JPS63182000A

JPS63182000A - クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬

Info

Publication number: JPS63182000A
Application number: JP62013645A
Authority: JP
Inventors: Masaru Suzuki; 勝鈴木
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1987-01-23
Publication date: 1988-07-27
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: JPH0698032B2; US5047329A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、酵素法による体液中のクレアチン又はクレア
チニンの測定法及びこれらの測定用試薬に関する。

［従来技術］現在、腎臓疾患、筋肉疾患の重要な検査項目として、血
清、尿中のクレアチニンあるいはクレアチンが、それぞ
れ臨床検査室で測定されている。

その測定法の大部分は、非特異的な化学反応に基づくヤ
ツフエ法でおこなわれ、測定値に誤差が生じる大きな欠
点がある。最近になって、この欠点を克服するために種
々の酵素的測定法が開発されているが、例えば次の酵素
反応による発色定量法が挙げられる。（特公昭６Ｏ−３
４８０）。

クレアチニン・アミドヒドロラーゼクレアチニン十Ｈ２０−一→クレアチンクレアチン・ア
ミジノヒドロラーゼクレアチン＋１−（２０−−一→ザルコシン十尿素パー
オキシダーゼＨ２Ｏ２＋発色剤　　　　　　　　発色（測定）［発明
が解決しようとする問題点］この方法は、ヤツフエ法に影響を与える各種物質（蛋白
質、ケトン体、セファロスポリン系抗生物質等）の影響
がなく非常に優れた方法である。

しかし、ザルコシン・オキシダーゼはその基質特異性の
ために、ザルコシンのみならず、治療上投与されている
薬物（例えばリドカイン等）の代謝物質であるＮ−エチ
ルグリシンにも作用するので、プラスの誤差（測定値の
異常高）が生じてくるという欠点がある。このような酵
素法による従来の測定法の欠点を解消すべく鋭意検討を
重ねた結果、被検試料中に存在するＮ−エチルグリシン
に対し極めて高い作用活性を有する酵素を用いて該物質
を予め分解した後、クレアチンもしくはクレアチニンを
測定すれば、精度良く試料中のクレアチンもしくはクレ
アチニンを測定出来ることを知り本発明を完成した。

本発明は下記の方法及び試薬を提供するものである。

（１）　　クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて
試料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在す
るＮ−エチルグリシンを酵素的に分解した後、ザルコシ
ン・オキシダーゼを作用させることを特徴とするクレア
チンの測定方法。

（２）　　クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて
試料中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在す
るＮ−エチルグリシンを該物質に対するＫｍ値（ミカエ
リス定数）が２ＱｍＭ以下のザルコシン・オキシダーゼ
で分解した後、該物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数
）が５ＱｍＭ以上のザルコシン・オキシダーゼを添加す
るか又は別個に作用させてクレアチンを測定することを
特徴とする上記第（１）項記載の方法。

（３）　　クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレア
チン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料中のクレアチ
ニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグ
リシンを酵素的に分解した後、ザルコシン・オキシダー
ゼを作用させることを特徴とするクレアチニンの測定方
法。

（４）　　クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレア
チン・アミジノヒドロラーゼを用いて、試料中のクレア
チニンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチル
グリシンを該物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が
２０ｍＭ以下のザルコシン・オキシダーゼで分解した後
、該物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が５Ｑ＋ａ
Ｈ以上のザルコシン・オキシダーゼを添加するか又は別
個に作用させてクレアチニンを測定することを特徴とす
る上記第（３）項記載の方法。

（５）ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシン
に対するＫｍ値；２０ｍ１４以下（ｐＨ８，３７℃）］
及びカタラーゼ、又は上記ザルコシン・オキシダーゼ、
並びに４−アミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与
体及びパーオキシダーゼから成る第１反応試薬及びクレ
アチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキシダ
ーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するＫｍ値；５ＱｍＭ以
上（ｐＨ８，３７℃）］、パーオキシダーゼ及びＨ２Ｏ
２発色剤から成る第２反応試薬を組合せて成るクレアチ
ン測定用試薬。

（６）　　クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコ
シン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するＫｍ
値；２０ｍＮ以下（ａｔ！８．３７℃）］及びカタラー
ゼ、又は上記クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザ
ルコシン・オキシダーゼ、並びに４−アミノアンチピリ
ンと酸化縮合する水素供与体及びパーオキシダーゼから
成る第１反応試薬及びクレアチニン・アミドヒドロラー
ゼ、ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに
対するＫｍ値；５ＱｍＭ以上（ｐＨ８，３７℃）］、パ
ーオキシダーゼ、及びＨ２０□発色剤とから成る第２反
応試薬を組合せて成るクレアチニン測定用試薬。

