reaction conditions of 25°C).)
  • the sample solution was dissolved in advance in ice-cooled 0.1 M phosphate buffer pH 6.0, and diluted with the same buffer to a concentration of 3.0 to 6.0 purpurogalin units (U)/mL. It is preferable to use it for measurement.
  • coloring agent As the coloring agent used in the present invention, any kind of coloring agent may be used as long as it reacts with hydrogen peroxide and is led to a dye and develops a color.
  • a combination of a hydrogen donor and a coupler examples include leuco bodies and tetrazolium salts. From the viewpoint that the effects of the present invention can be more effectively obtained, it is preferable to use a combination of a hydrogen donor and a coupler as the color former. There are no particular limitations on the amount or form of addition of the coloring agent. All of these can be obtained as commercially available products.
  • a typical example using a combination of a hydrogen donor and a coupler is the Trinder reagent, in which the hydrogen donor and coupler are oxidatively condensed with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to form a dye.
  • hydrogen donors used in Trinder's reagent and the like phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives, etc. are known, and these can be suitably used in the present invention.
  • it is an aniline derivative.
  • couplers include 4-aminoantipyrine (4-AA), aminoantipyrine derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), and sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH). Therefore, these can be suitably used in the present invention.
  • 4-aminoantipyrine 4-aminoantipyrine.
  • leuco derivatives include triphenylmethane derivatives, phenothiazine derivatives, diphenylamine derivatives, and the like. Specifically, 4,4'-benzylidenebis(N,N-dimethylaniline), 4,4'-bis[N-ethyl-N-(3-sulfopropylamino)-2,6-dimethylphenyl]methane , 1-(ethylaminothiocarbonyl)-2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-diethylaminophenyl)imidazole, 4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamine, N-(carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamine salt (DA64), 10-(carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazine salt (DA67),
  • Tetrazolium salts include 2,3,5-triphenyltetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3-(1-naphthyl)-2H-tetrazolium salt, 3,3'-[3,3'-dimethoxy-(1 , 1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium] salt, 3,3'-[3,3'-dimethoxy-( 1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) salt, 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium salt, 3,3'-(1,1'-biphenyl-4,4'-diyl)-bis(2,5-diphenyl
  • the first reagent and/or the second reagent used in the present invention are liquid reagents, it is preferable to contain a buffer component.
  • the buffer include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, and GOOD buffer.
  • the amount used, the pH setting, the form of addition, etc. are not particularly limited. All of these can be obtained as commercially available products.
  • GOOD buffers include N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES), and N-cyclohexyl- 2-aminoethanesulfonic acid (CHES), 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminomethanesulfonic acid (TES), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2- Hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid (CAPSO), 3-[N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino]
  • Examples of preservatives include azides, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, and the like.
  • examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salts.
  • examples of antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol, and the like.
  • examples of antibacterial agents include methylisothiazolinone, imidazolidinyl urea, ProClin, and the like.
  • Examples of salts include sodium chloride, potassium chloride, aluminum chloride, and the like.
  • enzyme stabilizers include sucrose, trehalose, cyclodextrin, gluconate, and amino acids.
  • Examples of the color former stabilizer include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and its salts, cyclodextrin, and the like.
  • methods for measuring biological components are known to have the problem of being susceptible to interfering substances that coexist in samples such as serum, such as in-vivo reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin.
  • Various countermeasures such as so-called elimination systems, are being considered depending on each interfering substance.
  • ascorbic acid can be eliminated by treating the sample with ascorbic acid oxidase.
  • bilirubin can be eliminated by treating the sample with bilirubin oxidase.
  • the method of the present invention preferably contains components that can reduce the effects of such in vivo reducing substances, and more preferably contains ascorbic acid oxidase and bilirubin oxidase, and particularly preferably contains ascorbic acid oxidase.
  • the component capable of reducing the influence of such a bioreducing substance may be included in either the first reagent and/or the second reagent, or it may be added as a different reagent from the first reagent and the second reagent. Good too.
  • the present invention can be practiced in measuring any biological sample that may contain elevated levels of creatinine. More specifically, the present invention can be implemented in the measurement of a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or higher. Biological samples with high creatinine values targeted by the present invention are not particularly limited as long as the creatinine concentration is 120 mg/dL or higher, but biological samples suspected of having a creatinine concentration of 120 to 200 mg/dL are preferred, and 120 to 200 mg/dL.
  • the biological sample is more preferably 180 mg/dL, more preferably 120 to 160 mg/dL, and even more preferably 120 to 140 mg/dL. Particularly preferred is a sample.
  • the measurement may be performed on a biological sample whose creatinine concentration is suspected to be 160 mg/dL or higher, for example, a biological sample suspected to be between 160 and 200 mg/dL.
  • a biological sample suspected to be between 160 and 200 mg/dL Even in such a biological sample with a high creatinine value, the present invention is advantageous because measurement errors can be effectively reduced and detection can be performed with more accurate measurement values.
  • Creatinine concentration in a biological sample can be measured by a method known in the art. Specifically, purified water and an aqueous solution known to contain 5 mg/dL creatinine (5 mg/dL creatinine aqueous solution) are prepared, and calculated by comparing with a calibration curve created from these measured absorbances (546 nm). can do.
  • the biological sample with a high creatinine value used in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample collected from a living body, but examples thereof include body fluids of a living body such as blood (particularly serum and plasma), urine, ascites, and cerebrospinal fluid. can be mentioned.
