JP2002502035A - 電気化学発光結合反応テストを利用したサンプルの分析方法 - Google Patents
電気化学発光結合反応テストを利用したサンプルの分析方法Info
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Abstract
Description
る。
に関するものである(定量分析)。場合によっては、サンプル中にアナライトが( 閾値以上の濃度で)存在しているかどうかを測定するだけで充分な場合もある(定
性分析)。本発明がとりわけ有用である医療上の用途においては、ホルモン、抗 体、抗原または薬剤など、そこに含まれるアナライトに関する体液(主として血 液、血清および尿)の分析が、重要な役割を担っている。
気化学発光結合反応分析と呼ばれることがある(以下、電気化学発光生化学的結 合分析(electrochemiluminescence biochemical binding analysis)を略してECL
-BBAと表す)。このような方法は、以下の特徴的な特性を備えている。
ハプテン間での免疫学的化学結合反応であり、その際抗体は抗原やハプテンと特
異的に結合する。その他の生化学的結合反応としては、タンパク質結合、その中
でもアビジンとビオチンの結合、レクチン炭水化物結合、受容体とリガンド間の
結合および核酸のハイブリダイゼーションがある。
きた。異なる1つまたは複数の段階からなる反応工程(テストプロトコール)が複
数あり、アナライトと、試薬系(結合試薬)に含まれる少なくとも1つの特異的結
合物質とが関係することで、最終的に分析の特徴である複合体が形成される。こ
の複合体には通常アナライトが含まれるが、必ずしも含まれていなくてもよい。
る。標識物質と結合試薬を含んでいる化学種は、コンジュゲートと呼ばれる。
測光法的に測定可能な光を発する。前駆物質と呼ばれる電気化学的に活性な第2
の物質は、一般にこの結合反応に寄与するものである。実際には、ECL標識とし ては主にルテニウム錯体(ルテニウム-トリス[ビピリジル])が使用され、前駆物 質としてTPA(トリプロピルアミン)が併用される。この2つの電気化学的に活性 な物質は、電極上で反応し合い、互いに電子を放出して、強力な還元性もしくは
酸化性化学種を形成する。その後の酸化還元反応によってECL標識は励起状態と なり、フォトンを放出することによって基底状態に戻る。ECL標識反応は好まし くは循環反応であり、そのため電極に電圧をかけると1個の標識分子から複数の
フォトンが放出される。
粒子(ビーズ)に固定する。具体的には、直径が一般に2〜3μmの磁化ポリスチロ ール球が使用される。固定は1組の特異的な生化学的結合パートナーを用いて行
う。ストレプトアビジン-ビオチンの対が特に有用であることがわかっている。 ストレプトアビジンポリマーでビーズを被覆する。ビオチンは複合体分子に結合
させる。
各電極(通常は作用電極、対電極、特に電位差測定の場合には参照電極)が備えら
れており、これらの電極は、ECL反応を引き起こすのに要する電界を生成するた めに必要である。ビーズは、作用電極の下に配置されたマグネットの磁界内にあ
る作用電極の表面に引きつけられる。通常、このような操作はサンプル液体を連
続的に流しながら貫流セル(flow-through cell)中で行うため、ビーズの磁力に よる堆積は「捕捉(capturing)」と呼ばれる。
成分を除去する。次いで作用電極にECL反応を引き起こすのに必要な電位を印加 し、発生したルミネセンス光を適切な光学検出器を用いて測定する。ルミネセン
ス光の強度は、作用電極表面における標識ビーズの濃度の判断基準であると共に
、サンプル中のアナライトの濃度の判断基準でもある。キャリブレーションを行
うことで、測定されたルミネセンスシグナルから目的の濃度を計算することがで
きる。
上記の個々の態様のそれぞれを示していると思われる。
titive test)の場合には、それぞれ異なるいくつかのサブ・バリエーションがあ
る)。根本的な相違点は、形成された複合体分子と複合体化していないコンジュ ゲートとを分離する必要のない均一テスト(homogeneous tests)と、結合したも のと遊離のものとを分離する必要がある不均一テスト(heterogeneous tests)と の間にある。テストプロトコールが反応順序を含み、その反応順序が少なくとも
1つの特異的化学結合反応を含んでなり、分析の特徴であるECL標識で標識され た複合体の形成につながるものである限りは、本発明は様々なテストプロトコー
ルに使用することができる。
ニウム錯体とTPAを併用するテスト方法にとりわけ有用であることが判明してい る。
といった類のテストのみに関するものである。本発明はまた、態様c)のバリエ ーションに依らず、例えば、ビーズの素材や大きさを変えたり、ビーズに複合体
を固定する方法を変えて使用することもできる。
開示はすべて、引用により本明細書に含まれるものとする: 1)G.F. Blackburn et al. “Electrochemiluminescence Detection for Deve
lopment of Immunoassays and DNA Probe Assays for Clinical Diagnostics”,
Clin. Chem. 37 (1991), 1534-1539 2)J.K. Leland and M.J. Powell: “Electrogenerated Chemilumenescence:
An Oxidative-Reduction Type ECL Reaction Sequence using Triprolyl Amine ”, J. Electrochem. Soc., 137 (1990), 3127-3131 3)J.H. Kenten et al. : “Improved Electrochemiluminescent Label for D
NA Probe Assays: Rapid Quantitative Assays of HIV-1 Polymerase Chain Rea
ction Products”, Clin. Chem. 38 (1992), 873-879 4)N.R. Hoyle: “The Application of Electrochemiluminescence to Immuno
assay-based Analyte Measurement” in “Bioluminescence and Chemilumenesc
ense”; Proceedings of the 8th International Symposium on Bioluminescenc
e and Chemilumenescence, Cambridge, September 1994, A.K. Campbell et al.
