JPS5948097A - ポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酸素を用いて、２種以上のポリアミン類の混
合物中における各ポリアミンの濃度を分別定量する方法
に関するものである。さらに詳しくいえば、本発明は、
動物、植物、細菌などの細胞中に広く存在することが知
られているポリアミンやそのアセチル化物に、特定の酸
化酵素を作用させ、発生する過酸化水素の量を測定する
ことにより、それぞれの濃度を分別定量する方法に関す
るものである。

ポリアミン例えばプトレッシンＨ２Ｎ（ＯＨ２）４ＮＨ
２、スペルミジンＨ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＯＨ２）３
ＮＨ２、スペルミンＨ２Ｎ（ＯＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）
＋ＮＨ（ＯＨ２）３ＮＨ２などは、動物をはじめ、植物
、細菌などあらゆる生命細胞の構成成分として生物界に
広く分布し、細胞の分裂、増殖及びその生化学的背景を
なす核酸の代謝に関与している物質として知られている
。

ところで、近年ガン患者の犀中ポリアミン量が正常人よ
りも多いことが報告され〔［キャンザー、リザーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｏｓｅａｒｃｈ　）　Ｊ、第３１巻、第
１５５５〜１５５８ベージ〕、多くの研究者により尿、
血液、す／パ液などいわゆる体液中のポリアミン量とガ
ン疾患との関係についての研究がなされてきたが、その
後ンユヨウ組織の増殖に際してもポリアミン代謝の高進
化が認められ、ポリアミン排泄量の変動がガン患者の病
状の推移を反映することが明らか（Ｃなり、臨床的にガ
ンの診断及びガンの治癒状態を知る上で、ポリアミンの
定量が重要となってきた。

従来、ポリアミ／の定量法としては、ガスクロマトグラ
フィーによる方法〔「クリニカルケミスト　リ　（Ｃ１
１ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）　　Ｊ　　
、　第１９巻、　第９０４〜９０７ページ〕、アミノ酸
分析１１１ｃよる方法〔「フエブス・レターズ（ＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　Ｊ、第４６巻、第３０５〜３
０７ページ］、高速液体クロマトグラフィーによる方法
〔「ジャーナル・オプ・クロマトグラフィー（Ｊ、　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）　Ｊ、第１４５巻、第
１４１〜１４６ページ〕などの化学的方法が主体となっ
ていたが、これらの化学的方法は迅速性に欠ける上は、
酸などによる加水分解後、さらにポリアミン類を測定可
能な誘導体に変換する前処理を必要とするため操作がは
ん雑になるなど実用上多くの不便を有していた。

他方、酵素の特異的作用を利用して、遊離へポリアミン
を定量する方法（特公昭５（ｉ−３６９１８号公報）、
スペルミジンとスペルミンを定量する方法（特公昭５６
−２１３９８号公報）、スペルミン、スペルミジン及び
プトレッシンを定量する方法（特開昭５０−９４９２号
公報）などが提案されている。これらの酵素的方法は、
化学的方法のように特に誘導体にするだめの前処理を施
す必要はなく、また迅速性の点でもかなシ改善された好
ましい方法であるが、これらの方法はいずれも遊離ポリ
アミンとしての定量を目的としたものであるため、アセ
チルポリアミンが混在した場合には塩酸などによる加水
分解や酵素による脱アセチル化を施し、これらを遊離ポ
リアミンに変換させなければならないので操作がはん雑
となる上に、アセデルポリアミンを直接に定量すること
ができない。

しかるに、最近の研究によれば　ガ／の種類やガン患者
の治療状態を把握するには、ポリアミンの定量のみなら
ず、スペルミン、スペルミジン、プトレッシンの比率、
アセチルスペルミン、アセチルスペルミジン、アセチル
プトレッシンの比率、あるいはＮ１−アセチルスペルミ
ン／とＮ８−アセチルスペルミジンの比率などが必要で
あることが明らかになりつつあシ、遊離ポリアミンと同
時に一アセチルポリアミンの濃度の定量を行いうる方法
の出現がこの分野１・′こおいて広く要望されるように
なってきた。

本発明者らは、このような事情に鑑み、多種類の複雑な
組成のアセチルポリアミン類と遊離ポリアミン類の混合
系において、個にの成分を迅速、簡便かつ正確に定量し
うる方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、これらの
混合系に特定の酵素の組合せを作用させ、それぞれに対
応して生成する過酸化水素の濃度を測定することにより
、その目的を達成しうることを見出し、この知見に基づ
いて本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、アセチルポリアミン１種又は２種
以上の混合系、あるいはアセチルポリアミン少なくとも
１種と遊離ポリアミン少なくとも１種との混合系に、特
定の基質に対する酸化酵素を作用させ、生成した過酸化
水素の濃度を測定することにより、アセチルポリアミン
及び遊離ポリアミンの個々の濃度を分別定量する方法を
提供するものである。

本発明方法において定量しつるアセチルポリアミンとし
ては、アセチルブトｘンン、アセチルスペルミン　Ｈｌ
−アセチルスペルミジン及ヒＮ８−アセチルスペルミジ
ンを挙げることができ、まだ遊離ポリアミンとしては、
スペルミン、スペルミジン及びプトレッシンを挙げるこ
とができる。

次に、本発明方法に用いられる酵素としては、ポリアミ
ンオキシダーゼＡＴ−１及びポリアミンオキシダーゼＰ
Ｃ−３のようなポリアミン酸化酵素、プトレッシンオキ
シダーゼのようなプトレッノン酸化酵素、アセチルプト
レッ／／オキ／ダニセノようなアセチルプトレッシン酸
化酵素を挙げることができる。上記のポリアミンオキシ
ダーゼ１ｒＴ−１は、例えば特開昭５６−９２７８８号
公報に記載されている公知の酵素で以下に示す理化学的
性質を有するものである。

（１）作　　用ニスペルミジンに作用して、１モルのス
ペルミジンより１モルのブト レツンン、１モルの３−　、”ミノプ ロビオンアルテヒドおよび１モル の過酸化水素を生成１−、、スペルミ ンに作用して、１モルのスペルミ ンヨリ、１モルのプトレッシン、 ２モルの３−アミノプロピオンア ルデヒドおよび２モルの過酸化水 素を生成する。

（２）　　基１％異性；スペルミジンとスペルミンを２
゜１の比率で酸化するが、他のアミ ンに対しては、はとんど作用しな い。

（３）至適ｐＨ：６．５付近。

（４）　　ｐＨ安定性；３０℃で３０分処理した場合、
ｐＨ５，２〜６．５において、９０係以上 の残存活性を有する。

（５）至適温度；　ｐＨ６，５においては、４５℃付近
、ｐＨ７，０においては５０℃付近に ある。

（６）温度安定性：　ｐＨ６，５において、３０℃１０
分処理で９０ｑｂ以上の残存活性を示 す。

（７）吸収スペクトルにおいて３７５ｎｍおよび４６０
ｎｍ付近に極大吸収を示すことよりフラピン酵素である
こと。

（８）阻害剤、金属イオンの影響； 金属イオンの銀イオンおよび水銀 イオンで強く阻害される。

（９）等電点；５．０〜５．２５ ０１　分　子　量：　１３０，０００　（セフ　７デツ
クスＧ−２００のゲル濾過法） ０ρ　サブユニットの分子量； ６５．０００　（ＳＤＳディスク電気泳動法） ０埠結晶形：釧　状。

次に上記のポリアミンオキシダーゼＰＣ−３は、例えば
特開昭５６−９２７８９号公報に記載されている公知の
酵素で以下に示す理化学的性質を有するものである。

（１）作　　用；スペルミジンに作用して、１モルのス
ペルミジンよ９１モルのブト レッシン、１モルの３−アミノブ ロピオンアルデヒド及び１モルの 過酸化水素を生成し、スペルミン に作用して１モルのスペルミンよ りエモルのプトレッシン、２モル の３−アミンプロピオンアルテヒ ド及び２分子の過酸化水素を生成 する。

（２）基質特異性；スペルミジンとスペルミンに対シて
作用するが、他のアミンに対し ては作用しない。

（３）至適ｐＨ：　ｐＨ５，０付近でスペルミジンに対
する作用が至適であり、ｐＨ９，５ 付近でスペルミンに対する作用が 至適である。

（４）　　ｐＨ安定性；３０℃で１０分処理した場合、
ｐＨ３，０〜ｐＨ５，０においてスペルミジンおよびス
ペルミンのいずれ を基質とした場合でも８５係以上 の残存活性を示す。

（５）至適温度：ｐＨ６，５においては、スペルミジン
を基質とした場合、２５℃付近に あり、スペルミンを基質とした場 合には３５℃付近にるる。そして ｐＨ７，０においては、スペルミン を基質とした場合４０℃付近にあ る。

（６）温度安定性；スペルミン基質でｐＨ４，０におい
て、３５℃、１０分処理で９５係 ては、２０℃、ｉｏ分処理で８５ ％以上活性が残存。

（７）吸収スペクトルにおいて３７５ｎｍ及び４５０ｎ
ｍ付近に極大吸収を示すことよりフラビン蛋白である。

補酵素としてＦＡＤが酵素１分子−当り２分子存在する
。

（８）阻害剤、金属イオ／の影響； スペルミンを基質とした場合、 ＰＣＭＢ及びモノヨード酢酸、銀イ オン・水銀イオン等で阻害され、 スペルミ）７を基質とした場合に は銀イオン、アルミニウムイオン で阻害される。

（９）等電点；５．４〜５．６ ０１　　分　子量；　１Ｇ０．０００　（−１＝　７７
デソクスＧ−２００のゲル濾過法） θｐ　サブユニットの分子量； ８０．０００　（ＳＤＳディスク電気泳動法） θ■結晶形；針状。

さらに、上記のプトレッシンオキシダーゼは、例えば［
アグリ力ルチュアル、バイオロジカル、ケミストリー（
Ａｇｒｉｃａｌ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｏｈｅｍ、）　ｊ
、第３０巻、第１２０２ページに記載されている公知の
酵素で、以下に示す理化学的性質を有するものである。

（１）作　　用；プトレッシンに作用して、１モルのプ
トレッシンより１モルのＮ　− アミノブチルアルデヒドと１モル の過酸化水素、１モルのアンモニー アを生成する。スペルミジンに作 用して、１モルのスペルミジンよ ９１モルのγ−アミノブチルアル デヒドと１モルの過酸化水素を生 成する。

