JP7484998B2 - 測定感度を改善した生体成分測定キット及び生体成分測定方法 - Google Patents
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生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、4-アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定キットであって、前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が1.5μg/ml以下であることを特徴とする生体成分測定キット。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.9μg/ml以下であることを特徴とする項1に記載の生体成分測定キット。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.6μg/ml以下であることを特徴とする項1又は項2に記載の生体成分測定キット。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.3μg/ml以下であることを特徴とする項1乃至は3のいずれかに記載の生体成分測定キット。
前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする項1乃至は4のいずれかに記載の生体成分測定キット。
前記酸化還元発色試薬がトリンダー試薬であることを特徴とする項1乃至は5のいずれかに記載の生体成分測定キット。
生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、4-アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定方法であって、前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が1.5μg/ml以下であることを特徴とする生体成分測定方法。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.9μg/ml以下であることを特徴とする項7に記載の生体成分測定方法。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.6μg/ml以下であることを特徴とする項7又は8に記載の生体成分測定方法。
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.3μg/ml以下であることを特徴とする項7乃至は9のいずれかに記載の生体成分測定方法。
前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする項7乃至は10のいずれかに記載の生体成分測定方法。
前記酸化還元発色試薬がトリンダー試薬であることを特徴とする項7乃至は11のいずれかに記載の生体成分測定方法。
本発明の生体成分測定に用いられる生体成分としては、例えば、AST(GOT)、ALT(GPT)、LDH(乳酸脱水素酵素)とアイソザイム、ALP(アルカリ性フォスファターゼ)とアイソザイム、CK(クレアチンキナーゼ)とアイソザイム、アミラーゼ(Amy)とアイソザイム、リパーゼ、γ-GTP(γ-グルタミルトランスペプチダーゼ)、コリンエステラーゼ(ChE)、ナトリウム(Na)、カリウム(K)、クロール(Cl)、カルシウム(Ca)、リン(P)〔無機リン(IP)〕、鉄(Fe)、マグネシウム(Mg)、総蛋白(TP)、血清蛋白分画(PF)、尿素窒素(BUN)、クレアチニン(CRE)、尿酸(UA)、ビリルビン(Bil)、アンモニア、コレステロール、HDLコレステロール(HDL-C、高密度リポタンパクコレステロールともいう)、LDLコレステロール(LDL-C、低密度リポタンパクコレステロールともいう)、中性脂肪(トリグリセリド)(TG)、コレステロール(CHO)、BTR(BTR、総分岐鎖アミノ酸/チロシン比)、チロシン測定試薬(TYR)、血糖(BS、GLU)、1,5-アンヒドロ-D-グルシトール(1,5-AG)、糖化アルブミン(GA)、糖化ヘモグロビン(HbA1c)などが挙げられる。
これらの生体成分の中でも、クレアチニン(CRE)、糖化ヘモグロビン(HbA1c)は、高感度な測定を必要とするために特に好適に用いられる。
本発明の生体成分測定に用いられる生体成分を含有する検体としては、例えば、血液(特に、血清や血漿など)、尿、腹水、髄液などの人の体液や、飲料、食品などの人が摂取するものなどが挙げられる。
本発明の生体成分測定方法は、以下の(1)~(3)の工程を含むものであれば特に限定されるものではない。
(1)生体成分に酸化酵素を作用させ、過酸化水素を発生させる工程、
(2)工程(1)で発生させた過酸化水素が、ペルオキシダーゼを共存させることによりペルオキシダーゼが作用することにより、4-アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより反応液を呈色させる工程、
(3)工程(2)で呈色した反応産物を比色定量する工程。
この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されるものではない。
の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ-発色剤系により定量することができる。
本発明の生体成分測定キットは、以下の(a)~(d)の要件を満たすものであれば特に限定されるものではない。
(a)生体成分に作用させることにより過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含有する。
(b)ペルオキシダーゼを含有する。
(c)ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含有する。
(d)酸化還元発色試薬のカップラーとして4-アミノアンチピリンを含有する。