(edit.), John Wiley & Sons 5)WO89/10551 6)WO90/11511 先に述べたように、ECL光の測定は、通常、貫流測定セル中で行なわれる。こ のセルは、サンプル液体用の狭い流路を含んでなり、流路を規定する壁の1つに
作用電極が取り付けられている。同じ測定セルを用いて異なるサンプルを連続し
て測定することを可能にするために、セル(特に、作用電極)を、測定と測定の間
に洗浄し、そこに堆積したビーズや他の不純物を取り除かなければならない。分
析器としての高い処理量や、精度の高い分析を保証するため、この洗浄工程は迅
速かつ効率よく行なわなければならない。
行う(特に洗剤を含有する洗浄液を通過させる)。また、強力な酸化および/また
は還元電位を作用電極へ印加して、電気化学的な洗浄を行ってもよい。この電位
は、通常、作用電極の表面に気泡が形成されるよう十分に高くする。これにより
洗浄工程が効果的に維持される。しかしながら、洗浄段階の後は、電極表面の電
気化学的平衡が著しく乱されているため、調整段階を実施し、作用電極に使用さ
れている電極素材の作用電位の範囲全体をカバーするだけの一定のパルスを流す
必要がある。
イクルをセル内で実施する。洗浄段階および調整段階の際には、洗浄液および調
整液をそれぞれセル中へ導入する。ビーズを含有するサンプル液は、捕捉段階の
開始時にのみ貫流測定セル内に導入する。不均一テストでは、捕捉段階と測定段
階の間に、追加の洗浄段階がある。検出サイクルについては、参考文献の1〜6
、特にWO89/10551に詳細に記載されている。
が高い点、測定可能な濃度の範囲が極めて広い点、経済的な分析である点、およ
び自動化の可能性が高い点などの理由から傑出した方法である。
電圧曲線の調整段階と捕捉段階の間に導入し、微粒子の堆積を向上させる。その
際、追加の電位パルスを、作用電極がサンプルに触れる前の(酸化または還元の いずれでもない)中性の電位に戻す。
点については、WO89/10511(参考文献5)で議論されている。この参考文献によれ
ば、分析結果の再現性を向上させるためには、「操作前電位 (preoperative pot
ential)」と呼ばれる一定の電位値を調整段階の完了時に印加しなければならな い。この操作前電位は、作用電極をサンプル液体と接触させてECL測定を行うま で、一定に維持しなければならない。作用電極の素材と使用される電解質に応じ
て、酸化電位または還元電位のいずれかにすべきである。
ルの電圧曲線に導入すれば、作用電極の表面にビーズを堆積させることに関する
実質的な改良と、それによる分析の再現性や精度に関する改良を成し得ることが
判明した。このパルスが一方では酸化もしくは還元電位値に到達し、他方ではサ
ンプルを測定セルへ導入して作用電極と接触させる前の(酸化または還元のいず れでもない)中性の電位に戻されるという点が重要である。
気化学的前処理を施すことにより実質的な改良を達成する。従来、ビーズの分布
は磁界の特性に依るものであるのに対し、電気化学的な調整および洗浄処置はシ
グナル発生の向上に役立つと考えられていたため、本発明で講じた改良がビーズ
の堆積の向上につながるという事実は予想外のことである。
化のことであり、パルスが発生している間は酸化もしくは還元電位値が達成され
るが、電位パルスの前後では電位は中性の範囲にある。電位曲線は、詳細には様
々な形をとることができる。電位曲線が、特定の幾何学的な形状(長方形、三角 形、もしくはステップ関数など)を示す必要は特にない。
の電位である。電位は、調整液と接触している作用電極の金属表面が電気化学的
に還元されると還元電位となる。清浄な金属表面上に酸化層や水素化物層が形成
されない場合の電位は中性である。この状態は、対応する金属の電気二重層領域
とも呼ばれる。
存在しない。当業者であれば、この点に関して、刊行されているデータ、特に電
極に使用される素材のサイクロボルタモグラム(cyclovoltamograms)からより詳 細な情報を得ることができるであろう。いずれにしても、酸化、還元もしくは中
性の電位値は実験により決定することができる。
構成するものである。また、こうした分析器は、ECL標識で標識された複合体の 形成(その濃度が分析の特徴となる)を導き、その複合体を磁性微粒子に結合させ