（２）基質特異性；スペルミジン、プトレッシンに作用
スるが、スペルミン、アセチル スペルミン、アセチルスペルミジ ン、アセチルプトレッシンにハ作 用しない。

（３）　至適ｐＨ；８．５付近。

（４）　　ｐＨ安定性；４０℃で１０分処理した場合、
ｐＨ５，５〜ｐＨ１０，０において９０係以上の残存活
性を示す。

（５）至適温度；５５℃付近。

（６）温度安定性；ｐＨ７，０において４５℃、１０分
処理で９０係以上活性が残存。

（７）吸収スペクトルにおいて３８０ｎｍ及び４６０ｎ
ｍイ」近に極大吸収を示す。ＦＡＤを補欠分子族として
持つ。

（８）等電点：４．１ （９）分子量；約９０，０００ 最後に、アセチルプトレッシンオキ７ダーゼは、例エバ
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒ
ｙｚａｅ　）　ＩＡＭ　２６８２によシ生産される文献
未載の新規な酵素であり、以下に示す理化学的性質を有
するものである。

（１）　作　　　用；アセチルプトレッシンに作用して
、その１モルより１モルの４−アセ チルアミノブタナールと１モルの 過酸化水素を生成する。

（２）基質特異性；アセチルプトレッシンに対しては作
用スル力、スペルミン、スペル ミジン、プトレッシン、Ｎ−アセ チルスペルミン　Ｎ１−アセチルス ペルミジン　Ｎ８−アセチルスペル ミジンに対しては作用しない。

（３）至適ｐＨ；８付近。

（４）　　ｐＨ安定性；ｐＨ６，０〜８．５において、
３７℃で３０分間加熱処理しても８５係 以上の残存活性を有する。

（５）至適温度；ｐＨ７，５において５０℃付近。

（６）温度安定性：ｐＨ７，０において４０℃、３０分
処理で９０係残存活性がある。

（７）本酵素は銅を含有する。

（８）等電点；５．０付近。

これらの各酵素の各基質に対する作用機序を反応式に示
すと次のようになる。

式１；ボリアミンオキンターゼＡＴ−１による遊離型ポ
リアミンの分解反応 Ｈ２Ｎ（ＣＨ，、）３ＮＨ（ＯＨ２）４ＮＨ（ＣＨ，、
）３ＮＨ２スペルミン Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２スペルミジ
ン Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ４ プトレッシン 式Ｉ＋　、ポリアミンオキシダーゼＡＴＩによるアセチ
ルポリアミンの分解反応 ａＨ３ｃｏｎＮ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）、ＮＨ（Ｃ
！Ｈ２）３ＮＨ２アセチルスペルミン ＣＨ３Ｃ０ＨＮ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４Ｎ■■２
Ｎ１−アセチルスペルミジン Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ２ プトレッシン 式■；ポリアミンオキシダーゼＰＣ−３による遊離ポリ
アミンの分解反応 Ｈ２Ｎ（ＯＨ２）−３＋ｏｒ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＯＨ２
）３ＮＨ２スペルミン Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２スペルミジ
ン Ｈ２Ｎ（Ｃ’Ｈ２）４ＮＨ２〜 プトレッシン 式■；ポリアミンオキンダーゼｐｃ−３によるアセチル
ポリアミンの分解反応 Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３Ｈ
２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３ アセチルプトレツシン 式■：プトレツシンオキシダーゼによる遊離ポリアミン
の分解反応 Ｈ２Ｎ（ＯＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２スペルミジ
ン Ｈ２Ｎ（ＯＨ２）３ＮＨ２ ■、３−ジアミノプロパン 及び　　Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ２ Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＣＨＯ ４−アミノブタナール 式Ｖｌ　、アセチルシトレノ７ンオキシダーゼによるア
セチルポリアミンの分解反応 ＣＨ３Ｃ０ＨＮ（ＣＨ２）４ＮＨ２ アセチルプトレツ／ン ＣＨ３Ｃ０ＮＨ（ＣＨ，、）３ｃＨ。

４−アセチルアミノブタナール このように、本発明方法で用いる４種の酵素の中のポリ
アミンオキシダーゼＡ’；ＩＩ’−１は、少眼を用いて
も遊離ポリアミンのスペルミンをプトレッシンに分解し
て２倍モル量の過酸化水素を生成し、またスペルミジン
をプトレッシンに分解して等モル量の過酸化水素を生成
するが、シトレノ／／Ｑ・こは全く作用しない。そして
、多量用いた場合にはアセチルポリアミンのアセチルス
ペルミンとＮ’　−アセチルスペルミジンには作用して
、前者からはプトレッシンと２倍モル量の過酸化水素を
、また後者からはプトレッシンと等モル量の過酸化水素
を生成するが　Ｎ８−アセチルスペルミジンとアセチル
プトレッシンには作用し力い。

次にポリアミンオキシダーゼＰＣ！−３は、遊離ポリア
ミンのスペルミンをプトレッシンに分解し、２倍モル量
の過酸化水素を生成し、またスペルミジンをプトレッシ
ンに分解し、等モル量の過酸化水素を生成するがプトレ
ッシンには作用しない。

そして、アセチルポリアミンについては　Ｎ８−アセチ
ルスペルミジンを特異的に酸化し、等モル量のアセチル
プトレッシンと等モル量の過酸化水素を生成するが、ア
セチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、アセ
チルプトレッシンにハ作用しない。

また、プトレッシンオキシダーゼは遊離ポリアミンのス
ペルミジンとプトレッシンに作用し、前の過酸化水素を
生成し、後者を４−アミノブタナールに分解して等モル
量のアンモニアと等モル量の過酸化水素を生成するが、
スペルミンやアセチルポリアミ／には作用しない。

さらに、アセチルプトレツシンオキノダーゼは、アセチ
ルポリアミンの中のアセチルプトレッシンのみに作用し
、等モル量、のアンモニアと等モル匿の過酸化水素を生
成するが、他のアセデルポリアミン及び遊離ポリアミン
には作用しない。

本発明方法は、これら４種の酵素の特異的な作用を組み
合わせることにより、従来の方法では全く不可能であっ
たアセチルポリアミン類又はアセチルポリアミン類と遊
離ポリアミン類との混合系中に存在するアセチルプトレ
ッシン、アセチルスペルミン　Ｎｌ−アセチルスペル１
ミジン　Ｎ８　７セチルスペルミジン、スペルミン、ス
ペルミジン、プトレッシンの個々の濃度を直接分別ポ量
するものである。

次に本発明の好適な実施態様を説明する。なお、ことに
示される酵素単位は、以下のようにして測定した１分間
に１μｍｏｌの過酸化水素を生成するのに要する酵素量
をもって１単位として定めたものである。

（１）ポリアミンオキシダーゼＡＴ−１の測定；ｐＨ６
，５の０．１　Ｍリン酸緩衝液１００ゴに、４−アミノ
アンチピリン１０ｍｂフェノール０．２ｍ／、ペルオキ
シダーゼ（ベーリンガー社製、グレードｎ）５ｍＶを溶
解し、発色液を調製する。

この発色液１　、５　ｍｌと１０ｍＭスペルミジン０　
、５　ｍｌとの混合物を３５℃で３分間予熱したのち、
酵素液０　、５　ｍｌを添加し、反応させる。そして、
５０５ｎｍにおける発色の分子吸光係数として６２５０
を用い、生成する過酸化水素に起因する５０５　ｎｍの
吸光度変化量（反応開始後１分間のΔＡ）より、酵素活
性を求める。

（２）ポリアミンオキシダーゼｐｃ−３の測定；基質と
して１０ｍＭスペルミン０．５−を用いる以外は、全く
（１）の場合と同様にして酵素活性を求める。

（３）プトレッシンオキシダーゼの測定。

基質として１０ｒｎＭプトレッシンｏ、５ｍｅヲ、ｉ’
ｃ発色液の緩衝液としてｐＨ８，５の０．１Ｍホウ酸緩
衝液を用いる以外は全く（１）の場合と同様にして酵素
活性を求める。

（４）アセチルブトレッシンオキンダーゼの測定；基質
として１０ｍＭアセチアセチルプトレッシン０．５、壕
だ発色液の緩１ＪｉｔトｂでｐＨ７，４）　ノＯ，］　
Ｍリン酸緩衝液をそれぞれ用いること以外は全て（１）
の場合と同僚にして酵素活性を求める。

本発明方法の第一の好適な実施態様例においては、先ス
、スペルミン、スペルミジン、プトレッンン、アセチル
スペルミン、Ｎ’７セチルスペルミシン　Ｎ８−アセチ
ルスペルミジン及びアセチルプトレッシンを含む試料に
、ｐＨ５〜７好ましくはｐＨ６〜６．５付近でポリアミ
ンオキシダーゼＡＴ−］０．０２〜０．２０単位を作用
させ、スペルトンとスペルミジンを完全に酸化させる（
へ工程）。この工程ではスペルミンとスペルミジンｉｌ
″ｊ：等モル畦のプトレッシンに分解され、それぞれ２
倍モル哨、等モル量の過酸化水素を生成する。

次いで、ｐＨを７〜９好ましくは８〜８．５　付近に１
１［し、プトレッシンオキシダーゼ少なくとも１単位を
添加し、プトレッシン（試料に含捷れていたプトレッシ
ン＋Ａ工程で生成したプトレッシン）を酸化する（Ｂ工
程）。

次に、新だに調製した７種のポリアミンとアセチルポリ
アミンを含む試料にｐＨ５〜７好ましくはｐＨ６〜６．
５付近でポリアミンオキシダーゼＡＴ−１を１単位以上
添加し、スペルミン、スペルミジン、アセチルスペルミ
ン　Ｎｌ−アセチルスヘルミージンを酸化する。この工
程で酸化される４種のポリアミンはいずれも等モル量の
プトレッシンに分解され、スペルミン、アセチルスペル
ミンカラハソレぞれ２１ｆモル量の過酸化水素が、スペ
ルミジン、Ｎｌ−アセチルスペルミジンからはそれぞれ
等モル量の過酸化水素が生成する（Ｃ工程）。反応終了
後、　　ｐＨを７〜９好ましくは８〜８．５付近に調整
し、プトレッシンオキ７ダーゼ少くとも１単位を添加し
１プトレツシン（試料に含まれていたプトレッシン＋Ｃ
工程で生成したブトレッジ／）を酸イヒする（Ｄ工程）
。

さらに、新だに調製した７種のポリアミンとアセチルポ
リアミンを含む試別にｐＨ７〜９好捷しくはｐＨ８〜８
．５付近でプトレッシンオキ７ダ−ゼ少なくとも１単位
を添加い反応させてスペルミージンとプトレッシンを酸
化する（Ｅ工程）。続いてアセチルプトレッシン尤キシ
ダーゼ０，０５〜０．５単位を添加いアセチルプトレッ
シンを酸イヒＪ−る（Ｆ工程）。この反応が終了したの
ち、ｐＨを５〜５．５付近に調整し、ポリアミンメーキ
シタ゛−ゼＰＣ−３少なくとも３単位を添加しスペルミ
ンとＮ８−アセチルスペルミジンをそれぞれプトレッシ
ンとアセチルプトレッシンに分解するとともに等モル量
の過酸化水素を生成させる（Ｃ工程）。この際、試料中
にはプトレッシンオキ／り′−ゼとアーヒチルブトレツ
シンオキシダーゼが存在する力’　ｓ　Ｉｔ’ｌｌ酵素
とも上記のｐＨではほとんど活性を示さない。

