JPH0115280B2

JPH0115280B2 -

Info

Publication number: JPH0115280B2
Application number: JP55011204A
Authority: JP
Inventors: Fujio Yamasato; Susumu Oosawa; Shin Furuya; Kuniaki Tokuda
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1980-02-01
Filing date: 1980-02-01
Publication date: 1989-03-16
Also published as: JPS56109595A

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の利用分野］本発明は酸化還元反応を利用した、体液中の成
分の定量方法における体液中の還元性妨害物質の
除去方法に関する。［発明の背景］生体体液や生体組識中の特定成分の含量を測定
し、その変動を追跡することは病態の合理的な診
断や治療を行うために必須のものである。成分の
定量にはその原理から分類すると化学分析法、機
器分析法、免疫学的分析法、酵素学的分析法等が
あり、その定量すべき目的成分に応じて、精度管
理の必要性、簡易性又は自動化の容易性などの観
点から、より適切な方法が選ばれるが、これらの
方法を用いて、最終的に生成する色素量を測定す
る、所謂、比色分析法が最も一般に普及してい
る。比色分析法には、目的成分の有する官能基と
反応する発色剤等を作用させて有色化合物に導い
たり、特異的なキレート剤を作用させて目的成分
を有色化合物に導いたり、又、目的成分の酸化還
元力を利用して、若しくは、目的成分を特異的に
酸化する酵素を用いて酸化し同時に生成した過酸
化水素の酸化力を利用して有色化合物を生成さ
せ、その色度を測定する方法等がある。一方、これらの測定方法は、厳密には、複雑多
種の成分の中から特異的、且つ正確に目的成分の
みを測定しているとは必ずしもいえず、特に酸化
還元反応を利用した測定方法では生体体液、生体
組識に存在する酸化還元性物質が測定値に誤差を
与えることがある。特に、治療の為に投与された
アスコルビン酸、トコフエロール、スルピリン、
アミノピリン等の薬剤、肝疾患の時に増加するビ
リルビン、蛋白質を構成しているシステインや、
同じくチオール基を持つ化合物であるグルタチオ
ン等はその強い還元力により測定値に正負の誤差
を与えることが多い。これらの還元性の測定妨害物質の中で、アスコ
ルビン酸の処理にはアスコルビン酸オキシダーゼ
又は銅イオンによる処理、チオール基を持つ化合
物の処理には水銀化合物やヨード酢酸の様なハロ
ゲン化合物による処理等で、一応それなりの効果
が得られている。しかしながら、これらの還元性
物質処理剤は高価で、調製後の安定性が悪く長時
間の使用が困難であつたり、毒性や腐食性が強く
使用に不便をきたすことが多い。しかも、最大の
欠点は特定化合物の処理しか出来ないことであ
る。例えば、アスコルビン酸オキシダーゼはアス
コルビン酸のみの、ヨード酢酸類はチオール基を
持つ化合物のみの除去方法であり、これらを併用
することは操作が複雑化し実用化は困難な状況に
あり、又、銅イオンによるアスコルビン酸の処理
は過酸化水素を発生する為はなはだ不都合であつ
た。［発明の目的］本発明の目的は、上述した如き状況に鑑み、安
価でしかも有効な、酸化還元反応を利用した体液
中の成分の定量方法における体液中の還元性妨害
物質の除去方法を提供することにある。［発明の概要］本発明は、酸化還元反応を利用した、体液中の
コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、
グルコース、乳酸脱水素酵素、トランスアミナー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、尿酸、コリンエ
ステラーゼ又はセルロプラスミンを定量する方法
において、試料をヨウ素酸又は／及びその塩で処
理することを特徴とする還元性妨害物質の除去方
法である。即ち、本発明者らは、鋭意研究の結果、ヨウ素
酸又は／及びその塩を用いて試料を処理すること
により、酸化還元反応を利用した体液中の成分の
定量方法自体は妨害されることなく試料中の還元
性妨害物質を有効に除去できることを見出し本発
明を完成するに到つた。本発明において、ヨウ素酸又は／及びその塩と
は、ヨウ素酸、ヨウ素酸アンモニウム、ヨウ素酸
カリウム、ヨウ素酸ナトリウム等を示す。試料とは、体液中の血液、血漿、血清、尿等を
示す。本発明を実施するには、試料に、調製したヨウ
素酸又は／及びその塩の水溶液を添加し放置後に
自体公知の方法であるコレステロールオキシダー
ゼ法の処方によりコレステロールを、グリセロリ
ン酸オキシダーゼ法の処方によりトリグリセライ
ドを、コリンオキシダーゼ法の処方によりリン脂
質、コリンエステラーゼを、リンタングステン酸
法、Fe³⁺−TPTZ法、Cu²⁺−バソクプロイン法
又はウリカーゼ・ペルオキシダーゼ法の処方によ
り尿酸を、グルコースオキシダーゼ法、フエリシ
アン法、INT法又はCu²⁺−ネオクプロイン法の
処方によりトランスアミラーゼ、乳酸脱水素酵
素、クレアチンホスホキナーゼを、ｐ−フエニレ
ンジアミン法の処方によりセルロプラスミンを定
量できる。ヨウ素酸又は／及びその塩は、好まし
くはPH３〜５の水溶液に調製される。つまり、PH
３〜５の条件で試料をヨウ素酸又は／及びその塩
を用いて処理すると測定目的物質を破壊せず還元
性妨害物質を効率良く除去できるのである。さらに、本発明は、尿酸、セルロプラスミン等
の測定目的物質自体が還元性を有している体液中
の成分の定量において極めて有効な方法である。次に実施例により本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。［実施例］実施例１（試薬）試薬Ａ；0.2％のヨウ素酸カリウムを含有する
0.01M−酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液（PH４）試薬Ｂ；0.01M−酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液
（PH４）試薬Ｃ；0.1Mリン酸緩衝液（PH８）100mlにウリ
カーゼ：20U、ペルオキシダーゼ：200U、４
−アミノアンチピリン：10mg、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｍ−トルイジン：250mgを含有する溶液（操作法及び結果）Ｌ−アスコルビン酸が無添加の血清100μl、又
は同血清にＬ−アスコルビン酸を25mg／dlとなる
ように添加した試料100μlにそれぞれ試薬A1ml又
は試薬B1mlを加えて37℃で５分間放置した後、
各々にウリカーゼ・ペルオキシダーゼ法の処方に
よる試薬C2mlを加え37℃で５分間放置した。精
製水を試料として同様の操作を行つたものを対照
に、550nｍの吸光度E_Sを測定し、尿酸標準液
（10mg／dl）を試料として同様の操作により得ら
れた吸光度E_STDから次式により尿酸値を得た。尿酸値（mg／dl）＝（E_S／E_STD）×10 尿酸を測定した結果を表−１(1)に、尿酸測定時
の盲検値及び尿酸標準液（10mg／dl）から得られ
た吸光度を表−１(2)に示す。

