JP3853407B2 - 免疫学的自動分析装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的方法を利用して、生体液内の微少成分を検出する分析装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
抗体はある特定の抗原に対して極めて特異的に結合することが知られており、一般に抗原抗体反応と呼ばれている。この抗原抗体反応を利用することにより、生体中、特にヒト血液中の極微量の物質の存在、あるいは、その物質の濃度を測定することが可能となるため、これを利用した免疫学的分析法は、近年、医療の分野で広く利用され、特に各種疾患の早期診断等に役立っている。
【0003】
免疫学的分析法としては競合法と非競合法が公知の方法であるが、抗原抗体反応を行った後の複合体を捕捉しやすくする手段として、近年、特に固相を利用する測定系が広く用いられている。例えば、非競合法では、分析対象とする体液中の抗原に対して、不溶性の固相に結合した抗体、及び、何らかの物質で標識した抗体を作用させ複合体を形成させるが、その抗体を結合するための固相としては、数μmから数mmまでの種々の粒径の不溶性の粒子物が知られている。この反応において、体液中の抗体の量と抗原抗体により生成する標識物質付きの複合体の量は比例するため、固相に結合した標識を測定することにより、体液中の抗原の存在、あるいは、量を知ることができる。
【0004】
しかし、免疫学的分析法に於いて、通常、抗体量と添加される試薬の量は1:1の関係にはなく、抗原抗体反応により生成した結合型の標識物(bound form:B)と遊離状の標識物(free form:F)の分離(B/F分離)が必要となる。この操作は、固相を何らかの方法で一時的に捕捉し、液相部分を流し去ることにより達成されるが、反応容器や専用の容器をB/F分離に使用した場合、溶液内の溶液の置換に時間がかかるため、分析装置の稼働効率が低下する、特別なB/F分離機構を必要とするためコストアップを招く等の問題が生じる。
【0005】
この問題を解決するものとして、従来の免疫学的分析方法及び装置には、特開昭60−122374号公報がある。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
上記先行技術は、固相として磁性粒子を使用し、この固相を含む反応混合物を導管に沿って次々に、そして、個別に流し、この流れの間に各反応混合物中の磁性粒子を磁気的に捕捉し、その捕捉した磁性粒子に対し、洗浄液体を通すことにより固相と液相との分離を行う事を特徴とする流体試料の分析方法及び分析装置である。
【0007】
固相を導管内で分離,洗浄した後、そのまま検出できる事が、上記先行技術の有利な特徴であるが、工業的に導管を製造する際に、その導管の内径の公差が問題となる。この様な目的のために使用する導管の内径は、使用する固相の粒径により多少異なるが、径が細すぎることによる固相の詰まりや、径が太すぎることによる試薬の浪費等を防ぐため、0.5〜1.5mm程度の物の使用が望ましい。
【0008】
また、導管の材質としては、非特異的な蛋白質等の吸着を防ぐため、あるいは、耐薬品性を持たせるなどの目的によりテフロン,ダイフロン,シリコン等の使用が望ましいが、現状の工業生産レベルにおいて、前記内径の物は±0.1〜0.2程度の公差を持つ。
【0009】
そのため、仮に、内径が1.0mmで±0.1mmの公差を持つ500mmの導管を作製すると、その体積はおよそ318〜475μlの裕度を持ち、最大と最小とでは150μl以上の差を持ち、平均体積に対しておよそ±20%の誤差を持つこととなり、これは固相の捕捉等に関して悪影響を与え、分析精度の劣化を招く。この様な事態を解決するための1手段として、固相を捕捉する際に時間的裕度を持たせることも可能である。つまり、分析用に吸引した固相を含む反応混合液の体積に、導管の内径の公差により生じる体積の最大値と最小値の差を、加えた分の体積を捕捉することも可能である。しかし、固相の捕捉を行う際に、より効率良く行う際には、その移動速度は低速であることが望ましいため、この方法は分析装置の稼働効率の低下を引き起こす。
【0010】
本発明の第一の目的は、導管等の内径の公差により生じる、分析精度の劣化を回避し、信頼性の高い測定を行うことの出来る免疫学的分析装置を提供することにある。
【0011】
