JP2646656B2 - 生体液中の成分の測定方法 - Google Patents

生体液中の成分の測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 A.産業上の利用分野 本発明は、血液、尿等の生体液中の成分であって、酸
化酵素の作用によって過酸化水素を生成する成分の測定
方法に関し、特に、生体液中のグルコース、尿酸、ポリ
アミン等の酸化酵素の基質となり過酸化水素を生成する
成分の測定方法に関する。
B.発明の概要 本発明は、生体液をカタラーゼ又は固定化カタラーゼ
で処理して、生体液中に含まれる過酸化水素を分解し、
その後、生体液中に含まれる成分の１つと選択的に反応
して過酸化水素を生成する酸化酵素を作用させ、生成し
た過酸化水素の濃度を測定して、得られた過酸化水素濃
度から測定対象である成分の濃度を決定することによ
り、生体液中の成分の測定を、簡易迅速、かつ精度よく
測定できるようにするものである。
C.従来の技術及び発明が解決しようとする課題 尿、血液、血清、血しょう、リンパ液、唾液、胃液等
の生体液中には、グルコース、尿酸、ポリアミン等の成
分が含まれており、健康の人の場合には、これら成分の
濃度はほぼ一定であるが、ある疾病によってこれらの成
分が変動することが知られており、これらの成分を定量
することは、臨床検査において極めて有効である。
特に、血液や尿等の生体液中には微量のグルコースが
含まれており、健康な人の場合には、生体液中に含まれ
るグルコースは極微量であるが、例えば糖尿病にかかっ
ている場合には、グルコースの量は著しく増加する。そ
のため、生体液中のグルコースを定量することは、糖尿
病の診断等において極めて有効な手段である。
従来は、尿等の生体液中のグルコースを定量するため
に、グルコースの還元力を利用した方法などが用いられ
ていたが、この方法は、煩雑な操作が必要であり、ま
た、特異性が低いために精度が低いという問題点があっ
た。
そのため、近年では、酵素反応により過酸化水素を発
生させ、過酸化水素の量からグルコースの量を求める方
法が用いられるようになった。この方法は、生体液中に
グルコースオキシダーゼを加えて、生体液中に含まれる
グルコースとの酵素反応により発生した過酸化水素を化
学発光法により定量し、予め作成したグルコース濃度と
過酸化水素濃度の関係を示す検量線から、グルコースの
量を求めるものである。
しかしながら、尿等の生体液中には、微量の過酸化水
素が存在するため、尿中に含まれるグルコースが微量の
場合には、過酸化水素の濃度からグルコースを定量する
ことが困難になる。特に、グルコース濃度が10-4mol/
以下の低濃度領域においては、正確な定量が殆ど不可能
であるという問題点がある。
また、血液、尿等の生体液中には少量の尿酸が含まれ
ており、腎機能障害、痛風、糖尿病、悪性腫瘍、子簡、
肺炎初期、腸障害、金属中毒及び高血圧等の場合には血
液中の尿酸が減少し、白血病、重症肝疾患、痛風等の場
合には尿中の尿酸が増加することが知られている。従っ
て、生体液中の尿酸を定量することは、上記の疾病の診
断等において極めて有効な手段であり、臨床医学の分野
では、血液及び尿中の尿酸の定量が行われている。しか
し、従来の方法では、生体液中の尿酸を精度よく、簡易
迅速に測定することが困難であった。
さらに、尿中には微量のポリアミンも含まれており、
健康な人の尿中に含まれるポリアミンは微量であるが、
癌患者の尿中に含まれるポリアミンの量は著しく増加す
る。そのため、尿中のポリアミンを定量することは、癌
の診断等において極めて有効な手段となる。
従来、尿中のポリアミンを定量するために、電気泳動
法、薄層クロマトグラィー法、アミノ酸分析法、ガスク
ロマトグラフィー法高速液体クロマトグラフィー法など
の方法が行われていたが、これらの方法は、いずれも煩
雑な操作が必要であり、かつ測定及び前処理に長時間を
要し、一度に多数の検体を処理できないという問題点が
あった。
そのため、近年においては、脱アセチル酵素（尿中の
アセチルポリアミンをポリアミンに変換する）を使用し
て、簡便な吸光法による測定法が開発されが、この測定
法においても、遠心分離の操作が必要であり、また陽イ
オン交換樹脂に一旦ポリアミンを吸着させた後に、洗浄
して脱着液を流して中和するといった煩雑な操作が必要
であり、さらに発色に時間がかかり、あまり簡便な方法
であるといえない。
従って、本発明は、血液、尿等の生体液中の成分を、
簡易迅速、かつ精度よく測定する方法を提供することを