  • body fluids of a living body such as blood (particularly serum and plasma), urine, ascites, and cerebrospinal fluid.
  • samples collected from humans such as samples derived from blood such as serum and plasma, and samples derived from urine, are preferred, with serum, plasma, and urine being more preferred, and urine being even more preferred.
  • these biological samples contain creatine of 120 mg/dL or more, measurement errors are likely to occur when catalase is used in the scavenging reaction, but the present invention has the advantage of being able to significantly reduce these measurement errors.
  • the present invention it is possible to reduce measurement errors that tend to occur when measuring creatinine using a method that uses catalase in an elimination reaction in a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or higher.
  • the degree to which the measurement error is reduced is not particularly limited, in a preferred embodiment, the present invention can suppress the measurement error in such a case to within ⁇ 10%, preferably within ⁇ 7%. , more preferably within ⁇ 5%, still more preferably within ⁇ 4%, and most preferably within ⁇ 3%.
  • measurement errors caused by components similar to creatinine (such as creatine) or reaction intermediates thereof that may be contained in biological samples can be suppressed.
  • the inclusion may cause warping and measurement errors.
  • catalase in the first reagent, it is possible to reduce measurement errors caused by substances similar to creatinine, and by including an azide in the second component, it is possible to reduce measurement errors that may occur in the case of samples with high creatinine values.
  • the resulting measurement error can also be reduced, the measurement error range can be kept within the above range, and detection can be performed with more accurate measurement values.
  • the present invention provides a method for measuring creatinine in a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or more, which contains a first reagent containing catalase and a second reagent containing an azide.
  • a biological sample suspected of having a creatinine concentration of 120 mg/dL or more which contains a first reagent containing catalase and a second reagent containing an azide.
  • Catalase that can be used in this kit, the type and amount of azide, and other components that may be coexisting are the same as those described above.
  • the reagent kit of the present invention includes information regarding how to use the kit (for example, that the kit is used in such a manner that the first reagent is mixed with a biological sample and then reacted, and then the second reagent is added; (instructions, etc.
  • Example 1 Confirmation of the effect of adding azide to the creatinine measurement reagent> A concentration of 0.5 g/L of sodium azide was added to the second reagent of the creatinine measurement reagent below (the final concentration of sodium azide in the reaction solution after adding the second reagent when using this creatinine measurement reagent was 0.0125 w/v%). As a comparative example, a second reagent without the addition of sodium azide was also prepared and measured as a control.
  • reagents for measuring creatinine As reagents for measuring creatinine, a first reagent and a second reagent having the following compositions were prepared.
  • First reagent Ascorbic acid oxidase Asyobo ASO-311) 3KU/mL Sarcosine oxidase (SAO-351 manufactured by Toyobo) 10KU/mL Creatine amidinohydrolase (CRH-221 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 40.0 KU/mL N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline 0.14g/L Catalase (manufactured by Toyobo Co., Ltd., CAO-519, Mw53,000) 200KU/mL Second reagent Creatinine amide hydrolase (CNH-311 manufactured by Toyobo) 400KU/mL Peroxidase (PEO-301 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 10