以下、本発明を具体的に示す。先ず本発明の被検液とし
ては、血清、尿等如何なる試料でも良い。

工、クレアチンの測定第１反応：ザルコシン・オキシダーゼーの同上刃タラーゼ２日２０２　　　　　　　　　　２Ｈ２０＋０２あるい
はパーオキシダーゼ第２反応：クレアチン・アミジノヒドラローゼクレアチン十Ｈ２Ｏ−一−→ザルコシン＋尿素ザルコシ
ン・オキシダーゼ−■ パーオキシダーゼＨ２Ｏ。十Ｈ２ｏ２の発色剤−→発色（測定）なお、上
記反応時のｐＨは、何れも６．５〜９．０の範囲である
のが望ましい。前記した４−アミノアンチピリンと酸化
縮合する水素供与体としては、（ｉ）一般式（■）：（但し、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、又は低級アルコキシル基、２は水
素原子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で
表わされるフェノール性化合物、（ｉｉ）一般式（■）
：（但し、Ｒ、Ｒは水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシル基、Ｒ，Ｒ３は低級アルキル基、ヒドロキシ低
級アルキル基、アセデルアミド基を含む低級アルキル基
またはスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）で
表わされるアニリン誘導体、（ｉｉｉ）　トルイジン系
誘導体或いは（１ｖ）アニシジン系誘導体を用いること
ができる。

一般式（Ｉ）で表わされるフェノール性化合物としては
、例えばｐ−りＯルフェノール、ｐ−ブロムフェノール
、２．４−ジクロルフェノール、２．４−ジブロムフェ
ノール、２．４−ジクロルフェノールスルホネート等が
ある。

一般式（ｎ）で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイ
ジン、ｍ−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（３〜メチルフェニルｉＮ−アセチルエチ
レンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ス
ルホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３
，５−ジメトキシアニリン等がある。

トルイジン系誘導体としては例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｍ−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン
、Ｎ、Ｎ−ジェタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ′　−ヒドロキシ−エチルアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′　−ア
セデルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチ
ルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−
（３−メチルスルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン
、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−トル
イジン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル＞−ｍ−トルイジン、ナトリウ
ム−３，５−ジメチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−アニリン等がある。

アニシジン系誘導体としては例えばＮ、Ｎ−ジメチル−
ｍ−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシ
ジン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３゜５−ジメトキシアニリン、ｍ−アセト
アミド−Ｎ。

Ｎ−ジエチルアニリン等がある。

又、本発明に於けるＨ２Ｏ２の発色剤としては、（１）
４−アミノアンチピリンと一般式（Ｉ）：（但し、Ｘは
ハロゲン原子、Ｙは水素原子、ハロゲン原子、低級アル
キル基、又は低級アルコキシル基、２は水素原子、スル
ホン酸基又はカルボキシル基を示す。）で表わされるフ
ェノール性化合物、ｍ＋４−アミノアンチピリンと一般
式（）：（但し、Ｒ，Ｒ４は水素原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシル基、Ｒ１Ｒ３は低級アルキル基、ヒドロキシ
低級アルキル基、アセチルアミド基を含む低級アルキル
基またはスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。）
で表わされるアニリン系誘導体、（ｉｉｉ）　４−アミ
ノアンチピリンとトルイジン系誘導体、（ｉＶ）４−ア
ミノアンチピリンとアニンジン系誘導体、或いは（■）
ジエチルアニリンまたはジメチルアニリンと３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを用いることがで
きる。

一般式（Ｉ）で表わされるフェノール性化合物としては
、例えばｐ−クロルフェノール、ｐ−ブロムフェノール
、２．４−ジクロルフェノール、２．４−ジブロムフェ
ノール、２．４−ジクロルフェノールスルホネート等が
ある。

一般式（Ｉ）で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイ
ジン、ｍ−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチルエ
チレンジアミン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
スルホプロピル）メタトルイジン、ナトリウム−Ｎ−エ
チル＝Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）３
゜５−ジメトキシアニリン等がある。

トルイジン系誘導体としては例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｍ−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン
、Ｎ、Ｎ−ジェタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ’　　−ヒトＯキシーエチルアニリン
、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′　−
アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メ
チルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ
−（３−メチルスルホンアミドエチル）−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ナトリ
ウム−３，５−ジメチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−アニリン等がある。