目的とする。
特に、本発明は、生体液中に含まれる成分であって、
酸化酵素の作用により過酸化水素を生成するグルコー
ス、尿酸、ポリアミン等の成分を精度よく測定する方法
を提供することを目的とする。
D.課題を解決するための手段 上記目的を達成するため、第１の発明によれば、生体
液中の成分を測定する方法は、生体液にカタラーゼを混
合して生体液中に含まれる過酸化水素を分解する工程
と、カタラーゼの過酸化水素分解機能を抑制するカタラ
ーゼ阻害剤を前記カタラーゼと生体液の混合物に添加す
る工程と、前記成分と選択的に反応して過酸化水素を生
成する酸化酵素を前記混合物に作用させる工程と、前記
酸化酵素と前記成分との反応によって生成した過酸化水
素の濃度を測定する工程と、測定された過酸化水素の濃
度から前記成分の濃度を決定する工程とから成る。
また、第２の発明によれば、生体液中の成分を測定す
る方法は、生体液を固定化カタラーゼと接触させて生体
液中に含まれる過酸化水素を分解する工程と、測定成分
と選択的に反応して過酸化水素を生成する酸化酵素を生
体液に作用させる工程と、酸化酵素と測定成分との反応
によって生成した過酸化水素の濃度を測定する工程と、
測定された過酸化水素の濃度から測定成分の濃度を決定
する工程とから成る。
これらの方法は、さらに、生体液中を陰イオン交換樹
脂で処理する工程を含むことができる。
E.作用 生体液をカラターゼ又は固定化カラターゼで処理し
て、生体液中に含まれる過酸化水素を分解し、その後、
生体液中に含まれる成分の１つと選択的に反応して過酸
化水素を生成する酸化酵素を作用させ、生成した過酸化
水素の濃度を測定して、得られた過酸化水素濃度から測
定対象である成分の濃度を決定する、この操作により、
生体液中に含まれている過酸化水素が測定値に影響する
のを防ぎ、生体液中の成分の濃度が低い場合であって
も、精度よく測定できるようにする。また、生体液を陰
イオン交換樹脂で処理することにより、生体液中に含ま
れる代謝生成物質を除去して、過酸化水素の生成を阻害
するのを防ぎ、生体液中の成分の濃度が高い場合にも、
精度よく測定できるようにする。
F.実施例 以下、本発明の一実施例を説明する。
生体液にカタラーゼを混合して生体液中に含まれる過
酸化水素を分解した後、カタラーゼの過酸化水素分解機
能を抑制するカタラーゼ阻害剤をカタラーゼと生体液の
混合物に添加する。その後、測定成分と選択的に反応し
て過酸化水素を生成する酸化酵素を混合物に作用させ、
反応によって生成した過酸化水素の濃度を測定し、測定
された過酸化水素の濃度から測定成分の濃度を決定す
る。
この方法によれば、生体液をカタラーゼで処理して生
体液中に含まれている過酸化水素を除去しているので、
酸化酵素と測定成分との反応により生じた過酸化水素を
精度よく測定することができる。生体液中の成分の量
は、過酸化水素と測定成分の関係を示す検量線から容易
に得ることができる。この処理によって、測定成分の濃
度が10-4mol/以下の低濃度の場合であっても精度よく
測定することができる。
また、生体液を強塩基性陰イオン交換樹脂等の陰イオ
ン交換樹脂で処理することにより、さらに好ましい測定
結果を得ることができる。この処理によって、生体液中
に含まれる代謝生成物質を除去して、代謝生成物質が過
酸化水素の生成を阻害するのを防ぎ、測定成分の濃度が
10-4mol/以上の場合であっても精度よく測定すること
ができる。
また、阻害剤として、アジ化ナトリウム、シアン化水
素、硫化水素、水酸化アンモニウム、３−アミノ−1,2,
4−トリアゾールを使用することができる。これらの物
質を阻害剤として使用した場合に同様の結果が得られる
ことが実験により確認された。本発明の方法は、尿、血
液、血清、血しょう、唾液、胃液、リンパ液等の生体液
に適用することができ、これらの生体液中に含まれる成
分であって、酸化酵素の作用により過酸化水素を生成す
るグルコース、尿酸、ポリアミン等の成分の測定に適用
することができる。グルコースを定量する場合には酸化
酵素としてグルコースオキシダーゼを使用し、尿酸を定
量する場合には酸化酵素としてメリカーゼを使用し、ポ
リアミンを定量する場合には酸化酵素としてプトレッシ
ンオキシダーゼを使用する。ポリアミンを定量する場
合、生体液をアシルポリアミンアミド加水分解酵素等の
脱アセチル化酵素で処理し、生体液中のポリアミンを第
アセチル化することにより、さらに好ましい測定結果を
得ることができる。酸化酵素と測定成分の反応により生