る反応順序を実施するためのユニットを備えている。これらの構成要素について
は図1には示していない。
は、作用電極(4)と対電極(5)が、狭い貫流チャネル (3)を通過する液体に接 触するように前記貫流チャネルに配置されている。対電極(5)は、図からもわか
るように、好ましくは作用電極(4)と差し向かいに配置する(即ち、貫流チャネ ル(3)を挟んだ向い側)。参照電極(7)は、通常検出ユニット(1)の液体導管(そ
の全体を8で表す)に配置し、貫流チャネル(3)の外側に置く。液体の吸引には 精密な往復ポンプ(9)を通常使用し、貫流セルの下流側の液体導管(8)に設置す
る。
、例えば、多方向(multiple way)バルブ(10)によって制御しながら貫流セル(2)
へ選択的に吸引させることができる。例示では、洗浄液を貯留する容器(12)、調
整液を貯留する容器(13)、およびサンプル液を貯留する容器(14)がある。サンプ
ル液容器(14)は、通常、試験管(反応管)として構成されており、プロセッシング
ローター(15)内に配置する。また、このプロセッシングローター内では、結合反
応を行うのに必要な段階を実施する。ここでは理解しやすいように、複数の反応
管のうちの1つだけをプロセッシングローター(15)内に配置した様子を示してい
る。
は面していない側に配置する。例示では永久磁石を使用しており、可動機構(18)
の作用によって、捕捉位置(少なくとも磁極片の1つが作用電極(4)に可能な限 り接近している)から、作用電極(4)から離れた中立の位置へ動かすことができ る。スイッチを入れたり切ったりできる電磁石を代わりに使用することも可能で
ある。
a)と向かい合う側に、作用電極(4)の貫通チャネル(3)に面する(マグネット(17
)には面していない)捕捉表面(4a)に対して光電子増倍管の感光表面が並行になる
ように配置する。
トは、これらの機器を制御したり、光検出器(19)からのシグナルを処理したりす
るためのものである (接続ケーブルについては一部だけを示す)。
依存性(各々、作用電極に接触している液体および参照電極を基準とする)が特定
の特徴を有することは、検出ユニット(1)の機能にとって重要なことである。こ
れについて、図2に示す電位曲線のグラフに基づいて、より詳細に述べることに
する。図2は、白金作用電極を用いる実施形態に関するものである。縦座標の電
圧値UはAg/AgCl参照電極を基準として測定し、時間tに対して秒単位でプロット
する。検出サイクルは、各分析ごとに同様に繰返す。以下、洗浄段階から説明を
始める。
純物を取り除いたり、もしくは電極表面を取りかえるために、毎回、その前に行
なった測定に続けて実施する。それぞれ強力な酸化および/また還元電位である
ClOもしくはClRを、洗浄工程を電気化学的に補助するために印加する。その電位
値は、一般に、検出サイクルにおける他のあらゆる電位よりも高い(酸化電位、 還元電位の双方とも)。図からも明らかなように、酸化電位ClOについては、その
値がそれ以前の測定段階(21)における同様の酸化電位値を超えていることが望ま
しい。例示のように、洗浄段階には、2つの低い還元電位ClR1およびClR2が含ま
れているが、これは必須ではない。本発明は、洗浄段階時に酸化もしくは還元電
位を作用電極に印加する検出サイクルの全てに適しているが、この電位はきわめ
て高いため、後続の調整段階時に電気化学的平衡を再度確立する必要がある。洗
浄段階時全般において、ポンプ(9)は、容器(12)から導管(8)を通じて、また貫
流チャネル(3)を通じて洗浄液を供給する。
平衡を再び確立するのに役立つ。このためには、一連の酸化および還元電位パル
スCO1、CR1、CO2、CR2、CO3およびCR3を図2に示すように交互に作用電極に印加
する。
ルスを交互に印加することからなり、酸化および還元パルスの総数が等しいこと
が特に好ましい。各調整パルスの持続時間は、実際には1秒未満である。0.7秒 未満かつ0.1秒を超える値が好ましく、約0.3秒〜約0.5秒の範囲が特に有用であ ることが判明している。
lse)」すなわちDIPのように、検出サイクルの電圧曲線に追加の電位パルスを導 入することである。この追加の電位パルスは、調整段階(22)の後かつ、図2中tp で表わした時点より前に導入する。時点tpでは、サンプルを容器(14)から吸出し