このようにして行われたＡ　、　Ｂ　、　Ｃ，Ｄ　、　
Ｅ　。

Ｆ及びＣ工程で生成する過酸化水素量、に、そオしぞれ
ａ　ｒ　ｂ　＋　Ｃ＋　ｄ　＋　ｅ　＋　ｆ及びｇモル
とするとその量は次のように表わされる。

ａ（モル）＝（スペルミンのモル数）　Ｘ　２　＋　（
スペルミジンのモル数） ｂ（モル）＝（スペルミンのモル数）＋（スペルミジン
のモル数）＋（プトレッシンのモル数）Ｃ（モル）＝（
スペルミンのモル数）Ｘ２＋（スペルミジンのモルｉ）
＋（アセチルスペルミンのモル数）Ｘ２＋（Ｎｌ−アセ
チルスペルミジンのモル数） ｄ（モル）＝（スペルミンのモル数）＋（スペルミジン
のモル数）＋（アセチルスペルミンのモル数）＋（Ｎ’
−アセチルスペルミジンのモル数）＋（プトレッシンの
モル数）ｅ（モル）＝（スペルミジンのモルｅ）＋（プ
）レツシンのモル数） ｆ（モル）＝（アセチルプトレッシンのモル数）ｇ（モ
ル）＝（スペノベンのモル数）Ｘ２＋（Ｎ８−アセチル
スペルミジンのモル数） したがって、スペルミン−スペルミジン、プトレッシン
、アセチルスペルばン　Ｎｌ−アセチルスペルミジン　
Ｎ８−アセチルスペルミジン１アセチルプトレツシンの
も＃度は上記Ａ−Ｇ工程の各週酸化水素量を測定するこ
とにより、次式に従って計算することができる。

スペルミン量（μＭ　）−ｘ　（ｂ−ｅ）スペルミジン
量（ｐ　Ｍ　）　＝　Ｋ　（ａ　＋　２　ｅ　−２ｂ　
）プトレッシン量（ＩＩＭ　）＝Ｋ　（２ｂ−ａ−ｅ　
）アセチルスペルミン［（ＰＭ）＝Ｋ（ｃ＋ｅ−ｂ−（
］−）］Ｎ１−アセチルスペルミジンμＭ　）＝Ｋ（２
ｂ＋２ａ−２θ−ａ−Ｃ） Ｎ８−アセチルスペルミジン −２ｂ） アセチルプトレッシン（μＭ）＝ｙｒ．−ｆ本発明方法
において過酸化水素量を測定するには、４−アミノアン
チピリン／フェノール／ペルオキソダーゼ系又は４−ア
ミノアンヂピリン／Ｎ，Ｎージエチルアニリン／ペルオ
キ／ダーゼ系の試薬を用いる比色法のほか、過酸化水素
の定；ｄに慣用されているけい光性、発光法などを用い
ることもできる。また、過酸化水素量を測定する代りに
、それに対応する酸素の減少−を測定することもできる
。

以上の実施態様においては、７種のポリアミン、アセチ
ルポリアミンを含む試料を用いているが、これらの中の
３種又は２種以上を欠く試料の場合も１本発明方法によ
り分別定量することができる。

例ｔ　ハ、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、
アセチルスペルミン　Ｎｌ−アセチルスペルミジンの５
種のみを含む試料の場合は、人工程からＥ工程捷で行え
ばよく、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、ア
セチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミン／、Ｎ８
−アセチルスペルミジンの６種のみを含む試料の場合は
、Ａ工程からＥ工程及びＧ工程を行えばよい。

また、スペルミン、スペルミジン１プ）レツンン、アセ
チルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、アセチ
ルプトレッシンの６種のみを含む試料の場合は・　Ａ工
程からＦ工程を行えはよく、スペルミン、スペルミジン
、プトレッシン　Ｎ８−アセチルスペルミジンの４棟の
みを含む試料の場合は、Ａ工程、Ｂ工程、Ｅ工程及びＧ
工程を行えばよい。さらに、スペルミン、スペルミジン
、プトレッシン、アセチルプトレッシンの組合せの場合
は、へ工程、Ｂ工程、Ｅ工程及びＦ工程を行えばよいし
、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン　Ｎ８−ア
セチルスペルミジン、アセチルプトレッシンの組合せの
場合は、Ａ工程、ＢＷ及びＥ工程からＧ工程までを行え
ばよい。

他方、本発明方法の第、二の好適な実施態様例において
は、前記の７種のポリアミン・アセチルポリアミンを含
む試料に、先ずｐＨ７，５〜９好ましくはｐＨ８〜８．
５付近でプトレツノンオキ／ターゼを作用させ、スペル
ミジンとプトレッシンを分Ａ（（−Ｊ−る（Ａ／工程）
。次にｐＨを５〜７好ましくは６〜６．５付近に調整し
てポリアミンオキ７ダーゼＡＴ−１を約０．０２〜０．
１単位添加しスペルミンを分Ｍさせ（Ｂ／主工程・、続
いてポリアミンオキ７ダーゼＡＴ−１を少なくとも２単
位添加し、アセチルスペルミンとＮ’ｌ−アセチルスペ
ルミジンを分解させる（　Ｃ／工程）。次いでＣ′工程
の反応生成物のｐ）Ｉを８．５付近に再、ｉｌｌ［Ｅし
て　Ｂ／主工程スペルミンから生じたプトレッシンと、
Ｃ／工程でアセチルスペルミン及びＮｌ−アセチルスペ
ルミジンから生じたプトレッシンを分解させる（　Ｄ／
工程）。Ｄ′工程においては　Ａ／工程で添加したプト
レッシンオキシダーゼをふ活して可使用する（プトレッ
シンオキシダーゼはｐＨ５〜６．５付近では安定である
が酵素活性は示さない）。

次に、新だに調製した７種のポリアミン、アセチル化ポ
リアミンを含む試料に、ｐＨ５〜６付近でポリアミンオ
キ７ダーゼＰＣ−３全約０．１〜０．２単位で添加し、
スペルミンとスペルミジンを分解させる（　Ｅ／工程）
。続いて、さらにポリアミンオキ７ダーゼＰＣ−３を少
なくとも１５単位追加し、Ｎ８−アセチルスペルミジン
を分解させる（　Ｆ／工程）。

次に、ｐＨを８．０　付近に調整してアセチルプトレッ
シンオキシダーゼを添加し、試料中に含捷れるアセチル
プトレッシン及びＦ′工程で生成したアセチルプトレッ
シンを分解させる（０／工程）。

このようにして行われたＡ／　、　Ｂ／　、　Ｃ／　、
　ＤＩ　、　Ｅ／。

Ｆ′及びＧ′工程で生成する過酸化水素量を・それぞれ
ａ　／　、　ｂＬ　、　ｃ　／　、　ｄ／　、　ｅ　′
、　ｆ／及びｇ′モルとすると、その量は次のように表
わされる。

ａ′（モル）＝（スペルミジンのモル数）　＋（プトレ
ッシンのモル数） ｂ′（モル）＝（スペルミンのモル数）　Ｘ　２ｄ′（
モル）＝（スペルミンのモル数）＋（アセチルスペルミ
ンの舌ル数）＋（Ｎｌ−アセチルスペルミジンのモル数
） ｅ′（モル）＝’（スペルミンのモル数）×２＋（スペ
ルミジンのモル数） ｆ’　（モル）＝　（Ｎ８−アセチルスペルミジンのモ
ル数）ｇ′（モル）＝（アセチルプトレッシンのモル数
）　−１−（Ｎ８−アセチルスペルミジンのモル数）し
だがって、スペルミン、スペルミジン、プトレツ７ン１
アセチルスペルミノ、　　Ｎｌ−アセデルスペルミジン
　Ｎ８−アセチルスペルミジン、アセチルプトレッシン
の各濃度は、」二組Ａ′〜Ｇ′工程の各過酸化水素量を
測定することにより、次式に従って計算することができ
る。

スペルミン量（μＭ）−１％４に、ｂ’スペルミジン量
（μＭ）−Ｋ（ｅ’−ｂ’）プトレッシン量（μＭ）−
Ｋ（ａ’＋ｂ’−ｅ／　）アセチルスペルミン（μＭ）
＝Ｋ（＋／！ｂ’＋ｃ’−ｄ’　）Ｎｌ−アセチルスペ
ルミジン（μＭ）−ｘ（２ａ’−ｂ’−Ｃ′） Ｎ８−アセチルスペルミジン（μＭ）＝に−ｆ’アセチ
ルプトレッシン（μＭ）−Ｋ（ｇ’−ｆ’）本発明方法
においては、前記した工程の順序や条件に限定されるも
のではないし、また使用される酵素についても同じよう
な基質特異性を示すものである限り特に制限はないし、
その添加順序も任意に選択することができる。

本発明方法に従えば、高速液体クロマトグラフィー、ア
ミノ酸分析計など特殊な装置を用いる化学的方法でも非
常に困難とされていたポリアミン、アセチルポリアミン
の混合系中の各成分を迅速、簡便かつ正確に測定するこ
とができるので、本発明方法は、ガンその他の病気の診
断や検査に非常に有用である。

次に参考例、実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る 参考例１ ベルオキノダーゼ（ベーリンガー社製、グレート用１　
）　５　ｍｇ、フェノール０　、２　ｍ７！、４−−７
ミ／７７チピリンｌ０ｍｇを、ｐＨ６，５のＯ，１Ｍ　
　リン酸緩衝（ｆＬｌｏｏｍ７！に溶解することにより
発色液を調製した。

上記の発色液１　、５　ｍｌに、４００／ＩＭ　スペル
ミン（市販品）０．５渭ｅ、蒸留、水０．４９ｍｅを混
合［７、；う５℃で３分間予熱後、ポリアミンオキンダ
ーゼＡＴ−］　　１０μｚ（ｏ、、ｏｓ単位）を添加し
、反応を行わせた。

別に対照として基質の代りに蒸留水を加えたものを調製
し、同様に処理した。

両者における５０５　ｎｍの吸光度変化を経時的に測定
して反応の進行状態を追跡し吸光度変化が認められなく
なった時点をもって終了点とした。

この結果を第１図に実線グラフ（１）として示す。この
グラフから明らかなように、反応は５分以内に終了し、
その吸光度は１．００であった。

次にスペルミンの濃度を１０μＭから１００　ｐＭ　チ
でに変化させて同様の操作を行った。この結果を第２図
に実線グラフ（１）として示す。このグラフから明らか
なように、濃度と吸光度の間には良好な直線関係が認め
られ、まだスペルミン１モルより２モルの過酸化水素が
生成することが認められた。