  • Example 2 Confirmation of the effects of adding azide at various concentrations>
  • a first reagent containing catalase and a second reagent to which sodium azide was added at various concentrations were prepared.
  • the concentrations of each sodium azide in the second reagents were 0.045 g/L, 0.5 g/L, 1.5 g/L, 3.5 g/L, and 5.0 g/L (these second reagents).
  • the final concentrations of sodium azide in the reaction solution after addition are 0.001 w/v%, 0.012 w/v%, 0.037 w/v%, 0.086 w/v%, and 0.123 w/v%, respectively. ).
  • the reagent kit and measuring method for measuring biological components, etc. of the present invention can easily obtain highly accurate measurement results, so it is very useful for testing applications such as in vitro diagnostic drugs, and will greatly contribute to the industry. be able to.

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Abstract

クレアチニン高値検体の測定時に生じる測定誤差を低減する方法を提供する。本発明は、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料のクレアチニン測定で起こる測定誤差を低減する方法であって、以下の工程：（１）生体試料中に存在するクレアチン及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも一種を消去する第一試薬を、生体試料と混合して反応させる工程、及び（２）生体試料中に存在するクレアチニンを測定する第二試薬を、前記工程（１）の反応液と混合し反応させる工程を包含し、前記第一試薬はカタラーゼを含有し、且つ、前記第二試薬はアジ化物を含有することを特徴とする。

Description

クレアチニン高値検体測定時の正確性向上
　本発明は、クレアチニン測定において、クレアチニンが高濃度含まれる生体試料を測定する際に起こる測定誤差を低減する方法、及びその方法に用いられる試薬キット等に関する。
　従来、臨床診断においては、生体成分等の測定方法として、それぞれの成分に対して、高い基質特異性を有する酵素を使用した酵素的測定方法が普及している。その中でも測定対象である生体成分又は生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法が多く用いられている。例えば、酵素法で第一試薬により測定対象成分外の物質を分解した後に発生する過酸化水素をカタラーゼによって水に分解し、次いで、第二試薬により測定対象成分から酸化酵素により過酸化水素を生成させ、この過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下で発色剤（色原体ともいう）と反応させることにより、発色剤を色素（例えば、キノンイミン色素）に変え、該色素を吸光度測定して比色定量する方法が広く知られている。
　一方で、このような臨床診断において生体成分を測定する際に、検体中の対象成分が高濃度のことがある。これは、その生体成分の正常範囲を超えた異常値を示す被験者がいる場合があることに加え、例えば、通常は血清・血漿検体中で測定するような成分を、尿中で測定したりする場合などに起こり得る。このような高濃度の検体では試薬中の反応成分との反応不足や、反応成分との過剰反応により、負の誤差や正の誤差が生じ、測定値誤差にしばしば繋がる。
　このような生体成分の高値検体の測定のために、いくつかの検討がされている。例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）等のタンパク質又は脂質等の生理活性成分の測定において、当該蛋白質に対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を含む測定試薬にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有させることでの測定範囲を拡大する方法（特許文献１）、分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液及び前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片を組み合わせて用いることで測定範囲を拡大する方法（特許文献２）などの免疫学的分析法で種々の検討がなされている。
　しかし、これらの文献では、クレアチニンのような低分子成分の測定において高値検体を正確に測定する方法については検討されていない。また、これらの文献では、酸化酵素等を用いる酵素法で測定する方法における高値検体の測定値の正確性向上に関しても検討されていなかった。
　また、測定対象成分以外の成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解し、次いで測定対象成分に由来する過酸化水素を定量することにより前記測定対象成分を定量する方法において、７５ｋＤａ以上のサブユニットを持つ特定の微生物由来のカタラーゼを用いることで、試薬中に含まれ得るアジ化物で引き起こされるカタラーゼ阻害に起因する測定誤差を低減する方法も知られている（特許文献３）。この特許文献３では、中性脂肪測定用試薬で効果を確認しており、カタラーゼ阻害に起因して内因性遊離グリセロールの消去が妨害されて測定値が上昇するという正の測定誤差を、特定カタラーゼを用いることで解決したことを記載している。しかし、特許文献３では、生体成分の高値検体の測定において起こる測定誤差（特に負の測定誤差）を解決することは全く検討していない。
特開２０１１－２５７２４３号公報 特開２００４－１９１３３２号公報 特開２００９－６５８８３号公報
　本発明者は、クレアチニン高値検体を測定する際に正しく測定できない場合があるという経験をした。そしてこの高値検体で起こる測定誤差は、クレアチニン測定用試薬キットがカタラーゼを含む場合に生じやすいことを突き止めた。本発明はこの新たに見出された課題を解決するものであり、高濃度のクレアチニンを含む生体試料においてクレアチニンを測定する場合に起こる測定誤差を低減し、それにより、例えば、各種生体試料におけるクレアチニン測定範囲を拡大し、高濃度のクレアチニンの正確な検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記の課題の解決を目指して検討を行った結果、測定試薬キットの第一試薬にカタラーゼを含むように設計し、且つ、第二試薬にアジ化物を添加することで、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬの高濃度の生体試料を測定する場合であっても、クレアチニン測定時の測定誤差を低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、代表的な本発明は、以下の構成を有する。
