JP4486702B2 - クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置 - Google Patents

クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置 Download PDF

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Description

本発明は、試料中に含まれるクレアチニンや塩分の定量を行うための測定方法、測定デバイス、及び測定装置に関する。
試料中に含まれるクレアチニン濃度の測定は、臨床化学や分析化学の分野において重要である。クレアチニンは筋肉の内在代謝の産物であるため、尿中のクレアチニン量は総筋肉質量を反映することが知られている。したがって、人間が一日に排泄する尿中のクレアチニン量は一般に個人ごとに一定であり、日間変動が無いといわれている。そのため、尿中のクレアチニン量は排泄される尿の濃淡の尺度として用いられることがある。また、尿中及び血中のクレアチニン量は尿毒症や腎機能の低下によって増減する。そのため、尿中または血中のクレアチニン量の測定により、尿毒症や腎機能の低下の有無を知ることができる。
クレアチニン濃度の測定方法としては、アルカリ性のピクリン酸溶液を用いたヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）反応に基づく方法が知られている。この方法においては、ピクリン酸がクレアチニンと反応することにより得られる橙赤色の生成物を分光学的に測定する（例えば、特許文献１参照）。
また、他のクレアチニン濃度の測定方法として、クレアチニンと特異的に反応する酵素を用いる方法が知られている。酵素を用いる方法としては、例えば、クレアチニンデイミナーゼを用いてクレアチニンを分解する方法がある（例えば、特許文献２参照）。この方法では、クレアチニンの分解により生成するアンモニア量をｐＨや電位の変化などから測定することにより、クレアチニン濃度を得ている。
酵素を用いる他の方法として、下記の式（１）〜（３）の反応により、クレアチニン濃度を測定する方法がある。
クレアチニン＋水 → クレアチン （１）
クレアチン＋水 → サルコシン＋尿素 （２）
サルコシン＋水＋酸素 →
グリシン＋ホルムアルデヒド＋過酸化水素 （３）
式（１）〜（３）の反応を触媒する酵素として、それぞれ順にクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）、及びサルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナーゼが用いられる。ここで、クレアチニンの定量方法としては、例えば、ペルオキシダーゼとともにロイコ色素やトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）試薬を利用し、式（３）において生成した過酸化水素を呈色させて分光学的に定量する方法が用いられている（例えば、特許文献３参照）。また、他のクレアチニン定量方法として、式（３）において生成した過酸化水素を電極で電気化学的に酸化し、流れる電流からクレアチニンを定量する方法が用いられている（例えば、特許文献４及び５参照）。
また、酵素を用いるさらに他の方法として、上記式（１）及び（２）の反応に加えて、上記式（３）の反応に代えて、サルコシンと電子伝達体（メディエータ）との反応を用いてクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献６及び７参照）。
特許文献６には、基板上に少なくとも一対の作用極及び対極を備え、電極上または電極周辺の基板上で試薬溶液を乾燥させることにより試薬を固定化したクレアチニンバイオセンサが開示されている。試薬溶液は、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びフェリシアン化カリウム（メディエータ）をｐＨ７〜８．５の緩衝液中に溶解させることにより得ている。また、緩衝液のｐＨが７未満またはｐＨが８．５を超えると、酵素活性が低下するため好ましくないことが開示されている。
特許文献７には、サルコシンオキシダーゼとともに、シクロデキストリンにより包摂されたメディエータを用い、比色法または電気化学的検出方法によりクレアチニンを定量することが開示されている。具体的には、シクロデキストリンにより包摂されるメディエータの例として、α−ナフトキノン（１，４−ナフトキノン）が挙げられている。しかし、特許文献７では、メディエータがシクロデキストリンに包摂されていない状態では、酵素を用いたクレアチニンの定量に不適切であることが開示されている。
また、酵素を用いるさらに他の方法として、式（１）及び（２）の反応に加えて、式（３）の反応に代えて、サルコシンとテトラゾリウム指示薬との反応を用いて分光学的にクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献８参照）。特許文献８には、クレアチニン定量用試薬組成物として、クレアチニン加水分解酵素、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム指示薬であるチアゾリルブルー及びｐＨ７．５のリン酸カリウムからなる混合試薬を用いることが開示されている。
また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ及びサルコシンデヒドロゲナーゼを用いて、クレアチニンをグリシンとホルムアルデヒドとに変えた後、生成したホルムアルデヒドを呈色剤により発色させ、その吸光度によりクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献９参照）。特許文献９には、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ及び呈色剤に加えて、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液と、ホルムアルデヒドの生成を促す反応促進剤としてフェリシアン化カリウムとを用いることが開示されている。
また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンの加水分解を触媒するポリマー、サルコシン酸化酵素及びメディエータを固定化した電極を用いて、クレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１０参照）。特許文献１０には、メディエータとして、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）などを用いることができることが開示されている。
さらに他のクレアチニン定量方法として、１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸カリウムを用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１１、非特許文献１〜３参照）。
米国特許第３７０５０１３号明細書 特表２００１−５１２６９２号公報 特開昭６２−２５７４００号公報 特表２００３−５３３６７９号公報 米国特許第５４６６５７５号明細書 特開２００６−３４９４１２号公報 特開２００５−１１８０１４号公報 特開昭５５−０２３９９８号公報 特開昭５４−１５１０９５号公報 特開２００３−３２６１７２号公報 特開昭６３−０３３６６１号公報
サリバン、外１名、「クレアチニンの高特異的テスト」、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、１９５８年、第２３３巻、第２号、ｐ．５３０−５３４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，"Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９５８，Ｖｏｌ．２３３，Ｎｏ．２，ｐ．５３０−５３４） ナラヤナン、外１名、「クレアチニン：レヴュー」、クリニカル ケミストリー、１９８０年、第２６巻、第８号、ｐ．１１１９−１１２６（Ｎａｒａｙａｎａｎ，"Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ"，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８，ｐ．１１１９−１１２６） クーパー、外１名、「４つの尿中クレアチニン測定方法の評価」、クリニカル ケミストリー、１９６１年、第７巻、第６号、ｐ．６６５−６７３（Ｃｏｏｐｅｒ，"Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９６１，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．６，Ｐ．６６５−６７３）
しかしながら、上記従来の方法では、以下のような問題点があった。
特許文献１に記載の方法においては、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、セリン等のアミノ酸やタンパク質、グルコース等の糖、アセトン、ビリルビン等の妨害成分の影響を受けるため、上記物質を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中においてクレアチニンを正確に定量することは困難である。例えば、アミノ酸やグルコース等の糖は、ピクリン酸と反応してしまう。
また、特許文献２に記載の方法においては、ｐＨや電位の変化が不安定であるため、クレアチニンを正確に定量することは困難である。
また、特許文献２〜１０に記載の方法においては、試料中に塩分等のイオン種や尿素が存在すると、酵素が変性することにより、酵素の活性が低下する。そのため、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって、反応速度にばらつきが生じる。したがって、イオン種や尿素を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中のクレアチニンを定量する際には、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって測定結果に誤差が生じる。
また、特許文献１１及び非特許文献１に記載されている１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸カリウムを用いる方法については、非特許文献２及び３において、測定結果の再現性が非常に低いという問題が報告されている。
そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く、かつ再現性良く定量することができるクレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第１の目的とする。
また、本発明は、尿中に含まれる塩分を精度良く、かつ再現性良く定量することができる塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第２の目的とする。
上記従来の問題を解決するために、本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む尿または血液とを混合して、クレアチニンによって金属錯体を還元させる工程、
ここで、前記工程（Ａ）において、混合後の前記尿または血液のｐＨが２．５以上７以下であり、
（Ｂ）工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的に測定する工程、並びに
（Ｃ）工程Ｂにおいて測定された還元された金属錯体の量に基づき、前記尿または血液中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。
工程Ａおよび工程ａでは、混合後の試料のｐＨを３以上、６以下とすることが好ましい。工程Ａおよび工程ａでは、試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合することが好ましく、この場合、試料のｐＨを５〜６に調整することが特に好ましい。工程Ａおよび工程ａにおいて、試料にカチオン化親水性ポリマーを混合すると、クレアチニンと試薬との反応の再現性が向上する。カチオン化親水性ポリマーは、カチオン化グアガムであることが好ましい。
本発明のクレアチニン濃度測定方法によれば、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く定量することができる。
本発明の参考形態１におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同参考形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の参考形態２におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同参考形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の参考形態３における塩分量測定デバイスを第１の基板の第１の面からみた構成を示す分解斜視図である。 同塩分量測定デバイスを第１の基板の第２の面からみた構成を示す分解斜視図である。 同参考形態における塩分量測定装置の外観を示す斜視図である。 同塩分量測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施例１における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例４において第１の電極に印加された電位と測定された電流値との関係を示すグラフである。 同実施例における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例５における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 同実施例及び参考例のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値のばらつきを示すグラフである。
本発明の発明者は、クレアチニンと、下記式（４）に記載の３価のアニオンであるヘキサシアノフェレート（慣用名：フェリシアネート）とが直接的に反応することを新たに見出した。この反応においては、クレアチニンに作用する酵素（例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンデイミナーゼ）およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが反応して、クレアチニンの酸化物と、下記式（５）に記載の４価のアニオンであるヘキサシアノフェレート（慣用名：フェロシアネート）とが生成する。本発明者が分析した結果、メチルグアニジンおよびＮ−メチル尿酸が反応生成物として得られていることがわかった。そのため、この反応におけるクレアチニンの酸化物は、クレアトールであると推測される。
[Fe(CN)6]3- （４）
[Fe(CN)6]4- （５）
また、本発明者は、クレアチニンと、下記式（６）に記載の３価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが直接的に反応することを新たに見出した。この反応においては、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと、３価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが反応して、クレアチニンの酸化物と、下記式（７）に記載の４価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが生成する。
[Ru(CN)6]3- （６）
[Ru(CN)6]4- （７）
本発明は上記の新たな知見に基づいており、クレアチニン濃度測定用試薬として、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方を用いることを特徴とする。
ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは、通常、錯塩の状態で存在する。例えば固体の状態では、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは、カウンターカチオンとともに錯塩を構成している。一方、溶液中では、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートの錯塩は電離しており、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは溶媒和したアニオンの状態で存在する。
クレアチニンと試薬との反応、特にクレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応速度は、リン酸系緩衝剤の存在下で速くなる。また、リン酸系緩衝剤の存在下において、クレアチニンと試薬とを反応させる際、カチオン化親水性ポリマーが存在すると、反応の再現性が向上する。
本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む尿または血液とを混合して、前記クレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、
ここで、前記工程（Ａ）において、混合後の前記尿または血液のｐＨが２．５以上７以下であり、
（Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的に測定する工程、並びに
（Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記尿または血液中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程を含む。
この方法によると、従来の測定方法と異なり、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件において、クレアチニンとクレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体とが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定方法よりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
クレアチニン定量用試薬は、ヘキサシアノフェレートであることが好ましい。ヘキサシアノフェレートは、化学的に安定であり、かつクレアチニンと効率よく反応する。ヘキサシアノフェレートの錯塩としては、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウムなどを用いることができる。
ヘキサシアノフェレートは、クレアチニンと反応する前は、３価のヘキサシアノフェレート、すなわちヘキサシアノフェレートの酸化体であっても、４価のヘキサシアノフェレート、すなわちヘキサシアノフェレートの還元体であってもよい。クレアチニン定量用試薬が、４価のヘキサシアノフェレートである場合は、試料中に溶解した４価のヘキサシアノフェレートを、３価へと酸化させればよい。３価のヘキサシアノフェレートは、例えば、４価のヘキサシアノフェレートを電極上で酸化することにより得ることができる。
クレアチニン定量用試薬は、ヘキサシアノルテネートであってもよい。ヘキサシアノルテネートの錯塩としては、ルテニウムヘキサシアン化カリウム、ルテニウムヘキサシアン化ナトリウムなどを用いることができる。
ヘキサシアノルテネートは、クレアチニンと反応する前は、３価のヘキサシアノルテネート、すなわちヘキサシアノルテネートの酸化体であっても、４価のヘキサシアノルテネート、すなわちヘキサシアノルテネートの還元体であってもよい。クレアチニン定量用試薬が、４価のヘキサシアノルテネートである場合は、試料中に溶解した４価のヘキサシアノルテネートを、３価へと酸化させればよい。３価のヘキサシアノルテネートは、例えば、４価のヘキサシアノルテネートを電極上で酸化することにより得ることができる。
工程Ａにおいて、試料に緩衝剤をさらに混合してもよい。
緩衝剤としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸系緩衝剤、クエン酸系緩衝剤、フタル酸系緩衝剤、酢酸系緩衝剤、ＭＥＳ（2-Morpholinoethane sulfonic acid）緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤を試料と混合することにより、試料のｐＨを３〜６に調整することが好ましい。特に、リン酸系緩衝剤を試料と混合することにより、試料のｐＨを５〜６に調整することが好ましい。
クレアチニン定量用試薬がヘキサシアノフェレートである場合は、特に試料にリン酸系緩衝剤を混合することにより、試料のｐＨが５〜６に調整されることが好ましい。このようにすると、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの直接反応の速度が速くなるため、測定時間を短縮することができる。