参考例２ 基質としてスペルミジン（市販品）を用いる以外は全く
参考例１と同様にして、吸光度の経時的変化及びスペル
ミジン濃度と吸光度との関係を調べた。その結果を第１
図及び第２図に破線グラフ（Ｉ＋）として示す。このグ
ラフから明らかなように、反応は５分以内に完了し、ス
ペルミジン】モルから１モルの過酸化水素が生成する。

参考例３ 基質としてアセチルスペルミンを、また酵素量を２単位
とする以外は、全く参考例１と同様に操作した。その結
果を第１図及び第２図に点線グラフ（ｍ）として示す。

このグラフから明らかなように、反応は１０分以内に完
了し、アセチルスペルミン１モルから２モルの過酸化水
素が生成する。

参考例４ 基質としてＮ１−アセチルスペルミンヲ用いる以外は、
全く参考例と同様にして操作した。その結果を第１図及
び第２図に一点鎖線グラフ（１■）として示す。このグ
ラフから明らかなように、反応は約１０分以内に完了し
Ｎ１−アセチルスペルミジン１モルから１モルの過酸化
水素が生成する。

参考例５ 発色液をｐＨ５，５のＯ，］ＭＩＪン酸緩衝液全緩衝て
調製すること及びポリアミンオギンダーゼＰＣ−３約０
，０５単位を用いること以外は、全く参考例１と同様に
して操作を行い、吸光度の経時黒変化及びスペルミン濃
度と吸光度との関係を調べた。

その結果を第３図及び第４図に実線グラフ（１）として
示す。このグラフから明らかなように、反応は約５分以
内に完了し、スペルミン１モルより２モルの過酸化水素
が生成した。

参考例６ 基質をスペルミジンに変えて、参考例５と同様の操作を
行った。その結果を第３図及び第４図に破線グラフ（Ｉ
Ｉ）として示す。このグラフから明らかなように、反応
は約１０分以内に完了し、スペルミジン１モルから１モ
ルの過酸化水素が生成する。

参考例７ 基質として１（８−アセチルスペルミジンを用い、酵素
量を約１５単位とすること以外は、全く参考例５と同じ
操作を繰り返した。その結果を第３図及び第４図に点線
グラフ（Ｉ）として示す。このグラフから明らかなよう
に、反応は約１０分以内に完了し　Ｎ８−アセチルスペ
ルミジン１モルから１モルの過酸化水素が生成した。

参考例８ 発色液をｐＨ８，５の０．１Ｍホウ酸緩衝液を用いて調
製し、基質としてプトレッシン（市販品）を、また酵素
としてプトレッシンオキシダーゼ約０．５単位を用いる
以外は、全く参考例１と同じ操作を繰り返した。その結
果を第５図及び第６図に実線グラフ（１）として示す。

このグラフより明らかなように１反応は約５分以内に完
了し、プトレッシン１モルよ９１モルの過酸化水素が生
成する。

参考例９ 基質としてスペルミジン（市販品）を用いること以外は
、全く参考例８と同様にして操作を繰り返した。その結
果を、第５図及び第６図に破線グラフ（１１）として示
す。このグラフから明らかなように、反応は１０分以内
に完了し、スペルミジン１モルから１モルの過酸化水素
が生成する。

参考例ＪＯ 発色液をｐＨ８，０の０．１ＭＩＪン酸緩衝液を用いて
調製し、基質としてアセチルブトレツ／ンを、また酵素
としてアセチルブトレノノンオキ／ダーゼ約０．５単位
を用いること以外は、全く参考例Ｉと同様にして操作全
線り返した。その結果を、第７図及び第８図にグラフと
して示す。このグラフから明らかなように、反応は約５
分以内に完了し、アセチル７”　）レツシン１モルより
１モルの過酸化水素が生成する。

参考例１１ ｐＨ６，５の０．１Ｍ１ｊン酸緩衝液を用いて調製した
発色ｉ１．５ｔｄに４００　／’Ｍスペルミン０　、５
　ｍｅ　、？ｈ留水０．１９−を加え、　３５℃で３分
間予熱したのち、ポリアミンオキシダーゼＡＴ〜１１０
μｔ（０，０５単位）を添加し反応させた。まだ、対照
として、基質の代わりに蒸留水を加えたものを用い同様
に処理した。約５分間反応させたのち、０．３Ｍホウ酸
ナナトリウム水溶液約０．３ｄ加えて、ｐＨ８〜８．５
に調整するとともに液量を２．５ｒｎｌとし、５０５ｎ
ｍの吸光度を測定したところ、吸光度は１．００であっ
た（人工程）。

次にこの反応混合物に、さらにプトレッシンオキシダー
ゼ５μｔ　（０，５単位）を添加し、５分間反応させ、
吸光度を測定したところ、吸光度は１．５０でアリ、プ
トレッシンオキシダーゼ添加後の吸光度変化量は０．５
０であった。（Ｂ工程）これらの結果を第９図にグラフ
で示す。このグラフから明らかなように、Ａ工程ではス
ペルミン１モルから２モルの過酸化水素が生成し、Ｂ工
程ではプトレッシンが酸化分解されて１モルの過酸化水
素が生成する。

参考例１２ 基質としてスペルミジンを用いる以外は参考例１１と全
く同様にして操作を繰り返した。その結果を第１０図に
グラフとして示す。グラフから明らかなように、Ａ工程
及びＢ工程のいずれの吸光Ｉｆ　ｆ　化ｔも０．５００
で、スペルミジン１モルかうへ工程で１モルの過酸化水
素が生成し、酸化分解生成物プトレッシン１モルから過
酸化水素１モルがＢ工程で生成することが認められる。

参考例１− 基質として４００μＭアセチルスペルミン０　、５　ｍ
ｌ及び酵素としてポリアミンオキンダーゼΔＴ−１約５
単位（１０μｔ）を用ｌ参考例１１と同様の操作を繰り
返した。その結果を第１１図にグラフで示す。

グラフよりへ工程及びＢ工程における吸光度の変化量は
それぞれ１．００及び０．５０で、　人工程において２
モルの過酸化水素、Ｂ工程において１モルの過酸化水素
を生成することがわかる。

参考例１４ 基質として４００μＭＮ！−アセチルスペルミジン０　
、５　ｍｅを用いる以外は参考例１３と全く同様の操作
を行った。その結果を第１２図にグラフで示す。

グラフから明らかなように、Ａ工程及びＢ工程における
吸光度の変化は、いずれも０．５０であシ、Ｎｌ−アセ
チルスペルミジン１モルから各工程においてそれぞれ１
モルの過酸化水素が生成することが認められる。

参考例１５ ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸緩衝液で調製した発色液１．
５ｍｊ！に４００μＭスペルミン０．５−及び蒸留水０
．１９ｍ１を添加溶解し、これを３５℃の温度で３分間
予熱後、ポリアミンオキシダーゼＰＣ−３１０μｔ（約
０．０５単位）を添加して反応させた。約５分間の反応
により反応を終了させてから０．３　Ｍホウ酸ナトリウ
ム溶液を加えてｐＨを８〜８．５　　に調整しく液量は
２．５ｍ３）、５０５ｎｍの吸光度を測定した（Ａ工程
）。吸光度は１．００であった。

次イでこの反応液にプトレツシンオキンダーゼ５μｔ（
約０．５単位）を添加し、さらに５分間反応を行った（
Ｂ工程）。反応液の吸光度は１．５０で、Ｂ工程におけ
る吸光度変化量は０．５０であっだ。

上記反応における吸光度の時間的変化を第１３図にグラ
フで示しだ。このグラフより、Ａ」二程で２モルの過酸
化水素、Ｂ工程で１モルの過酸化水素が生成することが
わかる。

参考例１６ 基質として４００μＭスペルミジン０．５ｍｌを使用す
るほかは参考例１５と同様の操作を繰り返して実験を行
った。その結果を第１４図にグラフで示す。

グラフから明らかなように、へ工程及びＢ工程における
吸光度変化量はいずれも０．５０で、スペル６９７１モ
ルを基準とするとき各反応工程においてそれぞれ１モル
の過酸化水素が生成することがわかる。

参考例１７ ０．１ＭＩＪン酸緩衝液（、ｐＨｓ、５）で調整した発
色液１．５７ト４００μＭ　ＮＢ−アセチルスペルミジ
ン０　、５　ｍｌ　ｓ蒸留水０．４４ｍｅとを混合し、
この溶液を３５℃の温度に３分間予熱後、ポリアミンオ
キ７ダーゼＰＣ−３１０μｔ（約１５単位）を除ノＪ］
１シで反応を開始した。反応は約１０分後には完了した
。

次いでこれに５Ｎ水酸化す）　ＩＪウム水溶液５ｏμｔ
を添加してｐＨを７．５付近に調整しく反応液量も２．
５ｍｌに調整）、５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ａ
工程）。吸光度は０．５００であった。

次に、この反応液にアセチルプトレッノンオキンダーゼ
５μｔ（約０．５単位）を添加し、約１０分間反応させ
た（Ｂ工程）。得られた反応液の吸光度は］　、０００
で、Ｂ工程における吸光度の変化量は０．５００であっ
た。

各工程における吸光度の時間（分）豹変化を第１５図に
グラフで示す。

各反応終了時の吸光度の変化から　ＮＢ−アセチルスペ
ルミジン１モル基準で、Ａ工程及びＢ工程それぞれにお
いて過酸化水素が各１モルずつ生成することが明らかで
ある。

なお、参考例及び以下の実施例において用いた各棟アセ
チルポリアミンは［メソツズ・イン・エンザイモロジ−
（Ｍｅｔｈｏｄ、ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ
、１７Ｂ１第８２９〜８３３ページに記載された方法に
従つて遊離ポリアミンより合成した。

実施例１ 参考例１と同様に、ベルオキンダーゼ５〜、フーｘ／−
ルｏ、２ｍｅ４−７ミノアンチピリ７１　Ｑ’ｍｇをｐ
Ｈ６，５の０．１Ｍリン酸緩衝１１００ｍ６に溶解して
発色液を調製した。

この発色液１　、５　ｍｌとスペルミン、スペルミジン
、プトレッシンｔアセチノにスペルミン、　Ｎｌ−アセ
チルスペルミジン、　ＮＢ−アセチルスペルミジン及び
アセチルブトレソンンのそれぞれの２．０ｍＭ、４網製
水溶ｇ１．２５１Ｉｔずつ及び蒸留水０．５２ｍ１を容
−＠−３’ｍｅのセルに入れた。この溶液中のポリアミ
ン類各成分の濃度はいずれも２ｏｐＭである。