、バルブ(10)を経由して貫流チャネル(3)へ送る(その結果、サンプル液に含ま れているビーズは、作用電極(4)に接触するようになる)。この追加のパルスは 、きわめて短い持続時間中に(好ましくは少なくとも約0.05秒、特に好ましくは 少なくとも0.1秒)酸化もしくは還元電位値を達成できるほど高いものであるが、
電極表面に電気化学的に影響を及ぼすものではない。電位がtpの時点より前に( 酸化電位でも還元電位でもない)中性の電位に戻ることはさらに重要である。図 示した酸化DIPの例は、その前の調整段階(22)の還元電位パルスCRに続くもので あり、特に好ましい。
、ECL検出手順の要件に最もよく合うように堆積パターンを調整することが可能 である。
貫通チャネル(3)を流れる微粒子は、磁界に引きつけられて作用電極の表面に堆
積する。捕捉段階(23)およびそれに続く洗浄段階(24)では、作用電極電位は、図
示したように、中性の範囲にいるのが好ましい。従来の方法では、作用電極は、
通常これらの段階ではポテンシオスタットから切り離されているため、電位が一
定ではない。WO89/10551によれば、検出サイクルのこうした段階では、記載され
ているように「操作前電位」、すなわち一定の酸化もしくは還元電位を作用電極
(4)に印加しなければならない。
段階(21)は常法で実施する。多方向バルブ(10)はtwの時点でスイッチが入るため
、サンプル液の代わりに、洗浄液としても同時に作用する調整液を、結合したも
のと遊離のものとを分離するために容器(13)から導管(8)へ吸引する。
きる。その場合、DIPはすべて、酸化電位もしくは還元電位のいずれかであるこ とが好ましい。1つのDIPもしくは複数のDIPが酸化もしくは還元領域に維持され
る持続時間の合計は、各検出サイクルごとに少なくとも0.05秒、好ましくは少な
くとも0.1秒であり、かつ最大で1秒、好ましくは最大で0.3秒である。
通常、こうした種類の測定は、参照電極を基準として、白金電極に印加する電位
を三角形を描くように変化させることによって行い、図のような電流/電圧曲線
が得られる。この循環ボルタモグラムは、白金電極を1Mの硫酸溶液に接触させ
た際の測定結果を示している。横座標の電圧値は標準水素電極を基準としている
。mA/cm2で表した電流Iを縦座標に示す。
、ほとんど測定不可能な電流がわずかに流れる領域に存在し、電気二重層の帯電
に関与する。この領域は、英語で言うところの「電気二重層領域 (double-layer
region)」のことである。電流は曲線領域Bで急激に増加する。ここでは、本発
明で使用される酸化電位値に到達する。すなわち、白金表面が電気化学的に酸化
される。曲線下面積は、酸化に要した電荷の量に相当している。
。酸化層の除去が完了した後では、電流は再び減少して電気二重層領域ではゼロ
近くまで落ち込み、白金の還元が起こる電圧値に達するまでこの状態が続く(白 金はそれまでに実質的に純粋な状態になる)。曲線領域Dにおける値の上昇は、 本発明で言うところの還元電位値を示している。酸化電位と還元電位の間の電圧
領域は、中性領域Nとして表す。約0.1Vで電位が再び反転した後、曲線領域E において白金表面の還元層が除去される。
施し、DIPを追加した場合としない場合の結果を比較した。検出サイクルは図2 のとおりである。DIPを追加した実験には、パルス高+0.9Vかつパルス持続時間
0.2秒の長方形の追加酸化パルスを導入した。PSAテスト(PSA=前立腺特異抗原(p
rostrate specific antigen))に対して、DIPなしでは以下のような値が得られた
。
グナルの平均値、VK:シグナルの変動係数(%)。
により安定に堆積するかどうかも判定した。DIPなしでは、ビーズは洗浄段階で 移動した。これでは、特にそれまでに作用電極に堆積しているビーズが失われて
しまう可能性があるため、測定の精度の点では不都合である。
フに示したものである。
Claims (11)
- 【請求項1】 電気化学発光結合反応方法を利用して液体サンプル、特に体
液を、前記サンプル中に含まれる物質について分析する方法であって、 少なくとも1つの特異的な生化学的結合反応を含み、化学発光標識物質を含む