じた過酸化水素を化学発光法により測定する場合、ルミ
ノール等の発光試験薬とフェリシアン化カリウム等の触
媒を、上記の操作により処理された生体液に加え、反応
により生じた光をルミノメータで測定することができ
る。発光試薬と触媒を予めカタラーゼ又は固定化カタラ
ーゼで処理して、これらの水溶液中に含まれる過酸化水
素を分解しておけば、生体液中の成分をさらに精度よく
測定することができる。過酸化水素を測定するために、
レーザー比濁法、ポーラログラフィー、過マンガン酸塩
法、ヨウ素還元滴定等の方法も使用することができる。
これらの方法のいずれを使用しても同様の結果が得られ
ることが実験により確認された。
また、生体液を固定化カタラーゼと接触させて生体液
中に含まれる過酸化水素を分解した後、測定成分と選択
的にっ反応して過酸化水素を生成する酸化酵素を生体液
に作用させ、反応によって生成した過酸化水素の濃度を
測定し、測定された過酸化水素の濃度から測定成分の濃
度を決定することもできる。
この方法では、阻害剤を使用する必要がなく、従っ
て、固定化カタラーゼを予め生成しておけば、生体液中
の成分の測定がより容易になる。
以下、実験例によって本発明の有効性を説明する。
例Ｉ 正常な人の尿中にグルコースが殆ど含まれていないも
のとして、尿にグルコースを加えて、０及び10-5、1
0-4、10-3、10-2、10-1、１及び10mol/のグルコース
を含む尿を調整した。それぞれの尿について、以下の実
験を行った。
尿のpHを測定し、その後、尿1mlに0.1mol/リン酸緩
衝液（pH5.0〜8.0）1mlを加えて、尿のpHを7.0に調整し
た。このように調整した尿1mlに、10,000U/mlカタラー
ゼ溶液0.01mlを加え、30℃の水浴で10分間加温した。
尚、カタラーゼ溶液は、42,500U/mlカタラーゼ（SIGMA
CHEICAL Co.Ltd製−from Bovine Liver−）を0.01mol/
リン酸緩衝液（pH7.0）で希釈して10,000U/mlに調整
したものを使用した。
その後、水浴から取り出して、カタラーゼの過酸化水
素分解能を抑制するために、カタラーゼ阻害剤として、
1mol/アジ化ナトリウム水溶液（国産化学（株）製、
特級）0.01mlを加え、この溶液0.2mlに純水9.8mlを加え
て希釈した。
上記の操作により、０、10-7、10-6、10-5、10-4、10
-3、10-2及び10-1mol/のグルコースを含む尿溶液を調
整した。これらの尿溶液0.1mlに100U/mlグルコースオキ
シダーゼ溶液0.01mlを加えて、酵素反応により過酸化水
素を発生させた。尚、グルコースオキシダーゼ溶液は、
グルコースオキシダーゼ（（株）東洋紡製−from Asper
gillus niger−）を0.01mol/酢酸緩衝液（pH5.1）で
調整したものを使用した。
その後、それぞれの溶液に、発光試薬として２×10-7
mol/のルミノール溶液0.5mlと、触媒して６×10-3mol
/のフェリシアン化カリウム水溶液（東京化成工業
（株）製、特級フェリシアン化カリウム）0.5mlを加
え、反応により生じた発光量をルミノメータ（UPD−800
0、（株）明電舎製）で測定した。尚、ルミノール溶液
は、ルミノール（メルク（MERCK）社製、pro analysi）
を0.2ml/炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液
（pH9.8）で調整したものを使用した。
比較例として、０及び10-7〜10-1mol/のグルコース
と水溶液と、０及び10-7〜10-1mol/のグルコースを含
みカタラーゼで処理していない尿を調整し、それぞれの
溶液について、反応により生じた光の発光量を例Ｉと同
様の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第１図及び第２図に示す。
第２図のように、カタラーゼで処理していない尿の場
合、10-4mol/以下の低濃度領域においては、グルコー
スとグルコースオキシダーゼとの反応によって生じる過
酸化水素に対して、予め尿に含まれている過酸化水素の
割合が大きいため、測定された過酸化水素の発光量が、
実際に反応により生じる過酸化水素による光の発光量よ
りも非常に大きくなっている。即ち、グルコース濃度が
10-4mol/以下の場合にバックグラウンドの影響が大き
く現れて、測定が困難であることがわかる。一方、例Ｉ
の場合、グルコース濃度が10-7mol/程度までバックグ