アニンジン系誘導体としては例えばＮ、Ｎ−ジメチル−
ｍ−メトキシ−アニリン、ナトリウム−Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−アニシ
ジン、ナトリウム−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３゜５−ジメトキシアニリン、ｍ−アセト
アミド−Ｎ。

Ｎ−ジエチルアニリン等がある。

本発明では過酸化水素の発色を妨害する検体中のアスコ
ルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させるこ
とによって除去することができる。

この場合、アスコルビン酸オキシダーゼは他の酵素反応
に先だって作用させても、また他の酵素反応と共役させ
て同時に作用させて除去してもよい。

アスコルビン酸オキシダーゼとしては植物由来のもの、
好ましくはカポチャ、キュウリ由来のものがある。

なお、ここで使用されるザルコシン・オキシダーゼ−の
はＮ−エチルグリシンに対し作用活性が高く、該物質に
対するミカエリス定数１（ｍが２０１以下の酵素なら酵
素の起源は問わないが、例えばコリネバクテリウム属、
アースロバフタ−属、アルカリゲネス属、シュウトモナ
ス属、ミクロコツカス属等の微生物が生産するザルコシ
ン・オキシダーゼがこれにあたる。これらの酵素はいず
れも培養によって生産でき、又市販品として入手するこ
ともできる。また、ザルコシン・オキシダーゼ−■は、
Ｎ−エチルグリシンに対し作用活性が低く、該物質に対
するミカエリス定数Ｋｍｉｌは５ＱｍＭ以上であり、ザ
ルコシンに対し作用活性が高い酵素であれば、その起源
を向わないが、例えばバチルス属の生産するザルコシン
・オキシダーゼ、特にザルコシン・オキシダーゼ−Ｎ（
特開昭６１−１６２１７４号）が好適な例として挙げら
れる。

■、クレアチニンの測定第１反応：クレアチン・アミジノヒドロラーゼクレアチン十Ｈ２ｏ−一一→ザルコシン＋尿素ザルコシ
ン・オキシダーゼ−のザルコシン・オキシダーゼ−のカタラーゼ２Ｈ２０２２Ｈ２０＋０２またはパーオキシダーゼＨＯ＋４−アミノアンチビ□無色物質リンと酸化縮合する水素供与体第２反応：クレアチニン・アミドヒドロラーゼクレアチニン十Ｈ２０クレアチンクレアチン・アミジノヒドロラーゼクレアチン十Ｈ２０ザルコシン＋尿素ザルコシン・オキシダーゼ−［Ｆ］ペパーキシダーゼＨ２Ｏ２＋Ｈ２Ｏ２の発色剤−発色剤（測定）４−アミ
ノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体及びｌ−１２
０□の発色剤としては前述のクレアチンの測定に使用し
たものと同じものが使用できる。

本発明に用いる酵素は、いかなる起源、由来のものでも
よく、クレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼに関しては、通常のクレアチニ
ン及びクレアチンの測定に於て用いられている酵素は例
外なく用いられるが、それらの内の数例を挙げれば、ク
レアチニン・アミドヒドロラーゼに於ては、例えば、ア
ルカリゲネス属、ペニシリュウム属、シュードモナス属
、フラボバクテリウム属、アースロバフタ−属、コリネ
バクテリウム属などの微生物が産生ずるクレアチニン・
アミドヒドロラーゼがあり、クレアチン・アミジノヒド
ロラーゼに於ては、例えば、シュードモナス属、バチル
ス属、アルカリ土類金属、フラボバクテリウム属、アー
スロバフタ−属、コリネバクテリウム属などの微生物が
産生ずるクレアチン・アミジノヒドロラーゼがあげられ
る。又カタラーゼ及びパーオキシダーゼも動物、植物、
微生物等の何れの起源のものを用いてもよい。これら酵
素はいずれも培養によって生産でき、又市販品として入
手できる。

本発明のクレアチンあるいはクレアチニンの分析は液体
中でおこなうか、または乾式分析法を用いておこなうこ
とができる。液体中でおこなう場合には、前述の第１反
応液と試料を混合して、除去すべき物質（例えばザルコ
シン、Ｎ−エチルグリシン等）を約３７℃で酵素分解し
、次いで第２反応試薬を加えて酵素反応させ、試料中の
クレアチンあるいはクレアチニンから生成する過酸化水
素をパーオキシダーゼと過酸化水素の発色剤との反応で
発色させ、分光光度計で測定する。乾式分析法で行うば
あいには、前記した第１反応試薬と第２反応試薬を別々
の吸収性担体く例えば口紙、ストリップ、ゼラチン質膜
等）に浸漬被覆し、その２層間にポリアクリルアミド等
の分子分画膜を入れる。これ等多層のものを支持膜で、
分光光度計で分析可能な透明な材質の上にのせる。試料
液を多層面上に滴下し、反応によって生ずる色の度合を
測定しクレアチン或いはクレアチニンを測定する。