本発明の生体成分測定方法に用いられる酸化酵素は、基質から過酸化水素を発生させることができるものであれば、目的となる測定対象に応じて制限なく用いることができる。具体例としては、上述のとおり、ウリカーゼ、サルコシンオキシダーゼ、グリセロール3リン酸オキシダーゼなどを用いることができる。市販品としては、UAO-211(東洋紡製)、SAO-351(東洋紡製)、G3O-311(東洋紡製)等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
本発明の生体成分測定方法に用いられるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、PEO-131(東洋紡製)、PEO-301(東洋紡製)、PEO-302(東洋紡製)等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
蒸留水14mL、5%(W/V)ピロガロール水溶液2mL、0.147M 過酸化水素水1mL及び100mM リン酸緩衝液(pH6.0)2mLを順次混合した後、20℃にて5分間予備温調し、サンプル溶液1mLを加え、酵素反応を開始する。
20秒間反応を行った後、2N 硫酸水溶液1mLを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル15mLにて5回抽出する。
抽出液を合わせた後、全量100mLとし、波長420nmにおける吸光度を測定する(ΔODtest)。
一方、盲検は蒸留水14mL、5% ピロガロール水溶液2mL、0.147M 過酸化水素水1mL及び100mM リン酸緩衝液(pH6.0)2mLを順次混合した後、2N 硫酸水溶液1mLを加えて混和し、次いでサンプル溶液1mLを加えて調製する。
この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する(ΔODblank)。
ΔODtest及びΔODblankの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。
上記条件で20秒間に1.0mgのプルプロガリンを生成する酵素量を1プルプロガリン単位(U)とする。計算式は、以下に示す通りである。
ペルオキシダーゼ活性(U/mL)
={ΔOD(ODtest-ODblank)×希釈倍率}/{0.117×1(mL))
=ΔOD×8.547×希釈倍率
ペルオキシダーゼ活性(U/mg)=ペルオキシダーゼ活性(U/mL)×1/C
0.117 : 1mg%プルプロガリンエーテル溶液の420nmにおける吸光度
C : 溶解時の酵素濃度(c mg/mL)
(1プロプルガリン単位は13.5国際単位(o-dianisidineを基質とし、25℃の反応条件下)に相当する。)
本発明の生体成分測定方法に用いられる酸化還元発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーの組合せが挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
水素供与体は、水素を供与できる性質を有するものであれば、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。本発明の生体成分測定法においては、トリンダー法などに用いる水素供与体として、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体などが用いられる。このような水素供与体は、酸化発色試薬等とも呼ばれている。
これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。
4-ヒドロキシアンチピリンは、4-アミノアンチピリンの4位のアミノ基が水酸基に変換された構造であり、4-アミノアンチピリンの製造工程で生成混入した副産物と考えられる。
本発明の4-ヒドロキシアンチピリンの定量に用いる試料としては、生体成分測定キットに用いられる4-アミノアンチピン原体乃至は4-アミノアンチピリンを含有する試薬が挙げられる。本明細書において試薬とは、二種以上の試薬を混ぜた試薬組成物の状態を含む。
本発明で用いられる4-アミノアンチピリン原体とは、本発明の生体成分測定キットを構成する試薬の中で4-アミノアンチピリンを含有する試薬を製造する際に用いる4-アミノアンチピリンの原液・原末をいう。
希釈倍率は、調製した測定試料の安定性やHPLCの測定感度に影響を与えないよう4/3~5倍程度が好ましく、より好ましくは2倍程度とする。
本発明の4-ヒドロキシアンチピリンの定量方法における4-ヒドロキシアンチピリンの検出感度は0.1μg/ml以下が好ましく、より好ましくは0.05μg/ml以下、さらに好ましくは0.03μg/ml以下である。
本発明の4-ヒドロキシアンチピリンの定量方法としては、高速液体クロマトグラフ法(以下、HPLC法ともいう)が好適に用いられる。
本発明の生体成分測定における4-ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度は、1.5μg/ml以下が好ましく、より好ましくは0.9μg/ml以下であり、さらに好ましくは0.6μg/ml以下、特に好ましくは0.3μg/ml以下である。
従って、2.6σの最大値の0.296mABS、つまり約0.3mABS以上の吸光度があればシグナルとして検出可能とであり、クレアチニンの存否判断やクレアチニンの定量が可能になると考えられる。
なお、より高感度な測定を必要とする場合など、本発明の生体成分測定における4-ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度は、より好ましくは0.9μg/ml以下であり、さらに好ましくは0.6μg/ml以下、特に好ましくは0.3μg/ml以下とした。
生体成分測定時の試薬感度(反応液の発色強度:mABS)の低下の度合いは4-アミノアンチピリン原体のロット差に起因することを見出したため、4-アミノアンチピリン原体中に極微量に含まれる不純物の含有量がロットごとに異なると推測し、HPLC法により4-アミノアンチピリン原体中の不純物の検出を行った。
これらを被検液として、下記HPLC条件で前記4-ヒドロキシアンチピリンの不純物の検出を行った。