本発明の第二の目的は、導管等の内径の公差により生じる、装置の稼働効率の低下を軽減する事の出来る免疫学的分析装置を安価に提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫学的分析装置は、第1及び第2の目的を達成するために次の構成を採用する。すなわち、2種類の電気電導度の異なる溶液を所定の流速で、シッパノズルより検出部へと流した際の経時的な電流値の変化に基づき装置上でシッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積を電気化学的に測定する為に必要なステップと機構及び電気化学的な電極,前記測定値を装置上、あるいは、外部の制御機器上に記憶させる為のステップと機構,抗原抗体反応を利用して試料中の測定対象物を免疫学的に測定するために、試料と、固相としての磁性粒子と、この磁性粒子を前記試料中の測定対象物に結合させる抗体とを反応容器内で混合して抗原抗体反応を行わせ、試料中の測定対象物に固相が結合した免疫複合体を含む反応混合液を生成するためのステップと機構、そして、前記反応容器内の反応混合液を検出部に通ずる導管に導き反応混合液中の固相の捕捉を前記測定値に基づき行うステップと機構を含む。
【0013】
上記の概念による免疫学的分析装置において、抗体の標識物は、放射性物質,蛍光発光物質,酵素,化学発光物質、及び、電気化学発光物質等が使用可能であるが、好ましくは、前記標識物質として電気化学的に発光する物質を使用し、前記体積測定用の電極と発光用の電極を同一の物でまかなうのが望ましい。
【0014】
この場合、電気化学的な電極は、電気化学の分野で公知の2電極式,3電極式のどちらでも使用可能である。
【0015】
上記測定により得られるシッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積は、書き換え可能で且つ安定に保存できる媒体の使用が望ましい。
【0016】
上記手段による各機構を持つ、免疫学的分析装置において、2種類の電気電導度の異なる溶液を所定の流速で、シッパノズルより検出部へと流した際の経時的な電流値の変化に基づき装置上でシッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積を電気化学的に測定した結果に基づき、その装置固有のシッパノズルから捕捉位置までの体積値を算出し、装置上、あるいは外部の制御機器等に保存し、前記体積値に基づき固相の捕捉を行うことにより、分析精度の劣化を防ぐことが可能である。
【0017】
また、装置固有の体積値に基づき固相を含む反応混合液のシッパノズルから検出部への移動を行うことが出来るため、装置の稼働が低下するのを防止することが可能である。
【0018】
また、標識物質として電気化学的に発光する物質を使用し、体積測定用の電極と標識物質発光用の電極を共有することにより装置のコストを下げ、よりコンパクトに作製することが可能である。
【0019】
【発明の実施の形態】
本発明に基づく実施例を図1及び図2を用いて説明する。
【0020】
図1は本発明の一実施例である免疫学的分析装置の検出部付近の説明図である。シッパノズル1は、ジョイント2により導管3及びフローセル7と結ばれており、シッパ用シリンジ44の動作により溶液の吸引と吐出が可能である。フローセル7は、溶液に接する形で実行電極4,対照電極5、及び、参照電極6が固定されている。これら三つの電極はポテンショスタットとなるように回路的に接続されている。また、フローセル7の上部にはフォトマルチプライヤ12が固定され、永久磁石8がフローセル7に接近、あるいは、離れることによりフローセル7に対する磁場の強さを変えることができる。フローセル7,フォトマルチプライヤ12,可動装置11等は検出部として、遮光箱の中に納められている。なお、検出部内のフローセル7,フォトマルチプライヤ12,可動装置11等の制御は全て、制御用基板部47,パーソナルコンピュータ48により行われ、測定結果等は全てパーソナルコンピュータ48内のメモリ、あるいは、ハードディスク等の書換可能な媒体に保存される。
【0021】
図2は本発明の一実施例である免疫学的分析装置の説明図である。サンプルディスク21,試薬ディスク23,ピペッタ27,蓋開閉機構28,撹反機29,グリッパ38,シッパ39,ピペット用シリンジ43,シッパ用シリンジ44は、いずれも制御基板部47を通して、パーソナルコンピュータ48により制御可能で、複数種類のシーケンスで動かすことが可能である。
