JPH0372280B2

JPH0372280B2 -

Info

Publication number: JPH0372280B2
Application number: JP57170639A
Authority: JP
Inventors: Yoshitsugu Sakata; Yoshinobu Myashita; Tadashi Hamanaka; Hiromasa Kodera; Yutaka Miki; Kazuhiko Yamanishi; Toshiro Hanada
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1982-09-29
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1991-11-18
Also published as: US4695539A; JPS59140899A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は基質定量方法に関する。更には臨床化
学検査等に於ける、血液成分等を基質とする酵素
反応利用の定量方法に関する。酵素就中オキシダーゼによる基質定量方法で
は、その酵素反応で生成するものは、水であり、
炭酸ガスであり、過酸化水素であるが、近来その
生成過酸化水素を測定して、基質の定量を行うこ
とは、酵素に先天的な特異性が即ち定量性である
という極めて常識的な生化学の智識によつて、広
い実用性を獲得した。これにより従前の化学的定
量法が、定量性を保持するには種々の工夫が要る
こと、薬品の腐食性が隘路になること、特異性に
問題があることなどの欠点から、駆逐されたに近
い状態になつていることは周知である。而も尚、
近来の酵素法が、十分満足できるものであるとは
限らない。これらのことを、コレステロールの定
量を例として述べれば次の通りである。コレステロールの増加を高コレステロール血
症、減少を低コレステロール血症というが、前者
はネフローゼ症候群、重症糖尿病、甲状腺機能低
下症、グリコーゲン蓄積症、家族性高脂血症等に
みられ、後者は重症な肝疾患、栄養不良、甲状腺
機能亢進症等にみられ、コレステロールの定量
は、臨床化学検査の分野で必須の試験項目であ
る。一般にリーベルマン・ブルクハルト反応やキ
リアニイ反応を、比色反応に用いたザク・ヘンリ
イ変法とかズルコウスキー法があつたが、コレス
テロールを、△⁴−コレステノンと過酸化水素と
に酸化する酵素と、生成過酸化水素を測定する試
薬との組合せが提唱されたあと、方法の主流はこ
の酵素法へ完全に移つた。しかしこれが酵素法も
体液中の還元性物質の影響を回避できず、改良が
提案されねばならず、また感度が充分でなく、よ
り高波長側で発色する被酸化性呈色試薬を使う方
法への改良が求められている。本発明者らは、各種基質に対する夫々特異のオ
キシダーゼの酵素反応が、水や過酸化水素のよう
な最終生成物を単純に産生するという従来の知識
に疑問をもち、これら酵素反応を深く解析すれば
新しい利用方法が展開すると期待、鋭意研究した
結果その洞察の正しいことを証明することを得、
本発明を完成した。即ち体液成分等の種々の基質
とそれら基質に夫々特異性を示すオキシダーゼと
の組合せにつき、本発明者らをグループに分けて
相互に着想を交換し、研究を協同し、逐次全く同
様に、これら基質に対し夫々のオキシダーゼが酵
素反応をなすとき、スーパーオキサイドイオンが
定量的に生成、あらためて次の段階を経てこれが
例えば過酸化水素に変換して行くことを確認し、
スーパーオキサイドイオンを測定する、基質の新
規にして有用な実用的定量方法を完成した。スーパーオキサイドイオンは、被還元性試薬を
還元して呈色を結果し、これらの程度またはその
変化の度合いを測定することは、当今の分光技術
を以てすれば真に容易であり普遍的である。被還
元性呈色試薬を適宜に選ぶことによつて、体液中
に存在する還元力小さいビリルビン、アスコルビ
ン酸等の影響が生じないのはひとつの利点であ
る。また高感度で且つ長波長側で発色する被還元
性試薬を、自由に選定使用できることはいまひと
つの利点である。従来遅速の差はあるにしても、スーパーオキサ
イドイオンは過酸化水素へ変化し、この変化は血
清中に通常（溶血しない限り、血清中の量は微量
であるが）存在するスーパーオキサイドジスムタ
ーゼによつて促進されるとされている。本発明の
いまひとつの重要な点は、過酸化水素へのコース
を、被還元性呈色試薬のスーパーオキサイドによ
る還元というコースへ、完璧に転ずる技術の発明
である。これはSH基をもつ化合物即ちチオール
化合物を以てするものであり、このチオール化合
物の合目的々効果を、パーオキシダーゼの添加で
更に助長して、オキシダーゼの酵素反応即ちスー
パーオキサイドイオンの生成及びスパーオキサイ
ドイオンの被還元性呈色試薬に対する還元反応を
促進することである。且つこれにフエノール類
（ナフトール類を含む。以下同じ。）またアミン類
を共存させることにより、本発明方法の定量性が
充分に満足できるものになることも確認された。即ち本発明方法及び試薬は、基質に夫々その基
