CN108051586A - 一种磁微粒化学发光定量检测gfap的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种磁微粒化学发光定量检测gfap的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学体外诊断领域，具体涉及一种磁微粒化学发光定量检测GFAP的试剂盒及其制备方法，本发明提供的一种磁微粒化学发光定量检测GFAP的试剂盒，包括磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂、底物、洗液、校准品、质控品、磁套和吸头。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒能够提高检测上限、反应速度和检测结果的灵敏度。

Description

一种磁微粒化学发光定量检测GFAP的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学体外诊断领域，具体涉及一种磁微粒化学发光定量检测GFAP的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经系统星形胶质细胞(AS)胞质内特异性酸性蛋白，被认为是AS的特有标志物，其在维持AS的形态和功能都具有作用。近年来研究发现血清及脑脊液GFAP水平在神经系统疾病的诊断、治疗及预后方面有重要的指导意义。例如血清GFAP在外伤性颅脑损伤(TBI)中升高，对TBI的早期诊断、鉴别诊断和判断预后有重要意义；急性缺血性脑卒中患者的血浆GFAP水平明显高于健康对照，且与患者的脑梗死体积间有明显相关性，GFAP水平越高，患者的神经缺损程度越高；阿尔兹海默病(AD)中AS增生是非常突出的中枢神经病理变化，众多研究报道AD患者刮氨酸化或氧化的GFAP升高，而且AD脑脊液中的GFAP水平与年龄呈正相关。
检测GFAP的技术有半定量的免疫印迹、免疫组织化学方法；定量的酶联免疫吸附(ELISA)、质谱法、基于荧光的多重技术等。其中定量检测技术由于其量化结果的特点，在临床指导意义上优于半定量检测技术。在定量检测技术中，ELISA方法相对于其他方法具有检测时间短、检测成本低的优点，市场上的GFAP检测试剂盒绝大部分均采用ELISA的检测方法。本试剂盒采用磁微粒化学法检测与现有技术相比，在检测时间，灵敏度上具有大大提高。
例如，中国专利申请号201110306638.4公开了一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、微球储存液、酶结合物、底物A、底物B、20×洗涤液、不干胶封片和使用说明书组成。本发明中的试剂盒将固相载体由传统的微孔板改为聚苯乙烯微球，抗原抗体的反应发生在液相中，不仅有利于二者保持生物活性和正确的空间构象，还可消除传统反应模式的表面张力和空间障碍对抗原抗体反应的影响，以上两点均有利于二者之间的反应，可以有效缩短反应时间与洗涤次数，同时该发明具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低的特点，对急性脑出血早期病情程度的诊断具有重要的临床意义。但是该发明定量检测是依据酶HRP和底物反应显色强弱来判断，通过色差的分辨灵敏度较低，影响定量检测的灵敏度。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种磁微粒化学发光定量检测GFAP的试剂盒，能够实现GFAP准确和高精确地定量测定。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
所述试剂盒包括：磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂、底物、洗液、校准品、质控品、磁套和吸头；
所述磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述抗体试剂为1个含有生物素标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述酶标试剂为1个含有碱性磷酸酶标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述底物为1个含有光泽精的Tris缓冲液瓶；
所述洗液为1个含有吐温-20、NaCl的Tris缓冲液瓶；
所述校准品包括2个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别为0.2ng/ml、25ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述质控品包括1个质控瓶，所述质控瓶内为5ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述磁套为1个保护磁棒避免污染的塑料管；
所述吸头为1个转移200ul液体的塑料管。
进一步的，所述磁微粒为羧基磁球。
进一步的，所述磁微粒直径为1-10μm。
进一步的，所述磁微粒直径为4μm。
本发明采取的又一技术方案是：所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：配制Buffer A溶液
配制1000ml Buffer A溶液，准确称取1.5601g NaH2PO4·2H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在5.9～6.1之间，如pH值超出5.9～6.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤2：配制Buffer B溶液
配制1000mlBuffer B溶液，准确称取0.0499g NaH2PO4·2H2O和0.6023g Na2HPO4·12H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤3：配制Buffer C溶液
配制1000mlBuffer C溶液，:准确称取75.07g甘氨酸，加入到900ml的Buffer B中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤4：配制样本稀释液
配制1000ml样本稀释液，准确称取5.8747g NaCl、12.1141g Tris、50g BSA，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.3～7.5之间，如pH值超出7.3～7.5，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤5：配制通用稀释液
配制1000ml通用稀释液，准确称取5.8746g NaCl、12.1141g Tris、0.2042gMgCl2.6H2O、50g蔗糖、5g BSA，加入到一定量的纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300和1ml吐温-20加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.9～8.1之间，如pH值超出7.9～8.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.45μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤6：配制磁分离试剂