【0022】
反応容器ラック36上に並べられた反応容器、及び、ディスポーザブルチップ用ラック37上に並べられたチップの移動は全てグリッパ38により行う。また、グリッパ38は、反応容器一時保管所32a,32bとインキュベータ34、あるいは、反応混合液吸引場所35への反応容器の移動を行うこともできる。
【0023】
グリッパ38によりチップ一時保管場所31aへ送られたチップは、ピペッタ27の先端に取り付けられ、ピペッタ27はサンプルディスク上のサンプルカップ22内の試料、あるいは、試薬ディスク23上の第一試薬ボトル25,第二試薬ボトル26,磁性粒子ボトル24内の溶液を所定の順番により吸引する。なお、チップは複数種類の試薬を同一チップにより吸引する際には、洗浄部30に於いて純粋にて、その外壁が洗浄される。そして、一つのシーケンスが修了した後、反応容器一時保管場所32a,32bに置かれた反応容器の中へ吸引した試料,試薬を吐出した後、チップ取り外し部33に於いて、先端より取り外される。また、試薬ディスク23上の試薬ボトルは、蓋が付いており、必要なときのみ蓋開閉機構28により蓋が開けられ、試薬吸引後、蓋開閉機構28により閉じられる。なお、磁性粒子ボトル24は、必要に応じて撹拌器29により撹拌される。試薬,試料の吐出された反応容器は、インキュベータ34の任意の位置へ運ばれ、一定時間経過後、必要に応じて、一時保管場所32a,32bへ運ばれ、更に試薬の吐出を受け、更に一定時間インキュベーションを行う。
【0024】
インキュベーシュン修了後、インキュベータ34上の反応混合液吸引場所35へ送られ、シッパ39に取り付けられたシッパノズル1から反応混合液が吸引される。吸引された反応混合液は、永久磁石8の力により実行電極4上に捕捉される。
【0025】
この間、及び、この後、所定のシーケンスによりフローセル7には電圧が印加される。また、フローセル7内は固相を永久磁石8の力により捕捉しつつ、所定のシーケンスにより分析用緩衝液ボトル41内の溶液が流され、フローセル7内で固相の洗浄が行われる。固相の洗浄修了後、フローセル7内の溶液の流れを止めた後、永久磁石8をフローセル7より遠ざけ、所定の電圧を印加して電気化学発光を起こし、この際の光の強さをフォトマルチプライヤ12より測定する。測定修了後、フローセル7内に洗浄液ボトル42内の溶液を導きつつ、所定のシーケンスで電圧を印加し、フローセル7内の洗浄を行う。フローセル7の洗浄修了後、所定のシーケンスで電圧を印加しつつ、分析用緩衝液を吸引し、フローセル7のコンディショニングを行う。
【0026】
なお、一連の流れは、最短で全ての測定が行えるよう、予め計算により最適化されてから行われる。
【0027】
分析にともない生じる液体の廃液は全て廃液タンク45に集められ、固形の廃棄物は全て固形用ダストボックス49に集められる。これらは、脱着が可能であり、必要に応じて取り外し、内部の廃液、あるいは、廃棄物を捨てることが可能である。
【0028】
本発明に於ける試料中の抗体量の検出方法は、電気化学的な発光が望ましいが、より具体的な標識物質は、Ru(ルテニュウム)化合物が使用される。Ruを利用した電気化学的な発光法は、“[Ru]他を用いるエレクトロケミルミネッセンス法(特許公表 昭64−500146号)”が、公知の方法である。
【0029】
本発明による免疫分析装置による分析項目は、TSH(thyroid-stimulating hormone:甲状腺刺激ホルモン),T3(triiodothyronine:3,3′,5−L−トリヨードチロニン),HCG(human chorionic gonadotropin:絨毛性性腺刺激ホルモン),CEA(carcinoembryonic antigen:がん胎児性抗原),AFP(α fetoprotein:αフェトプロテイン)等があげられるが、これらは、使用する抗体を変える事により、装置の構成を変えずに行う事ができる。
【0030】
次に、図1,図2、及び、図3を用いて、本発明の特徴であるシッパノズルから固相捕捉部までの体積測定方に関して説明する。
【0031】
