JP7206631B2

JP7206631B2 - ４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法、並びに生体成分測定キットの製造方法及び生体成分測定キット

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Publication number: JP7206631B2
Application number: JP2018091296A
Authority: JP
Inventors: 研吾西村; 香代子梶谷; ますみ舩山
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2023-01-18
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: JP2019196993A

Description

本発明は、臨床診断において、生体成分を測定するための組成物および該組成物を用いて生体成分の分析を行う方法等に関する。さらに詳しくは、生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素がペルオキシダーゼの共存下４－アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量して測定するための組成物および該組成物を用いて生体成分の分析を行う方法に利用される定量方法などに関する。

従来、臨床診断においては、酵素法による生体成分の測定が行われており、特に酸化酵素－ペルオキシダーゼ－酸化還元発色試薬（以下、発色剤とも表記する。）系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下、発色剤と反応させて比色定量する方法が広く行われている。（非特許文献１）

該酸化還元発色試薬系としては、例えば水素供与体とカップラーを用いた方法があげられる。代表例としては、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法があげられる。本方法で用いるカップラーとしては例えば４－アミノアンチピリン（以下、４ＡＡとも表記する）が知られている。

また、従来から薬物の生体内での代謝物として血液中や尿中の４－アミノアンチピリンや４－ヒドロキシアンチピリンなどを逆相カラムを用いたＨＰＬＣ法で分析・定量する方法について報告されている。（非特許文献２及び３）

ＢＵＮＳＥＫＩＫＡＧＡＫＵＶｏｌ．４５，Ｎｏ．２，ｐｐ．１１１－１２４（１９９６）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹＶｏｌ．３７５，ｐｐ．９１－９９（１９８６）ＡＮＡＬＹＳＴ，ＪＡＮＵＡＲＹＶｏｌ．１０７，ｐｐ．６１－７０（１９８２）

本発明の目的は、生体成分測定に関して、事前に生体成分の測定感度を低下する夾雑物の存在や量を確認することにより、一つは生体成分測定キットを製造する際に測定感度が低下した生体成分測定キットの製造を防止し、二つは生体成分を測定する際に認識なく測定感度が低下することにより測定ミスや測定誤差を生じることを防止することにある。

また、近年、一部の生体成分において高感度の測定が求められており、三つとして生体成分の含有量が極微量であっても安定した測定結果が得られる測定キットや測定方法を提供することを目的とするものである。

本発明者は、４－アミノアンチピリンおよび水素供与体を用いた酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系の生体成分測定試薬を調製し、それを生体成分測定に用いるにあたり、原因不明の測定感度の低下を経験した。

測定感度の低下の程度は、測定のために調製した試薬のロットによりばらつきがあったため、本発明者は、測定キットの試薬組成について種々検討した。その結果、意外なことに、４－アミノアンチピリン中に極微量の４－ヒドロキシアンチピリン（以下、４ＨＡとも表記する。）という物質が存在することを見出した。４－ヒドロキシアンチピリンが試薬中に存在した場合、構造上４－ヒドロキシアンチピリンは水素供与体とカップリング反応しないが、過酸化水素存在下、４－ヒドロキシアンチピリンとペルオキシダーゼが反応し、過酸化水素が消費されると考えられるため、その結果、検体中の測定対象物質に酵素を反応させて発生した過酸化水素が４－ヒドロキシアンチピリンに消費されることとなり、本来の４－アミノアンチピリン－水素供与体の反応で発色する発色量が減り、感度が低下すると考えられた。そして、試薬中の４－ヒドロキシアンチピリン濃度を一定以下にすることで、設計された測定感度レベルから低下すること無く良好な生体成分の測定結果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。

（項１）
生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、４－アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定キットに用いられる４－アミノアンチピリン原体乃至は４－アミノアンチピリンを含有する試薬中の４－ヒドロキシアンチピリンを定量する方法であって、４－ヒドロキシアンチピリンの定量をＨＰＬＣ法により行い、その検出感度が０．１μｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法。

（項２）
前記ＨＰＬＣ法が多孔質シリカベースの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ法であることを特徴とする項１に記載の４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法。

（項３）
前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする項１又は２に記載の４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法。

（項４）
前記酸化還元発色試薬がトリンダー試薬であることを特徴とする項１乃至は３のいずれかに記載の４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法。