【表】

【表】実験例２還元性妨害物質を10mg／dlとなるように添加し
た血清を試料とし、その100μlにそれぞれ所定PH
の0.2％ヨウ素酸カリウム溶液１mlを加えて37℃
で５分間放置後、実験例１で用いた試薬Ｃを用い
て同様の操作により尿酸値を測定し、式−１によ
り還元性妨害物質の影響度を検討した結果を表−
２に示す。式−１影響度＝（A¹−A²）／（A¹−A³）×100 A¹；還元性妨害物質無添加血清中の尿酸値 A²；試料を本発明の方法により処理した場合に
得られた尿酸値 A³；未処理試料中の尿酸値

【表】した。
注^２；pH3以下では尿酸自体が破壊される。
実験例３（発色試液）４−アミノアンチピリン 15mg フエノール 100mg トリトンＸ−100 100mg コレステロールオキシダーゼ 15U コレステロールエステルヒドラーゼ 15U パーオキシダーゼ 100U 上記物質を0.1M−トリス−コハク酸緩衝液
（PH7.0）100mlに溶解し発色試液とした。（操作法及び結果）還元性妨害物質を所定濃度となるように添加し
た血清を試料とし、その100μlにそれぞれ所定PH
の0.2％ヨウ素酸カリウム溶液１mlを加えて37℃
で５分間放置後、上記発色試薬２mlを加え37℃で
５分間放置した。精製水を試料として同様の操作
を行つたものを対照に、505nｍの吸光度E_Sを測
定し、尿酸標準液（200mg／dl）を試料として同
様の操作により得られた吸光度E_STDから次式によ
りコレステロール値C.C.を得た。 C.C.（mg／dl）＝（E_S／E_STD）×200 得られたC.C.を用いて、式−２により還元性妨
害物質の影響度を検討した結果を表−３に示す。式−２、影響度＝（B¹−B²）／（B¹−B³）×100 B¹；還元性妨害物質無添加血清中のC.C. B²；試料を本発明の方法により処理した場合に
得られたC.C. B³；未処理試料中のC.C.

【表】注；ビリルビンの場合は患者血清を使用し
た。
実験例４Ｌ−アスコルビン酸が無添加の血清100μl、又
は同血清にＬ−アスコルビン酸を所定濃度となる
ように添加した試料100μlを試料として、実験例
１と同様の試薬を用いて同様の操作を行い尿酸を
測定した結果を表−４に示す。