まず、シッパ39を分析用緩衝液ボトル41上に移動する。移動度,シッパノズル1を液面まで下げ、シッパノズル1,導管3、及び、フローセル7を全て分析用緩衝液で満たすのに十分な量をシッパ用シリンジ44により吸引する。吸引後、液面より高い位置に、シッパノズル1を持ち上げ、小量のかつ必要十分な量の空気を吸引する。その後、シッパノズル1を再び液面下まで下げ、シッパ用シリンジ44により、一定の流速で分析用緩衝液を吸引する。吸引開始後、所定の時間が経過した後、フローセル7内の実行電極4と参照電極6の間に所定の電圧を印加し続け、この際の経時的な実行電極4と対照電極5の間に流れる電流変化を測定した。シッパノズル1及び導管3の公差から、この部分の体積が420±50μlになると予想される装置に対して、50μl/sの流速で吸引を行い、吸引開始後7.2 秒より経時変化を測定した際の結果を図3に示す。この結果は5回測定した平均値であり、最も電流の流れた時間をxとすると、シッパノズル1及び導管3の体積は体積=(7.2+x)・50−αにより算出される。
【0032】
ここで、αは使用したフローセル7の形状に依存する値であり、この場合α=5であった。そのため、この装置に於けるシッパノズルから導管までの体積が415μlであることが求められた。この値は、装置に内蔵されるフロッピーディスクドライブ50に保存され、この値を基に固相の捕捉をこの装置上で最適化することにより装置の再現性、及び、精度は向上した。
【0033】
また、固相を捕捉する際に時間的裕度を持たせることにより再現性、及び、精度は向上した。しかし、固相を含む反応混合液150μlを吸引し、120μl/sの流速でシッパノズル1及び導管3内を移動させ、25μl/sの流速により実行電極4上に固相を捕捉する際に要する時間は、本発明による方法を用いた際には、約12秒で済むのに対し、約16秒を必要とした。
【0034】
【発明の効果】
本発明により、免疫学的分析装置において、導管等の内径の公差により生じる、分析精度の劣化や稼働効率の低減を回避し、フロー系で効率良く固相の吸着を行う事、信頼性の高い測定を行うことの出来る免疫学的分析装置を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例である免疫学的分析装置の検出部付近の説明図。
【図2】本発明の一実施例である免疫学的分析装置の説明図。
【図3】本発明による導管内の体積測定の結果を示す特性図。
【符号の説明】
1…シッパノズル、2…ジョイント、3…導管、4…実行電極、5…対照電極、6…参照電極、7…フローセル、8…永久磁石、9…磁石用ホルダ、10…磁石用可動アーム、11…可動装置、12…フォトマルチプライヤ、13…検出部。
Claims (3)
- 反応容器内で液相と固相からなる試薬により抗原抗体反応を行わせ、試料中の被検物質を免疫学的に測定する装置において、抗原抗体反応生成物である複合体を担持する固相として磁性粒子を使用し、前記複合体の形成時もしくは形成後に標識した抗原、または、抗体を作用させた後、前記複合体を含む反応容器内の反応混合液を検出部に通じる導管へ導き、前記導管内の特定の場所に設けられた磁場により固相を捕捉する際に、予め測定したシッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積値に基づき固相の捕捉を行う機構を有し、
前記シッパノズルがジョイントにより前記導管およびフローセルと結合されており、
該フローセルには実行電極、対照電極および参照電極が固定されており、
前記標識物に電気化学的に発光する物質を用い、前記フローセル内の実行電極と参照電極の間に所定の電圧を印加し続け、この際の経時的な実行電極と対照電極の間に流れる電流変化を検出する事により、シッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積測定を行う免疫学的自動分析装置。 - 電気電導度の異なる2種類の溶液が、前記フローセル内の実行電極と参照電極との間を通過する際に、電気電導度の差により生じる実行電極と対照電極の間に流れる電流変化を検出する事により、シッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積測定を行う請求項1の免疫学的自動分析装置。
- 電気化学的な分析を行う際に使用する導電性の緩衝液と空気とを、交互に、前記導管内を通して、前記フローセル内の実行電極と参照電極との間を通過させ、電気電導度の異なる2種類の溶液の電気電導度の差により生じる電流値の経時的な変化を利用し、シッパノズルから磁石による固相の捕捉位置までの体積測定を行う請求項2の免疫学的自動分析装置。
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