JP6569193B2 - 生体成分の測定方法および測定用組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、臨床診断において、生体成分を酸化還元反応を利用して測定する測定方法およびそれに用いる測定用組成物に関し、さらに詳しくは、生体成分中に共存する妨害物質の影響を回避することのできる上記方法および組成物に関する。
従来、臨床診断においては、酵素法による生体成分の測定が行われており、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬（以下、発色剤とも表記する。）系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下発色剤と反応させて比色定量する方法が広く行われている。この方法では、血清中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて種々の対策が検討され、克服されてきた。
一方、妨害物質としてこれまでエタンシラートが見出されている（非特許文献１）。エタンシラートは止血剤として用いられる医薬品で、毛細血管抵抗性の減弱及び透過性の亢進によると考えられる出血傾向、例えば紫斑病などの患者に経口投与されるため、血清などの体液に混入して測定値に影響を与える可能性がある。非特許文献１によれば、エタンシラートがペルオキシダーゼに対し水素供与体として作用し、測定対象の濃度に応じて生成した過酸化水素を発色色素よりも先に消費してしまうため、真の値に対し負の影響を与えることとなる。
臨床病理 第４０巻 第８号 ８６３−８６７ページ（１９９２）
本発明の目的は、エタンシラートの影響を回避するために、より簡便、安全かつ効果的な方法を創出することである。
本発明者らは、反応系への４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル（以下、ＡＡＱ−２とも記載する。）の添加によりエタンシラートの影響を回避できることを見出した。さらに、ＡＡＱ−２を測定用組成物に予め添加することにより、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を受けない測定が出来ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
酸化還元反応を利用して生体成分を測定する過程において、以下の（１）〜（３）の成分を共存させることを特徴とする、エタンシラートの影響を低減させる方法。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
［項２］
以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
酸化還元反応を利用して生体成分を測定する過程において、以下の（１）〜（３）の成分を共存させることを特徴とする、エタンシラートの影響を低減させる方法。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
［項２］
以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
本発明により、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による酵素法での生体成分測定において、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を受けない測定が可能となった。
（生体成分測定方法）
本発明が適用される生体成分測定方法は、酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する方法である。
この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。
例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）などの生体成分等を測定するための方法が例示できる。
本発明が適用される生体成分測定方法は、酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する方法である。
この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。
例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）などの生体成分等を測定するための方法が例示できる。
例えば、ＵＡを測定する場合は、ＵＡを基質とするウリカーゼ（酸化酵素）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することができる。
他方、ＣＲＥを測定する場合は、ＣＲＥを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを予め試薬に添加したクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンを予め試薬に添加したサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＣＲＥ濃度の定量が可能になる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＴＧ濃度の定量が可能になる。
このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、過酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。
他方、ＣＲＥを測定する場合は、ＣＲＥを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを予め試薬に添加したクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンを予め試薬に添加したサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＣＲＥ濃度の定量が可能になる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＴＧ濃度の定量が可能になる。
このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、過酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。
上記の方法を実施するための手段としては、汎用の自動分析機（例えば、日立７１７０形自動分析機）に適用できるよう構成された液状試薬（またはキット）を用いる方法、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）を用いる方法、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサを用いる方法など種々の形態が例示できる。
好ましくは、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
好ましくは、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
本発明は、酸化還元反応を利用した生体成分測定方法において、エタンシラートの影響を低減させる方法である。本発明の方法は、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定する場合に、試料の前処理を行わずにエタンシラートの影響を低減させることを可能にする。エタンシラートが含まれている可能性がある試料としては、例えば、エタンシラート投与患者の体液（たとえば、血清・血しょうなど血液に由来する試料）があるが、それに限定されない。
（生体成分測定試薬）
本発明のエタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬は、以下の（１）〜（３）の成分を含むものであれば特に限定されるものではない。上記のとおり種々の形態をとることができ、その試薬組成などの構成は当業者であれば本明細書の説明に基づいて適宜設定することができる。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
本発明のエタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬は、以下の（１）〜（３）の成分を含むものであれば特に限定されるものではない。上記のとおり種々の形態をとることができ、その試薬組成などの構成は当業者であれば本明細書の説明に基づいて適宜設定することができる。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