ラウンドの影響が殆どなく、本発明によれば、このよう
な低濃度であってもグルコースを定量することができる
ことがわかった。
第２図に示すように、例Ｉでは、グルコース濃度が10
-4mol/以上の場合に、グルコース水溶液の場合と比較
して、発光量が少なくなっている。この差異を修正する
ために、以下の実験を行った。
例II 健康な人の尿にグルコースを加えて、０及び２×1
0-6、２×10-5、２×10-4、２×10-3、２×10-2、２×1
0-1及び2mol/のグルコースを含む尿を調整した。それ
ぞれの尿について、以下の実験を行った。
尿2ml強塩基性陰イオン交換樹脂（OH-型）2mlを加え
て撹拌し、その上澄液1mlを採取した。尚、強塩基性陰
イオン交換樹脂は、AG1−X4（Cl-型、BIO−RAD研究所
製、、100〜200メッシュ）を1N水酸化ナトリウム水溶液
でOH-型に変換したものを使用した。
この上澄液に、0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）1ml
を加えてpH7.0に調整した。この溶液に、例Ｉで調整し
た10,000U/mlのカタラーゼ0.01mlを加えて、30℃の水浴
で10分間加温した。水浴から取り出した後、カタラーゼ
の過酸化水素分解能を抑制するために、カタラーゼ阻害
剤として、1mol/のアジ化ナトリウム水溶液0.01mlを
加え、この溶液0.2mlに純水0.8mlを加えて希釈した。
上記の操作により、０、10-7、10-6、10-5、10-4、10
-3、10-2及び10-1mol/のグルコースを含む尿溶液を調
整した。これらの尿溶液の各々に、例Ｉで調整した100U
/mlのグルコースオキシダーゼ溶液0.01mlを加えて、過
酸化水素を発生させた。その後、これらの溶液に、例Ｉ
で調整した２×10-7mol/のルミノール溶液0.5mlと６
×10-3mol/のフェリシアン化カリウム水溶液0.5mlを
加え、反応により生じた光の発光量をルミノメータで測
定した。
比較例として、０及び10-7〜10-1mol/のグルコース
水溶液と、０及び10-7〜10-1mol/のグルコースを含み
カタラーゼで処理していない尿を調整し、それぞれの溶
液について、反応により生じた光の発光量を例IIと同様
の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第３図及び第４図に示す。
第４図に示すように、例IIの場合の発光量は、グルコ
ース濃度が10-4mol/以上であっても、グルコース水溶
液の場合に比べて殆ど相違なく、本発明によれば、様々
な濃度のグルコースを精度よく定量することができる。
例III 水不溶性担体を多官能性試薬と反応させて担体を官能
化させ、これにカタラーゼを固定化させて、固定化カタ
ラーゼを生成した。水不溶性担体としてアミノプロピル
−CPG（多孔性ガラスの一種であり、修飾型）（孔径156
Å、120〜200mesh、ELECTRO−NUCLEONICS INC製）を使
用し、多官能性試薬としてグルタルアルデヒドを使用し
た。
具体的に説明すると、アミノプロピル−CPG1gをグル
タルアルデヒドの2.5％溶液（0.01％リン酸緩衝液）25m
lと室温で２時間反応させてアルデヒドCPGを生成し、こ
れを100,000U/mlのカタラーゼ溶液（0.01％リン酸緩衝
液）2mlと室温で３時間反応させて、固定化カタラーゼ
を生成した。
この反応の反応式を以下に示す。
次に、健康な人の尿にグルコースを加えて、０、２×
10-6、２×10-5、２×10-4、２×10-3、２×10-2、２×
10-1及び2mol/のグルコースを含む尿を調整した。そ
れぞれの尿について、以下の実験を行った。
尿のpHを測定し、その後、尿1mlに0.1mol/リン酸緩
衝液（pH5.0〜8.0）1mlを加えて、尿のpHを7.0に調節し
た。このように調整した尿2mlを上記の固定化カタラー
ゼを充填したカラムに通し、濾液のうち最初の0.5mlを
捨てて、その後の濾液を収集し、この濾液0.2mlに純水
9,8mlを加えて希釈した。
上記の操作によって、０、10-7、10-6、10-5、10-4、
10-3、10-2及び10-1mol/のグルコースを含む溶液を調
整した。これらの各々の尿溶液の0.1mlに、例Ｉで調整
した100U/mlのグルコースオキシダーゼ溶液0.01mlを加
えて過酸化水素を発生させた。その後、これらの溶液
に、例Ｉで調整した２×10-7mol/のルミノール溶液0.