質に特異性をもつオキシダーゼを作用させ、その
酵素反応で定量的に生成するスーパーオキサイド
イオンを捉え、その還元性を利用して基質を定量
するものであるが、SH基をもつ化合物とパーオ
キシダーゼ、更に好ましくはアミン類またはフエ
ノール類を共存させることによつて、測定時間、
感度、定量性などを、実用に当つて要求される水
準へ充分に対応させたものである。更に本発明者らは、試薬及び反応系に於いて、
チオール化合物等の添加剤の、またはおそらくは
測定時の反応の好ましくない副反応である、自動
酸化を除去する為に、キレート剤を共存させて、
所望の反応を安定に進行させる方法を見出した。
即ち本発明方法及び試薬は、更に、定量対象であ
る基質に特異なオキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、アミン類またはフエノール類、チオール化合
物、及びキレート剤を共存させるものである。 0.1モル・トリス緩衝液（PH8.0）に、チトクロ
ームＣが2.5×10^-5モルに、コレステロールオキ
シダーゼが15単位／dlに、パーオキシダーゼが
600単位／dlに、フエノールが0.1％になるように
溶解、これに同じ緩衝液にグルタチオン（還元
型）0.8％溶解した液を加え、この両液の混液に
コレステロール200mg／dlを含むイソプロパノー
ルを添加、37℃で例えば10分間インキユベートす
る。チトクロームＣが発色し、波長550nｍの吸
光度は試薬盲検を対照に（即ち0.D.（−Bl）は）
0.10を示す。コレステロールのイソプロパノール
溶液の代りに、同量のイソプロパノールのみを与
える場合、チトクロームＣの発色はない。また被
還元性呈色試薬に２，2′−ジ（４−ニトロフエニ
ル）−５，5′−ジフエニル−３，3′−ジメトキシ
−４，4′−ジフエニレン）ジテトラゾリウム＝ク
ロイド（以下ニトロTBという）を用いても同様
である。且つこれらの呈色は、スーパーオキサイ
ドイオンに特異的に作用する、スーパーオキサイ
ドジスムターゼを大量に存在させることによつて
阻害を認める。促ち本発明の呈色は、スーパーオ
キサイドイオンの還元作用によることが確認され
るのである。オキシダーゼは酸化酵素であり、基質毎に特異
的にそのオキシダーゼが存在する。グルコースに
対してはグルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルに対してはコレステロールオキシダーゼといつ
た具合であることは周知であり、パーオキシダー
ゼと同様に、それらを産生する生物体から収得さ
れて市販され、使用されていることも周知であ
り、これらを夫々使用すれば良い。アミン類は通常の有機アミンが使用される。脂
肪族アミンに比べて芳香族アミンが、使用量少く
ても効果がある。一般、二級、三級を問わない。
実用に与つては、アニリン、Ｎ−エチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−ｍ
−トルイジンなど、入手し易い安価なものを適宜
に選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の段階
で、反応液中0.0001％〜0.2％程度存在するよう
に添加すれば良い。フエノール類も特に他の置換基によつて支障を
生ずるということはない。フエノール、クロロフ
エノール類、ジクロロフエノール類、ナフトール
スルホン酸類など、入手し易い安価なものを適宜
選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の段階
で、反応液中0.0001％〜0.2％程度存在するよう
に用いれば良い。フエノール類とアミン類とを併用することも、
また例えば１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−４−ナ
フトールとか、４−Ｎ，Ｎ−ジエチルサリチル酸
のように、一つの化合物がフエノール類でもあ
り、アミン類でもある化合物を使用することもで
きる。但し基質がアミンとかＬ−アミノ酸など
で、オキシダーゼが夫々アミンオキシダーゼとか
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼなどである場合、アミ
ン類でなくフエノール類を用いることは当然であ
る。チオール化合物についても特に制限はなく、還
元型グルタチオン、チオグリコール酸、メルカプ
トエタノール、チオサリチル酸、システアミン、
システイン、ジメルカプトコハク酸などが例示さ
れ、入手し易い安価なものを適宜選んで使用すれ
ば良く、多くの場合呈色の時点で、反応液中１〜
50mg／dl程度存在するように用いれば良い。被還元性呈色試薬としては、適当な酸化還元電
位を示して、スーパーオキサイドイオンによつて
還元されて呈色するもの、既に化学分析に於いて
多数のものが使用されている中から、適宜に選ん
で使用すれば良い。ニトロTB、２−（４−ヨー
ドフエニル）−３−（４−ニトロフエニル）−５−
フエニルテトラゾリウム＝クロリド（以下INT
という）、または３−（４，５−ジメチルチアゾリ
ル−２）−２，５−ジフエニルテトラゾリウム＝