(1)カラム Imtakt Cadenza CD-C18 2.0×150mm
(2)移動相 A:0.1%ギ酸、B:メタノール
(3)グラジエント条件
0min(A95%、B5%)-(この間リニアグラジエント)-15min(A2%、B98%)-25min(A2%、B98%)
(4)流速 0.2mL/min
(5)カラム温度 40℃
(6)試料注入量 5μL
(7)検出波長 UV250nm
実施例1の図2で見られた3種類の不純物(a、b、c)について各ロットの含有量を検討したところ、不純物bのみがロットごとに含有量が大きく異なることが分かった。
そこで、これら3種類の不純物について質量分析法(MSスペクトル法)にて分子量および構造を解析した。
4-ヒドロキシアンチピリン(4-Hydroxyantipyrine)シグマ社Cas.NO.1672-63-5、
製品番号109428-5G、純度99%
4-ヒドロキシアンチピリンの定量方法の検出感度を測定した。
これらを被検液として、下記HPLC分析条件で分析した。
(1)カラム Waters BEH-C18 2.1×150mm
(2)移動相 A:0.1%ギ酸、B:アセトニトリル
(3)グラジエント条件
0min(A98%、B2%)-(この間リニアグラジエント)-25min(A82%、B18%)-26min(A2%、B98%)-30min(A2%、B98%)
(4)流速 0.2mL/min
(5)カラム温度 40℃
(6)試料注入量 5μL
(7)検出波長 UV250nm
以上の結果より、S/Nを3とした場合、6mm×3=18mm、つまり4-ヒドロキシアンチピリン濃度として0.02μg/mlが検出感度と求められた。
また、4-ヒドロキシアンチピリン濃度が0.1μg/ml、0.05μg/mlのチャートでも同様の傾向を確認することができた。
下記のクレアチニン測定試薬の第2試薬に、4HAを試薬中終濃度で0.13~8.75μg/mlとなるように添加し各々の測定試薬を調製した。
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES-NaOH 50mM pH7.4
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡製ASO-311) 3U/mL
ザルコシンオキシダーゼ(東洋紡製SAO-351) 10U/mL
クレアチンアミジノヒドロラーゼ(東洋紡製CRH-229) 40U/mL
カタラーゼ(東洋紡製CAO-509) 130U/mL
N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン 0.14g/L
第二試薬
PIPES-NaOH 50mM pH7.4
クレアチニンアミドヒドロラーゼ(東洋紡製CNH-311) 400U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡製PEO-302) 10U/mL
4-アミノアンチピリン 0.6g/L
日立7180形自動分析機を用いた。試料2.7μLに第一試薬 120μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を40μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で546nmにおける吸光度(主波長)および800nmにおける吸光度(副波長)を測定した。主波長から副波長を引いた吸光度を算出して求めた。
4-ヒドロキシアンチピリンの反応液中濃度が高くなるにしたがって、試料測定感度が低下することを確認した。
反応液中の4-ヒドロキシアンチピリン濃度としては、1.5μg/ml以下であることが好ましく、0.9μg/ml以下であればより好ましく、0.6μg/ml以下であればさらに好ましく、0.3μg/ml以下であれば特に好ましい結果であった。
異なるロットの4-アミノアンチピリン原体を用いて、10種類のロット(S1~S10)のクレアチニン測定試薬キットを製造し、各ロット毎に、反応液中の4-ヒドロキシアンチピリン濃度(μg/ml)と試薬測定感度(mABS)を測定した。
反応液中の4-ヒドロキシアンチピリン濃度(μg/ml)の測定は実施例3と実質的に同じ条件で行い、4-ヒドロキシアンチピリンの定量前にAmicon Ultra 30Kフィルター(MILLIPORE社)を用いて除蛋白処理を行った。試薬測定感度(mABS)の測定は実施例4と同じ条件で行った。
Claims (5)
- 生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、4-アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定キットの製造方法であって、
前記反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が1.5μg/ml以下となるように調整されていることを確認する工程、
を包含する、生体成分測定キットの製造方法。 - 前記確認する工程において、反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.9μg/ml以下となるように調整されていることを確認する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記確認する工程において、反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.6μg/ml以下となるように調整されていることを確認する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記確認する工程において、反応液中の4-ヒドロキシアンチピリンの濃度が0.3μg/ml以下となるように調整されていることを確認する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかである、請求項1~4のいずれかに記載の製造方法。
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