このように調製された溶液を３５℃の温度で３夕 だ。反応終了液に０．３　Ｍホウ酸ナトリウム水溶液０
　、３　ｍｌを加えてｐＨ８−８，５に調整し、５０５
ｒ＋＋ｎの吸光度を測定した（Ａ工程）。

続いて、この測定液にプトレソノンオキ／ターゼ５μｔ
（約５単位）を添加し、３５℃の温度で１５分間反応さ
せだのちその吸光度を測定した（Ｂ工程）。

次に、同様に発色液１．５ｒｎＩ２、ポリアミン類７種
のそれぞれの２．０ｍＭ水溶液各２５μＬ及び蒸留水０
．５２　ｄを混合して新たに試料液を調製し、これを３
５℃の温度に３分間予熱後、ポリアミンオキシダーゼＡ
Ｔ−１を５μｔ（約３単位）添加し、１０分間反応を行
った。反応終了液に０．３Ｍホウ酸ナトリウム水溶ｔＬ
Ｏ、３ｍｌ！、を加え５０５　ｎｍの吸光度を測定シた
（Ｃ工程）。続いてプトレツンンオキンダーゼ５μｔ（
約５単位）を添加し、３５℃で１５分間反応を続け、そ
の吸光度を測定した（Ｄ工程）。

次に、さらにポリアミン類７棟の各２．０ｍＭ水溶液の
それぞれ２５μｔと蒸留水０．５２　ｙｄを、　　ｐＨ
８，５の０．１．Ｍリン酸緩衝液とｐＨ’８．５の０．
１　Ｍ炭酸ナトリウム・塩化カリウム・ホウ酸緩衝液と
の１〜１混合液で同様に調製した発色液１　、５　ｍｌ
に添加して新たに試料液を調製し、これを３５℃の温度
で３分間予熱したのち、プトレッシンオキシダ応させた
。反応終了液に５Ｎ塩酸水溶液２０ｐｔ奮添加し、５０
５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｅ工程）。

次いで、この液にアセチルプトレッ／ンオキ／ダーゼを
５μｔ（約０．５単位）添加し、１０分間反応させたの
ち、５０５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｆ工程）。

この反応終了液にさらに５Ｎ塩酸水溶ｏ、２０μｔを添
加してｐＨを５〜．．５　、５に調整し、ポリアミンオ
キ７ダーゼｐｃ−３を約５μｔ（約１５単位）添加して
約１５分間反応させたのち、５０５　ｎｍの吸光度を測
定した（Ｃ工程）。

各工程で測定された生成過酸化水素哨にもとず（５０５
ｎｍの吸光度変化蟻は次の通りであった。

Ａ工程の吸光度変化臥ａ　＝　０．３７５Ｂ　　ｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　ｂ＝０．３７５ＣＩＩ　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ＝０．２５０Ｄ　
　　／Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｄ　　−
０，／１９７Ｅ　　　ｒｒ　　　　　　　　　　　　　
　　　ｅ＝０．２５０ｆＰ　　　ｔｒ　　　　　　　　
　　　　　　　　ｆ＝０．＋２：うＧｔｔ　　　　　　
　　　ｇ　＝　０．３７０これらの値にもとすいて、本
発色液の分子吸光係数６２５０を代入した定数Ｋを用い
前記第一の実施態様の各成分計算式から、７種のポリア
ミン各成分濃度を算出すると、次のような結果が得られ
た。

スペルミン　　　　　　　　２０．０μＭスペルミジン
　　　　　　　２０．０／７プトレツ／ン　　　　　　
　２０．０　＃アセチルスペルミン　　　　２０．２／
／Ｎ１−アセチルスペルミジン　１９．４〃Ｎ８−アセ
チルスペルミジン　１９．２＃アセチルプトレツシン　
　　１９．７ｔｒこれらの結果から、各成分濃度値は、
いずれも所定の各成分濃度値２０．０μＭと極めてよく
一致しておシ、本発明の方法が高い信頼性を有すること
が理解されよう。

実施例２ ペルオキシダーゼ（ベーリンガー社グレードＩＩ　）５
、ｏｍｙ、４−アミノアンチピリ／１０．０７１１ｐ、
ラジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルフオプロピル）　−ｍ　−１−ルイジン５４．１ｌｌ
ｙを０６１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，５）　−０，１Ｍ
炭酸ナトリウム・塩化カリウム・ホウ酸緩衝液（ｐＨｓ
、り　）１：１の混合液１００ｍ１で溶解して調製した
発色液１．５ｍｌと尿０．５　ｍｌと蒸留水０．４６ｍ
１を３ｍｌセルに注入し、３５℃で３分間予熱後、グト
レツ／ンオキ７ダーゼ５μｔ（約５単位）添加し、約１
５分間反応させた。反応液に５Ｎ、−塩酸水溶′液３０
μｔを加え、ｐＨを６から６．５付近に調整し、５５５
　ｎｍ　の吸光度を測定した（へ工程）。次にポリアミ
ンオキ／ダーゼＡＴ−１を５μｔ（約０．１単位）添加
し、５分間反応後５５５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｂ
工程）。続いてポリアミンオキノダーセＡｒ−＋ヲ５μ
ｔ（約５単位）添加し１０分間反応させ、反応終了液の
５５５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｃ工程）。

次に、これに５Ｎ−水酸化すＩ−ＩＪウム水溶ＲＫ　３
０μＬを加えてｐＨを８．５付近にもどしｔ　最初に添
υ１１したプトレツ／ンオキンダーゼの活性が再発現さ
せてそのまま３５℃で１５分間反応を行わせたのち、５
５５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｄ工程）。

次に、０．１．Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，５で調製した上
記と同一組成の発色液１．５ｍ／！に尿０　、５　ｍｌ
と蒸留水０．４９ｍ１を加えて新しい試料液を調製し、
これを３　ｍｌセルに注入し、３５℃で３分間予熱後、
ポリアミンオキシダーゼｐｃ−３を５μｔ（約０．１単
位）添加し、５分間反応させた。反応液の５５５　ｎｍ
の吸光度を測定（Ｅ工程）後、ポリアミンオキ／ダーゼ
ＰＣ−３をさらに５μｔ（約１５単位）添加し、約５分
間反応後５５５ｎｍの吸光度を測定した（Ｆ工程）。次
に、これに５Ｎ−水酸化す）　ｌ）ラム水溶液を４５μ
Ｌ添加してｐＨを７．５付近に調整し、アセチルプトレ
ッシンオキ／ダーゼ５μｍ（約０．５単位）を添加し１
５分間反応後、５５５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｃ工程
）０ これらの反応によって得られた吸光度変化量は次の通り
であった。

Ａ工程の吸光度変化量ａ　＝　０．０２４Ｂ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｂ　　＝　　０．０１８
ＣＣ＝　　０．０１１ Ｄ　　　　　’　　　　　　　　　　　　　　（１＝０
．０２０Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｅ
　　＝　　０．０２８Ｆ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｆ　　＝　　０．００５Ｇ工程の吸光度変
化量ｇ　＝　０．０３５これらの値と本発色度による分
子吸光係数］７２００を用い、前記第二の実施態様の各
成分１譜式に代入し計算する゛ことにより反応ｏ、（２
、５’ｍｅ　）中の７種のポリアミン類各成分の濃度は
次のように算出された。

スペルミン　　　　　　　　−０，５２μＭスペルミジ
ン　　　　　　　−０，５８μＭプトレッシン　　　　
　　　−０，８１μＭアセチルスペルミン　　　　−０
．００μＭＮ１−アセチルスペルミジン−０，６４μＭ
Ｎ８−アセチルスペルミジン−０，２９μＩＡアセチル
プトレツノン　　　−１，７４μＭこれらの値から換算
される尿中のポリアミン濃度は次の通りである。

スペルミン　　　　　　　　−２，６μＭスペルミジン
　　　　　　　−２．９μＭグトレツンン　　　　　　
　−ＣＩ、ｒＩＭアセチルスペルミン　　　　＝　Ｏμ
ＭＮｌ　　７セチルスペルミジ７　＝：Ｌ２μＭＮ８　
７セチルスペルミジンー１．５μＭアセチルプトレッシ
ン　　　−８，７７ｚＭ実施例３ 赤白法２．５ｍｌに蒸留水６．５ｍｌを添加し、１分間
激しくかきまぜる。次にこの液に過塩素酸３０係水溶液
を１−添加し２分間激しくかきまぜ、生じた沈殿物を遠
心分離（３０００ｒｐｍ　１０分）し、上澄液ｉ−］ニ
ア、５．Ｎ炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７付近に調整し
た。このように、調製された試料をポリアミンの分析に
用いた。

実施例２と同一組成の発色液を０．１ＭＩＪン酸緩衝液
ｐＨ６，５で調整し、その発色液１．５１ｎｌＶ、試料
０．５ｍｌ、蒸留水０．１９５　ｒｎｌを３ｒｎ１．セ
ルに入れ３５℃で３分間予熱後、ポリアミンオキシダー
ゼＡＴ−１５μｔ（約０．１単位）を添加し約５分間反
応した。

反応終了液に０．３Ｍホウ酸ナナトリウム溶液０．３ｒ
ｎｌ添加し、ｐＨを８から８，５付近に調整後、５５５
Ｄｍの吸光度を測定した（Ａ工程）続いてプトレッシン
オキシダーゼを５μｔ（約５単位）添加し３５℃で約１
５分間反応を続け、５５５Ｄｍ　の吸光度を測定した（
Ｂ工程）。次に、前記赤血球調製試料０．５−１蒸留水
０．１９５７．０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，５で調整
した発色液１　、５　ｍｌを混合して新だに調製した液
を、温度３５℃で３分間１熱後、ポリアミンオキシダー
ゼＡＴ−１を５μｔ（約３単位）添加後、１０分間反応
させた。反応終了液に０．３Ｍホウ酸ナナトリウム溶液
０、３　ｍｌを加え、５５５Ｄｍの吸光度を測定した（
Ｃ工程）。続いてプトレッシンオキシダーゼ５μｔ（約
５単位）を添加し、１５分間反応を続け、５５５ｎ！Ｔ
Ｉの吸光度を測定した（Ｄ工程）。