ブロミド（MTT）等のテトラゾリウム塩、チト
クロームＣ、テトラニトロメタン（危険性の故に
実用は奨められない）、プラストシアニン、ブル
ープロテイン等が例示できる。被還元性呈色試薬
は通常呈色の時点で、反応液中１〜40mg／dl程度
存在するように用いれば良い。テトラゾリウム類
は、従来それらが還元されて生ずるホルマザン類
が水難溶で、呈色の定量性及び機器類汚染につき
問題ありとされることがあつたが、近時溶解性基
を巧みに導入することにより、その問題の解消が
進み、本発明の実施に貢献するようになつた。キレート剤も、EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）、CyDTA（トランス−シクロヘキサンジアミ
ン四酢酸＝トランス−１，２−シクロヘキサンジ
アミン−Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラアセチツクア
シド）、DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸＝
ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，N′，N″，N″−
ペンタアセチツクアシド）と略称される通常周知
のものを始め、極めて多数のものがあるが、これ
もそれらの中から、入手し易い安価なものを適宜
選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の段階
で、反応液中0.5〜５ミリモル／dl程度存在する
ように用いれば良い。キレート剤添加効果は、現
象的には試薬盲検値の変動が小さいという結果を
招来する。パーオキシダーゼは多くの場合呈色の段階の液
量に対して、50〜1000単位／dl程度になるように
用いれば良い。上記の各化合物を適宜に組み合せて使用する場
合、呈色を測定しようとする最終混液に、それは
臨床化学分析にままあることであるが、万一濁り
が生じて測定に支障を来たす場合は、適宜界面活
性剤乃至溶解補助剤を予め加えて、この問題を解
消する通常の手法を用いる。またキレート剤を使用するのであるが、これは
抗凝固剤として、ヘパリン、クエン酸ナトリウ
ム、シユウ酸ナトリウムと同様に使用され、別の
目的で使用されている場合もあるが、キレート剤
の存在は前述の通り、本発明方法及び試薬では積
極的に使用すべきものである。他の抗凝固剤、ま
たフツ化ナトリウムの如き解糖阻止剤の存在は、
本発明方法及び試薬による呈色を全く阻害しな
い。また生体に生理的に病理的にまたは治療のた
めに投与することにより存在する量の、アスコル
ビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン、尿酸、ピル
ビン酸、グルコース等は、各々目的の基質に対す
る夫々のオキシダーゼの特異性の故に、全く目的
の呈色を阻害しない。実際の測定に当つては、適宜の媒体（通常緩衝
液であるが）の中に於いて、被検液に、通量対象
基質に特異なオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、
アミン類またはフエノール類、チオール化合物、
及び被還元性呈色試薬、更に好ましくはキレート
剤の混合を与え、インキユベートして所望の反応
を所望の程度に迄進行させ、結果として生ずる呈
色またはそれらの変化を測定、被検液中の基質を
定量する。その方法のためにオキシダーゼ以下の
添加剤乃至試薬を、一つに混合、或は幾つかの群
に分けて単独にまたは混合し、当該の基質の測定
用試薬として組み合せ、本発明の試薬が得られ
る。試験中のPHが7.0以上、好ましくは7.5以上に
なるように、試薬の媒体乃至反応液の媒体を選ん
で処方する。斯く本発明は、スーパーオキサイドイオンを測
定することにより、体液成分などの基質を定量す
る方法と試薬とを提供する、極めて画期的な発明
であり、斯界に貢献する処著しいものである。以
下に実施例を示すが、これらは限定的な例示では
ない。実施例中の発色試液は本発明試薬の実施例
であり、これによる測定定量が本発明方法の実施
例である。実施例１（コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、第１表のフエノール化
合物またはアミン化合物が1.06ｍＭ／、還元型
グルタチオンが0.65ｍＭ／、パーオキシダーゼ
が300U／dl、コレステロールオキシダーゼが
15U／dl、トリトンＸ−100が0.1ｇ／dl、エマル
ゲン920が0.4ｇ／dlの濃度になるように、
0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発色試
薬と、コレステロール200mgを、イソプロパノー
ルに溶解して100mlとした被検試液を準備する。被検試液50μに発色試液が3.0mlを加え、37℃
恒温槽中10分間インキユベートし、夫々試薬ブラ
ンクを対照として、波長560nｍに於ける吸光度
を測定する。第１表に示す結果が得られ、本発明方法及び試
薬に於ける、フエノール類またはアミン類の添加
効果が知られる。