5/mlと、６×10-3mol/のフェリシアン化カリウム水溶
液0.5/mlを加え、反応により生じた光の発光量をルミノ
メータで測定した。
比較例として、０及び10-7〜10-1mol/のグルコース
水溶液と、０及び10-7〜10-1mol/のグルコースを含み
固定化カタラーゼで処理していない尿を調整し、それぞ
れの溶液について、反応により生じた光の発光量を例II
Iと同様の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第５図及び第６図に示す。
第６図に示すように、例IIIでは、例Ｉと同様の結果
が得られた。この方法によれば、予め固定化カタラーゼ
を充填したカラムを作成しておけば、カタラーゼを阻害
剤を使用する必要がないので、例Ｉに比べて容易に操作
することができる。
例Ｉと同様に、グルコース濃度が10-4mol/以上の場
合に、グルコース水溶液に比べて発光量が少なくなって
いるが、この差異は以下に示す例VIの方法によって修正
することができる。
例IV 健康な人の尿にグルコースを加えて、０、２×10-6、
２×10-5、２×1-4、２×10-3、２×10-2、２×10-1及
び2mol/のグルコースを含む尿を調整した。それぞれ
の尿について、以下の実験を行った。
尿2mlに、例IIと同様の強塩基性陰イオン交換樹脂2ml
を加えて撹拌し、その上澄液1mlを採取した。この上澄
液に0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）1mlを加えてpH7.0
に調整した。このように調整した溶液を、例IIIで生成
した固定化カタラーゼを充填したカラムに通し、濾液の
うち最初の0.5mlを捨てて、その後の濾液を収集し、こ
の濾液0.2mlに純水0.8mlを加えて希釈した。
上記の操作により、０、10-7、10-6、10-5、10-4、10
-3、10-2及び10-1mol/のグルコースを含む尿溶液を調
整した。これらの各々の尿溶液0.1mlに、例Ｉで調整し
た100U/mlグルコースオキシダーゼ溶液0.01mlを加えて
過酸化水素を発生させた。その後、これらの溶液に、例
Ｉで調整した２×10-7mol/ルミノール溶液0.5mlと、
６×10-3mol/フェリシアン化カリウム水溶液0.5mlを
加え、反応により生じた光の発光量をルミノメータで測
定した。
比較例として、０及び10-7〜10-1mol/のグルコース
水溶液と、０及び10-7〜10-1mol/のグルコースを含み
固定化カタラーゼで処理していない尿を調整し、それぞ
れの溶液について、反応により生じた光の発光量を例IV
と同様の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第７図及び第８図に示す。
第８図のように、例IVでは例IIと同様の結果が得られ
た。この方法によれば、カタラーゼ阻害剤を使用しなく
てもよく、様々な濃度でグルコースを精度よく測定する
ことができる。
例Ｖ 5.9mg/dlの尿酸を蔵えた尿溶液を調整し、その一部を
1/4、2/4、3/4倍に希釈し、４つの尿溶液を調整した。
それぞれの溶液に0.1mol/リン酸緩衝液を等量ずつ
加え、 pH7.0に調整した溶液をつくった。これらの溶液を1mlず
つ取り出して、それぞれに例Ｉで調整した10,000U/mlカ
タラーゼ溶液0.01mlをピペットで添加し、30℃で10分間
反応させ、溶液中の過酸化水素を分解した。その後、カ
タラーゼの過酸化水分解能を抑制するために、各々の溶
液に、カタラーゼ阻害剤としつ1mol/アジ化ナトリウ
ム溶液0.01mlずつをピペットで添加した。これらの溶液
を蒸留水で1/100倍に希釈した後、1mlずつを取り出し、
それぞれにウリカーゼ溶液0.01mlをピペットで添加し、
30℃で10分間反応させ、過酸化水素を発生させた。この
反応の反応式を以下に示す。
尚、ウリカーゼ溶液は、ウリカーゼ（ベーリンガーマン
ハイム社製、50％グリセリン、sp.活性4.5U/mg（25
％））を0.13mol/炭酸ナトリウム溶液（pH10.2）に溶
解することによって調整した。
反応後、これらの溶液0.1mlずつを取り出し、それぞ
れの溶液に、例Ｉで調整した２×10-7mol/ルミノール
溶液0.5mlと６×10-3mol/フェリシアン化カリウム溶
液0.5mlを加え、反応により生じた光の発光量をルミノ
メータ（UPD−8000）で測定した。
比較例として、５、10及び14mg/dlの尿酸水溶液を調
整し、それぞれの溶液について、反応によって生じる光
の発光量を例Ｖと同様の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第９図乃至第11図に示す。
第11図い示すように、例Ｖの場合、発光量は尿酸の濃
度に比例し、この結果は第10図に示す尿酸水溶液の結果
と一致することがわかる。従って、本発明の方法によれ
ば、尿酸の濃度が比較的低い場合であっても精度よく測
定できることがわかった。
例VI 5.9mg/dlの尿酸を加えた尿溶液を調整し、その一部を
尿酸濃度が1/4、2/4、3/4倍になるように希釈し、４つ