（ペルオキシダーゼ）
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。
ペルオキシダーゼ活性は、以下の方法で定義する。
蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。２０秒間反応を行った後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
Ｕ／ｍＬ
＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率}／｛０．１１７×１（ｍＬ））
＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
Ｕ／ｍｇ＝｛Ｕ／ｍＬ｝×１／Ｃ
０．１１７ ： １ｍｇ％ プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 溶解時の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍＬ）
（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）
なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０〜６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。
蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。２０秒間反応を行った後、２Ｎ硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
Ｕ／ｍＬ
＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率}／｛０．１１７×１（ｍＬ））
＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率
Ｕ／ｍｇ＝｛Ｕ／ｍＬ｝×１／Ｃ
０．１１７ ： １ｍｇ％ プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ ： 溶解時の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍＬ）
（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）
なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０〜６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。
（酸化還元発色試薬）
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。
トリンダー法などに用いる水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が知られている。
たとえば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。
また、カップラーとしては４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が知られている。
トリンダー法などに用いる水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が知られている。
たとえば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。
また、カップラーとしては４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が知られている。
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
（ＡＡＱ−２）
本発明に用いるＡＡＱ−２は同仁化学社より入手可能である。
本発明に用いるＡＡＱ−２は同仁化学社より入手可能である。
ＡＡＱ−２の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい下限は３．０ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。
２試薬系の場合、ＡＡＱ−２は第一試薬に添加することが好ましい。
本発明には、緩衝液成分を含有させることが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。
ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。
本発明において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
（酵素の安定化方法）
また、当初は予測できなかったことであるが、後述の実施例に記載したとおり、本発明の生体成分測定方法に用いるＡＡＱ−２には、酵素の安定化効果があることがわかった。すなわち、本発明は、酵素の安定化方法としての一局面も有している。
また、当初は予測できなかったことであるが、後述の実施例に記載したとおり、本発明の生体成分測定方法に用いるＡＡＱ−２には、酵素の安定化効果があることがわかった。すなわち、本発明は、酵素の安定化方法としての一局面も有している。
ここで、安定化対象となる酵素は特に限定されない。たとえば上述の生体成分測定方法の説明において示した、ＵＡ、ＣＲＥ、ＴＧ、ＣＨＯなどの測定に用いられる各酵素、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
ところで、これらの方法では、血清などの試料中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて、いわゆる消去系など種々の対策が検討され、克服されてきた。例えば、アスコルビン酸に対しては、試料にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させることにより消去できる。また、ビリルビンに対しては、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させることにより消去できる。このような方法を採用した試薬には、アスコルビン酸オキシダーゼおよび／またはビリルビンオキシダーゼが含まれる。これらの酵素もまた、安定化の対象となりうる。
さらに、数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が試料に含まれることにより正誤差を発生するので、これらについても消去系が検討されている。代表的な方法は、測定対象物質に直接作用する酵素以外の酵素を試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去した後、測定対象物質に直接作用する酵素を反応系に追加して過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させると同時に、カタラーゼの作用を事実上停止させて比色定量する方法である。たとえばＣＲＥ測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素（クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ）を試料に作用させて、反応中間体（クレアチンなど）に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるＣＲＥに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する（このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。）。このような方法を採用した試薬には、カタラーゼが含まれる。この酵素もまた、安定化の対象となりうる。
さらに、数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が試料に含まれることにより正誤差を発生するので、これらについても消去系が検討されている。代表的な方法は、測定対象物質に直接作用する酵素以外の酵素を試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去した後、測定対象物質に直接作用する酵素を反応系に追加して過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させると同時に、カタラーゼの作用を事実上停止させて比色定量する方法である。たとえばＣＲＥ測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素（クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ）を試料に作用させて、反応中間体（クレアチンなど）に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるＣＲＥに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する（このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。）。このような方法を採用した試薬には、カタラーゼが含まれる。この酵素もまた、安定化の対象となりうる。