【表】実施例２（コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが1.06ｍ
Ｍ／、第２表のチオール化合物が0.65ｍＭ／
、パーオキシダーゼが300U／dl、コレステロ
ールオキシダーゼが15U／dlの濃度になるよう
に、0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発
色試薬と、コレステロール200mgを、イソプロパ
ノールに溶解して100mlとした被検試液を準備す
る。被検試液50μと発色試液が3.0mlで、実施例１
と同様に測定、第２表に示す結果を得、チオール
化合物の添加効果が知られる。

【表】

【表】実施例３（コレステロール）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.1％、ト
リトンＸ−100が0.13％、パーオキシダーゼ（バ
イオザイム社製）が600U／dl、コレステロール
オキシダーゼ（天野製薬(株)製、2.16U／mg）が
15U／dl、コレステロールエステラーゼ（天野製
薬(株)製、29.2U／mg）が100U／dlの濃度になるよ
うに、0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した
液を第１発色試液とする。グルタチオン（還元
型）を同じ緩衝液に溶かして、800mg／dl濃度液
にしたものを第２発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはコレ
ステロールの200mg／dlになるイソプロパノール
溶液、検体Ｃは、従来の測定法によつてコレステ
ロールの定量値が、289mg／dlとされた人血清で
ある。第１発色試液と第２発色試液とを、37℃に予備
加温しておき、第１発色試液４mlに第２発色試液
100μを通じた液を検体の数だけ作り、夫夫15
秒後に検体Ａ、Ｂ、及びＣを個々に20μずつ添
加、37℃で各々を正確に10分間インキユベート
し、560nｍの吸収（O.D.₅₆₀）を測定、第３表の
結果から、検体Ｃに含有されるコレステロールの
量は、285mg／dlと算出される。

【表】従来法でコレステロールの定量値が、155〜285
mg／dlと定量された18検体につき、実施例３の試
薬を以て定量したところ、相関係数0.923、回帰
直線ｙ＝1.002x−14.5を得た。なお、第１発色試液にEDTA2.5ｍMol／添
加した試液を用い、これに第２発色試液を加えた
場合の試薬ブランク（試薬盲検）値の変化は△
0.002／分であるのに対し、EDTAの添加なしの
場合の試薬ブランク値の変化は△0.010／分であ
つた。実施例４（アシルCoA）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.1％、パ
ーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来、バイオザイム
社製）が600U／dl、グルタチオン（還元型）が
20mg／dl、アシルCoAオキシダーゼ（東洋醸造
(株)製）が240U／dlとなるように、0.1M・トリス
緩衝液（PH8.0）に溶解して発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはパル
ミトイルCoA（東洋醸造(株)製、含量93.6％）の２
ｍＭ水溶液である。発色試液３mlを２本の試験管にとり、各々に検
体ＡまたはＢを、夫々100μ加え、37℃で10分
間加温する。直ちにＡを対照にＢの吸光度を、波
長560nｍで測定する。また検体Ｂを蒸溜水で２
倍及び４倍に希釈して検体B′及びB″とし、同様
に操作して測定する。結果は第４表であり、直線
検量線が得られることが示される。