　［項１］　クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料のクレアチニン測定で起こる測定誤差を低減する方法であって、以下の工程：
（１）生体試料中に存在するクレアチン及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも一種の成分を消去する第一試薬を、生体試料と混合して反応させる工程、及び
（２）生体試料中に存在するクレアチニンを測定する第二試薬を、前記工程（１）の反応液と混合し反応させる工程、
を包含し、ここで前記第一試薬はカタラーゼを含有し、且つ、前記第二試薬はアジ化物を含有する、方法。
　［項２］　前記工程（２）において、生体試料中のクレアチニン又はクレアチニンに由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下で発色剤と反応させて比色定量することによりクレアチニンを測定する、項１に記載の方法。
　［項３］　前記生体試料が、クレアチニン濃度が１２０～２００ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料である、項１又は２に記載の方法。
　［項４］　前記生体試料が、血清、血漿、及び尿からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～３のいずれかに記載の方法。
　［項５］　前記工程（２）の第二試薬混合後の反応液中におけるアジ化物の濃度が０．００１～０．２ｗ／ｖ％である、項１～４のいずれかに記載の方法。
　［項６］　前記アジ化物がアジ化ナトリウムである、項１～５のいずれかに記載の方法。
　［項７］　前記工程（１）の第一試薬混合後の反応液中におけるカタラーゼの濃度が１０～５００ＫＵ／ｍＬである、項１～６のいずれかに記載の方法。
　［項８］　前記発色剤がトリンダー試薬である、項２～７のいずれかに記載の方法。
　［項９］　クレアチニン測定で起こる負の測定誤差を低減する、項１～８のいずれかに記載の方法。
　［項１０］　項１～９のいずれかに記載の方法で用いられる、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料を測定可能なクレアチニン測定用試薬キットであって、カタラーゼを含有する第一試薬及びアジ化物を含有する第二試薬を含む、試薬キット。
　本発明によれば、酵素法による血清、血漿又は尿中等の生体試料に含まれるクレアチニンの測定において、１２０ｍｇ／ｄＬ以上というクレアチニン高値検体を測定する場合でも測定誤差を高度に（例えば±１０％未満に）抑えることができる。従って本発明により、クレアチニン測定範囲の拡大、及び／又は、高濃度のクレアチニンを含む生体成分の正確な測定が可能となる。
　以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
（クレアチニン高値検体測定時の測定誤差の低減方法）
　一つの実施形態において、本発明は、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料のクレアチニン測定で起こる測定誤差を低減する方法であって、少なくとも以下の工程：
（１）生体試料中に存在するクレアチン及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも一種の成分を消去する第一試薬を、生体試料と混合して反応させる工程（以下、この工程の反応を「第一反応」ともいう）、及び
（２）生体試料中に存在するクレアチニンを測定する第二試薬を、前記工程（１）の反応液と混合し反応させる工程（以下、この工程の反応を「第二反応」ともいう）、
を包含し、ここで前記第一試薬はカタラーゼを含有し、且つ、前記第二試薬はアジ化物を含有することを特徴とする方法である。
　本発明の上記方法によれば、クレアチニン高値検体であっても正確に定量することが可能となり得る。よって本発明の上記方法は、高濃度範囲までクレアチニンを測定可能にするという意味で各種生体試料におけるクレアチニン測定範囲を拡大する方法ということもできるし、高濃度のクレアチニンの正確な検出方法ということもできる。
　従来、クレアチニン等の生体成分測定試薬においてアジ化物は防腐剤等として使用され、一般には、生体成分測定において測定誤差を生じさせ得る成分として知られてきた（特許文献３）。本発明では全く予想外のことに、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上という高値検体を測定する特定の場面では、測定誤差を生じさせ得る成分として知られてきたアジ化物が所定の方法で用いられると測定誤差を低減させる作用を有することを見出したことに基づいている。
（工程（１）の第一反応）
　クレアチニン測定においては、生体試料中に含まれ得るクレアチニンの類似成分（例えば、クレアチン等）、又は数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が測定誤差を生じさせる場合がある。そのため前記の本発明の方法では、工程（１）においてまずこのような測定誤差を生じさせるクレアチニン以外の成分を消去する第一反応（消去系反応等ともいう）を行う。この第一反応では、クレアチニンに構造及び／又は性質が類似する生体成分又はその反応中間体などの測定誤差を生じさせ得る成分として、クレアチン及び／又はサルコシンを消去する。好ましくは、クレアチンを分解すると共にサルコシンも分解して両成分を消去する。また、この第一反応において、クレアチン及び／又はサルコシン以外の成分も消去するように反応させてもよい。
　前記の本発明の方法において、第一反応は、生体試料中に存在するクレアチン及び／又はサルコシンを消去する第一試薬を、生体試料と混合して反応させることにより実施され得る。具体的には、第一反応において、例えば、クレアチニンに直接作用する酵素以外の酵素を生体試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去する方法であり得る。好ましくは、第一反応においてクレアチニンアミドヒドロラーゼ以外の酵素（例えば、クレアチンアミジノヒドロラーゼ及び／又はサルコシンオキシダーゼ等）を生体試料に作用させて、クレアチンなどに起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去する方法等が挙げられる。なお、第一試薬は、一つの試薬であってもよいし、二以上の試薬の組合せ（例えば、クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する試薬とサルコシンオキシダーゼを含有する試薬の組合せ）であって第一反応において同時に又は互いに前後して生体試料と混合されるように構成されたものであってもよい。
　本発明の方法において、第一反応に用いられる第一試薬は、カタラーゼを含有することを特徴とする。第一試薬が複数試薬の組合せである場合、いずれの試薬にカタラーゼが含まれていてもよい。カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は、プロトヘムを有するヘム蛋白質で、過酸化水素を分解する反応を触媒する酵素である。本発明は第一反応に用いる第一試薬にカタラーゼが存在する場合に、クレアチニン高値検体の測定時に測定誤差が生じ易いことを突き止めたことに基づく。クレアチニンに直接作用する酵素反応は後述の第二反応において起こることになるため、クレアチニンには直接作用しない第一反応の第一試薬中の成分が影響することは全く意外なことであった。
　本発明の方法において第一試薬に用いられ得るカタラーゼは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、任意の微生物（真菌、細菌、古細菌等）に由来するカタラーゼを使用できる。例えば、本発明に用いられるカタラーゼは、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ボトリオチニア（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ）属、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ノゼマ（Ｎｏｓｅｍａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物に由来するカタラーゼであり得るが、これらに限定されない。より本発明の効果が得られ易いという観点から、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物に由来するカタラーゼを用いることが好ましい。