リン酸系緩衝剤は、リン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとから構成されることが好ましい。これらのリン酸塩が試料中に溶解することによって、試料のｐＨを５〜６の範囲内に容易に調整することができる。
試料におけるリン酸系緩衝剤の濃度（リン原子の濃度）は、５〜１１００ｍＭであることが好ましく、５〜５００ｍＭであることが、さらに好ましい。本発明者は、リン酸系イオンの濃度の増加に伴い、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応の速度が速くなることを見出した。リン酸系緩衝剤の濃度が５ｍＭ以上であれば、十分な反応速度が得られる。また、１１００ｍＭはリン酸系緩衝剤の溶解度の上限である。
工程Ａでは、緩衝剤に加えて、さらに、カチオン化親水性ポリマーを試料に混合してもよい。ヘキサシアノフェレート、ヘキサシアノルテネート及びリン酸系緩衝剤は、アニオン性である。よって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により、試薬が静電気的に引き寄せられ、試薬が均一になるものと予想される。そのため、再現性良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと考察される。
試料におけるカチオン化親水性ポリマーの濃度は、０．０２〜０．５重量％であることが好ましい。カチオン化親水性ポリマーの濃度が０．０２重量％以上であれば、十分な再現性向上の効果が得られる。また、カチオン化親水性ポリマーの濃度が０．５重量％以下であれば、カチオン化親水性ポリマーが試料中に良好に溶解することができる。
カチオン化親水性ポリマーとしては、カチオン化グアガム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｇｕａｒ ｇｕｍ）が挙げられる。グアガムはマメ科の植物であるグアの種子の胚乳部から得られる多糖類である。カチオン化グアガムは、グアガムのカチオン化物である。本発明において用いるカチオン化グアガムとしては、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドが挙げられる。
本発明のクレアチニン濃度測定方法においては、リン酸系緩衝剤に加えて、さらに、カチオン化親水性ポリマーを試料に混合することにより、試料のｐＨを５〜６の範囲内に調整することが最も好ましい。
還元された金属錯体の量を電気化学的に測定する場合、
例えば、工程Ｂは、
（Ｄ）試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
（Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含む。
また、工程Ｃは、
工程Ｅにおいて検出された電流値または電荷量に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。
このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を電気化学的に容易に求めることができる。
クレアチニン定量用試薬が溶解していない尿の電気特性は、尿中に含まれる電解質の濃度を反映している。尿中に含まれる電解質の濃度は、尿中に含まれる塩分の濃度と相関がある。塩分等の成分は、水分摂取、発汗などの影響を受け、濃縮または希釈されて尿中に排泄される。そのため、昼間、夜間を問わず随時に採取された尿である随時尿中に含まれる塩分等の尿中成分の濃度は、尿の濃縮及び希釈の影響を受けて変動する。
一方、上述のように、クレアチニンは筋肉量に依存して産生されることから、単位時間当たりの尿中へのクレアチニンの排泄量は一定であることが知られている。そこで、随時尿を用いた場合であっても、例えば、測定された尿中成分濃度のクレアチニン濃度に対する比（尿中成分／クレアチニン比）を求めることにより、尿の濃縮及び希釈の影響を補正することができる。
以下、本発明の参考形態について、図面を用いて説明する。
（参考形態１）
本発明の参考形態１に係るクレアチニン濃度測定デバイス１００について、図１を用いて説明する。図１は、測定デバイス１００の構成を示す分解斜視図である。
測定デバイス１００は、電気化学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス１００は、絶縁性の第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する絶縁性の第２の基板１０４とが、スリット１１０を有する絶縁性のスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。
第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。
次に、測定デバイス１００の製造方法について説明する。本参考形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートの錯塩であるフェリシアン化カリウムを用いている。
まず、第１の基板１０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これによって、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述するクレアチニン濃度測定装置の端子と電気的に接続される。
次に、第１の基板１０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、フェリシアン化カリウム、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二カリウムを溶解した水溶液、あるいはフェリシアン化カリウム、カチオン化グアガム、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二カリウムを溶解した水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。
塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよい。例えば、試薬を含む水溶液中の３価のヘキサシアノフェレートの濃度は０．１Ｍ程度であり、水溶液の滴下量は１．４μＬ程度である。また、試薬を含む水溶液がカチオン化グアガムを含む場合、水溶液中のカチオン化グアガムの濃度は０．２５重量％程度であり、滴下量は１．４μＬ程度である。
試薬層１３０を形成する領域の面積は、試料に対する試薬の溶解性などを鑑みて適宜選択すればよいが、例えば、その面積を３ｍｍ2程度とする。
次に、電極及び試薬層１３０が形成された第１の基板１０２、スペーサ１０６、及び第２の基板１０４を組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。
次に、本参考形態に係るクレアチニン濃度測定装置２００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図２及び３を用いて説明する。図２は、測定装置２００の外観を示す斜視図であり、図３は測定装置２００の構成を示すブロック図である。
まず、測定装置２００の構成について、図２を参照しながら説明する。
測定装置２００の筐体２０２には、測定デバイス１００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置２００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続される第１の端子及び第２の端子が設けられている。
次に、測定装置２００の筐体２０２内部の構成について、図３を参照しながら説明する。
測定装置２００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス１００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に、電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。
電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。
記憶部３１０には、クレアチニン濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
制御部３０６は、上記相関データを参照して、電気信号検出部３０４により検出された電気信号をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
次に、測定デバイス１００及び測定装置２００を用いた、本参考形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。
まず、使用者が測定デバイス１００のリード側を、測定装置２００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子及び第２の端子とが、それぞれ接触することにより電気的に導通する。
測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス１００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス１００の挿入を検知すると、制御部３０６が電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、試料導入を検知するための電圧（例えば０．２Ｖ）が印加される。
次に、使用者が、測定デバイス１００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って測定デバイス１００の試料収容室内に、試料（例えば０．６μＬ程度）が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２及び第２の電極１１４との間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。
電気信号検出部３０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
試料収容室内に露出している試薬層１３０に試料が接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが、試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と、４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。