【表】実施例５（グルコース） INTが10mg／dl、3.5−ジメトキシ−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ソジウムスルホ
プロピル）アニリンが0.1％、パーオキシダーゼ
（バイオザイム社製）が600U／dl、グルタチオン
（還元型）が20mg／dl、グルコースオキシダーゼ
（天野製薬(株)製）が3000U／dlの濃度になるよう
に、0.1M・燐酸塩緩衝液（PH8.0）に溶解して発
色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはブド
ウ糖の200mg／dl水溶液、検体Ｃは従来の測定法
によつてグルコースの定量値が、121mg／dlとさ
れた人血清である。また検体Ｃを蒸溜水で２倍及
び４倍に希釈して、夫々検体C′及びC″とする。発色試液３mlを５本の試験管に採り、各試験管
に検体Ａ、Ｂ、Ｃ、C′、及びC″を夫々20μ加
え、37℃で10分間加温する。直ちにＡを対照にＢ
以下の吸光度を、波長500nｍで測定する。吸光
度を第５表に示す。

【表】これより検体Ｃのグルコース含量は、120mg／
dlと算出され、Ｃ、C′、及びC″から、検量線の
直線性が認められる。実施例６（ピルビン酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが0.1％、パ
ーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が600U／
dl、グルタチオン（還元型）が10mg／dl、ピルビ
ン酸オキシダーゼ（東洋醸造(株)製）が700U／dl、
フラビンアデニンジヌクレオチドが２mg／dl、チ
アミンピロホスフエートが44mg／dl、酢酸マグネ
シウムが0.15％の濃度になるように、0.02M・燐
酸塩緩衝液（PH7.1）に溶解して発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはピル
ビン酸リチウムをピルビン酸として10mg／dlとな
るように溶解した水溶液である。発色試液３mlを２本の試験管にとり、各々に検
体Ａ、並びに検体Ｂを、夫々100μ加え、37℃
で15分間加温する。直ちにＡを対照にしてＢの波
長560nｍの吸光度を測定、0.042を得る。実施例７（コリン）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.1％、パ
ーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が600U／
dl、チオサリチル酸が10mg／dl、コリンオキシダ
ーゼ（東洋醸造(株)製）が500U／dlとなるように、
0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解して発色試
液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂは塩化
コリンの70mg／dl水溶液である。検体Ｂを蒸溜水
で２倍及び４倍に稀釈、夫々検体B′及びB″とす
る。発色試液３mlを４本の試験管にとり、各々に検
体Ａ、Ｂ、B′、及びB″を夫々20μ加え、37℃で
10分間加温する。直ちにＡを対照に、Ｂ以下の吸
光度を波長560nｍで測定、第６表の結果を得る。

【表】実施例８（グリセロール−３−燐酸）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.05％、
パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が
600U／dl、グルタチオン（還元型）が20mg／dl、
グリセロール−３−燐酸オキシダーゼ（東洋醸造
(株)製）が600U／dlの濃度になるように、0.1M・
トリス緩衝液（PH8.0）に溶解して発色試液とす
る。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはグリ
セロール−３−燐酸の10ｍＭ（172mg／dl）水溶液
である。検体Ｂを蒸溜水で２倍及び４倍に希釈、
夫々検体B′及びB″とする。発色試液４mlを４本の試験管にとり、各々に検
体Ａ、Ｂ、B′、及びB″を夫々50μ加え、37℃で
10分間加温する。直ちにＡを対照にＢ以下の吸光
度を、波長560nｍで測定、第７表の結果を得る。

【表】実施例９（グリセロール）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.05％、
パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が
600U／dl、グルタチオン（還元型）が20mg／dl、
グリセロールオキシダーゼ（協和醗酵(株)製）が
600U／dlとなるように、0.05M・燐酸塩緩衝液
（PH8.0）に溶解して発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはグリ
セリンの２ｍＭ水溶液である。検体Ｂを蒸溜水で
２倍及び４倍に稀釈し、夫々検体B′及びB″とす
る。発色試液４mlを４本の試験管にとり、各々に検
体Ａ、Ｂ、B′、及びB″を夫々50μ加える。37℃
で10分間加温し、直ちにＡを対照にＢ以下の吸光
度を波長560nｍで測定、第８表の結果を得る。