　本発明に用いられるカタラーゼは、任意のサイズのカタラーゼであってよく、例えば、分子量（Ｍｗ）が約５００００～９００００のカタラーゼであり得る。一つの実施形態において、本発明に用いられるカタラーゼは、分子量７５０００未満のカタラーゼであってよく、また分子量６５０００以下のカタラーゼであってもよく、更には分子量６００００以下のカタラーゼであってもよい。このように比較的小さな分子量のカタラーゼを用いることにより、より一層高い効果を発揮することが期待できる。
　本発明において、第一試薬中におけるカタラーゼの濃度は特に限定されない。好ましくは、第一試薬は、前記工程（１）の第一試薬混合後の反応液中におけるカタラーゼの濃度が１０～５００ＫＵ／ｍＬとなるように、好ましくは１５～３７０ＫＵ／ｍＬとなるように、より好ましくは５０～３５０ＫＵ／ｍＬとなるように、更に好ましくは１００～３００ＫＵ／ｍＬとなるように調整された量でカタラーゼを含有する。例えば、第一反応においてカタラーゼを含有する第一試薬を２倍希釈して使用されることを想定している場合には、第一試薬中におけるカタラーゼの濃度を２倍量とすればよい。このような濃度で第一反応においてカタラーゼを用いる場合であっても、本発明によればカタラーゼにより引き起こされ得るクレアチニン高値検体測定時の測定誤差を効果的に抑制できる。
　前記の本発明の方法において、工程（１）の第一反応は、カタラーゼを含有する第一試薬を生体試料と混合して一定時間反応させることにより行う。第一反応の反応条件は、使用する酵素などの反応成分の種類や量等により適宜変動するが、例えば、カタラーゼを含有する第一試薬を生体試料と混合後、１～１０分間（例えば、５分間）反応させることにより実施され得る。反応温度は特に限定されないが、例えば、２０～４０℃（例えば、３７℃）の条件下で行うことが好ましい。
（工程（２）の第二反応）
　前記の本発明の方法では、前記工程（１）の第一反応（消去系反応）を行った後、クレアチニンを測定する第二試薬を反応系に追加して第二反応を行う。好ましい実施形態では、ここで用いられる第二試薬はクレアチニンに直接作用する酵素等を含有し、これらの酵素等（酸化酵素等を含む）を作用させることにより、生体試料中のクレアチニン又はクレアチニンに由来する物質から過酸化水素を発生させ、ここで生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量することによりクレアチニンを測定することを可能にする。例えば、第二反応においてクレアチニンアミドヒドロラーゼを含む第二試薬を添加し、前記第一反応を終えた反応液と混合して反応させることにより、測定対象であるクレアチニンに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量することができる。
　なお、クレアチニンを基質とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミドヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンをクレアチンアミジノヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンに対してサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を反応させて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、クレアチニンを測定することが可能である。この第二反応において作用させるクレアチニンアミドヒドロラーゼ以外の成分は、第一反応で反応系に添加する第一試薬に含有させてもよいし、第二反応で反応系に添加する第二試薬に含有させてもよいし、第一試薬及び第二試薬の両方に含有させてもよい。クレアチニンに直接作用するクレアチニンアミドヒドロラーゼは、第一試薬に含有させると第一反応の消去系でクレアチニンが分解されてしまい測定誤差を生じさせることになるため、第二試薬に含有させることが好ましい。当業者は、クレアチニン基質に直接作用する成分と、それ以外の共役反応系で作用する成分とを選択し、それらの成分を第一試薬及び／又は第二試薬のいずれに含有させればよいかを適宜設計し得る。また第一試薬と同様に、第二試薬もまた、一つの試薬であってもよいし、二以上の試薬の組合せであって第二反応において同時に又は互いに前後して第一反応の反応液と混合されるように構成されたものであってもよい。
　前記の本発明の方法では、第二反応に用いられる第二試薬が、アジ化物を含有することを特徴とする。第二試薬が複数試薬の組合せである場合、いずれの試薬にアジ化物が含まれていてもよい。このように第二試薬がアジ化物を含むことにより、第一反応から持ち込まれることになるカタラーゼの作用を実質的に停止させることができる。理論に束縛されることは望まないが、クレアチニン高値検体の測定では、第一反応から持ち込まれるカタラーゼを十分に失活できていないことに少なくとも一部起因して測定誤差が生じている可能性があり、本発明では第二試薬に有効量のアジ化物を含有させておくことでカタラーゼの作用を実質的に停止させて測定誤差を低減していると推測される。本発明によれば、クレアチニン高値検体測定時にカタラーゼが過剰に作用することで発生する測定値の低値化を抑制することができ、負の測定誤差を低減して高精度な生体成分の測定等が可能になる。
　本発明の方法において第二試薬に用いられ得るアジ化物は、本発明の効果を奏する限り特に限定されない。第二反応系において作用させ易いという観点から、好ましくは、アジ化物の金属塩であり、より好ましくはアジ化物のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはアジ化物のアルカリ金属塩（例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化リチウム）である。
　本発明において、第二試薬中におけるアジ化物の濃度は特に限定されない。好ましくは、第二試薬は、前記工程（２）の第二試薬混合後の反応液中におけるアジ化物の濃度が０．００１～０．２ｗ／ｖ％となるように、好ましくは０．００３～０．１７ｗ／ｖ％、より好ましくは０．００５～０．１５ｗ／ｖ％となるように、更に好ましくは０．０１～０．１３ｗ／ｖ％となるように調整された量でアジ化物を含有する。一つの好ましい実施形態では、例えば、第二試薬は、前記工程（２）の第二試薬混合後の反応液中におけるアジ化物の濃度が０．００１～０．０１５ｗ／ｖ％となるように調整された量でアジ化物を含有してもよい。例えば、第二反応においてアジ化物を含有する第二試薬を４倍希釈して使用されることを想定している場合には、第二試薬中におけるアジ化物の濃度を４倍量とすればよい。このような濃度で第二反応においてアジ化物を用いることで、クレアチニン高値検体測定時の測定誤差をより一層効果的に抑制できる。
　前記の本発明の方法において、工程（２）の第二反応は、アジ化物を含有する第二試薬を第一反応後の反応液と混合して一定時間反応させることにより行う。第二反応の反応条件は、使用する酵素などの反応成分の種類や量等により適宜変動するが、例えば、アジ化物を含有する第二試薬を第一反応後の反応液と混合後、１～１０分間（例えば、５分間）反応させることにより実施され得る。反応温度は特に限定されないが、例えば、２０～４０℃（例えば、３７℃）の条件下で行うことが好ましい。
　本発明では、酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下で発色剤と反応させて色素へと導き比色定量する酵素法（本明細書ではこれを単に、「酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法」などともいう）において、前記の第一反応及び第二反応を行ってクレアチニン高値の生体試料を測定する際に特に有用である。