具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、カタラーゼが例示できる。中でもアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼが好ましい。
酵素の安定化方法におけるＡＡＱ−２の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい下限は２．０ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい上限は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。
酵素の安定化方法においては、２試薬系の場合、ＡＡＱ−２はどちらの試薬に添加してもかまわない。エタンシラートの影響回避効果を得たいのであれば、第一試薬に添加することが好ましい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
（実施例１）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２９） ４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ／Ｌ
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２９） ４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
結果を表１に示す。比較例およびＡＡＱ−２の添加量が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下または１００ｍｍｏｌ／Ｌの場合と比較し、添加量が０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの場合はエタンシラートの影響を回避できる結果であった。添加量が３．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの場合は、さらに好ましい結果が得られた。
（実施例２）
実施例１に記載のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製して測定試薬とした。
測定試薬とし、調製直後、３５℃・７日間保存後および３５℃・１４日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。
試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。
また、実施例１と同様に試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
実施例１に記載のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製して測定試薬とした。
測定試薬とし、調製直後、３５℃・７日間保存後および３５℃・１４日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。
試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。
また、実施例１と同様に試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
結果を表２に示す。ＡＡＱ−２を添加した場合、エタンシラートの影響については、３５℃、７日間および１４日間保存後も影響を回避できる結果であった。
実施例のブランク値および感度は、３５℃、７日間および１４日間保存後も良好であった。
実施例のブランク値および感度は、３５℃、７日間および１４日間保存後も良好であった。
（実施例３）
実施例２に用いた各試薬について、第一試薬中の各酵素の安定性について確認した。各酵素は下記測定法にて測定した。
調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・７日間、１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
実施例２に用いた各試薬について、第一試薬中の各酵素の安定性について確認した。各酵素は下記測定法にて測定した。
調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・７日間、１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
結果を表３に示す。ＡＡＱ−２を添加した実施例の方が、無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＡＡＱ−２添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。
（酵素活性測定法）
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）
下記条件下で1分間に1マイクロモルのアスコルビン酸を酸化する酵素量を1単位(Ｕ)とする。
試薬
（Ａ）１．０ｍＭアスコルビン酸溶液〔１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液を１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４溶液で１０倍希釈する〕（用時調製）
１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液は１７６ｍｇのＬ−アスコルビン酸（試薬特級，ＭＷ＝１７６．１３）を精秤し１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．０ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍＬに溶解して調製する。
（Ｂ）１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液
（Ｃ）０．２Ｎ ＨＣｌ溶液
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した蒸留水で溶解（６０Ｕ／ｍＬ以上）し、分析直前に０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（氷冷）で０．１５〜０．２５Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に下記反応混液を調製し、３０℃で約５分間予備加温する。
０．５ｍＬ 基質溶液（Ａ）
０．５ｍＬ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（Ｂ）
（反応混液のｐＨは５．６）
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３０℃で正確に５分間反応させた後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき２４５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は反応混液（１）を３０℃で５分間放置後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて混和し，次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｂｌａｎｋ−ＯＤｔｅｓｔ）×４．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（１０．０×１．０×５（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．８２×希釈倍率
１０．０：アスコルビン酸の上記測定条件下（ｐＨ１．０）でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）
下記条件下で1分間に1マイクロモルのアスコルビン酸を酸化する酵素量を1単位(Ｕ)とする。