【表】実施例 10 （尿酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが0.1％、パ
ーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が600U／
dl、グルタチオン（還元型）が10mg／dl、ウリカ
ーゼ（東洋紡績(株)製）が30U／dlの濃度になるよ
うに、0.1M・トリス緩衝液（PH7.1）に溶解して
発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂは尿酸
10mgを１％炭酸リチウム水溶液100mlに溶解した
10mg／dlの溶液、検体Ｃは従来法で12mg／dlと定
量された高尿酸血清である。発色試液３mlを２本の試験管にとり、各々に検
体Ａ、Ｂ、及びＣを夫々60μ加え、37℃で10分
間加温する。直ちにＡを対照にＢ、Ｃの吸光度を
波長560nｍで測定、第９表の結果から、検体Ｃ
の本法による尿酸含有量21.8mg／dlを得た。

【表】実施例 11 （Ｌ−乳酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが0.1％、パ
ーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が600U／
dl、グルタチオン（還元型）が10mg／dl、Ｌ−乳
酸オキシダーゼ（東洋醸造(株)製）が85U／dlとな
るように、0.1M・トリス緩衝液（PH7.5）に溶解
して発色試液とする。検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体ＢはＬ−
乳酸ナトリウムの10ｍＭ水溶液である。発色試液３mlを２本の試験管にとり、各々に検
体Ａ並びにＢを夫々50μ加え、37℃で10分間イ
ンキユベートする。直ちにＡを対照にしてＢの波
長560nｍの吸光度を測定、0.110を得た。実施例 12 （コレステロール）酸化型チトクロームＣ（シグマ社製、タイプ）
が３×10^-5モル、フエノールが0.1％、パーオキ
シダーゼ（バイオザイム社製）が600U／dl、コ
レステロールオキシダーゼ（天野製薬(株)製）が
15U／dlになるように、0.1M・トリス緩衝液
（PH8.0）に溶解した液を第１発色試液とし、グル
タチオン（還元型）を同じ緩衝液に溶解し、800
mg／dlにしたものを第２発色試液とする。検体Ａはブランクとしてイソプロパノール、検
体Ｂはコレステロールが200mg／dlのイソプロパ
ノール溶液、検体Ｃはコレステロールが従来法で
230mg／dlと定量された血清である。また検体Ｃ
をイソプロパノールで２倍及び４倍に稀釈して、
夫々検体C′及びC″とする。両発色試液を37℃に予備加温しておき、測定直
前に第１発色試液４mlに、第２発色試液100μ
と検体20μを添加、37℃で正確に２分間加温し
た後、波長550nｍの吸収を測定する。結果を第
10表に示す。

【表】これより、本法による検体Ｃのコレステロール
定量値は238mg／dlであり、検体Ｃ、C′、及び
C″の値は直線性を示している。実験例１ニトロTBが20mg／dl、所定のフエノール化合
物又はアミン化合物が1.06ｍＭ／、還元型グル
タチオンが0.65ｍＭ／、パーオキシダーゼが
300U／dl、コレステロールオキシダーゼが
15U／dl、トリトンＸ−100が0.1ｇ／dl、エマル
ゲン920が0.4ｇ／dlの濃度になるように、
0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発色試
液と、コレステロール200mgをイソプロパノール
に溶解して100mlとした被検試液（コレステロー
ル濃度：5.2ｍＭ）と、５ｍＭの過酸化水素水と
を準備する。発色試液3.0mlに、被検試液又は過酸化水素水
50μを加え、37℃恒温槽中10分間イキユベート
し、夫々試薬ブランクを対照として、波長560n
ｍに於ける吸光度を測定する。結果を第11表に示す。

【表】実験例２ニトロTBが20mg／dl、フエノールが1.06ｍ
Ｍ／、所定のチオール化合物が0.65ｍＭ／、
パーオキシダーゼが300U／dl、コレステロール
オキシダーゼが15U／dlの濃度になるように、
0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発色試
薬を用いた他は、実験例１と同じ被検試液及び過
酸化水素水を用い、同様の操作法により測定を行
う。結果を表12に示す。