【表】実験例１〜４の結果からヨウ素酸カリウムは血
清中の還元性妨害物質であるアスコルビン酸、シ
ステイン、アミノピリン、ビリルビンを分解し、
測定目的物質の尿酸又はコレステロールの測定に
は何等悪影響を与えることがなく、しかも過剰の
ヨウ素酸カリウムを分解しなくとも盲検値の上昇
もない。即ち、尿酸の如く測定目的物質が還元性
である場合においても、簡易な条件で還元性の妨
害物質のみ選択的に除去できることがわかる。実施例１コレステロールの定量（前処理液）ヨウ素酸カリウム 20mg トリトンＸ−100 100mg 上記物質を水100mlに溶解後、塩酸でPH3.0とし
前処理液とした。（発色試液）４−アミノアンチピリン 15mg フエノール 100mg トリトンＸ−100 100mg コレステロールオキシダーゼ 15U コレステロールエステルヒドラーゼ 15U パーオキシダーゼ 100U 上記物質を0.1M−トリス−コハク酸緩衝液
（PH7.0）100mlに溶解し発色試液とした。（試料）血清にアスコルビン酸が所定濃度となるように
添加したものを試料とした。（操作法）試料20μlに前処理液0.5mlを加え37℃で３分間
放置後、発色試液2.5mlを加え37℃に５分間放置
した後、505nｍの吸光度E_Sを測定した。また、
精製水又は標準液（コレステロール濃度；200
mg／dl）を用いて同様の操作を行い各々の吸光度
E_B1及びE_stdを測定し、次式に従つて試料中のコ
レステロール濃度C.C.を得た。 C.C.＝（E_S−E_B1）／（E_std−E_B1）×200 比較例１コレステロールの定量前処理液を精製水とした以外は、実施例１と同
じ試料、試液を用い、同様の操作を行つて試料中
のコレステロール濃度の測定を行つた。実施例２トリグリセライドの定量（前処理液）無水ヨウ素酸 20mg トリトンＸ−100 100mg 上記物質を水100mlに溶解後、塩酸でPH3.0とし
前処理液とした。（発色試液）４−アミノアンチピリン 10mg ｐ−クロルフエノール 100mg トリトンＸ−405 60mg 酢酸マグネシウム 100mg リポプロテインリパーゼ 4000U グリセロールキナーゼ 300U Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ 500U パーオキシダーゼ 300U 5′−アデノシン−３−リン酸 130mg 上記物質を0.05M−トリス・塩酸緩衝液（PH
7.5）100mlに溶解し発色試液とした。（試料）実施例１と同じ試料を用いた。（操作法）試料20μlに前処理液0.5mlを加え37℃で３分間
放置後、発色試液2.5mlを加え37℃に５分間放置
した後、505nｍの吸光度E_Sを測定した。また、
精製水又は標準液（トリグリセライド濃度；200
mg／dl）を用いて同様の操作を行い各々の吸光度
E_B1及びE_stdを測定し、次式に従つて試料中のト
リグリセライド濃度T.C.を得た。 T.C.（E_S−E_B1）／（E_std−E_B1）×200 比較例２トリグリセライドの定量前処理液を精製水とした以外は、実施例２と同
じ試料、試液を用い、同様の操作を行つて試料中
のトリグリセライド濃度の測定を行つた。実施例３グルコースの定量（前処理液）ヨウ素酸ナトリウム 20mg トリトンＸ−100 100mg 上記物質を水100mlに溶解後、塩酸でPH3.0とし
前処理液とした。（発色試液）４−アミノアンチピリン 10mg フエノール 50mg グルコースオキシダーゼ 3000U パーオキシダーゼ 80U 上記物質を0.1M−トリス・塩酸緩衝液（PH
7.2）100mlに溶解し発色試液とした。（試料）実施例１と同じ試料を用いた。（操作法）試料20μlに前処理液0.5mlを加え37℃で３分間
放置後、発色試液2.5mlを加え37℃に10分間放置
した後、505nｍの吸光度E_Sを測定した。また、
精製水又は標準液（グルコース濃度；200mg／dl）
を用いて同様の操作を行い各々の吸光度E_B1及び
E_stdを測定し、次式に従つて試料中のグルコース
濃度G.C.を得た。 G.C.＝（E_s−E_B1）／（E_std−E_B1）×200 比較例３グルコースの定量前処理液を精製水とした以外は、実施例３と同
じ試料、試液を用い、同様の操作を行つて試料中
のグルコース濃度の測定を行つた。実施例４リン脂質の定量（前処理液）ヨウ素酸ナトリウム 20mg トリトンＸ−100 100mg 上記物質を水100mlに溶解後、塩酸でPH3.0とし
前処理液とした。（発色試液）４−アミノアンチピリン 15mg フエノール 50mg トリトンＸ−100 100mg 塩化カルシウム５mg ホスホリパーゼＤ 45U コリンオキシダーゼ 200U パーオキシダーゼ 500U 上記物質を0.05M−トリス・塩酸緩衝液（PH
8.0）100mlに溶解し発色試液とした。（試料）実施例１と同じ試料を用いた。（操作法）試料20μlに前処理液0.5mlを加え37℃で３分間
放置後、発色試液2.5mlを加え37℃に10分間放置
した後、505nｍの吸光度E_Sを測定した。また、
精製水又は標準液（リン脂質濃度；300mg／dl）
を用いて同様の操作を行い各々の吸光度E_B1及び
E_stdを測定し、次式に従つて試料中のリン脂質濃
度P.C.を得た。 P.C.＝（E_S−E_B1）／E_std−E_B1）×300 比較例４リン脂質の定量前処理液を精製水とした以外は、実施例４と同
じ試料、試液を用い、同様の操作を行つて試料中
のリン脂質濃度の測定を行つた。実施例１〜４及び比較例１〜４で得られた結果
を併せて表−５に示す。

【表】表−５の結果からヨウ素酸類は血清中の還元性
妨害物質であるアスコルビン酸を分解し、測定目
的物質の測定には何等悪影響を与えることがな
く、簡易な条件で還元性の妨害物質のみ選択的に
除去できることがわかる。［発明の効果］以上述べた如く、本発明は、酸化還元反応を利
用した体液中の特定成分を定量する方法におい
て、還元性の妨害物質のみを選択的に一挙に除去
できる優れた方法であり斯業に貢献するところ大
なる発明である。

Claims

【特許請求の範囲】

１酸化還元反応を利用した、体液中のコレステ
ロール、トリグリセライド、リン脂質、グリコー
ス、乳酸脱水素酵素、トランスアミナーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼ、尿酸、コリンエステラー
ゼ又はセルロプラスミンを定量する方法におい
て、試料をヨウ素酸又は／及びその塩で処理する
ことを特徴とする還元性妨害物質の除去方法。