従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法において、クレアチニン高値検体測定時の測定誤差（例えば、負の測定誤差）を低減する方法又はクレアチニン高値検体の測定値の正確性を向上させる方法等ともいうことができる。本発明は、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法でクレアチニン高値検体を測定する任意の場面において有用である。酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法の原理を用いるクレアチニン測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、クレアチニンの量または濃度を測定することができ、使用する酵素の種類や量、酵素や発色剤の添加の順番、タイミング等の態様は特に制限されない。
　上記の本発明の方法を実施するための手段としては、例えば、汎用の自動分析機（例えば、日立７１８０形自動分析機）を利用できる。好ましい実施形態では、このような汎用の自動分析機に適用できるように第一試薬及び第二試薬を構成するように試薬を調製すればよい。例えば、これらの第一試薬及び第二試薬を、液状試薬（またはキット）として調製して用いる方法、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）として調製して用いる方法、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサとして調製して用いる方法など種々の形態が例示できる。好ましくは、１又は複数の液状試薬を用いて自動分析機で測定する方法であり、より好ましくは、第一試薬及び第二試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬ともいう）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（第一試薬）を添加して一定時間反応させ（これを第一反応とする）、次いで２種類目の試薬（第二試薬）をさらに添加して一定時間反応させ（これを第二反応とする）、第一反応終了後の吸光度と第二反応終了後の間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を比色定量することが出来る。
　前記の本発明の方法では、クレアチニンの測定において有用な更なる成分又はこれらの成分等の安定化に寄与する成分等を使用することが好ましい。このような成分としては、例えば、ペルオキシダーゼ、発色剤、緩衝液成分、防腐剤、キレート剤、抗生物質、抗菌剤、塩類、酵素安定化剤、発色剤安定化剤等を上げることができるがこれらに限定されない。これらの成分は、前記の第一試薬及び／又は第二試薬のどちらに含まれていてもよい。第二反応で作用する成分であっても、第一試薬を混合した第一反応の反応液から持ち込まれて作用できるので、第一試薬に含まれていてもよい。また、第一試薬及び第二試薬とは異なる試薬として添加されてもよい。これらの成分の使用量等は、本発明の効果を阻害しない限り、特に限定されない。これらは例えば、市販品などを使用することができる。
（ペルオキシダーゼ）
　本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と発色剤（酸化還元系発色試薬ともいう）との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ－１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
　ペルオキシダーゼ活性は、以下の方法で定義する。
　蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。２０秒間反応を行った後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
　Ｕ／ｍＬ
　＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ－ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率｝／｛０．１１７×１（ｍＬ））
＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
　Ｕ／ｍｇ＝｛Ｕ／ｍＬ｝×１／Ｃ
　０．１１７：１ｍｇ％プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
　Ｃ：溶解時の酵素濃度（ｃ　ｍｇ／ｍＬ）
　（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）
　なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０～６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。
（発色剤）
　本発明に用いる発色剤としては、過酸化水素と反応することで色素に導かれ呈色するものであれば、いかなる種類の発色剤を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーとの組合せ、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。より一層効果的に本発明の効果が得られ易いという観点から、好ましくは、発色剤として水素供与体とカップラーとの組合せを使用するのがよい。発色剤の使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
　水素供与体とカップラーとの組合せを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）試薬である。トリンダー試薬などに用いる水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が知られており、本発明ではこれらを好適に使用できる。好ましくはアニリン誘導体である。
　たとえば、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－２，５－ジメチルアニリン等のアニリン誘導体；Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。
これらの水素供与体はカップラーと組合せて用いることが好ましい。
　また、カップラーとしては４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が知られており、本発明ではこれらを好適に使用できる。好ましくは、４－アミノアンチピリンである。
　ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）、４，４’－ビス［Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピルアミノ）－２，６－ジメチルフェニル］メタン、１－（エチルアミノチオカルボニル）－２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェニル）－４，５－ビス（４－ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
　テトラゾリウム塩としては、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５－ジフェニル－３－（１－ナフチル）－２Ｈ－テトラゾリウム塩、３，３’－［３，３’－ジメトキシ－（１，１’－ビフェニル）－４，４’－ジイル］－ビス［２－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム］塩、３，３’－［３，３’－ジメトキシ－（１，１’－ビフェニル）－４，４’－ジイル］－ビス（２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム）塩、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム塩、３，３’－（１，１’－ビフェニル－４，４’－ジイル）－ビス（２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム）塩、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩等が挙げられる。