（項５）
生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、４－アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定キットの製造方法であって、以下の工程：
（１）前記生体成分測定キットの製造に用いられる４－アミノアンチピリン原体乃至は４－アミノアンチピリンを含有する試薬中に含まれる４－ヒドロキシアンチピリンを定量する工程
（２）前記反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が１．５μｇ／ｍｌ以下となるように、前記生体成分測定キットに含まれる４－アミノアンチピリンを含有する試薬中の４ヒドロキシアンチピリンの濃度を調整する工程
を包含することを特徴とする、生体成分測定キットの製造方法。

（項６）
前記４－ヒドロキシアンチピリンを定量する工程において、４－ヒドロキシアンチピリンの定量をＨＰＬＣ法により行うことを特徴とする項５に記載の生体成分測定キットの製造方法。

（項７）
前記ＨＰＬＣ法が多孔質シリカベースの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ法であることを特徴とする項６に記載の生体成分測定キットの製造方法。

（項８）
前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする項５乃至は７のいずれかに記載の生体成分測定キットの製造方法。

（項９）
前記酸化還元発色試薬がトリンダー試薬であることを特徴とする項５乃至８のいずれかに記載の生体成分測定キットの製造方法。

（項１０）
項５乃至９のいずれかに記載の生体成分測定キットの製造方法を用いて製造したことを特徴とする生体成分測定キット。

本発明により、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法での生体成分測定において、試薬製造ロットごとに感度が設計されたレベルから低下せずに生体成分測定試薬を得ることが可能となり、該試薬を用いて良好な測定が可能となった。
また、生体成分の含有量が極微量であるなど高感度を要する生体成分の測定においても安定した測定が可能となった。

４－アミノアンチピリンと４－ヒドロキシアンチピリンの化学構造式を示す図である。４－アミノアンチピリンを分析した場合のＨＰＬＣフラクションを示す図である。４－ヒドロキシアンチピリンのＨＰＬＣ法による定量方法の検出感度を示す図である。４－ヒドロキシアンチピリンのＨＰＬＣ法による定量方法の定量精度を示す図である。反応液中の４－ヒドロキシアンチピリン濃度と試料測定感度（ｍＡＢＳ）との関係と試料測定感度（ｍＡＢＳ））を示す図である。

（生体成分）
本発明の生体成分測定に用いられる生体成分としては、例えば、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）とアイソザイム、ＡＬＰ（アルカリ性フォスファターゼ）とアイソザイム、ＣＫ（クレアチンキナーゼ）とアイソザイム、アミラーゼ（Ａｍｙ）とアイソザイム、リパーゼ、γ－ＧＴＰ（γ-グルタミルトランスペプチダーゼ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、クロール（Ｃｌ）、カルシウム（Ｃａ）、リン（Ｐ）〔無機リン（ＩＰ）〕、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、総蛋白（ＴＰ）、血清蛋白分画（ＰＦ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、尿酸（ＵＡ）、ビリルビン（Ｂｉｌ）、アンモニア、コレステロール、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ、高密度リポタンパクコレステロールともいう）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、低密度リポタンパクコレステロールともいう）、中性脂肪（トリグリセリド）（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）、ＢＴＲ（ＢＴＲ、総分岐鎖アミノ酸/チロシン比）、チロシン測定試薬（ＴＹＲ）、血糖（ＢＳ、ＧＬＵ）、１,５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール（１，５－ＡＧ）、糖化アルブミン（ＧＡ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）などが挙げられる。
これらの生体成分の中でも、クレアチニン（ＣＲＥ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、高感度な測定を必要とするために特に好適に用いられる。

（検体）
本発明の生体成分測定に用いられる生体成分を含有する検体としては、例えば、血液（特に、血清や血漿など）、尿、腹水、髄液などの人の体液や、飲料、食品などの人が摂取するものなどが挙げられる。

（生体成分測定方法）
本発明の生体成分測定方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むものであれば特に限定されるものではない。
（１）生体成分に酸化酵素を作用させ、過酸化水素を発生させる工程、
（２）工程（１）で発生させた過酸化水素が、ペルオキシダーゼを共存させることによりペルオキシダーゼが作用することにより、４－アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより反応液を呈色させる工程、
（３）工程（２）で呈色した反応産物を比色定量する工程。

本発明の生体成分測定方法は、酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による方法であり、すなわち検体中の生体成分を酵素反応させることにより生体成分の量に応じた過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて生じた発色を比色定量することを測定原理とするものである。
この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されるものではない。