計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２及び第２の電極１１４との間に、４価のヘキサシアノフェレートの濃度を測定するための電圧を印加する。例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．５〜＋０．６Ｖとなる電圧を印加する。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される。よって、電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号を試料中のクレアチニン濃度に換算する。
得られたクレアチニン濃度はディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザはクレアチニン濃度測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
測定デバイス１００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、ヘキサシアノフェレート及びリン酸系緩衝剤はアニオン性であって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により静電気的に引き寄せられ、均一な試薬を形成すると予想される。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと考察される。
本参考形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートを用いる例を示したが、代わりにヘキサシアノルテネートを用いてもよい。クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノルテネートを用いる場合にも、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖などの妨害成分の影響を受けることなく、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
本参考形態では、測定デバイスが１つの試薬層を備える例を示したが、これに限定されない。測定デバイスが、２つの試薬層、例えばクレアチニン定量用試薬を含む第１の試薬層と、リン酸系緩衝剤を含む第２の試薬層とを備えていてもよい。
本参考形態では、試料収容室に試料が導入されたことを制御部が検知することにより、電圧印加部による印加電圧が異なる電圧に切り替えられる例について示したが、これに限定されない。クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも印加電圧を切り替える必要はない。測定に必要な電圧値（例えば、第１の電極が第２の電極に比べて＋０．５Ｖ〜＋０．６Ｖとなる電圧）を測定デバイスの挿入検知時から印加し、試料導入の検知後も、その電圧値を継続して印加してもよい。
本参考形態では、４価のヘキサシアノフェレートの濃度に対応する電気信号を得るための第１の電極への印加電位を、第２の電極に対して０．５〜０．６Ｖとする例を示したが、これに限定されることはない。第１の電極と第２の電極との間の電圧は、クレアチニンとの酸化還元反応により生成したクレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体の還元体（本参考形態では４価のヘキサシアノフェレート）が酸化される電圧であればよい。
本参考形態では、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する電流値の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、反応時間をより長くした場合、クレアチニンと３価のアニオンであるヘキサシアノフェレートとの反応が完了状態あるいは定常状態に達する可能性が高まる。そのため、温度などの環境条件の影響を受けずにクレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。
本参考形態では、電極に電位を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。この時間は、クレアチニン濃度の違いに対する電気信号の差を有意に検出できる時間であればよい。
また、電極系、リード、及び端子の形状、個数、配置等は、本参考形態に限定されない。他の参考形態についても同様である。
なお、本参考形態では、還元された金属錯体の量を測定する例を示したが、金属錯体の酸化体の減少量を測定することにより、間接的に金属錯体の還元体の量を得てもよい。
測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、レシチンをトルエンまたはその他の有機溶媒に溶解した溶液を、第２の基板の内壁に塗布して乾燥させることにより、レシチン層を形成してもよい。このような構造にすることにより、試料量をより再現性よく一定とすることができる。そのため、より精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
クレアチニン濃度測定装置は、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。取り外し可能な記憶媒体に測定結果を保存することにより、測定結果を測定装置から容易に取り出すことができる。よって、分析関連業者に測定結果の分析を依頼することが容易になる。
測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。これにより、測定結果を、病院内の分析関連部門または分析関連業者等に送信することができる。よって、測定から分析までの時間を短縮することができる。
測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。これにより、分析結果を迅速に使用者にフィードバックすることができる。
（参考形態２）
次に、本発明の参考形態２に係るクレアチニン濃度測定デバイス４００について、図４を用いて説明する。図４は、測定デバイス４００の構成を示す分解斜視図である。
測定デバイス４００は、光学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス４００は、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、スリット１１０を有するスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。
測定デバイス４００は、参考形態１に係る測定デバイス１００と異なり、第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４は配置されていない。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上ではなく、第１の基板１０２上に、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。
次に、測定デバイス４００の製造方法について説明する。
まず、第１の基板１０２上に、参考形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、参考形態１と同様にすればよい。
次に、試薬層１３０が形成された第１の基板１０２、スペーサ１０６、及び第２の基板１０４を組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずに組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。
次に、本参考形態に係るクレアチニン濃度測定装置５００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図５及び６を用いて説明する。図５は、測定装置５００の外観を示す斜視図であり、図６は測定装置５００の構成を示すブロック図である。
まず、測定装置５００の構成について、図５を参照しながら説明する。
測定装置５００の筐体２０２には、測定デバイス４００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置５００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。
次に、測定装置５００の筐体２０２内部の構成について、図６を参照しながら説明する。
測定装置５００は、筐体２０２内部に、光源５０２、受光器５０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
光源５０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内に入射する光を出射する機能を有する。光源５０２から出射される光の波長は、クレアチニン定量用試薬中の金属錯体とクレアチニンとの反応に応じて吸収強度が変化する波長を選択すればよい。
受光器５０４は、光源５０２から出射され、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内において反射した光を検出する機能を有する。
記憶部３１０には、クレアチニンの濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
制御部３０６は、上記相関データを参照して、受光器５０４により検出される反射光の強度をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
次に、測定デバイス４００及び測定装置５００を用いた、本参考形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。
まず、使用者が測定デバイス４００の、試料導入口１３２の反対側を測定装置５００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。
測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス４００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス４００の挿入を検知すると、制御部３０６は光源５０２を作動させる。これにより、測定デバイス４００の試料収容室に光源５０２からの光が照射される。