の尿溶液を調整した。
それぞれの溶液に0.1/mol/リン酸緩衝液を等量ずつ
加え、pH7.0に調整した溶液をつくった。これらの溶液
を2mlずつ取り出し、それぞれ、例IIIで生成した固定化
カタラーゼを充填したカラムに通した。これらの溶液を
蒸留水で100倍に希釈した後、1mlずつを取り出し、それ
ぞれに例Ｖで調整したウリカーゼ溶液0.01mlをピペット
で添加し、30℃で10分間反応させ、過酸化水素を発生さ
せた。反応後、これらの溶液0.1mlずつを取り出し、そ
れぞれの溶液に、例Ｉで調整した２×10-7mol/ルミノ
ール溶液0.5mlと６×10-3mol/フェリシアン化カリウ
ム溶液0.5mlを加え、反応により生じた光の発光量をル
ミノメータで測定した。
比較例として、５、10及び14mg/dlの尿酸水溶液を調
整し、それぞれの溶液について、反応によって生じる光
の発光量を例VIと同様の方法で測定した。
これらの工程及び結果を第12図乃至第14図に示す。
第12図及び第13図に示すように、例VIの場合も、例Ｖ
と同様の結果が得られた。
例VII 健康な人の尿にポリアミンを加えて、０、２×10-7、
２×10-6、２×10-5、２×10-4、２×10-3及び２×10-2
mol/のポリアミンを含む尿を調整し、それぞれの尿に
ついて、以下の実験を行った。
尿2mlに、例IIと同様の強塩基性陰イオン交換樹脂2ml
を加えて撹拌し、その上澄液1mlを採取した。この上澄
液に0.4mol/トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）（トリス：
トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）1mlと脱
アセチル酵素溶液1mlを加えて撹拌し、37℃の水浴で１
時間加温した。脱アセチル酵素溶液は、脱アセチル酵素
（アシルポリアミンアミド加水分解酵素、徳山曹達
（株）製）を0.1mol/リン酸緩衝液（pH7.2）に溶解し
たものを使用した。
その後、水浴から取り出した溶液3mlに、0.5mol/リ
ン酸緩衝液（pH5.9）1mlを加えてpH7.0に調整した。こ
の溶液に、例Ｉで調整した10,000U/mlのカタラーゼ溶液
0.01mlを加え、30℃の水浴で10分間加温した。
水浴から取り出した後、カタラーゼの過酸化水素分解
能を抑制するために、カタラーゼ阻害剤として、例Ｉと
同様の1mol/アジ化ナトリウム水溶液0.01mlを加え、
この溶液0.4mlに純水0.6mlを加えて希釈した。
上記の操作によって０、10-8、10-7、10-6、10-5、10
-4及び10-3mol/のポリアミンを含む尿溶液を調整し
た。これらの各々の尿溶液0.1mlに10U/mlのプトレッシ
ンオキシダーゼ溶液0.02mlを加えて、過酸化水素を発生
させた。プトレッシンオキシダーゼ溶液は、プトレッシ
ンオキシダーゼ（徳山曹達（株）製）を0.1mol/トリ
ス−塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解したものを使用した。
その後、この溶液に、例Ｉで調整した２×10-7mol/ル
ミノール溶液0.5mlと６×10-3mol/のフェリシアン化
カリウム水溶液0.5mlを加え、反応により生じた光の発
光量をルミノメータで測定した。
比較例として、０及び10-8〜10-3mol/のポリアミン
水溶液と、０及び10-8〜10-3mol/のポリアミンを含み
カタラーゼ、脱アセチル化酵素及び強塩基性イオン交換
樹脂で処理していない尿を調整し、それぞれの溶液につ
いて、反応により生じた光の発光量を例VIIと同様の方
法で測定した。
これらの工程及び結果を第15図及び第16図に示す。
第16図に示すように、カタラーゼ等で処理していない
尿溶液の場合、10-5mol/以下の低濃度領域において
は、ポリアミンとプトレッシンオキシダーゼとの反応に
よって生じる過酸化水素に対して、予め尿に含まれてい
る過酸化水素の割合が大きいため、測定された過酸化水
素の発光量が、実際に反応により生じる過酸化水素によ
る光の発光量よりも非常に大きくなっている。即ち、ポ
リアミン濃度が10-5mol/以下の場合にバックグラウン
ドの影響が大きく現れて、測定が困難であることがわか
る。一方、例VIIの場合、ポリアミン濃度が10-8mol/
程度までバックグラウンドの影響が殆どなく、本発明に
よれば、このような低濃度であってもポリアミンを定量
することができることがわかった。
例VIII 健康な人の尿にポリアミンを加えて、０、2.5×1
0-7、2.5×10-6、2.5×10-5、2.5×10-4、2.5×10-3及
び2.5×10-2mol/のポリアミンを含む尿を調整し、そ
れぞれの尿について、以下の実験を行った。
尿1mlに、例VIIと同様の0.4mol/トリス−塩酸緩衝
液1mlと脱アセチル酵素溶液0.1mlを加えて撹拌し、37℃
の水浴で１時間加温した。このようにして得られた脱ア
セチル化した尿3mlに、例IIと同様の強塩基性陰イオン
交換樹脂2mlを加えてえ撹拌し、その上澄液を採取し