以下、本発明の生体成分測定方法について、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を例として、生体成分測定方法の具体的な態様を説明する。

尿酸（ＵＡ）を測定する場合は、尿酸（ＵＡ）を基質とするウリカーゼ（酸化酵素）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ－発色剤系により定量することができる。

クレアチニン（ＣＲＥ）を測定する場合は、クレアチニン（ＣＲＥ）を基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを予め試薬に添加したクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンを予め試薬に添加したサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ－発色剤系によるクレアチニン（ＣＲＥ）濃度の定量が可能になる

トリグリセライド（ＴＧ）を測定する場合は、トリグリセライド（ＴＧ）を基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ－発色剤系によるトリグリセライド（ＴＧ）濃度の定量が可能になる。

糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を測定する場合は、糖化ヘモグロビンを基質とする糖化ヘモグロビンオキシダーゼ（例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ－発色剤系において定量することができる。

このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、過酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。

（生体成分測定キット）
本発明の生体成分測定キットは、以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たすものであれば特に限定されるものではない。
（ａ）生体成分に作用させることにより過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含有する。
（ｂ）ペルオキシダーゼを含有する。
（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含有する。
（ｄ）酸化還元発色試薬のカップラーとして４－アミノアンチピリンを含有する。

本発明の生体成分測定キットを用いて生体成分を測定する場合、汎用の自動分析機（例えば、日立７１８０形自動分析機）を用いることができる。本発明の生体成分測定キットは、このような自動分析機に適用できるよう構成されたものであってもよい。その態様は特に限定されず、例えば、液状試薬で構成されたキット、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥試薬と溶解液の組み合わせで構成されたキット、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステムなどと呼ばれるキットやセンサを用いる形態のキットなど種々の形態が例示できる。

本発明の生体成分測定キットの構成としては、試薬が１つで構成されたキット、また試薬が分包されて２乃至３以上で構成されたキットなどが挙げられる。

以下、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する）で構成されたキットを例に説明する。

この形態の試薬を用いて自動分析機で分析する方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第二試薬またはＲ２とも記載する）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することができる。

本発明の生体成分測定試薬には、緩衝液成分を含有させることが好ましい。また、本発明の生体成分測定試薬において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。

本発明の生体成分測定試薬に含有させることができる緩衝液成分としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。

ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。

本発明の生体成分測定試薬において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などの使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。

防腐剤としては、プロクリン１５０、プロクリン２００、プロクリン３００、プロクリン９５０、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。

キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。

抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。

抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。

塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。

酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。

色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。

（酸化酵素）
本発明の生体成分測定方法に用いられる酸化酵素は、基質から過酸化水素を発生させることができるものであれば、目的となる測定対象に応じて制限なく用いることができる。具体例としては、上述のとおり、ウリカーゼ、サルコシンオキシダーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼなどを用いることができる。市販品としては、ＵＡＯ－２１１（東洋紡製）、ＳＡＯ－３５１（東洋紡製）、Ｇ３Ｏ－３１１（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。

（ペルオキシダーゼ）
本発明の生体成分測定方法に用いられるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ－１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。

ペルオキシダーゼ活性は、以下の方法で定義する。
蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。
２０秒間反応を行った後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。
抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤ_ｔｅｓｔ）。
一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。
この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤ_{ｂｌａｎｋ}）。
ΔＯＤ_ｔｅｓｔ及びΔＯＤ_{ｂｌａｎｋ}の吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。
上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝｛ΔＯＤ（ＯＤ_ｔｅｓｔ－ＯＤ_{ｂｌａｎｋ}）×希釈倍率}／｛０．１１７×１（ｍＬ））
＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）＝ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）×１／Ｃ
０．１１７：１ｍｇ％プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：溶解時の酵素濃度（ｃｍｇ／ｍＬ）
（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）

なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０～６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。

（酸化還元発色試薬）
本発明の生体成分測定方法に用いられる酸化還元発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーの組合せが挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。

水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。

（水素供与体）
水素供与体は、水素を供与できる性質を有するものであれば、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。本発明の生体成分測定法においては、トリンダー法などに用いる水素供与体として、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体などが用いられる。このような水素供与体は、酸化発色試薬等とも呼ばれている。

たとえば、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－２，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。