次に、使用者が、測定デバイス４００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って測定デバイス４００の試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が試料収容室内における光の照射位置に到達すると、試料収容室内の透過率が変化する。それに起因する反射光強度の変化を、受光器５０４が検出する。
受光器５０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
試料収容室内に露出している試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と、４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。３価のヘキサシアノフェレートが４価のヘキサシアノフェレートに変化することにより、試料の吸収スペクトルが変化する。ここで、試料の吸収スペクトルの変化量は、生成した４価のヘキサシアノフェレートの濃度に依存する。
計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、試料収容室内において反射した光の強度を受光器５０４において測定する。このとき、受光器５０４において測定される反射光の強度は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
制御部３０６は、記憶部３１０に格納されているクレアチニン濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データを読み出し、それを参照する。これにより、受光器５０４において検出された反射光の強度が、試料中のクレアチニン濃度に換算される。
得られたクレアチニン濃度は、ディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
測定デバイス４００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、ヘキサシアノフェレート及びリン酸系緩衝剤はアニオン性であって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により静電気的に引き寄せられ、均一な試薬を形成するものと予想される。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと推察される。
本参考形態では、参考形態１と同様に、測定デバイスが２つ以上の試薬層を備えていてもよい。
本参考形態では、試料導入の検知後、反射光強度を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する反射光強度の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、反応時間をより長くした場合、クレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。
測定デバイスは、試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、参考形態１と同様に、レシチン層を具備してもよい。
参考形態１と同様に、クレアチニン濃度測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。また、測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。さらに、測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。
（参考形態３）
次に、本発明の参考形態３に係る塩分量測定デバイス７００について、図７及び８を用いて説明する。図７は、測定デバイス７００を第１の基板の第１の面側の構成を示す分解斜視図であり、図８は、第１の基板の第２の面側の構成を示す分解斜視図である。
測定デバイス７００は、試料である尿中に含まれるクレアチニンを電気化学的に測定するとともに、尿の電気特性を測定し、これらの測定結果を用いて、１日に排泄される尿中に含まれる塩分の量を推定する方法に用いられる。
測定デバイス７００においては、絶縁性の第１の基板１０２の第１の面７０２と、スリット１１０を有する絶縁性の第１のスペーサ１０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、第１のスペーサ１０６を挟んで組み合わされている。さらに、第１の基板１０２の第２の面８０２と、スリット７１０を有する絶縁性の第２のスペーサ７０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔７０８を有する第３の基板７０４とが、第２のスペーサ７０６を挟んで組み合わされている。第１の基板１０２と、第１のスペーサ１０６、第２の基板１０４、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４は、例えば、ポリエチレンテレフタレート製である。
第１の基板１０２の第１の面７０２上には、参考形態１に係る測定デバイス１００と同様に、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。
一方、第１の基板１０２の第２の面８０２上には、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８が配置されている。さらに、第２の面８０２上には、第３の電極７１２と電気的に接続された第３のリード７２２、第４の電極７１４と電気的に接続された第４のリード７２４、第５の電極７１６と電気的に接続された第５のリード７２６、及び第６の電極７１８と電気的に接続された第６のリード７２８が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。
次に、測定デバイス７００の製造方法について説明する。
まず、第１の基板１０２の第１の面７０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。
次に、第１の基板１０２の第２の面８０２上に、上記の電極パターンマスクとは異なるパターンを有する電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、第６の電極７１８、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８を形成する。第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８は、それぞれ第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。
次に、第１の基板１０２の第１の面７０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、実施の形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。
次に、第１の基板１０２の第１の面７０２と第１のスペーサ１０６とが接し、第１の基板１０２の第２の面８０２と第２のスペーサ７０６とが接するように、第２の基板１０４、第１のスペーサ１０６、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６、及び第３の基板７０４を組み合わせる。各部材の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、第１のスペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、クレアチニン濃度測定用の第１の試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が第１の試料導入口１３２として機能する。
一方、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第３の基板７０４との間で、第２のスペーサ７０６に設けられたスリット７１０により形成される空間部が、尿の電気特性測定用の第２の試料収容室として機能する。また、スリット７１０の開口部が第２の試料導入口７３２として機能する。
次に、本参考形態に係る塩分量測定装置９００及びそれを用いた塩分量測定方法について、図９及び１０を用いて説明する。図９は、測定装置９００の外観を示す斜視図であり、図１０は測定装置９００の構成を示すブロック図である。
まず、測定装置９００の構成について、図９を参照しながら説明する。
測定装置９００の筐体２０２には、測定デバイス７００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置９００によるクレアチニン濃度及び尿の電気特性の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続される第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子が設けられている。
次に、測定装置９００の筐体２０２内部の構成について、図１０を参照しながら説明する。
測定装置９００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、定電流交流電源９０２、電圧検出器９０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス７００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。
電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。
定電流交流電源９０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流を印加する機能を有する。一定の交流電流の印加は、測定デバイス７００の第３のリード７２２及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続された第３の端子及び第６の端子を介して行われる。印加する交流電流は、例えば、周波数が１ｋＨｚ程度、電流値が０．１ｍＡ程度である。
電圧検出器９０４は、第４の端子及び第５の端子を介して、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電圧の実効値）を検出する機能を有する。
記憶部３１０には、