た。この上澄液に、0.5mol/リン酸緩衝液（pH5.9）1m
lを加えてpH7.0にい調整した。この溶液を例IIIで生成
した固定化カタラーゼを充填したカラムに通し、濾液の
うち最初の1mlを捨てて、その後の濾液を収集し、この
濾液0.4mlに純水0.6mlを加えて希釈した。
上記の操作によって０、10-8、10-7、10-6、10-5、10
-4及び10-3mol/のポリアミンを含む尿溶液を調整し
た。これらの各々の尿溶液0.1mlに、例VIIIと同様の10U
/mlのプトレッシンオキシダーゼ溶液0.02mlを加えて、
過酸化水素を発生させた。その後、これらの溶液に、例
Ｉで調整した２×10-7mol/ルミノール溶液0.5mlと６
×10-3mol/フェリシアン化カリウム水溶液0.5mlを加
え、反応により生じた光の発光量をルミノメータで測定
した。
比較例として、０及び10-8〜10-3mol/のポリアミン
水溶液と、０及ひ10-8〜10-3mol/のポリアミンを含み
カタラーゼ、脱アセチル化酵素及び強塩基性陰イオン交
換樹脂で処理していない尿を調整し、それぞれの溶液に
ついて、反応により生じた光の発光量を例VIIIと同様の
方法で測定した。
これらの工程及び結果を第17図及び18図に示す。
第18図に示すように、例VIIIの場合も例VIIと同様の
結果が得られた。この方法は、カタラーゼ阻害剤を使用
する必要がない点で、例VII場合よりも簡易に測定する
ことができる。
G.発明の効果 本発明は、以上のように構成したので、以下のような
効果を奏する。
請求項１項の方法によれば、生体液中のカタラーゼを
添加することにより、生体液中に含まれる過酸化水素を
分解しているので、酸化酵素の作用により生成した過酸
化水素の濃度から生体液中の成分を精度よく定量するこ
とができ、特に、生体液中の成分の低濃度領域における
測定精度を従来よりも、著しく向上させることができ
る。また、発光試薬中の過酸化水素を分解した後に、カ
タラーゼの過酸化水素分解能を抑制するカタラーゼ阻害
剤を添加しているので、酸化酵素の作用により生成する
過酸化水素の濃度に影響を与えることがない。さらに、
この方法は、簡易迅速な操作によって行うことができる
ので、臨床検査等において、短時間に多数の検体を測定
することが出来る。
請求項２項の方法によれば、生体液中の過酸化水素の
分解に、固定化カタラーゼを使用しているのでカタラー
ゼの過酸化水素分解能を抑制するためのカタラーゼ阻害
剤を添加する操作を行う必要がなく、請求項１項の場合
と同様な効果が得られる。
請求項３項の方法によれば、生体液を陰イオン交換樹
脂で処理しているので、生体液中に含まれる代謝生成物
質を除去して、代謝生成物質が過酸化水素の生成を阻害
するのを防ぎ、生体液中の成分が高濃度の場合であって
も、精度よく測定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
第１図は例Ｉの工程図、第２図は例Ｉ及びその比較例に
おける発光量とグルコース濃度の関係を示す図、第３図
は例IIの工程図、第４図は例11及びその比較例における
発光量とグルコース濃度の関係を示す図、第５図は例II
Iの工程図、第６図は例III及びその比較例における発光
量とグルコース濃度の関係を示す図、第７図は例IVの工
程図、第８図は例IVおよびその比較例における発光量と
グルコース濃度の関係を示す図、第９図は例Ｖの工程
図、第10図は尿酸水溶液中の尿酸濃度に対する発光量の
関係を示す図、第11図は例Ｖにおける尿酸濃度に対する
発光量の関係を示す図、第12図は例VIの工程図、第13図
は尿酸水溶液中の尿酸濃度に対する発光量の関係を示す
図、第14図は例VIにおける尿酸濃度に対する発光量の関
係を示す図、第15図は例VIIの工程図、第16図は例VII及
びその比較例における発光量とポリアミン濃度の関係を
示す図、第17図は例VIIIの工程図、第18図は例VIII及び
その比較例における発光量とポリアミン濃度の関係を示
す図である。
フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願昭62−125025 (32)優先日 昭62(1987)５月23日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−125689 (32)優先日 昭62(1987)５月25日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−220399 (32)優先日 昭62(1987)９月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−220400 (32)優先日 昭62(1987)９月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体液中の成分であって、酸化酵素の作用
    により過酸化水素を生成する成分を測定する方法におい
    て、生体液にカタラーゼを混合して生体液中に含まれる
    過酸化水素を分解する工程と、カタラーゼの過酸化水素