試薬
（Ａ）１．０ｍＭアスコルビン酸溶液〔１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液を１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４溶液で１０倍希釈する〕（用時調製）
１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液は１７６ｍｇのＬ−アスコルビン酸（試薬特級，ＭＷ＝１７６．１３）を精秤し１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．０ｍＭ ＨＣｌ溶液１００ｍＬに溶解して調製する。
（Ｂ）１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液
（Ｃ）０．２Ｎ ＨＣｌ溶液
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した蒸留水で溶解（６０Ｕ／ｍＬ以上）し、分析直前に０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（氷冷）で０．１５〜０．２５Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に下記反応混液を調製し、３０℃で約５分間予備加温する。
０．５ｍＬ 基質溶液（Ａ）
０．５ｍＬ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（Ｂ）
（反応混液のｐＨは５．６）
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３０℃で正確に５分間反応させた後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき２４５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は反応混液（１）を３０℃で５分間放置後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて混和し，次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｂｌａｎｋ−ＯＤｔｅｓｔ）×４．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（１０．０×１．０×５（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．８２×希釈倍率
１０．０：アスコルビン酸の上記測定条件下（ｐＨ１．０）でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
ザルコシンオキシダーゼ（ＳＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．２Ｍサルコシン溶液〔１．７８ｇのサルコシン（ＭＷ＝８９．０９）を８０ｍＬの０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１．０ＮのＮａＯＨあるいはＨＣｌでｐＨを８．０に調整（２５℃）し，蒸留水で１００ｍＬとする〕
（Ｂ）０．１％４−ＡＡ水溶液（１００ｍｇの４−アミノアンチピリンを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｃ）０．１％フェノール水溶液（１００ｍｇのフェノールを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｄ）ペルオキシダーゼ水溶液〔２５ｍｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（１１０プルプロガリン単位／ｍｇ）を蒸留水１００ｍＬに溶解する〕
（Ｅ）０．２５％ＳＤＳ水溶液〔１．２５ｇのｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を５００ｍＬの蒸留水に溶解する〕
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し、分析直前に同緩衝液で０．０７−０．１７Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）下記反応混液を調製する（褐色瓶にて氷冷保存）。
５０ｍＬ サルコシン溶液（Ａ）
１０ｍＬ ４−ＡＡ水溶液（Ｂ）
２０ｍＬ フェノール水溶液（Ｃ）
２０ｍＬ ペルオキシダーゼ水溶液（Ｄ）
（２）反応混液１．０ｍＬを試験管に採り，３７℃で約５分間予備加温する。
（３）被検酵素溶液０．０５ｍＬを加え，反応を開始する。
（４）３７℃で正確に１０分間反応させた後，ＳＤＳ水溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき５００ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用い、上記同様に操作を行って吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍＬ）×希釈倍率）／（１３．３×（１／２）×１．０×１０（分）×０．０５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．９１７×希釈倍率
１３．３：Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子である事による係数
１．０：光路長（ｃｍ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．２Ｍサルコシン溶液〔１．７８ｇのサルコシン（ＭＷ＝８９．０９）を８０ｍＬの０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１．０ＮのＮａＯＨあるいはＨＣｌでｐＨを８．０に調整（２５℃）し，蒸留水で１００ｍＬとする〕
（Ｂ）０．１％４−ＡＡ水溶液（１００ｍｇの４−アミノアンチピリンを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｃ）０．１％フェノール水溶液（１００ｍｇのフェノールを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｄ）ペルオキシダーゼ水溶液〔２５ｍｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（１１０プルプロガリン単位／ｍｇ）を蒸留水１００ｍＬに溶解する〕
（Ｅ）０．２５％ＳＤＳ水溶液〔１．２５ｇのｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を５００ｍＬの蒸留水に溶解する〕
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し、分析直前に同緩衝液で０．０７−０．１７Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）下記反応混液を調製する（褐色瓶にて氷冷保存）。
５０ｍＬ サルコシン溶液（Ａ）
１０ｍＬ ４−ＡＡ水溶液（Ｂ）
２０ｍＬ フェノール水溶液（Ｃ）
２０ｍＬ ペルオキシダーゼ水溶液（Ｄ）
（２）反応混液１．０ｍＬを試験管に採り，３７℃で約５分間予備加温する。
（３）被検酵素溶液０．０５ｍＬを加え，反応を開始する。
（４）３７℃で正確に１０分間反応させた後，ＳＤＳ水溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき５００ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（２．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用い、上記同様に操作を行って吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍＬ）×希釈倍率）／（１３．３×（１／２）×１．０×１０（分）×０．０５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．９１７×希釈倍率
１３．３：Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子である事による係数
１．０：光路長（ｃｍ）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＣＲＨ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．１Ｍクレアチン溶液〔１．４９ｇのクレアチン（ナカライテスク製）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、１００ｍＬとする〕