（カップラー）
これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。

本発明の生体成分測定に用いられるカップラーとしては、４－アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体等のアミノアンチピリン系化合物；バニリンジアミンスルホン酸等のバニリンジアミンスルホン酸系化合物；メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等のメチルベンズチアゾリノンヒドラゾン系化合物などが用いられる。アミノアンチピリン系化合物は夾雑物として４－ヒドロキシアンチピリンを含み得ることが想定される。

（４－ヒドロキシアンチピリン）
４－ヒドロキシアンチピリンは、４－アミノアンチピリンの４位のアミノ基が水酸基に変換された構造であり、４－アミノアンチピリンの製造工程で生成混入した副産物と考えられる。

４－アミノアンチピリンと４－ヒドロキシアンチピリンの化学構造式を図１に示す。

しかし、混入量が極僅かであっても、本発明の生体成分測定法での発色反応において、４－ヒドロキシアンチピリンは過酸化水素を消費し、呈色反応に多大な影響を及ぼすことを本発明者は見出した。

（４－ヒドロキシアンチピリンの定量に用いる試料調製）
本発明の４－ヒドロキシアンチピリンの定量に用いる試料としては、生体成分測定キットに用いられる４－アミノアンチピン原体乃至は４－アミノアンチピリンを含有する試薬が挙げられる。本明細書において試薬とは、二種以上の試薬を混ぜた試薬組成物の状態を含む。
本発明で用いられる４－アミノアンチピリン原体とは、本発明の生体成分測定キットを構成する試薬の中で４－アミノアンチピリンを含有する試薬を製造する際に用いる４－アミノアンチピリンの原液・原末をいう。

本発明で用いられる生体成分測定キットとしては、前述した通り、液状試薬で構成されたキット、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥試薬と溶解液の組み合わせで構成されたキット、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステムなどと呼ばれるキットやセンサを用いる形態のキットなど種々の形態が例示されるが、本発明で用いられる４－アミノアンチピン原体乃至は４－アミノアンチピリンを含有する試薬は、キットの処方通りに生体成分測定を行う際に通常用いられる状態に処方した溶液状態とし、さらに水溶液との親和性がよく且つ４－ヒドロキシアンチピリンの溶解性に優れた溶媒により希釈して４－ヒドロキシアンチピリンの定量に供する。
希釈倍率は、調製した測定試料の安定性やＨＰＬＣの測定感度に影響を与えないよう４／３～５倍程度が好ましく、より好ましくは２倍程度とする。

本発明で用いられる４－アミノアンチピリンの定量に用いる試料調製用の希釈溶媒としては特に限定はなく、低分子量のアルコールやＨＰＬＣ法で用いられる移動相溶媒などが用いられるが、特にメタノールやエタノールは水溶液との親和性や４－ヒドロキシアンチピリンの溶解性がよく好適に用いられる。

４－ヒドロキシアンチピリンを定量する際は、測定に先立ち適宜、除蛋白操作をしてもよい。除蛋白操作の方法は限定されないが、例えば限外ろ過にて除蛋白する方法が挙げられる。具体的には、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３０Ｋフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて、遠心加速度２９００ｇで２０分程度遠心し、限外ろ過することで除蛋白することが可能である。

（４－ヒドロキシアンチピリン検出感度）
本発明の４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法における４－ヒドロキシアンチピリンの検出感度は０．１μｇ／ｍｌ以下が好ましく、より好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは０．０３μｇ／ｍｌ以下である。

後述する通り、本発明の生体成分測定における反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの許容濃度については、１．５μｇ／ｍｌ以下が好ましく、より好ましくは０．９μｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは０．６μｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以下であり、ＨＰＬＣ法による定量時に数倍程度に希釈することを勘案すれば、４－ヒドロキシアンチピリンの検出や定量を行うためには、４－ヒドロキシアンチピリンの検出感度は０．１μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、より高感度な生体成分測定が求められる場合には、０．０５μｇ／ｍｌ以下であればより好ましく、０．０３μｇ／ｍｌ以下であればさらに好ましい。

（４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法）
本発明の４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法としては、高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法ともいう）が好適に用いられる。

高速液体クロマトグラフィーを用いる場合、その分離の物理化学的原理は特に限定されない。例えば、分配（順相・逆相）、吸着、分子排斥、イオン交換などの諸原理が挙げられる。

高速液体クロマトグフィーを用いる場合、一般的な逆相カラムクロマトグラフィーが好適に用いられる。逆相カラムクロマトグラフィーの担体は特に限定されないが、例えばシリカゲルやポリマー系などの担体が好適に用いられ、中でも多孔質シリカゲルがより好適に用いられる。シリカゲルを担体として使用する場合はエンドキャップ処理の有無は特に制限はない。