    分解機能を抑制するカタラーゼ阻害剤を前記カタラーゼ
    と生体液の混合物に添加する工程と、前記成分と選択的
    に反応して過酸化水素を生成する酸化酵素を前記混合物
    に作用させる工程と、前記酸化酵素と前記成分との反応
    によって生成した過酸化水素の濃度を測定する工程と、
    測定された過酸化水素の濃度から前記成分の濃度を決定
    する工程とから成る、生体液中の成分の測定方法。
  2. 【請求項２】生体液中の成分であって、酸化酵素の作用
    により過酸化水素を生成する成分を測定する方法におい
    て、生体液を固定化カタラーゼと接触させて生体液中に
    含まれる過酸化水素を分解する工程と、前記成分と選択
    的に反応して過酸化水素を生成する酸化酵素を前記生体
    液に作用させる工程と、前記酸化酵素と前記成分との反
    応によって生成した過酸化水素の濃度を測定する工程
    と、測定された過酸化水素の濃度から前記成分の濃度を
    決定する工程とから成る、生体液中の成分の測定方法。
  3. 【請求項３】前記生体液を陰イオン交換樹脂で処理する
    工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２項のいず
    れかに記載の生体液中の成分の測定方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE151466T1 (de) * 1992-01-31 1997-04-15 Actimed Lab Inc Hemmung der katalaseaktivitaet in biologischen fluessigkeiten
JP3279362B2 (ja) * 1992-10-05 2002-04-30 井上 聰一 糖尿病判定方法及び糖尿病判定装置
JP5448317B2 (ja) * 2007-09-12 2014-03-19 デンカ生研株式会社 アジ化物によるカタラーゼの阻害に起因する測定誤差の低減方法
KR101822417B1 (ko) 2017-06-14 2018-01-29 주식회사 청도제약 인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL134608C (ja) * 1963-06-17
DE2526558C2 (de) * 1975-06-13 1984-11-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur enzymatischen Analyse
US4172765A (en) * 1977-09-14 1979-10-30 Technicon Instruments Corporation Method for the quantitative determination of alpha-amylase
JPS5460996A (en) * 1977-10-22 1979-05-16 Mitsubishi Chem Ind Method of measuring amount of sugar
US4242446A (en) * 1978-07-26 1980-12-30 Coulter Electronics, Inc. Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method
DE2907628C2 (de) * 1979-02-27 1981-02-05 C.A. Greiner Und Soehne Gmbh & Co Kg, 7440 Nuertingen Proberöhrchen für die Untersuchung von Proben im klinischen Bereich, insbesondere von Urinproben
DE2914487A1 (de) * 1979-04-10 1980-10-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und mittel zur entfernung von ascorbinsaeure aus waessrigen fluessigkeiten
JPS5783287A (en) * 1980-11-14 1982-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Elimination of hydrogen peroxide
JPS5948097A (ja) * 1982-09-14 1984-03-19 Amano Pharmaceut Co Ltd ポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法
JPS60251899A (ja) * 1984-05-29 1985-12-12 Kyoto Daiichi Kagaku:Kk 総ポリアミンの定量方法

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