（i）クレアチニンの濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す第１の検量線に相当する第１の相関データ、
（ii）塩分濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の検量線に相当する第２の相関データ、及び
（iii）１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データ、が格納されている。
記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
制御部３０６は、
（I）第１の相関データを参照して、電気信号検出部３０４により検出された電気信号を、クレアチニン濃度に換算する機能、
（II）第２の相関データを参照して、電圧検出器９０４により検出された電圧を、塩分濃度に換算する機能、
（III）得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する機能、及び
（IV）第３の相関データを参照して、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する機能、を有する。
制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
次に、測定デバイス７００及び測定装置９００を用いた、本参考形態に係る尿中塩分量測定方法について説明する。
まず、使用者が測定デバイス７００のリード側を測定装置９００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子とが、それぞれ電気的に導通する。
測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス７００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス７００の挿入を検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に電圧（例えば０．２Ｖ）を印加する。
次に、使用者が、測定デバイス７００の第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２に、試料を接触させる。この接触により、第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２を通って、測定デバイス７００の２つの試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、２つの試料収容室内が試料によって充填される。
第１の試料収容室において、試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２及び第２の電極１１４間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。
電気信号検出部３０４からの出力信号により、第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知する。
第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
第２の試料収容室への試料導入の検知に伴い、制御部３０６は、定電流交流電源９０２を制御して、第３の端子及び第６の端子を介して、第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流（例えば、周波数１ｋＨｚ、電流値０．１ｍＡ）を印加する。交流電流の印加から所定時間経過後（例えば５秒後）に、電圧検出器９０４は、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電流の実効値）を測定する。
制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている塩分の濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電圧検出器９０４により検出された電圧を試料中の塩分濃度に換算する。得られた塩分濃度はディスプレイ２０４に表示される。
第１の試料収容室において、試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。
計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、再度異なる電圧を印加する（例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．５〜＋０．６Ｖとなる電圧）。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される。電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す第１の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号は試料中のクレアチニン濃度に換算される。
次に、制御部３０６は、得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する。続いて、制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する。
得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、ディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
測定装置９００によれば、高い精度で測定されたクレアチニン濃度により補正された塩分濃度に基づいて、１日当たりの尿中塩分排泄量を算出できる。よって、１日当たりの尿中塩分排泄量を精度良く求めることができる。
なお、本参考形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートを用いる例を示したが、代わりにヘキサシアノルテネートを用いてもよい。ヘキサシアノルテネートを用いる場合にも、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖などの妨害成分の影響を受けることなく、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
本参考形態では、参考形態１と同様に、測定デバイスが、２つ以上の試薬層を備えていてもよい。
本参考形態においても、クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも電圧印加部による印加電圧を異なる電圧に切り替える必要はない。
本参考形態においても、第１の電極と第２の電極との間の電圧は、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される電圧であればよい。
本参考形態においても、参考形態１と同様に、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）は限定されない。
本参考形態では、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。
本参考形態では、記憶部に、上記の第１〜第３の相関データが格納されている例を示したが、これに限定されない。これに代えて、電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧と、単位時間当たり（例えば１日）の尿中塩分排泄量との相関を示す相関データが記憶部に格納されていてもよい。この場合は、クレアチニン濃度や塩分濃度を求めなくてもよい。電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧とを用いて、単位時間当たりの尿中塩分排泄量を直接求めることができる。
塩分量測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、参考形態１と同様のレシチン層を、第２の基板及び第３の基板の内壁に形成してもよい。
塩分量測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。
塩分量測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。
塩分量測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。
（実施例１）
本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために以下の実験を行った。本実施例では、クレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体としてヘキサシアノフェレート、その錯塩であるフェリシアン化カリウム（ポタシウムフェリシアネート）を用いた。
まず、４００ｍＭのリン酸水素二カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液と、４００ｍＭのリン酸二水素カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。このようにして得られた４００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、フェリシアン化カリウムを濃度が４００ｍＭとなるよう溶解した。
得られた水溶液をガラス製のセル容器に入れ、第１の電極、第２の電極、及び第３の電極を、それぞれ、前記セル容器中の水溶液に浸漬した。第１の電極としては、金電極（電極面積２ｍｍ2）を用いた。第２の電極は、長さ５ｃｍの白金線をコイル状に巻くことにより得た。第３の電極としては、Ａｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ水溶液）参照極を用いた。これら電極は全て、ビー・エー・エス株式会社の市販品である。第１の電極、第２の電極及び第３の電極の接続端子を、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ−６６０Ａ）の作用極、対極、参照極の接続端子にそれぞれ順に接続した。
次に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）を、前記セル容器中の水溶液に少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう測定毎に調整した。