高速液体クロマトグラフィーの装置は、低圧、中圧、高圧のいずれのシステムであっても条件を目的に合わせて適正に調整することにより使用することができる。

高速液体クロマトグラフィー担体に結合するリガンドの種類も特に限定されない。リガンドは汎用されているオクタデシル基（ＯＤＳ）の他、フェニル基、オクチル基も条件を適正化することで選択することが出来る。リガンドの結合は、モノメリックでもポリメリックでも良い。いずれの充填剤であっても分離条件を適正化することで使用可能である。

高速液体クロマトグラフィーの移動相は水と、メタノールまたはアセトニトリルのような水溶性の溶剤を使用すれば良く、シリカゲルのシラノール基とのイオン的相互作用を回避するため常法に従い移動相のｐＨを酸性側に調整してもよく、また、イオンペア試薬を微量添加してもよい。

移動相の流速は、使用するシステムの能力によって最適化すればよい。また、リニアグラジエントではなく、ステップワイズで溶出させ分離しても良い。

（４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度）
本発明の生体成分測定における４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度は、１．５μｇ／ｍｌ以下が好ましく、より好ましくは０．９μｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは０．６μｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以下である。

以下、測定対象の生体成分の一例をクレアチニンとして、４－ヒドロキシアンチピリンの生体成分測定の感度低下に及ぼす影響と４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度について説明する。

近年、ｅＧＦＲの算出には小数点下二桁までのクレアチニンの測定精度が求められており、最少検出感度としてはクレアチニン濃度で０．０３ｍｇ／ｄＬ程度が要求されている。

一方、実施例５などの事例で、クレアチニン試薬のブランクの変動はσ＝０．０４５～０．１１４ｍＡＢＳ程度であり、一般的に体外診断薬の最小検出感度とされる２．６σ（９９．５％正規分布）は０．１１７～０．２９６ｍＡＢＳ程度と算出される。
従って、２．６σの最大値の０．２９６ｍＡＢＳ、つまり約０．３ｍＡＢＳ以上の吸光度があればシグナルとして検出可能であり、クレアチニンの存否判断やクレアチニンの定量が可能になると考えられる。

つまり、クレアチニン濃度が０．０３ｍｇ／ｄＬの時の最少検出感度として約０．３ｍＡＢＳが必要とされることになり、これはクレアチニン濃度が５ｍｇ／ｄＬの時に置き換えると検出感度は約５０ｍＡＢＳに相当する。

実施例４では、５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン水溶液を用いて、各種濃度の４－ヒドロキシアンチピリンを添加した測定試薬を調整し、クレアチニンの測定感度を測定し、結果を図５に示した。

図５より、検出感度が５０ｍＡＢＳの時の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度は約１．５μｇ／ｍｌと読み取れる。

以上より、本発明の生体成分測定における４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度は、１．５μｇ／ｍｌ以下が好ましいことが分かる。
なお、より高感度な測定を必要とする場合など、本発明の生体成分測定における４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中の許容濃度は、より好ましくは０．９μｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは０．６μｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以下とした。

本発明の生体成分測定キットの製造方法において、４－アミノアンチピリン原体乃至は試薬中に含まれる４－ヒドロキシアンチピリンを定量する工程で用いられる４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法は前述した通りである。

本発明の生体成分測定キットの製造方法において、反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が１．５μｇ／ｍｌ以下となるように、前記生体成分測定キットに含まれる４－アミノアンチピリンを含有する試薬中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を調整するのが好ましい。

本発明の生体成分測定キットの製造方法において、４－アミノアンチピリンを含有する試薬中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を調整する方法としては、高い濃度の４－ヒドロキシアンチピリンを含有する４－アミノアンチピリン原体の使用を回避することや、低い濃度の４－ヒドロキシアンチピリンを含有する４－アミノアンチピリン原体と混合することにより反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を許容濃度以下となるように調整する方法などが挙げられる。