（Ｂ）ＤＡＢ溶液（２．０ｇのｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１００Ｐのジメチルスルホキシドに溶解させた後、濃塩酸１５ｍＬを加える）
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、分析直前に同緩衝液で２．０〜３．０Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを採り、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１０分間反応させた後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）２５℃で２０分間放置後、４３５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを３７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（０．３２１×１．０×１０（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×９．６５×希釈倍率
０．３２１：黄色色素のミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．１Ｍクレアチン溶液〔１．４９ｇのクレアチン（ナカライテスク製）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、１００ｍＬとする〕
（Ｂ）ＤＡＢ溶液（２．０ｇのｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１００Ｐのジメチルスルホキシドに溶解させた後、濃塩酸１５ｍＬを加える）
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、分析直前に同緩衝液で２．０〜３．０Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを採り、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１０分間反応させた後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）２５℃で２０分間放置後、４３５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを３７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（０．３２１×１．０×１０（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×９．６５×希釈倍率
０．３２１：黄色色素のミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
カタラーゼ（ＣＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を加水分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０（２５℃における）
（Ｂ）Ｈ２Ｏ２溶液 １６ｍＭ（０．１８２ｍｌの３０％（Ｗ／Ｖ）を１００ｍＬの（Ａ）で溶解する。））
（Ｃ）チタン試薬 １．０ｇのＴｉＯ２と１０ｇのＫ２ＳＯ４とを１５０ｍＬの濃硫酸とともに、マントルヒーター上で１８０−２２０℃で２−３時間混ぜる。混合液を冷却して、溶液部分を水で１．５Ｌに希釈する。
（Ｄ）酵素希釈液 （Ａ）を用いる。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを採り、２５℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．２５ｍＬを加えて混ぜる。
（３）２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを２５℃で５分間放置後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．２５ｍＬを加えて調製する。（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０（ｍＬ）×希釈倍率）／（Ｆ×１．０×５（分）×０．２５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×２．４×（１／Ｆ）×希釈倍率
Ｆ：１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在により生じるＴｉｔａｎｉｕ ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔの吸光係数（普通は約７．０であるが、既知濃度のＨ２Ｏ２の濃度を用いて、各々のロットにおいて決める。）
１．０：光路長（ｃｍ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を加水分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０（２５℃における）
（Ｂ）Ｈ２Ｏ２溶液 １６ｍＭ（０．１８２ｍｌの３０％（Ｗ／Ｖ）を１００ｍＬの（Ａ）で溶解する。））
（Ｃ）チタン試薬 １．０ｇのＴｉＯ２と１０ｇのＫ２ＳＯ４とを１５０ｍＬの濃硫酸とともに、マントルヒーター上で１８０−２２０℃で２−３時間混ぜる。混合液を冷却して、溶液部分を水で１．５Ｌに希釈する。
（Ｄ）酵素希釈液 （Ａ）を用いる。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを採り、２５℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．２５ｍＬを加えて混ぜる。
（３）２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを２５℃で５分間放置後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．２５ｍＬを加えて調製する。（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０（ｍＬ）×希釈倍率）／（Ｆ×１．０×５（分）×０．２５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×２．４×（１／Ｆ）×希釈倍率
Ｆ：１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在により生じるＴｉｔａｎｉｕ ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔの吸光係数（普通は約７．０であるが、既知濃度のＨ２Ｏ２の濃度を用いて、各々のロットにおいて決める。）
１．０：光路長（ｃｍ）
（実施例４）
下記の尿酸測定試薬（ＵＡ）、中性脂肪測定試薬（ＴＧ）、総コレステロール測定試薬（ＴＣ）、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）の各々の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していない各測定試薬で同様の検討を行なった。
下記の尿酸測定試薬（ＵＡ）、中性脂肪測定試薬（ＴＧ）、総コレステロール測定試薬（ＴＣ）、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）の各々の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるようにエタンシラートを加え、エタンシラートを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していない各測定試薬で同様の検討を行なった。
（試薬の調製）
尿酸測定試薬（ＵＡ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１） ０．８Ｕ／ｍＬ
中性脂肪測定試薬（ＴＧ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ １ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
総コレステロール測定試薬（ＴＣ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ２Ｕ／ｍＬ
コール酸ナトリウム ５ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ２Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．１％