さらに、緩衝液として、ｐＨ８，５の０．１Ｍリン酸緩
衝液とｐＨ８，５の０．１Ｍ炭酸ナトリウム・塩化カリ
ウム・ホウ酸緩衝液との１：ｌ混合液を用いて同組成の
発色液を調製し、その１．５−に上記赤血球調製試料液
０．５−及び蒸留水０．１８＋＋＋ｊ！を加えて新たな
測定試料液を調製した。これを３５℃の温度で３分間予
熱したのち、プトレッシンオキシダーゼｌＯμｔ（約５
単位）を添加した。約１５分間反応させたのち、５Ｎ−
塩酸溶液２０μｔを添加しｐＨ７−５（”ｊ近に調整し
、５５５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｅ工程）。続いてア
セチルブトレノ／ンオキシダーゼを５μｔ（約０．５単
位）添加し、約１０分間反応後、５５５Ｄｍの吸光度を
測定した（Ｆ工程）。この反応終了液にさらに５Ｎ＝塩
酸水溶液２０μｔを添加してｐＨを５から゛５．５付近
に調整し、ポリアミンオキ／ダーゼＰＣ−３を約５μｔ
（約１５単位）添加した。約１５分間反応させたのち５
５５Ｄｍの吸光度を測定した（Ｇ工程）。これら各工程
において得られた５５５Ｄｍの吸光度変化量は次の通シ
であった。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．０３４Ｂ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ｂ　　＝　　０．
０２９Ｃｃ　　＝　　０．０５０ Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　、　　　　ｄ＝
０．０４０１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｅ　　＝　　０．０２３Ｆ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｆ　　＝　　０．０００Ｇ　　　　　
　　　　　ｇ＝０．０１４これらの値より、実施例２と
同様にして、測定試料液中のポリアミン類各成分の濃度
を算出し、次の結果を得た。

スペルミン　　　　　　−０，３５μＭスペルミジン　
　　　　＝　１．２８μＭプトレッシン　　　　　　＝
　０．０６μＭアセチルスペルミン　　−０，２３μＭ
Ｎ１−７セチルスペルミジン　＝　０．４７μＭＮ８−
アセチルスペルミジン　−０，１２μＭアセチルグトレ
ツシン　　　−０ これらの濃度値から換算される赤白球中のポリアミン類
の各成分濃度は次の通りとなる。

スペルミン　　　　　　−７，０１１Ｍスペルミジン　
　　　　　＝　２５；６μＭプトレッシン　　　　　　
−１，２μＭアセチルスペルミン　　−４，６μＭ Ｎ１−アセチルスペルミジン　＝９．３μＭＮ８−−ア
セチルスペルミジン　＝２．３μＭアセチルプトレッシ
ン　　　−０，０μＭ実施例４ 緩衝液として、ｐＨ８，５の０．１ＭＩＪン酸緩衝液０
．１Ｍ炭酸ナトリウム・塩化カリウム・ホウ酸緩衝液ｌ
：１の混合液を用い、その１００＋＋＋１！に参考例１
と同じ組成成分を溶解して調製した発色液１．５−にス
ペルミン、スペルミジン、プトレッシン、Ｎ１−７セチ
ルスベルミジン　Ｎ８−アセチルスペルミジン、アセチ
ルプトレッシンの各２．０ｍＭ水溶液を５０μｔずつ（
最終的にはこれら各既知成分の濃度はいずれも４０μＭ
）と管理用血清液０．２５ｍ１　（コ７ンセーラ「ニツ
スイ」１ピンをｉ留水１．５ｍ７！で溶解したもの）と
蒸留水０．４３−を３−セルに入れ、３５℃で３分間予
熱した。これにプトレッシンオキシダーゼ１０μｔ　（
約ｓ　単位）　全添加し、３５℃で１５分間反応させた
のち、５Ｎ−塩酸水溶液２０μｔを添加してｐＨを７．
５付近に調整し、５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ａ
工程）。

続いてアセチルプトレッシンオキシダーゼ５μｔ（約し
５単位）を添加し、１０分間反応させたのち５０５Ｄｍ
の吸光度を測定した（Ｂ工程）。さらに５Ｎ塩酸水溶液
１０μｔを添加し、ｐＨを６〜６．５に調整後、ポリア
ミンオキシダーゼＡＴ−１を５μｔ（約０．１単位）添
加し１０分間反応させた。反応終了液の５０５　ｎｍの
吸光度を測定した（Ｃ工程）のち、これにさらにポリア
ミンオキ／ダーゼＡＴ−１を５μｔ（約５単位）添加し
、′、０分間反応を行った。反応終了液の５０５Ｄｍの
吸光度を測定した（Ｄ工程）。

次に新たに調製した試料（各５０μｔずつ）、管理用血
清液２５ｍ１、蒸留水０．４４−を０．１Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ５，５で調製した発色液１．５ｍｌとともに３艷
セルに入れ、３５℃、で３分間予熱後、ポリアミンオキ
シダーゼＰＣ−３を５μｔ　（約０．１単位）を添加し
た。３５℃で約５分間反応後５０５ｎｍ　　の吸光度を
測定した（Ｅ工程）。続いて反応終了液にポリアミンオ
キシダーゼｐｃ、−３をさらに５μｔ（約１５単位）添
加して約１０分間反応させた。

°反応終了後、５０５μｍの吸光度を測定した　（Ｆ工
程）。このようにして得られた各工程における５０５　
ｎｍの吸光度変化量は次の通りであった。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．４９３Ｂ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ｂ　　＝　　０．
２４５Ｃ！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｃ＝　　０．５００Ｄ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ｃＬ　　＝　　０．５００Ｅ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ｅ　　＝　　０．７４６Ｆ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｆ　　＝　　
０．２４２本操作における人工程〜Ｆ工程の各工程の吸
光度変化量は、それぞれ次のようなポリアミン類の成分
濃度に依存する。すなわち へ工程：　　スペルミジン＋フトレッシンＢ　〃　：　
　アセチルプトレッシン Ｃ〆ｌ　：　　２・スペルミン ］）　　／／　　：　　　Ｎ１−アセチルスペルミジン
Ｅ　〃　：　　２・スペルミン＋スペルミジンＦ　　／
／　　：　　　Ｎ８−アセチルスペルミジン従って、ス
ペルミン、スペルミジン、プトレッシン　Ｎ１−アセチ
ルスペルミン　Ｎ８−アセチルスペルミジン及びアセチ
ルプトレッシンは、各工程における吸光度変化量ａ　＝
　ｆより次のように計算することができる。

スペルミン（μＭ）＝に一＋ｃ スペルミジン（μＭ）÷Ｋ（ｅ−ｃ） プトレッシン（μＭ）＝Ｋ（ａ＋ｃ−ｅ　）Ｎ１−アセ
チルスペルミジン（μＭ）＝に−（１Ｎ８−７セチルス
ペルミジン（μＭ）＝に−ｆアセチルプトレッシン（μ
Ｍ）＝に−ｂただし、Ｋ　＝　Ｉ　Ｘ　１０６／６２５
０吸光度変化量の測定値を代入して計算した結果は次の
とおシである。

スペルミン：　４０．０μＭ、　スペルミジン。３９．
４μＭプトレッシン：３９．５μＭ。

Ｎ１−アセチルスペルミジン：　４０．０μＭ。

Ｎ８−アセチルスペルミジン：３８．７μＭ。

アセチルプトレッシン：３９．２μＭ 本発明の分別定量法により測定されたポリアミン類各類
似成分の濃度は、調製された各成分濃度４０μＭとよく
一致し、本発明方法が優れた実用的価値を有することが
確認される。

実施例５ 丙施９１Ｌ２と同一組成物を含む発色剤をｐＨ５，５の
０．１リン酸緩衝液を用いて調製した。この発色液１．
５−にスペルミン、スペルミジン、プトレッシン、Ｎ１
−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン
の各１．０　Ｍを２５μｔ（最終の溶液中の各濃度１０
μＭ）と蒸留水０．８６５ｍ１を３葱セルに加えて混合
し、３５℃で３分間予熱した。予熱後、ポリアミンオキ
シダーゼｐｃ−ａを５μｔ（約０．１単位）添加し、約
５分間反応後５０５ｎｍの吸光度を測定した（人工程）
。続いて、これにポリアミンオキシダーゼＰＣ−３を５
μｔ（約１５単位）添加し、約１５分間反応後、５０５
　ｎｍの吸光度を測定した（Ｂ工程）。次に５Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液１０μｔを添加し、ｐＨを６から６．
５に調整し、ポリアミンオキシダーゼＡＴ−１を５μｔ
（約５単位）添加した。３５℃で約１０分間反応後５０
５ｎｍ　　の吸光度を測定した（Ｃ工程）。次に新たに
調製した試料各２５μｔと蒸留水０．８３０ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，５：　０．１　Ｍ−炭酸ナト
リウム−塩化カリウム・ホウ酸緩衝液ｐＨ８，５（１：
　ｌ　）で調製した発色液１．５−に加え、３５℃で３
分間予熱後、プトレッシンオキシダーゼを５μｔ（約５
単位）添加した。３５℃で約１５分間反応後、５Ｎ−塩
酸水溶液３０μｔを添加してｐＨを６から６．５に調整
し、その吸光度を測定した（Ｄ工程）。次にポリアミン
オキシダーゼＡＴ−１を５μｔ（約帆１単位）添加して
１０分間反応さく、反応液の５０５Ｄｍの吸光度を測定
した（Ｅ工程）。

各工程における５０５Ｄｍの吸光度変化量は次の通りで
あった。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．１８８Ｂ　　　　
　　　　　　　ｂ　＝　０．０〜６００　　　　　　　
　　　　ｃ　＝　０．０６４Ｄ　　　　　／７　　　　
　　ｄ＝０．１２４Ｂ　　　　　　　　　　　ｅ　＝　
０．１２５各工程におけるそれぞれの吸光度変化量は次
のポリアミン成分濃度に相当する吸光度である。

へ工程゛　２°スペルミン＋スペルミジンＢ　　ｔｒ　
　’、　　Ｎ８−アセチルスペルミジンＣ〃　：　Ｎ１
−アセチルスペルミジンＤ　〃　こスペルミン＋スペル
ミジン→−ブトレソシノ（Ｎ１−アセチルスペルミジン Ｅ　〃　、スペルミジン＋プトレツンン従って、スペル
ミン、スペルミジン、プトレッシン　Ｎｌ−アセチルス
ペルミジン　Ｎ８−アセチルスペルミジンは次の式から
求めることができる。

スペルミン（μＭ）＝Ｋ（ｄ、−ｃ−ｅ　）スペルミジ
ン（μＭ）　＝Ｋ　（ａ　＋　２０　＋２ｅ　−２ｄ　
）プトレッシン（μＭ）＝Ｋ（２ｄ−ａ−２ｃｍｅ　）
Ｎ’−７セチルスペルミシン（μＭ）＝に−ｃＮ８−ア
セチルスペルミジン（μＭ）＝に−ｂただし、Ｋ＝　Ｉ
　Ｘ　１０’／６２５０上記式及び測定値から各成分濃
度を計算した結果は次のとおりである。