【表】表11及び表12の結果から明らかな如く、本発明
に係る発色試液は過酸化水素によつては何ら呈色
を生じないことから、本願発明の方法は過酸化水
素の還元力を利用して被還元性呈色試薬を発色さ
せているのではないことが判る。実験例３ニトロTBが20mg／dl、フエノールが1.06ｍ
Ｍ／、グルタチオン（還元型）が0.65ｍＭ／
、パーオキシダーゼが300U／dl、コレステロ
ールオキシダーゼが15U／dlの濃度になるよう
に、0.1M・トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発
色試薬と、この発色試液にスーパーオキサイドジ
スムターゼ（SOD）を5000U／dl又は10000U／
dl添加したものと、コレステロール200mgをイソ
プロパノールに溶解して100mlとした被検試液と
を準備する。所定の発色試液3.0mlに、被検試液50μを加
え、37℃恒温槽中10分間インキユベートし、夫々
試薬ブランクを対照として、波長560nｍに於け
る吸光度を測定する。結果を第13表に示す。

【表】この結果から明らかなように、本発明の方法に
よる発色は、SODにより阻害されること、従つ
て本発明の方法による発色にはスーパーオキサイ
ドイオンが関与していることが判る。実験例４ニトロTBが20mg／dl、コレステロールオキシ
ダーゼが15U／dlの濃度になるように、0.1M・
トリス緩衝液（PH8.0）に溶解した溶液に、フエ
ノール、グルタチオン（還元型）、又は／及びパ
ーオキシダーゼ（POD）を夫々適宜添加して得
られる発色試液と、コレステロール200mgをイソ
プロパノールに溶解して100mlとした被検試液と
を準備する。所定の発色試液3.0mlに、被検試液50μを加
え、37℃恒温槽中10分間インキユベートし、夫々
試薬ブランクを対照として、波長560nｍに於け
る吸光度を測定する。結果を第14表に示す。尚、表中、−は無添加を、
○は添加したことを夫々示す。

【表】この結果から、チオール化合物が存在しなけれ
ば全く呈色が生じないこと、言い換えればチオー
ル化合物の存在下で始めてスーパーオキサイドイ
オンが生成することが、また、スーパーオキサイ
ドイオンにより被還元性呈色試薬の還元が効率良
く行われるためには少なくともPODが必要であ
り、更にこれがより効率良く行われるためには、
フエノール類又はアミン類が必要であることが判
る。従つて、本願発明に於いて、チオール化合物
はオキシダーゼによるスーパーオキサイドイオン
の生成反応に必須のものであり、PODはスーパ
ーオキサイドイオンが被還元性呈色試薬を還元す
る反応を促進する作用を有するものであり、フエ
ノール類（又はアミン類）はそれを更に促進させ
るものであると考えられる。

Claims

【特許請求の範囲】１オキシダーゼの酵素反応即ちスーパーオキサ
イドイオンの生成、及びスーパーオキサイドイオ
ンの被還元性呈色試薬に対する還元反応を、パー
オキシダーゼ及びSH基を持つ化合物をもつて促
進することを特徴とする、基質の定量方法。２アミン類又はフエノール類（ナフトール類を
含む）を共存させる、特許請求の範囲第１項に記
載の定量方法。３キレート剤を共存させる、特許請求の範囲第
２項に記載の定量方法。４基質がグルコース、コレステロール、グリセ
ロール、グリセロール燐酸エステル、コリン、ア
シルCoA、ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は
乳酸であり、対応するオキシダーゼが夫々グルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロール燐
酸エステルオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、
アシルCoAオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダ
ーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ又は
乳酸オキシダーゼである、特許請求の範囲第１
項、第２項又は第３項に記載の定量方法。５オキシダーゼと、パーオキシダーゼと、SH
基を持つ化合物と、被還元性呈色試薬とを組み合
わせて成る、基質の定量用試薬。６アミン類又はフエノール類（ナフトール類を
含む）を共存させる、特許請求の範囲第５項に記
載の定量用試薬。７キレート剤を共存させる、特許請求の範囲第
６項に記載の定量用試薬。８基質がグルコース、コレステロール、グリセ
ロール、グリセロール燐酸エステル、コリン、ア
シルCoA、ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は
乳酸であり、対応するオキシダーゼが夫々グルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロール燐
酸エステルオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、
アシルCoAオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダ
ーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ又は
乳酸オキシダーゼである、特許請求の範囲第５
項、第６項又は第７項に記載の定量用試薬。