　本発明に用いる第一試薬及び／又は第二試薬が液状試薬である場合には、緩衝液成分を含有させることが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
　ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。
　防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
　抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
　抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア、ＰｒｏＣｌｉｎ等が挙げられる。
　塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
　発色剤安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
　また、生体成分等の測定方法では、血清などの試料中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響も受けやすい問題点が知られており、これらの妨害物質に対しても、それぞれの妨害物質に応じて、いわゆる消去系など種々の対策が検討されている。例えば、アスコルビン酸に対しては、試料にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させることにより消去できる。また、ビリルビンに対しては、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させることにより消去できる。従って、本発明の方法ではこのような生体内還元物質の影響を軽減できる成分を含むことも好ましく、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼを含むことがより好ましく、なかでもアスコルビン酸オキシダーゼを含むことが好ましい。このような生体内還元物質の影響を軽減できる成分は、第一試薬及び／又は第二試薬のどちらに含まれていてもよいし、第一試薬及び第二試薬とは異なる試薬として添加されてもよい。
　本発明は、高値のクレアチニンを含み得る任意の生体試料の測定において実施され得る。より具体的には、本発明は、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料の測定において実施され得る。本発明が対象とするクレアチニン高値検体の生体試料は、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であれば特に限定されないが、１２０～２００ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料であることが好ましく、１２０～１８０ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料であることがより好ましく、１２０～１６０ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料であることが更に好ましく、１２０～１４０ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料であることが特に好ましい。また、一つの好ましい実施形態では、クレアチニン濃度が１６０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料、例えば、１６０～２００ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料の測定において実施されてもよい。このようなクレアチニン高値の生体試料であっても、本発明によれば測定誤差を効果的に低減でき、より正確な測定値で検出することが可能となるので有益である。
　生体試料におけるクレアチニン濃度は、当該分野で公知の方法により測定できる。具体的には、精製水及び５ｍｇ／ｄＬのクレアチニンを含むことが分かっている水溶液（５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液）を用意し、これらの測定吸光度（５４６ｎｍ）より作成される検量線との対比で算出することができる。
　本発明に用いられるクレアチニン高値の生体試料は、生体から採取した試料であれば特に限定されないが、例えば、血液（特に、血清や血漿など）、尿、腹水、髄液などの生体の体液などを挙げることができる。なかでも血清、血漿等の血液に由来する試料、尿に由来する試料などのヒトから採取した試料が好ましく、血清、血漿、尿であることがより好ましく、尿であることが更に好ましい。これらの生体試料が１２０ｍｇ／ｄＬ以上のクレアチンを含む場合に、消去系反応でカタラーゼを用いるときには、測定誤差が生じ易いが、本発明によればその測定誤差を高度に低減できるという利点がある。
　本発明によれば、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料において、消去系反応でカタラーゼを使用する方法でクレアチニン測定を行う場合に起こりやすい測定誤差を低減できる。測定誤差を低減する程度は特に限定されないが、好ましい実施形態では、本発明により、このような場合の測定誤差を±１０％以内に抑えることができ、好ましくは±７％以内に抑えることができ、より好ましくは±５％以内に抑えることができ、更に好ましくは±４％以内に抑えることができ、なかでも好ましくは±３％以内に抑えることができる。カタラーゼを含有する第一試薬を用いる第一反応で、生体試料中に含まれ得るクレアチニンの類似成分（例えば、クレアチン等）又はその反応中間体により生じる測定誤差を抑制できるが、このようにカタラーゼを含むことによりクレアチニン高値検体の場合には反って測定誤差を引き起こす場合があることが本発明者の検討により分かっている。本発明によれば、第一試薬にカタラーゼを含有させることによりクレアチニンの類似物質等により引き起こされる測定誤差を低減できるだけでなく、第二成分にアジ化物を含有させることでクレアチニン高値検体の場合に起こり得る測定誤差も低減でき、測定誤差範囲を上記のような範囲内に収めることができ、より正確な測定値で検出することが可能となる。
（クレアチニン高値検体を測定するためのクレアチニン測定用試薬キット）
　前記のように、第二反応に用いる第二試薬にアジ化物を含有させ、第二反応の反応液中にアジ化物を共存させて生体試料に作用させることで、第一反応としてカタラーゼを用いる消去系反応を行うクレアチニン測定法でクレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上の高値検体を測定する場合であっても、測定誤差を抑えつつ、より正確なクレアチン濃度を測定することが可能となる。この本発明の方法は、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法でのクレアチニン測定において、生体試料中の高値のクレアチニンに起因して引き起こされる測定誤差を抑制する際に特に有用である。
　従って、本発明は更に別の観点から、カタラーゼを含有する第一試薬及びアジ化物を含有する第二試薬を含む、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料を測定可能なクレアチニン測定用試薬キットを提供する。本キットに用いられ得るカタラーゼ、アジ化物の種類や量、その他に共存させてもよい他の成分等は、前述で説明したものと同様である。本発明の試薬キットは、当該キットの使用方法に関する情報（例えば、第一試薬を生体試料と混合後に反応させた後、第二試薬を添加するように使用すること、及び、前記第二試薬を第一反応の反応液と混合したときのアジ化物の終濃度が０．００１～０．２ｗ／ｖ％となるような量で前記第二試薬を添加することなどを説明した指示書等）を含む態様で提供することができる。
　本キットを用いることにより、例えば、血清、血漿、尿などの高値のクレアチニンを含み得る生体試料において、負の測定誤差を軽減し、より正確なクレアチニン濃度の測定が可能となる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
＜実施例１：クレアチニン測定試薬へのアジ化物添加効果の確認＞