スペルミン゛　　１０．０μＭ スペルミジン：　　　１０．１μＭ プトレッシン：　　１０．１μＭ Ｎ１−アセチルスペルミジン　：　　１０．２μＭＮ８
−アセチルスペルミジン　：９．６μＭこの各成分の測
定結果は、調製各成分濃度と極めてよく一致し、本発明
の定量法が高い精度を有することが認められる。

実施例６ 本例は、スペルミン、スペルミジン、フトレッシン、ア
セチルスペルミン、　Ｎ１−アセチルスペルミン　Ｎ８
−アセチルスペルミジン、アセチルプトレッシンを含有
ｆる試料からスペルミン、スペルミジン、プトレッシン
及びアセチルプトレツ／／の濃度を求める場合のもので
ある。

まず１．、参考例１と同一組成の発色液を０．１Ｍ’Ｊ
ン酸緩衝液ｐＨ６，５で調整し、この発色液１．５ｍＡ
ト市販試薬スペルミン、スペルミジン、フトレソゾン、
アセチルスベルミ、ン　Ｈ＋−アセチルスペルミジン　
Ｎ８−アセチルスペルミジノ、アセチルプトレッシンを
用いて、それらの各２．０ｍＭ水溶液を調製し、各溶液
２５μｔずつ（最終の各成分濃度は２０μＭ）と蒸留水
０．５２＋＋＋ｌを３ｍ７！セルに入れ、３５℃で３分
間予熱後、ポリアミンオキシダーゼＡＴ−１５μｔ（約
０．１単位）を添加し、約５分間反応させた。反応終了
液に０．３Ｍホウ酸ナナトリウム水溶液０．３ｌを添加
し、５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ａ工程）。続い
てプトレッシンオキシダーゼを５μｔ（約５単位）添加
し、３５℃で１５分間反応を続け、５０５ｎｍの吸光度
を測定した（Ｂ工程）。次に新たに調製したポリアミン
類各成分水溶液試料各２５μｔと蒸留水０．７２ｍ１を
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５で調製した発色液１．
５−に添加し、３５℃で３分間予熱後、アセチルプトレ
ッシンオキシダーゼを５μｔ（約０．５単位）添加し、
約１０分間反応させた。反応終了後０．３　Ｍホウ酸ナ
トリウム水溶液ｏ、ｉｙを添加し、５０５　ｎｍの吸光
度を測定した（Ｃ工程）。続いてプトレッシンオキシダ
ーゼ５μｔ（約５単位）を添加し約１５分間反応を続け
５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｄ工程）。このよう
にして得られた各工程の吸光度変化量は次の通りであっ
た。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．３７５１３　　ｔ
ｔ　　　　　　　　　　ｂ　＝　０．３７４０　　／／
　　　　　　　　　　　　　　　ｃ　　＝　　０．１２
３１）　　ｔｔ　　　　　　　　　　　　　　　ｄ　　
＝　　０．２５０目的とする各成分濃度（μＭ）は次式
で与えられる。

スペルミン＝Ｋ（ｂ−ｄ） スペルミジン−Ｋ（ａ＋２ｄ−２ｂ　）プトレッシン−
Ｋ　（２ｂ−ａ−ｄ、　）アセチルプトレッシン＝に−
ｃ ただし、Ｋ　＝　Ｉ　Ｘ　１０’／６２５０これよす、
スペルミン１９．８μＭ、スペルミジン２０．３μＭ、
プトレッシン１９．７μＭ及びアセチルプトレッシン１
９．７μＭが算出され、各調製成分濃度と測定誤差範囲
内でよく一致した値が得られていることがわかる。

実施例７ 本例はスペルミン、スペルミジン、フトレツンン、アセ
チルスペルミン　Ｈ＋−アセチルスペルミジン　Ｎ８−
アセチルスペルミジン、アセチルプトレッシンの混合試
料中のスペルミン、スペルミジン、プトレッシン　Ｎ８
−アセチルスペルミジンの濃度を求める場合のものであ
る。

実施例１のＡ工程とＢ工程の測定を行ったのち、以下の
操作を行った。

新たに調製した７種のポリアミン類の混合試料と蒸留水
０．７５ゴを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，５・０．１
Ｍ炭酸ナトリウム・塩化カリウム・ホウ酸カトリウム緩
衝液（ｐＨ８，５）の１１の混合液で調製した発色液１
．５ｍｌに添加し、３５℃で３分間予熱後、プトレッシ
ンオキ／ダーゼを５μｔ（約５単位）添加し約１５分間
反応した。反応終了後、５Ｎ塩酸水溶液４０μｔを添加
し、５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｃ工程）。続い
てこれにポリアミンオキシダーゼＰＣ−３を５μｔ（約
１５単位）を添加し、約１０分間反応後、５０５　ｎｍ
の吸光度を測定した（Ｄ工程）。

このようにして得られた各工程の吸光度変化量は次の通
υであった。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．３７５Ｂ　　ｔｔ
　　　　　　　　　　ｂ　＝　０．３７５０／７　　　
　　　　ｔｔ　　　　　　　　　　　ｃ＝０．２５０Ｄ
　　／／　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｄ　　
＝　　０．３７０７種のポリアミン類の各成分混合試料
中の４種の各ポリアミン成分濃度は、 スペルミン−Ｋ（ｂ−ｃ） スペルミン７　＝　Ｋ　（ａ＋　２ｃｍ２ｂ　）プトレ
ッシン＝　Ｋ　（２ｂ−ａ−ｃ　）Ｎ８−アセチルスペ
ルミジン−Ｋ（２ｃ＋ｄ−２ｂ）であるから、上記測定
値より算出された各成分濃度は、次のとおりである。

スペルミン　：　　２０．０μＭ スペルミジン：　　２０゜０　〃 プトレッシン：２０．０／／ Ｎ８−アセチルスペルミジン　　１９．２／／これらは
調製成分濃度と極めてよく一致している。

実施例８ 参考例１と同一組成の発色液を０．１ＭＩＪン酸緩衝液
ｐＨ６，５で調製し、この発色液１．５−とアセチルス
ペルミ／、Ｎ１−アセデルスペルミジン　Ｎ８−アセチ
ルスペルミジン、アセチルプトレッシンの各２．０ｍＭ
水溶液を２５μｔずつ（最終的各成分濃度は２０μＭ）
と蒸留水０．６０＋＋＋Ｊを３　ｍｌセルに入れ、３５
℃で３分間予熱後、ポリアミンオキシダーゼＡＴ−１を
５μｔ（約５単位）添加し、１０分間反応させた。反応
終了液に０．３Ｍホウ酸ナナトリウム溶液０．３ｅを加
え５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ａ工程）。続いて
プトレッシンオキ／ダーゼ５μｔ（約５単位）を添加し
、３５℃で１５分間反応を続け、その吸光度を測定した
（Ｂ工程）。

次に新たに調整した各成分水溶液試料（各２５μｔ）と
蒸留水０．８４７を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，５で
調製した発色液１　、５　ｍｌとともに３　ｍｌセルに
入れ、３５℃で３分間予熱後、ポリアミンオキシダーゼ
ＰＣ−３を５μｔ（約１５単位）を添加した。約１５分
間反応後、５Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液５０μｔを添
加し、ｐＨを７．５付近に調整し５０５　ｎｍの吸光度
を測定した（Ｃ工程）。続いてアセチルプトレッシンオ
キソダーゼを５μｔ（約０．５単位）添加して約１０分
間反応させ、アセチルプトレッシン（Ｎ８−アセチルス
ペルミジンから生じたアセチルプトレッシンと試料中ア
セチルプトレッシン）の酸化によって生じた過酸化水素
にもとず〈吸光度を測定した（Ｄ工程）。この反応にお
いて得られた各工程の５０５　ｎｍの吸光度変化量は下
記のポリアミン量に相当する過酸化水素量を示すもので
ある。

へ工程：２・アセチルスペルミン＋Ｎ１−アセチルスペ
ルミジン Ｂ工程ニアセチルスペルミシン ジン Ｃ工程：Ｎ８−アセデルスペルミジン Ｄ工程：Ｎ８−アセチルスペルミジン＋アセチルプトレ
ツン／ なお、各工程において測定された吸光度変化量は、次の
とおりであった。

Ａ工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．３７５Ｂ　　ｕ　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｂ　　＝　　０．２
５０Ｃ　　／／　　　　　　　　　　　　　　　　ｃ＝
０．１３０Ｄ　　ｔｔ　　　　　　　　　　　　　　　
　　ｄ　　＝　　０．２６２従って、各ポリアミン成分
濃度（７７Ｍ）は、各］工程の吸光度変化量よ９次の式
で算出することができる。

アヤチ／ｌ／　２　＜　／ｌ／ミ７＝Ｋ　（　ａ−ｂ　
）　　−２（１．０”Ｍ）Ｎ１−アセチルスペルミジン
＝Ｋ　（　２ｂ−ａ　）　−２０．ＯＨ２−アセチルス
ペルミジン−に−ｃ＝２０．８アセチルプトレツシン＝
Ｋ（　ｄ−ｃ　）＝２１．まただし、Ｋ　＝　Ｉ　Ｘ　
１０６／６２５０これら本発明の方法による各成分の定
険値は、供試調製各成分濃度とよく一致している。

実施例９ ｐＨ６，５の０．１Ｍリン酸緩衝液１００　ｍにペルオ
キシダーゼ５ｍ７、フェノール０．２ｍ／！及び４−ア
ミノアンチピリン１０〜を溶解して調製した発色液１．
５−と蒸留水０．５４ｍ１及びアセチルスペルミン、Ｎ
１−アセチルスペルミジン　Ｎ８−アセチルスペルミジ
ンをそれぞれ別個に溶解して調製した各１．０ｍＭ水溶
液を５０μｔずつを容量３ｙｄのセルに入れた。この場
合の混合液中のポリアミン類各成分の濃度は各２０μＭ
である。この混合液を３５℃の温度で３分間予熱したの
ち、ポリアミンオキシダーゼＡＴ−１を５μｔ（約３単
位〕添加し、１０分間反応させた。反応終了液に０．３
Ｍホウ酸ナナトリウム溶液０．３−加えて５０５　ｎｍ
の吸光度を測定した（人工程）。

続いて、この液にプトレツノンオキシダーゼ５μｔ（約
５単位〕を添加し、３５℃の温度で１５分間反応させ、
反応終了液の５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｂ工程
）。

この溶液にさらに５Ｎ塩酸水溶液５０μｔを添加してｐ
Ｈを５．５付近に調整し、ポリアミンオキ／ダーゼＰＣ
−３を５μｔ　（約１５単位）添加後、約１５分間反応
を行い５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｃ工程）。