また、４－ヒドロキシアンチピリンが微温下（３０～４０℃）にある水溶液中で分解されやすい性質をもっていることを勘案し測定キットを製造する際に４－アミノアンチピリンを含有する試薬やそれらの中間体を水溶液の状態で微温下に置き一定期間経過させ経時的に４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を減少させる方法や、４－ヒドロキシアンチピリンを酸化処理することや、４－ヒドロキシアンチピリンを分解可能な組成物を添加することにより、４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を調整する方法などが挙げられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）４－アミノアンチピリン原体の不純物の確認
生体成分測定時の試薬感度（反応液の発色強度：ｍＡＢＳ）の低下の度合いは４－アミノアンチピリン原体のロット差に起因することを見出したため、４－アミノアンチピリン原体中に極微量に含まれる不純物の含有量がロットごとに異なると推測し、ＨＰＬＣ法により４－アミノアンチピリン原体中の不純物の検出を行った。

各ロットの４－アミノアンチピリン原体をメタノールで希釈し、４－アミノアンチピリン濃度が０．６ｇ／Ｌとなるように調整した。
これらを被検液として、下記ＨＰＬＣ条件で前記４－ヒドロキシアンチピリンの不純物の検出を行った。

（ＨＰＬＣ分析条件）
（１）カラムＩｍｔａｋｔＣａｄｅｎｚａＣＤ－Ｃ１８２．０×１５０ｍｍ
（２）移動相Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：メタノール
（３）グラジエント条件
０ｍｉｎ（Ａ９５％、Ｂ５％）－（この間リニアグラジエント）－１５ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）－２５ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）
（４）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ
（５）カラム温度４０℃
（６）試料注入量５μＬ
（７）検出波長ＵＶ２５０ｎｍ

ロット差の検討に使用した４－アミノアンチピリン原体中の４－アミノアンチピリンの純度はＪＩＳ－Ｋ８０４８にて９８．０％以上のものを使用した。

４－アミノアンチピリン原体の一つのロットを分析した場合のＨＰＬＣフラクションを図２に示す。グラフの横軸の溶出時間７～８分のピークが４－アミノアンチピリンのピークである。４－アミノアンチピリンのピーク以外に３種類の不純物を確認した。

（実施例２）４－アミノアンチピリン原体中の４－ヒドロキシアンチピリンの同定
実施例１の図２で見られた３種類の不純物（ａ、ｂ、ｃ）について各ロットの含有量を検討したところ、不純物ｂのみがロットごとに含有量が大きく異なることが分かった。
そこで、これら３種類の不純物について質量分析法（ＭＳスペクトル法）にて分子量および構造を解析した。

その結果、不純物ｂは４－ヒドロキシアンチピリンと同定された。

４－ヒドロキシアンチピリンの標準品として４－ヒドロキシアンチピリン（シグマ社）を用いた。実施例１と同条件でＨＰＬＣを実施したところ、４－ヒドロキシアンチピリン（シグマ社）と不純物ｂのフラクションピークの溶出時間の値は一致した。

（４－ヒドロキシアンチピリン標準品）
４－ヒドロキシアンチピリン（４－Ｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）シグマ社
Ｃａｓ．ＮＯ．１６７２－６３－５、
製品番号１０９４２８－５Ｇ、純度９９％

（実施例３）４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法の検出感度と定量精度
４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法の検出感度を測定した。

４－ヒドロキシアンチピリン（シグマ社）をメタノールで希釈し、４－ヒドロキシアンチピリン濃度が０．１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌとなるように調整した。
これらを被検液として、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析した。

（ＨＰＬＣ分析条件）
（１）カラムＷａｔｅｒｓＢＥＨ－Ｃ１８２．１×１５０ｍｍ
（２）移動相Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル
（３）グラジエント条件
０ｍｉｎ（Ａ９８％、Ｂ２％）－（この間リニアグラジエント）－２５ｍｉｎ（Ａ８２％、Ｂ１８％）－２６ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）－３０ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）
（４）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ
（５）カラム温度４０℃
（６）試料注入量５μＬ
（７）検出波長ＵＶ２５０ｎｍ

４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が０．０２μｇ／ｍｌのチャートを図３に示す。

４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が０．０２μｇ／ｍｌのピーク高さは１８ｍｍ、ピーク以外の信号の最大値と最小値の振れ幅は１２ｍｍと測定され、ピーク半値幅法（ピーク前後のベースラインのうち、ピーク半値幅の１０倍～２０倍の時間幅においてピーク以外の信号の最大値と最小値の振れ幅を求め、その１／２をノイズとする、ダイオネクステクニカルリビューＴＲ０１５ＹＳ－００８３日本ダイオネクス株式会社）により、ノイズ高さは６ｍｍと測定された。
以上の結果より、Ｓ／Ｎを３とした場合、６ｍｍ×３＝１８ｍｍ、つまり４－ヒドロキシアンチピリン濃度として０．０２μｇ／ｍｌが検出感度と求められた。
また、４－ヒドロキシアンチピリン濃度が０．１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌのチャートでも同様の傾向を確認することができた。