　下記のクレアチニン測定試薬の第二試薬に、アジ化ナトリウムの濃度を０．５ｇ／Ｌ添加した（なお、このクレアチニン測定試薬使用時における第二試薬添加後のアジ化ナトリウムの反応液中終濃度は０．０１２５ｗ／ｖ％となる）。比較例としてアジ化ナトリウムを無添加の第二試薬も用意し、対照として測定した。
（試薬の調製）
　クレアチニン測定試薬として、下記組成を有する第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬
　アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ－３１１）３ＫＵ／ｍＬ
　サルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ－３５１）１０ＫＵ／ｍＬ
　クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ－２２１）４０．０ＫＵ／ｍＬ
　Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン　０．１４ｇ／Ｌ
　カタラーゼ（東洋紡社製、ＣＡＯ－５１９、Ｍｗ５３，０００）２００ＫＵ／ｍＬ
第二試薬
　クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ－３１１）４００ＫＵ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ－３０１）１０ＫＵ／ｍＬ
　４－ＡＡ　０．６ｇ／Ｌ
（測定サンプルの調製）
　サンプル（試料）としては下記サンプルを調製した。
　サンプル１　クレアチニン　１２０ｍｇ／ｄＬ水溶液
　サンプル２　クレアチニン　１４０ｍｇ／ｄＬ水溶液
　サンプル３　クレアチニン　１６０ｍｇ／ｄＬ水溶液
　サンプル４　クレアチニン　１８０ｍｇ／ｄＬ水溶液
　サンプル５　クレアチニン　２００ｍｇ／ｄＬ水溶液
　上記サンプル１～５の水溶液のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度（５４６ｎｍ）より作成した検量線との対比で算出して確認した。
（測定法）
測定には日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬を１２０μＬ添加し５分間インキュベーションして第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度（主波長）および８００ｎｍにおける吸光度（副波長）を測定した。主波長から副波長を引いた吸光度を算出して求めた。クレアチニン測定値（ｍｇ／ｄＬ）は、上記サンプル１～５の水溶液のクレアチニン濃度の算出と同じく、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より作成した検量線との対比で算出して求めた。また、クレアチニン濃度の期待値との乖離度を、以下の式（Ｉ）で算出した。
　クレアチニン（ＣＲＥ）期待値との乖離度＝｛（CRE測定値―CRE期待値）÷CRE期待値｝×１００（％）・・・式（Ｉ）
　アジ化ナトリウム無添加の場合の結果を下記の表１に示し、アジ化ナトリウムを添加した場合の結果を下記の表２に示す。
　表１から分かるように、消去系反応を行う第一反応でカタラーゼを含有する第一試薬を用いる場合、第二試薬にアジ化物が無添加の場合はクレアチニン添加濃度が高くなるにつれてクレアチニン測定値の負の影響が大きくなり、期待値との乖離が大きくなった。なお、クレアチニン低値検体（１００ｍｇ／ｄＬ以下）の場合にはこのような期待値との乖離は殆ど認められない。そのためこの期待値との乖離が起きた原因は不明ではあるが、一つの推測として、第一反応中のカタラーゼが失活できておらず、第二反応で多量に生じた過酸化水素も消去してしまうことに少なくとも一部起因して、クレアチニン高値検体の場合に測定値が低値化した結果と推察された。
　一方、表２から分かるように、アジ化ナトリウムを第二試薬に０．５ｇ／Ｌ添加したクレアチニン測定試薬では、第一反応でカタラーゼを含有する第一試薬を用いてクレアチニン高値検体を測定しても、測定値の低値化は殆ど起きていない。本実施例の結果から、本発明により、クレアチニン濃度１２０ｍｇ／ｄＬ以上の高値のクレアチニン検体であっても、測定値の乖離を改善し、より正確な測定が可能となることが分かった。
＜実施例２：アジ化物の各濃度添加による効果の確認＞
　本実施例では、クレアチニン測定試薬においてクレアチニン濃度１２０ｍｇ／ｄＬ以上の高値の検体測定時の負の影響を改善できるアジ化物濃度について更に評価を行った。
　先ず、実施例１と同様に、カタラーゼを含有する第一試薬と、アジ化ナトリウムを種々の濃度で添加した第二試薬を調製した。尚、第二試薬における各アジ化ナトリウムの濃度は０．０４５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌとした（これらの第二試薬添加後のアジ化ナトリウムの反応液中終濃度は、それぞれ、０．００１ｗ／ｖ％、０．０１２ｗ／ｖ％、０．０３７ｗ／ｖ％、０．０８６ｗ／ｖ％、０．１２３ｗ／ｖ％となる）。
　表３から分かるように、第二反応に用いる第二試薬にアジ化ナトリウムを０．０４５ｇ／Ｌ（反応液中終濃度が０．００１ｗ／ｖ％）と少量添加するだけでも測定値の負の影響を低減できることが分かった。
　本発明の生体成分等測定用試薬キット及び測定方法は、簡便に高精度な測定結果を得ることができるので、体外診断用医薬品などの検査用途に非常に有益であり、産業界に大いに寄与することができる。
 
 

Claims (10)

  1. 　クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料のクレアチニン測定で起こる測定誤差を低減する方法であって、以下の工程：
    （１）生体試料中に存在するクレアチン及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも一種の成分を消去する第一試薬を、生体試料と混合して反応させる工程、及び
    （２）生体試料中に存在するクレアチニンを測定する第二試薬を、前記工程（１）の反応液と混合し反応させる工程、
    を包含し、ここで前記第一試薬はカタラーゼを含有し、且つ、前記第二試薬はアジ化物を含有する、方法。
  2. 　前記工程（２）において、生体試料中のクレアチニン又はクレアチニンに由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下で発色剤と反応させて比色定量することによりクレアチニンを測定する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記生体試料が、クレアチニン濃度が１２０～２００ｍｇ／ｄＬであることが疑われる生体試料である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記生体試料が、血清、血漿、及び尿からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記工程（２）の第二試薬混合後の反応液中におけるアジ化物の濃度が０．００１～０.２ｗ／ｖ％である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記アジ化物がアジ化ナトリウムである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記工程（１）の第一試薬混合後の反応液中におけるカタラーゼの濃度が１０～５００ＫＵ／ｍＬである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記発色剤がトリンダー試薬である、請求項２～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　クレアチニン測定で起こる負の測定誤差を低減する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法で用いられる、クレアチニン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ以上であることが疑われる生体試料を測定可能なクレアチニン測定用試薬キットであって、カタラーゼを含有する第一試薬及びアジ化物を含有する第二試薬を含む、試薬キット。
     
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