各工程において測定された吸光度変化量は次のとおりで
あった。

Ａ工程における吸光度変化量　ａ　＝　０．３７０Ｂ　
　ｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｂ　
　＝　　０．２５０Ｃ！　　／／　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ｃ　　＝　　０．１２９これ
らの各工程における吸光度変化量は、それぞれ下記のポ
リアミン成分量に相当する過酸化水素生成量にもとすく
ものである。

ａ　　２・アセチルスペルミン十Ｎ１−アセチルスペル
ミジン ｂ゛　アセチルスペルミン＋Ｎ１−アセチルスペルミジ
ンｃ：Ｎ８−アセチルスペルミジン 従って、各ポリアミン成分濃度は、次のように算出され
る。

（ｔｉ　Ｍ　） アセチルスペルミン＝Ｋ（ａ−ｂ　）＝　　１９．２Ｎ
１−アセチルスペルミジン＝Ｋ　（２ｂ−ａ　）　＝２
０．８Ｎ８−アセチルスペルミジン−に−ｃ＝２０．６
ただし、Ｋ　＝　ｌ　Ｘ　１０　／６２５０である。

本発明方法による上記測定値は、各成分調製濃度とよく
近似し、信頼性の高いものであることが理解できる。

実施例１０ 緩衝液としてｐＨ５，５の０．１ＭＩＪン酸緩衝液を用
いて参考例１と同様の組成の発色液を調製した。

コノ発色液１．５ｒｎｌとＮ８−アセチルスペルミジン
。

アセチルプトレッシンの各２．０ｍＭ溶液を５０μｔず
つ（各成分の最終濃度は４０μＭ）と蒸留水０．８４ゴ
を３−セルに入れ、３５℃で３分間予熱後、ポリアミン
オキ／ダーゼｐｃ−３を５μｔ（約１５単位）添加し、
約１５分間反応させた。反応終了後、５Ｎ−水酸化ナト
リウム水溶液５０μｔを添加し、ｐＨを７．５付近に調
整して５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ａ工程）。続
いてアセチルプトレッシンオキシダーゼを５μｔ（約０
．５単位〕添加し、約１０分間反応させた。反応終了後
５０５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｂ工程）。

両工程の反応による吸光度変化量は、それぞれ次のとお
りであった。

人工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．２５２Ｂ　　　ｎ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｂ　　＝　　０
．５０８これらの吸光度変化量は、下記のポリアミン成
分モル割合量に相当する過酸化水素生成量にもとすくも
のである。

ａ：Ｎ”−アセチルスペルミジン ｂ：Ｎ８−アセチルスペルミジン＋アセチルフトレツシ
ン 従って、上記測定値より、各ポリアミン成分濃度（μＭ
）は次のように算出することができる。

Ｎ８−アヤチ／ｌ／　２　＜　／ｌ／　ｉジｙ−に、ａ
＝４０．３　”Ｍ）アセチルプトレッンン二Ｋ（ｂ−ａ
　）＝４１．０各成分濃度４０μＭに対し、良好な近似
値が得られており、本発明の定量法が優れていることが
わかる。

実施例１１ 実施例２に用いた尿試料と同一の試料を用いて本発明の
分別定量法をさらに検討した。すなわち、実施例２と同
一組成の発色液をｐＨ６，５の０．１Ｍリン酸緩衝液で
調製し、この発色液（１）ｉ、ｓｍｌに尿０　、５　ｍ
ｌと蒸留水０．１９−加えて３５℃で３分間予熱した。

次いでポリアミンオキンダーゼＡＴ−１を０．１単位（
１０μｔ）添加し５分間反応させ、反応終了液に０．３
Ｍホウ酸ナナトリウム溶液０、３　ｍｌを加えてｐＨを
８付近に調整しく液量は２．５−となる）、５５５　ｎ
ｍの吸光度を測定した（Ａ工程）。続いてプトレッシン
オキシダーゼ５単位（５μｔ）を添加し、３５℃で１５
分間反応させ、５５５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｂ工
程）。次に、０．１Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，５）　
　０．１Ｍ炭酸ナトリウム・塩化カリウム・ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，５）１：１の混合液で調製した上記と同一
組成の発色液（ｎ）１．５−に尿０．５−と蒸留水帆１
９ｒｎｌを加えて３５℃で３分間予熱シ、プトレツシン
オキシター−ゼを５単位添加し、３５℃で１５分反応後
、５５５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｃ工程）。次に尿
２０ｒｎｌに１２Ｎ塩酸５．０ｍ／を加え、１００℃で
３時間加熱した。生じた沈殿を遠心分離し、上澄液にＩ
ＯＮの水酸化ナトリウム液を加えｐＨを６付近に調整し
た。さらに蒸留水６０ｍ６を加えた（液量約１００ｍ／
り。この液をアンバーライトＣＧ−５０カラム（容積２
．０ｍｅ）に吸着させ、蒸留水２０ｄと０．５Ｎ塩酸３
　ｍｅで洗浄後、０．５Ｎ塩酸１０７で溶出した。溶出
液１ｄ工。

Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７刊近に調整し、蒸留
水で２０ｍ１とし、脱アセチル化尿として次の測定に使
用した。

上述の発色液１１．５＋ｍに上記脱アセチル化尿０．５
ｍｌと蒸留水０．１９ｍ７！を加えて３５℃で３分間予
熱したのち、ポリアミンオキシダーゼ帆１単位（１０μ
ｔ）添加し５分間反応させた。反応終了液に０．３Ｍホ
ウ酸ナナトリウム溶液０、３　ｍｅを加えた後５５５ｎ
ｍの吸光度を測定した（Ｄ工程）。続いてプトレッシン
オキシダーゼ５単位（５μｌ）ｔ”添加し、３５℃で１
５分間反応させ５５５　ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ工
程）。次に発色液ｍｌ−５ｍ１に脱アセチル尿０．５−
と蒸留水帆１９ｍ１を加えて３５℃で３分間予熱し、プ
トレッシンオキシターゼを約５単位添加し、３５℃の温
度で１５分間反応させたのち５５５　ｎｍの吸光度を測
定した（Ｆ工程）。

各工程の反応によシ得られた吸光度の変化量は次のとお
りであった。

人工程の吸光度変化量　ａ　＝　０．０２７Ｂ　　ｕ　
　　　　　　　　　ｂ　＝　０．０３３０　　／／ｃ　
＝　０．０２５ Ｄ　　ｔｔ　　　　　　　　　　ｄ　＝　０．０４２Ｅ
　〃　　　　　　　　　θ＝　０．０８１Ｆｎ　　　　
　　　　　　ｆ　＝　０−０７３本例に用いた発色系の
分子吸光係数は１７，２００であυ、従って濃度（μＭ
）換算における定数には、Ｋ＝　Ｉ　Ｘ　１０　／１７
，２００ で与えられるから、測定液を基準とした場合のポリアミ
ン類各成分濃度は、次のように算出される。

スペルミン−０，４７μＭ、スペルミジンー０．６４μ
Ｍプトレッシン−０，８１ｚｚＭ、アセチルスペルミン
−０μＭアセチルスペルミジン＝０．８７μＭ。

アセチルプトレッシン−１，９０μＭ 従って、試料として用いた尿中のポリアミン類各含有成
分の濃度は次のように換算された。

スペルミン＝２．４μＭ、スペルミジン−３，２μＭフ
トレツシンー４．１μＭ、アセチルスペルミン−０μＭ
アセチルスペルミジンー４．４μＭ アセチルフトレツシン−９，５μＭ このように実施例２と実施例１４の結果は非常によく一
致し、いずれの方法も極めて有効な方法であることを示
すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図、第５図、第７図及び第９〜第１５図は
、各種ポリアミン類をそれぞノ１．の成分に好適な酸化
酵素を用いて酸化反応させた場合の時間と生成過酸化水
素にもとすいて変化する吸光度との関係を示すグラフで
あり、第２図、第４図。 第６図及び第８図は、ポリアミン類各種成分の濃度と吸
光度との関係を示すグラフである。 特許出願人　天野製薬株式会社 代理人　同　形　　明 第１図　　　　第２図 １１４ＭＣ分）　　　　　　　　　　　　　　　　ボッ
アミン膿しＬ（ｐＨ）第３図　　　　第４図 時　聞　（ｅ−）　　　　　　　　　　　　　　　　　
約１ミゾ社≠Ｈ）第５図　　　第６図 第、７図　　　第８図 ｎ　　ｌ’ＪＩ　　　（分）　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　７゛′す′す゛）Ｌ、７　；３（、Ｍ
）第０図　　　　第１０図 第１１図　　　　　第１２図 第１３図　　　　　第１４図 時用（Ｊｔ−）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　アセチルスペルミン　Ｎ＋−アセチルスペルミジン
   及びＮ８−アセチルスペルミジンの中から選ばノｔた少
   なくとも１種のアセチルポリアミンとアセチルプトレッ
   シンとを含む混合系あるいはさらにスペルミン、スペル
   ミジン及びプトレッシンの中から選ばれた少なくとも１
   種のポリアミンを含む混合系に対し、アセチルプトレッ
   シンオキシダーゼと、ポリアミンオキンダーゼ及ヒプト
   レツノンオキシダーゼの中から選ばれた少なくとも１種
   の酵素とを作用させ、生成する過酸化水素量を測定し、
   これに基づいて各成分の濃度を定量することを特徴とす
   るポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法。 ２　ポリアミンオキシダーゼがポリアミンオキシダーゼ
   ＡＴ−１及びポリアミンオキシダーゼＰＣ−３の中から
   選ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３　アセチルスペルミン、Ｎ−アセチルスペルミン７及
   びＮ８−アセチルスペルミジンの中から選ばれた少なく
   とも１種のアセチルポリアミンを含む混合系又はこのア
   セチルポリアミンと、スペルミ／、スペルミジン及びフ
   トレソシンの中から選ばノＬ／ζ少なくとも１種のポリ
   アミンとを含む混合系に対し、ポリアミンオキシダーゼ
   とプトレツンンオキンダーゼとを作用させ、生成する過
   酸化水素量を測定し、これに基づいて各成分の濃度を定
   量することを特徴とするポリアミン及びアセチル化ポリ
   アミンの分別定量方法。 ４　ポリアミンオキシダーゼがポリアミンオキシダーゼ
   ＡＴ−１及びポリアミンオキシダーゼＰＣ−３の中から
   選ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 ５　アセチルプトレッシンを含む糸に、アセチルプトレ
   ッシンオキンダーゼを作用させ、生成する過酸化水素量
   を測定し、これに基づいてアセチルプトレッシンの濃度
   を定量することを特徴とするアセチルプトレッシンの定
   Ｊｔ　方法。