ジギトニン（同仁化学社製） ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製） ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．４ｇ／Ｌ
ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
尿酸測定試薬（ＵＡ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１） ０．８Ｕ／ｍＬ
中性脂肪測定試薬（ＴＧ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ １ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
総コレステロール測定試薬（ＴＣ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ２Ｕ／ｍＬ
コール酸ナトリウム ５ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ２Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．６ｇ/Ｌ
ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．１％
ジギトニン（同仁化学社製） ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製） ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．４ｇ／Ｌ
ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料に第一試薬を添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で所定の波長における吸光度を測定した。
各々以下のサンプル（Ｓ）、試薬量（Ｒ１、Ｒ２）、測定波長を用いた。（Ｓ/Ｒ１、Ｒ２/測定波長）
ＵＡ ２．７μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＣ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＧ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＨＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
ＬＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
濃度の算出は、精製水および各項目の標準液の測定吸光度より算出して求めた。
各項目の標準液濃度は以下を用いた。
ＵＡ ６．９ｍｇ／ｄＬ
ＴＣ ２２１ｍｇ／ｄＬ
ＴＧ １２４ｍｇ／ｄＬ
ＨＤＬ ８９ｍｇ／ｄＬ
ＬＤＬ ９１ｍｇ／ｄＬ
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料に第一試薬を添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で所定の波長における吸光度を測定した。
各々以下のサンプル（Ｓ）、試薬量（Ｒ１、Ｒ２）、測定波長を用いた。（Ｓ/Ｒ１、Ｒ２/測定波長）
ＵＡ ２．７μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＣ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＴＧ １．５μＬ ／１２０μＬ、６０μＬ／ ６００ｎｍ
ＨＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
ＬＤＬ １．６μＬ ／１５０μＬ、５０μＬ／ ６００ｎｍ
濃度の算出は、精製水および各項目の標準液の測定吸光度より算出して求めた。
各項目の標準液濃度は以下を用いた。
ＵＡ ６．９ｍｇ／ｄＬ
ＴＣ ２２１ｍｇ／ｄＬ
ＴＧ １２４ｍｇ／ｄＬ
ＨＤＬ ８９ｍｇ／ｄＬ
ＬＤＬ ９１ｍｇ／ｄＬ
結果 表４に示す。比較例と比較し、いずれの試薬もＡＡＱ−２を添加した実施例では、エタンシラートの影響を低減できる結果であった。
（実施例５）
実施例３と同様の実験を、ＡＡＱ−２の濃度を１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で表５に記載のように変え、調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
実施例３と同様の実験を、ＡＡＱ−２の濃度を１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で表５に記載のように変え、調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
結果を表５に示す。ＡＡＱ−２を添加した実施例の方が、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＡＡＱ−２添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。
生体成分を酸化還元反応を利用して測定する測定方法、および、該方法に用いる試薬や組成物に適用できる。
Claims (6)
- 酸化還元反応を利用して生体成分を測定する過程において、以下の（１）〜（５）の成分：
（１）ペルオキシダーゼ、
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬、
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、
（４）ＧＯＯＤ緩衝液成分、及び
（５）カタラーゼ、
を共存させ、且つ、前記生体成分を測定する過程が２試薬系であって、第一試薬に前記（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを試薬中終濃度が３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように含有させて用いることにより共存させることを特徴とする、エタンシラートの影響を低減させる方法。 - クレアチニン測定、尿酸測定、中性脂肪測定、総コレステロール測定、ＨＤＬ−Ｃ測定、又はＬＤＬ−Ｃ測定のために行われる、請求項１に記載の方法。
- （３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルと、（６）アスコルビン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、及びクレアチンアミジノヒドラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素とを更に共存させる、請求項１又は２に記載の方法。
- 以下の（１）〜（５）の成分：
（１）ペルオキシダーゼ、
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬、
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、
（４）ＧＯＯＤ緩衝液成分、及び
（５）カタラーゼ、
を含む試薬であって、且つ、前記試薬が２試薬系であって、第一試薬が前記（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを試薬中終濃度が３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように含有することを特徴とする、エタンシラートが含まれている可能性がある生体試料を測定するための試薬。 - クレアチニン測定試薬、尿酸測定試薬、中性脂肪測定試薬、総コレステロール測定試薬、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬、又はＬＤＬ−Ｃ測定試薬である、請求項４に記載の試薬。
- （３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルと、（６）アスコルビン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、及びクレアチンアミジノヒドラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素とを共存させる、請求項４又は５に記載の試薬。
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