［発明の効果］本発明によれば、試料中に存在するＮ−エチルグリシン
に対し作用活性の高い酵素（ザルコシン・オキシダーゼ
）を用いて該物質を予め分解した後、クレアチンもしく
はクレアチニンを測定するため、著しく高い精度で試料
中のクレアチンもしくはクレアチニンを測定することが
可能となり、臨床検査の診断分野において極めて有意義
である。

［実施例１以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１第１反応試薬：クレアチン・アミジノヒドロラーゼ（盛
進製薬株式会社製）４０にＵ、ザルコシン・オキシダー
ゼ（Ｓｏ）（盛進製薬株式会社製、Ｎ−エチルグリシン
に対するＫｍ値、１１　ｍＭ）　３にυ、西洋ワサビ由
来のパーオキシダーゼ７にＵ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼ０．５ＫＵ、２．４−ジクロルフェノールスルフォ
ネートＱ、５ｉＨ。

ＥＤＴＡ　・２Ｎａ２００１９、トリトンｘ−ｉｏ。

０１４ｇを０．１モルＴＥＳグツド・バッファー（ｐＨ
８，０＞１００ｍに溶解したもの。

第２反応試薬：クレアチニン・アミドヒドロラーゼ（盛
進製薬株式会社製）１０にＵ、ザルコシン・オキシダー
ゼＮ（特開昭６１−１６２１７４号に記載の方法により
製造したもの、Ｎ−エチルグリシンに対する）（ｍ値、
７７ｍＭ）１にｕ１フェロシアン化カリウム１．７Ｒｇ
、２，４−ジクロルフェノールスルフォネート０．１５
ｍＭ、　４−アミノアンチピリン０．０５ｍＭ，ＥＤＴ
Ａ　・２Ｎａ２００＊、トリトンＸ−１０００，４ｇを
０．１モルＴＥＳグツド・バッファー（ｐＨ８，Ｏ）　
１００ｍに溶解したもの。

試料（ヒト血清＞０．１１Ｉｉを採取し、これに第１反
応試薬を０．１ｊＩｅ加え３７℃、５分間反応させ、試
料中に含まれるクレアチン、ザルコシン、及びＮ−エチ
ルグリシンを分解した。次いでこれに第２反応試薬を１
．５ｍ加え、３７℃、５分間反応させた後、ミクロスペ
クトロメーター（ギルホード社製ステーサ■型）でΔＯ
Ｄ５１０ｎｍにて０、Ｄ、値を求め、予じめ既知濃度の
標準クレアチニン試料で求めた検量線よりクレアチニン
量を求めた。

他方比較のため、クレアチニンを１．Ｏｏ■／ｄ１含有
（標準クレアチニンを１．ＯＯＩＲｇ／ｄＪ添加した標
準ヒト血清）ヒト血清にＮ−エチルグリシンを０．９１
１９／ｄ１の割合になるように添加し、本発明法と従来
法〈Ｎ−エチルグリシンの分解反応を行なわないで、第
１反応試薬と第２反応試薬の２種の試薬を混合して３７
℃で１０分間作用させる。ただしカタラーゼは作用さゼ
ない。）で測定したところ、本発明法では０．９９ｓ＋
ｙ／ｄｉ、従来法では１．８１■／ｄ１どなった。

実施例２第１次反応試薬：ザルコシン・オキシダーゼ（Ｓｏ）（
盛進製薬■製、Ｎ−エチルグリシンに対する）（ｍ値、
１１１Ｍ）３にＵ、東洋紡■製西洋ワサビのパーオキシ
ダーゼ７にｕ１東洋紡＠製アスコルビン酸オキシダーゼ
０．５にＵ、２．４−ジクロルフェノールスルフォネー
ト０．５ミリモル、ＥＤＴＡ　−２−ソー’ｊ２００ｑ
、トリトンＸ−１００，０，４ｇを１００ａｉ！の０．
１モルＴＥＳグツド・バッファー（ｐＨ８）に溶解した
もの。