クレアチニンの添加とともに計時を開始し、クレアチニンの添加から１０分後に、第３の電極に対して０．５Ｖの電位を第１の電極に印加した。そして、電位印加後５秒後の電流値を測定した。以上の実験は、室温（約２５℃）で行った。
セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、１、２、５、１０、２０、３０、４０、及び５０ｍＭの場合について、それぞれ以上の測定を行った。
図１１は、測定された電流値をクレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１１において、横軸はセル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。図１１から明らかなように、得られた電流値は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に増加し（すなわち、比例し）、電流値とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。したがって、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、得られる電流値に基づいてクレアチニンの定量を行うことが可能であることがわかる。
測定後に、セル容器中に残った、クレアチニン濃度の異なる複数の水溶液について、カラムを用いたクロマトグラフィーにより、反応生成物の分析を行った。分析の結果、セル容器中の水溶液には、４価のヘキサシアノフェレートが生成していることがわかった。また、４価のヘキサシアノフェレートの生成量は、クレアチニン１分子あたり最大４分子であった。以上の分析結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における反応を次のように説明することができる。
試料中において、３価のヘキサシアノフェレートは、リン酸系緩衝剤の存在下、クレアチニンと反応して還元され、４価のヘキサシアノフェレートに変換される。すなわち、クレアチニンは、本反応によって３価のヘキサシアノフェレートに電子を供与し、酸化される。このとき、クレアチニンは、本反応によって、最大４電子の酸化を受けているものと考察することができる。第１の電極には、４価のヘキサシアノフェレートより電子を受容するような電位が印加されている。そのため、生成した４価のヘキサシアノフェレートは、第１の電極において、電気化学的に酸化される。これに伴い、第１の電極には電流が流れる。一定時間に生成する４価のヘキサシアノフェレートの濃度は、クレアチニン濃度に依存する。また、４価のヘキサシアノフェレートの酸化電流は、試料中に存在する４価のヘキサシアノフェレートの濃度に依存する。よって、得られる電流値は、クレアチニン濃度に依存する。
（実施例２）
次に、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における好ましいｐＨ範囲を調べるために、以下の実験を行った。実験に用いた試料の調製方法及び装置構成、並びに実験手順は、実施例１と同様であるため、説明を省略する。ただし、本実施例においては、試料中のクレアチニン濃度は２７ｍＭとした。また、試料中に添加するリン酸系緩衝液のｐＨが、２、２．５、３、４、５、６、７、８、及び９の場合について、それぞれ実施例１と同様の測定を行った。
表１に、電流値の測定結果を示す。ｐＨが２．５〜７の領域、特に３〜６の領域において、顕著に電流値が大きく、かつ電流値が安定している。この結果から、前記ｐＨ領域において、クレアチニンの定量が特に感度良く、かつ高い再現性で測定できることがわかった。前記領域のうち、ｐＨ５〜６は、リン酸系緩衝剤によって付与できる。また、リン酸系緩衝剤の存在下で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応速度が速くなることがわかっている。したがって、リン酸系緩衝剤を試料と混合し、ｐＨを５〜６に調整することが好ましい。また、このようなｐＨは、リン酸水素イオンとリン酸二水素イオンとによってもたらされる。よって、リン酸系緩衝剤として、例えばリン酸水素二カリウムまたはリン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素ナトリウムとを組み合わせて用いるのが好ましいと考えられる。また、ｐＨが２．５〜７の領域においても電流値は得られており、クレアチニンの定量が可能である。
Figure 0004486702
（実施例３）
次に、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法において、試料中に含まれ得る共存物質の影響を調べるため、以下の実験を行った。
生体試料中に含まれ得る共存物質としては、イオン種、酵素変性剤、クレアチニンの酵素反応生成物、糖、アミノ酸等が挙げられる。そこで、本実施例では、共存物質の代表例として、試料中に溶解することによりイオン種を生成するＮａＣｌ、酵素変性剤である尿素、クレアチニンの酵素反応生成物であるクレアチン、サルコシン及びグリシン、糖であるグルコース、並びにアミノ酸であるヒスチジン、タウリン、グルタミン、及びセリンを用いた。
実施例１と同様の手順により、濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝６）を調製し、その緩衝液に、所定の濃度となるように、各共存物質を溶解した。室温２５℃での測定と、反応を促進するために試料を６０℃に加温しての測定とを行った。その他の試料の調製方法及び装置構成、並びに実験の手順は、実施例１と同様であるため説明を省略する。
表２に、用いた共存物質及びその濃度と、測定された電流値を示す。表２において、試料１は、共存物質を含まず、３ｍＭのクレアチニンを含んでいるリン酸緩衝液である。また、試料２〜１１は、表２に記載の各共存物質を含み、クレアチニンは含んでいない。表２において、測定された電流値は、試料１について測定された電流値を１００とした場合の相対値を示している。
表２から、いずれの共存物質を含む試料の場合も、クレアチニンを含み、共存物質が存在しない試料１と比べて、有意な電流は測定されなかったことがわかる。この結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法は、ＮａＣｌ、尿素、クレアチン、サルコシン、グリシン、グルコース、ヒスチジン、タウリン、グルタミン、及びセリンのいずれの物質が試料中に含まれていても影響も受けないことがわかった。
Figure 0004486702
一方、ヤッフェ法のように、アルカリ性溶液中で酸化剤を用いてクレアチニンの定量を行う従来の方法においては、測定結果に与える糖やアミノ酸の影響は大きいことが知られている。これは、アルカリ性溶液中では、ピクリン酸がクレアチニンと同様に多くの有機分子と反応しやすいためである。
比較例として、従来の酵素法により、同様の実験を行った。まず、７Ｕ／ｍＬクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）（東洋紡株式会社製、ＣＮＨ−３１１）、１０Ｕ／ｍＬクレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）（東洋紡株式会社製、ＣＲＨ−２２１）、５Ｕ／ｍＬサルコシンオキシダーゼ（東洋紡株式会社製、ＳＡＯ−３５１）、及び１００ｍＭフェリシアン化カリウムを含む、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を調製した。
上記のリン酸緩衝液に、濃度が３ｍＭとなるようにクレアチニンを添加し、試料１２を調製した。
試料１２に、さらに共存物質として、濃度が０．５ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、試料１３を調製した。
試料１２に、さらに共存物質として、濃度が１Ｍとなるように尿素を添加し、試料１４を調製した。
試料１２〜１４について、反応を促進するために試料を４０℃に加温した以外は、本実施例と同様の手順により実験を行った。
表３に、比較例について得られた結果を示す。電流値は、試料１２について測定された電流値を１００とした相対値で示した。
表３からわかるように、試料中に０．５ＭのＮａＣｌまたは１Ｍの尿素が存在するとき、共存物質が存在しない場合と比較して、クレアチニンに由来する電流値は大きく低下した。このような結果は、高濃度のＮａＣｌや尿素により、酵素タンパク質が変性されたためであると考えられる。これらの共存物質により、測定に用いた酵素の活性が２５〜８０％に低下することがわかった。酵素の変性の結果、酵素活性が低下して、一定時間における反応の進行が低下するため、電流値が減少したものと考えられる。このような傾向は室温においても同様であると考えられる。
Figure 0004486702
以上の結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、イオン種、尿素、クレアチニンの酵素反応生成物、糖、アミノ酸などの共存成分の影響を受けることなく、従来の測定方法よりも精度良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができることがわかった。
（実施例４）
本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために、以下の実験を行った。
本実施例では、クレアチニン定量用試薬として、下記式（８）に示す、４価のアニオンであるヘキサシアノルテネートのカリウム塩（三津和化学薬品株式会社製）を用いた。
K4[Ru(CN)6] （８）
まず、２００ｍＭのリン酸水素二カリウム水溶液と、２００ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら、２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。このようにして得られた２００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、式（８）に示すヘキサシアノルテネートのカリウム塩を濃度が１ｍＭとなるよう溶解した。
本実施例に用いたセル及び測定装置の構成は、実施例１と同様であるので説明を省略する。
次に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液を、前記セル容器中の水溶液に少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう、測定毎に調整した。セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、８、１６、３２、及び６４ｍＭの場合について、それぞれ以下の測定を行った。