分析の特徴である複合体を形成させ、さらに前記複合体を磁性微粒子に結合させ
る反応順序を実施し、 標識された微粒子の濃度を測定するための作用電極(4)を備えた測定セル(2)
内で検出サイクルを実施する ことを含んでなり、前記検出サイクルは、 作用電極(4)を電気化学的に洗浄するために、強力な酸化電位(ClO)および/ または還元電位(ClR)を作用電極(4)に印加する洗浄段階(20)、 一連の還元および酸化電位パルス (CO1、CR1、CO2、CR2等)を作用電極へ交互 に印加する調整段階(22)、 微粒子を含むサンプルを作用電極(4)と接触させ、作用電極のサンプルには面
していない側に配置されたマグネット(17)の磁界によって微粒子を引き寄せ、サ
ンプルに面する作用電極の堆積表面(4a)に微粒子を堆積させる捕捉段階(23)、お
よび、 作用電極に電位を印加してECL反応を引き起こし、標識物質から発せられた電 気化学発光を測定して作用電極(4)の堆積表面(4a)上に堆積した標識物質の濃度
を判定する測定段階(21)、 からなる一連の段階を含むものであり、 微粒子の堆積を向上させるために、酸化もしくは還元電位を有する追加の電位
パルス(DIP)を検出サイクルの電圧曲線の調整段階(22)と捕捉段階(23)の間に導 入し、前記追加の電位パルス(DIP)を、酸化電位でも還元電位でもない、サンプ ルを作用電極(4)に接触させる前(tP時点)の中性の電位に戻すことを特徴とする
、前記分析方法。 - 【請求項2】 追加の電位パルス(DIP)に先立って印加される調整段階(22) の最後の電位パルスが、還元電位パルス (CR3)である、請求項1記載の方法。
- 【請求項3】 追加の電位パルス(DIP)が酸化電位パルスである、請求項1 または2記載の方法。
- 【請求項4】 調整段階(22)において、酸化電位パルス (CO1、CO2等)およ び還元電位パルス(CR1、CR2等)を作用電極(4)へ交互に印加する、請求項1〜3
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項5】 還元および酸化電位パルスの数が同じである、請求項4記載
の方法。 - 【請求項6】 測定段階(21)において、追加の電位パルス(DIP)がECL反応を
引き起こす電位と同じ極性を有し、前記追加の電位パルス(DIP)の最大値がECL反
応を引き起こす電位の最大値よりも低い、請求項1〜5のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項7】 作用電極が白金電極であり、追加の電位パルス(DIP)の最大 値が、Ag/AgCl参照電極を基準にして少なくとも0.6V、好ましくは少なくとも0.
8Vの電圧に相当する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項8】 追加の電位パルス(DIP)の最大値が、Ag/AgCl参照電極を基準
にして最大で1.6V、好ましくは最大で1.2Vの電圧に相当する、請求項7記載の
方法。 - 【請求項9】 微粒子の堆積を向上させるために、複数の追加の電位パルス
を検出サイクルの電圧曲線の調整段階(b)と捕捉段階(c)の間に導入し、最後の追
加の電位パルスを、酸化電位でも還元電位でもない、サンプルを作用電極に接触
させる前の中性の電位に戻す、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項10】 少なくとも1つの追加の電位パルスを酸化もしくは還元電
位領域に維持する持続時間の合計が、各検出サイクルごとにそれぞれ少なくとも
0.05秒、好ましくは少なくとも0.1秒である、請求項1〜9のいずれか一項に記 載の方法。 - 【請求項11】 少なくとも1つの追加の電位パルスを酸化もしくは還元電
位領域に維持する持続時間の合計が、各検出サイクルごとにそれぞれ最大で1秒
、好ましくは最大で0.3秒である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法 。
Applications Claiming Priority (3)
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