第２反応試薬：クレアチン・アミジノヒドロラーゼ３に
ｕ１ザルコシン・オキシダーゼＮ（実施例・１と同じも
の）１にｕ１フェロシアン化カリウム１．７ｇ１ｇ、２
．４−ジクロルフェノールスルフォネート０．１５ミリ
モル、４−アミノアンチピリン０．０５ミリモル、ＥＤ
ＴＡ　−２Ｎａ２００１１９、トリトンＸ−１００，０
，４ｇを１００ａｄ！の０．１モルＴＥＳグツド・バッ
ファー（ｐＨ８）に溶解したもの。

試料（ヒト血清）Ｏ５，１＃ｌ＋１！を採取し、第１反
応試薬を０．１ａｇ加え、５分間３７℃で反応させ、試
料中に含まれるザルコシン及びＮ−エチルグリシンを分
解した。次いで、第２反応試薬を１．５ｄ加えて３７℃
５分間反応させて、ミクロスペクトロホトメーター（ギ
ルホード社製ステーサ■型）でΔ０Ｄ５１０ｎｉ値を求
め、予め標準クレアチン試料で求めた検量線より、クレ
アチン吊を求めた。

他方比較のためクレアチンを１．０Ｏａ１ｇ／ｄｊ！含
有する（標準クレアチンを１．００Ｒｇ／ｄｊ！添加し
た標準ヒト血清）ヒト血清にＮ−エチルグリシンを０．
９■／ｄＪの割合になるよう添加し、本発明方法と従来
法で測定したところ、本発明法で１．０１■／ｄ１、従
来法では１．８４ｓ＋ｙ／ｄＪどなった。

前記した実施例より明らかな如く、本発明によれば従来
法と比較して、特異的な反応を行なうものであり、クレ
アチン及びクレアチニンを精度良く定量出来ることが認
められた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料
中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在するＮ
−エチルグリシンを酵素的に分解した後、ザルコシン・
オキシダーゼを作用させることを特徴とするクレアチン
の測定方法。
（２）クレアチン・アミジノヒドロラーゼを用いて試料
中のクレアチンを測定するに際し、試料中に存在するＮ
−エチルグリシンを該物質に対するＫｍ値（ミカエリス
定数）が２０ｍＭ以下のザルコシン・オキシダーゼで分
解した後、該物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が
５０ｍＭ以上のザルコシン・オキシダーゼを添加するか
又は別個に作用させてクレアチンを測定することを特徴
とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレアチン
・アミジノヒドロラーゼを用いて試料中のクレアチニン
を測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグリシ
ンを酵素的に分解した後、ザルコシン・オキシダーゼを
作用させることを特徴とするクレアチニンの測定方法。
（４）クレアチニン・アミドヒドロラーゼとクレアチン
・アミジノヒドロラーゼを用いて、試料中のクレアチニ
ンを測定するに際し、試料中に存在するＮ−エチルグリ
シンを該物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が２０
ｍＭ以下のザルコシン・オキシダーゼで分解した後、該
物質に対するＫｍ値（ミカエリス定数）が５０ｍＭ以上
のザルコシン・オキシダーゼを添加するか又は別個に作
用させてクレアチニンを測定することを特徴とする特許
請求の範囲第（３）項記載の方法。
（５）ザルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシン
に対するＫｍ値；２０ｍＭ以下（ｐＨ８、３７℃）］及
びカタラーゼ、又は上記ザルコシン・オキシダーゼ、並
びに４−アミノアンチピリンと酸化縮合する水素供与体
及びパーオキシターゼから成る第１反応試薬及びクレア
チン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキシダー
ゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するＫｍ値；５０ｍＭ以上
（ｐＨ８、３７℃）］、パーオキシダーゼ及びＨ＿２Ｏ
＿２発色剤から成る第２反応試薬を組合せて成るクレア
チン測定用試薬。
（６）クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコシン
・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対するＫｍ値；
２０ｍＭ以下（ｐＨ８、３７℃）］及びカタラーゼ、又
は上記クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシ
ン・オキシダーゼ、並びに４−アミノアンチピリンと酸
化縮合する水素供与体及びパーオキシダーゼから成る第
１反応試薬及びクレアチニン・アミドヒドロラーゼ、ザ
ルコシン・オキシダーゼ［Ｎ−エチルグリシンに対する
Ｋｍ値；５０ｍＭ以上（ｐＨ８、３７℃）］、パーオキ
シダーゼ、及びＨ＿２Ｏ＿２発色剤とから成る第２反応
試薬を組合せて成るクレアチニン測定用試薬。