各濃度の４－ヒドロキシアンチピリンの希釈液を測定試料として、フラクションピークの面積を測定し、４－ヒドロキシアンチピリンの濃度とフラクションピークの面積との相関関係を評価した。

結果を図４に示す。図４に示されるように高い相関性の傾向が確認された。

（実施例４）４－ヒドロキシアンチピリン濃度（反応液中濃度）とクレアチニン測定感度の関係
下記のクレアチニン測定試薬の第２試薬に、４ＨＡを試薬中終濃度で０．１３～８．７５μｇ／ｍｌとなるように添加し各々の測定試薬を調製した。

比較対照として、市販の４－アミノアンチピリン原体を精製し、４－ヒドロキシアンチピリンを含まない４－アミノアンチピリンを製造し、用いた。

試料として、５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液を用いた。

［試薬の調製］
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ５０ｍＭｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製ＳＡＯ－３５１）１０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製ＣＲＨ－２２９）４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡製ＣＡＯ－５０９）１３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ５０ｍＭｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製ＣＮＨ－３１１）４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ－３０２）１０Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン０．６ｇ／Ｌ

［測定法］
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬１２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度（主波長）および８００ｎｍにおける吸光度（副波長）を測定した。主波長から副波長を引いた吸光度を算出して求めた。

なお、本測定条件での反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度は、０．０３～２．１４μｇ／ｍｌとなる。

結果を表１および図５に示す。
４－ヒドロキシアンチピリンの反応液中濃度が高くなるにしたがって、試料測定感度が低下することを確認した。
反応液中の４－ヒドロキシアンチピリン濃度としては、１．５μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、０．９μｇ／ｍｌ以下であればより好ましく、０．６μｇ／ｍｌ以下であればさらに好ましく、０．３μｇ／ｍｌ以下であれば特に好ましい結果であった。

（実施例５）ロット間差
異なるロットの４－アミノアンチピリン原体を用いて、１０種類のロット（Ｓ１～Ｓ１０）のクレアチニン測定試薬キットを製造し、各ロット毎に、反応液中の４－ヒドロキシアンチピリン濃度（μｇ／ｍｌ）と試薬測定感度（ｍＡＢＳ）を測定した。
反応液中の４－ヒドロキシアンチピリン濃度（μｇ／ｍｌ）の測定は実施例３と実質的に同じ条件で行い、４－ヒドロキシアンチピリンの定量前にＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３０Ｋフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて除蛋白処理を行った。試薬測定感度（ｍＡＢＳ）の測定は実施例４と同じ条件で行った。

対照品として、市販の４－アミノアンチピリンを精製した４－ヒドロキシアンチピリンを含有しない４－アミノアンチピリンを用いてクレアチニン測定試薬キットを製造し、上記と同様に測定した。

結果を表２に示す。

本発明は、臨床診断における生体成分の測定方法、並びに、該測定方法に用いる測定キットやキットを構成する試薬や組成物に適用できる。

Claims

生体成分に酸化酵素を作用させ生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼの共存下、４－アミノアンチピリンと水素供与体を酸化縮合することにより生じた反応液の呈色を比色定量する生体成分測定キットの製造方法であって、以下の工程：
（１）前記生体成分測定キットの製造に用いられる４－アミノアンチピリン原体乃至は４－アミノアンチピリンを含有する試薬中に含まれる４－ヒドロキシアンチピリンをＨＰＬＣ法により定量する工程であって、前記ＨＰＬＣ法の検出感度が０．１μｇ／ｍｌ以下である、工程
（２）前記反応液中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が１．５μｇ／ｍｌ以下となるように、前記生体成分測定キットに含まれる４－アミノアンチピリンを含有する試薬中の４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を調整する工程
を包含することを特徴とする、生体成分測定キットの製造方法。
前記ＨＰＬＣ法が多孔質シリカベースの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ法であることを特徴とする請求項１に記載の生体成分測定キットの製造方法。
前記生体成分がクレアチニン又は糖化ヘモグロビンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体成分測定キットの製造方法。