クレアチニン水溶液の添加後、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ−６６０Ａ）により、第１の電極に印加する電位を第３の電極に対して０．５Ｖから１Ｖへ掃引し、続いて１Ｖから０．５Ｖへと掃引し、そのときに流れる電流を測定した。電位の掃引速度は１ｍＶ／秒とした。
図１２に、測定結果（サイクリックボルタモグラム）を示す。図１２において、曲線Ａ〜Ｅは、それぞれクレアチニン濃度が０、８、１６、３２、及び６４ｍＭの場合の測定結果を示している。クレアチニンが存在しない場合、０．７５Ｖ付近を酸化還元電位とするヘキサシアノルテネートの第１の電極上での酸化還元反応が見られた。クレアチニンを添加することにより、０．８Ｖよりポジティブな電位での電流が有意に増加した。以上の結果は、クレアチニンがヘキサシアノルテネートの酸化体により酸化され、生成したヘキサシアノルテネートの還元体が第１の電極で酸化されていることを示唆している。すなわち、クレアチニンの電気化学的な触媒酸化反応が、ヘキサシアノルテネートを通して進行していることを示している。
クレアチニン濃度が異なる各試料について、図１２に示すサイクリックボルタモグラムから０．９Ｖにおける酸化電流値を求め、クレアチニン濃度が０の場合の酸化電流値との差を算出した。図１３は、得られた酸化電流値の差をクレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１３に示すように、得られた酸化電流値はクレアチニンの濃度の増大と共に増加した。したがって、本実施例のようにサイクリックボルタンメトリーを行い、酸化電流値を求めることにより、クレアチニンの定量を行うことができることがわかった。
なお、本実施例においては、サイクリックボルタンメトリーにより酸化電流を測定したが、これに限定されない。これに代えて、例えば、第３の電極に対して０．９Ｖの一定電位を第１の電極に印加し、クレアチニンの添加から一定時間（例えば３分）後に流れる酸化電流を測定してもよい。この場合も、酸化電流値は、試料中に含まれるクレアチニンの濃度に応じて増加するため、クレアチニンの定量が可能である。
（実施例５）
本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために、以下の実験を行った。
本実施例では、ヘキサシアノフェレートの金属錯体として、フェリシアン化カリウム（ポタシウムフェリシアネート）、カチオン化親水性ポリマーとして、カチオン化グアガムを用いた。また、参考形態１と同様の手順により、図１に示す構造を有するクレアチニン濃度測定デバイスを作製した。本実施例においては、カチオン化グアガムとして、市販のグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドを用いた。
試薬層１３０を形成する際に用いた、試薬を含む水溶液は、以下のように調製した。まず、４００ｍＭのリン酸水素二カリウム水溶液と、４００ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。次に、ｐＨメーターを用いてモニターしながら、２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。最後に、このようにして得られた４００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、フェリシアン化カリウムを濃度が１００ｍＭとなるよう溶解させ、カチオン化グアガムを濃度が０．２５重量％となるように溶解させることにより、試薬を含む水溶液が得られた。
第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、上記の手順により調製された水溶液を１．４μＬ滴下することにより、試薬層１３０を形成した。試薬層１３０を形成する領域の面積は３ｍｍ2とした。また、作製されたクレアチニン濃度測定デバイスの試料収容室の容積は０．６μＬである。
また、参考例として、試薬層を形成する際に用いた水溶液中にカチオン化グアガムを添加しない点以外は、実施例１と同様の手順により、図１に示す構造を有するクレアチニン濃度測定デバイスを作製した。
クレアチニン濃度測定デバイスの第１のリード、及び第２のリードに、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ−６６０Ａ）の作用極用の端子、及び対極、参照極用の２つの端子をそれぞれ接続した。その後、クレアチニン濃度測定デバイスの試料導入口に、試料であるクレアチニンを溶解した水溶液を接触させることにより、試料収容室内に０．６μＬの試料を導入した。試料の導入から６０秒経過後、上記電気化学アナライザーを用いて、第１の電極が第２の電極に比べて＋０．６Ｖとなる電圧を印加した。電圧の印加から１０秒後に、第１の電極と第２の電極との間に流れる電流を測定した。以上の実験は、室温（約２５℃）で行った。
クレアチニン濃度が、０、１０、３０、及び４０ｍＭの試料について、それぞれ以上の測定を行った。
図１４は、実施例５のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値を、クレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１４において、横軸は試料中に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。図１４から明らかなように、得られた電流値は、試料中に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に増加し（すなわち、比例し）、電流値とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。
図１５は、実施例５及び参考例のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値のばらつき（変動係数）を示すグラフである。図１５において、横軸は試料中に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は変動係数（％）を示す。また、白の棒グラフが実施例５のデータ、黒の棒グラフが参考例のデータを示す。
図１５からわかるように、クレアチニン濃度の異なるいずれの試料について測定を行った場合でも、参考例に比べて、実施例５のクレアチニン濃度測定デバイスでは、変動係数が低くなっている。この結果から、試薬層にカチオン化グアガムを添加することにより、クレアチニン濃度測定の再現性が向上していることが分かる。
本発明は、試料、特に尿などの生体試料中に含まれるクレアチニンを定量する際に有用である。
１００、４００ クレアチニン濃度測定デバイス
１０２ 第１の基板
１０４ 第２の基板
１０６ スペーサ（第１のスペーサ）
１０８、７０８ 空気孔
１１０、７１０ スリット
１１２ 第１の電極
１１４ 第２の電極
１２２ 第１のリード
１２４ 第２のリード
１３０ 試薬層
１３２ 試料導入口（第１の試料導入口）
２００、５００ クレアチニン濃度測定装置
２０２ 筺体
２０４ ディスプレイ
２０６ 測定開始ボタン
２０８ 測定デバイス取付け部
３０２ 電圧印加部
３０４ 電気信号検出部
３０６ 制御部
３０８ 計時部
３１０ 記憶部
５０２ 光源
５０４ 受光器
７００ 塩分量測定デバイス
７０２ 第１の面
７０４ 第３の基板
７０６ 第２のスペーサ
７１２ 第３の電極
７１４ 第４の電極
７１６ 第５の電極
７１８ 第６の電極
７２２ 第３のリード
７２４ 第４のリード
７２６ 第５のリード
７２８ 第６のリード
７３２ 第２の試料導入口
８０２ 第２の面
９００ 塩分量測定装置
９０２ 定電流交流電源
９０４ 電圧検出器

Claims (7)

  1. （Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む尿または血液とを混合して、前記クレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、
    ここで、前記工程（Ａ）において、混合後の前記尿または血液のｐＨが２．５以上７以下であり、
    （Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的に測定する工程、並びに
    （Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記尿または血液中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程
    を含む、
    尿または血液中に含まれるクレアチニン濃度測定方法。
  2. 工程Ａにおいて混合後の前記試料のｐＨが、３以上、６以下である、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  3. 前記工程Ａにおいて、
    前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  4. 前記工程Ａにおいて、
    前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合することにより、前記試料のｐＨを５〜６に調整する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  5. 前記工程Ａにおいて、
    前記試料にカチオン化親水性ポリマーをさらに混合する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  6. 前記カチオン化親水性ポリマーが、カチオン化グアガムである、請求項５に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  7. 前記工程Ｂが、
    （Ｄ）前記試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
    （Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含み、
    前記工程Ｃにおいて、
    前記工程Ｅにおいて検出された前記電流値または前記電荷量に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
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