配制1000ml的磁分离试剂，A瓶：用10ml Buffer A洗涤400mg的磁微粒，洗涤两次，再加入5ml Buffer A；B瓶：用400μL DMSO溶解400mg EDC和240mg NHS；C瓶：32mg SA溶于2ml buffer B中；B瓶溶液加入A瓶，室温充分震荡反应10min，用10ml buffer A洗涤两次；3ml buffer B加入A瓶重悬磁微粒，C瓶溶液加入A瓶，混匀，室温震荡反应1h；向A瓶加入800ul buffer C终止5min，用10ml bufferB洗涤磁球三次，加入10ml通用稀释液；使用100ul～1000ul量程的移液器将A瓶溶液加入广口瓶，补加通用稀释液用量筒定容至溶液配制总量；
步骤7：配制抗体试剂
将0.5mg/ml生物素联抗体原液用样本稀释液稀释400倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于399ml样本稀释液中稀释400倍，搅拌混匀，浓度为0.00125mg/ml。
步骤8：配制酶标试剂
将0.5mg/ml酶标抗体原液用样本稀释液稀释200倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于199ml样本稀释液中稀释200倍，搅拌混匀，浓度为0.0025mg/ml。
步骤10：配制校准品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为0.2ng/ml、25ng/ml共2个浓度点；
步骤11：配制质控品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为5ng/ml。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
1、本发明所述试剂盒固相载体为磁微粒，在磁微粒表面包被抗体，具有更多的表面积来包被抗体，能够提高检测上限和灵敏度。
2、本发明所述试剂盒中磁微粒上的抗体和液相中的抗原抗体反应，磁微粒直径为1-10微米，能够悬浮在液体中，增加反应的有效碰撞，提高了反应速度和检测结果的灵敏度。
3、本发明所述试剂盒采用磁微粒化学发光方法的定量是依据酶ALP催化底物产生发光，通过光的强度来判断，相对于通过色差的分辨更灵敏，提高了磁微粒化学发光检测的灵敏度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明所述试剂盒作进一步详细的说明。
实施例1
所述试剂盒包括：磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂、底物、洗液、校准品、质控品、磁套和吸头；
所述磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述抗体试剂为1个含有生物素标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述酶标试剂为1个含有碱性磷酸酶标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述底物为1个含有光泽精的Tris缓冲液瓶；
所述洗液为1个含有吐温-20、NaCl的Tris缓冲液瓶；
所述校准品包括2个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别为0.2ng/ml、25ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述质控品包括1个质控瓶，所述质控瓶内为5ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述磁套为1个保护磁棒避免污染的塑料管；
所述吸头为1个转移200ul液体的塑料管。
进一步的，所述磁微粒为羧基磁球，羧基磁球上的羧基基团能够与链霉亲和素蛋白偶联，链霉亲和素与生物素在反应时的比例是1比4，即1个亲和素能和4个生物素反应，能够放大反应信号。
实施例2
如实施例1所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：配制Buffer A溶液
配制1000ml Buffer A溶液，准确称取1.5601g NaH2PO4·2H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在5.9～6.1之间，如pH值超出5.9～6.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，浓度过高调节pH不精确，过低需滴加的液量太大，导致体积变大，影响溶质浓度，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤2：配制Buffer B溶液
配制1000mlBuffer B溶液，准确称取0.0499g NaH2PO4·2H2O和0.6023gNa2HPO4·12H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤3：配制Buffer C溶液
配制1000mlBuffer C溶液，准确称取75.07g甘氨酸，加入到900ml的Buffer B中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤4：配制样本稀释液
配制1000ml样本稀释液，准确称取5.8747g NaCl、12.1141g Tris、50g BSA，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.3～7.5之间，如pH值超出7.3～7.5，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤5：配制通用稀释液
配制1000ml通用稀释液，准确称取5.8746g NaCl、12.1141g Tris、0.2042gMgCl2.6H2O、50g蔗糖、5g BSA，加入到一定量的纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300和1ml吐温-20加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.9～8.1之间，如pH值超出7.9～8.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.45μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤6：配制磁分离试剂
配制1000ml的磁分离试剂，A瓶：用10ml Buffer A重悬洗涤400mg的磁微粒，能够彻底清洗磁微粒并节省试剂，洗涤两次，去除更换磁微粒原来的保存液，再加入5ml BufferA；B瓶：用400μL DMSO溶解400mg EDC和240mg NHS，DMSO、EDC、NHS是偶联试剂，能够活化基团，提高活性；C瓶：32mg SA溶于2ml buffer B中；B瓶溶液加入A瓶，室温充分震荡反应10min，用10ml buffer A洗涤两次；3ml buffer B加入A瓶重悬磁微粒，C瓶溶液加入A瓶，混匀，室温震荡反应1h；向A瓶加入800ul buffer C终止5min，用10ml bufferB洗涤磁球三次，加入10ml通用稀释液；使用100ul～1000ul量程的移液器将A瓶溶液加入广口瓶，补加通用稀释液用量筒定容至溶液配制总量；
本发明中B瓶先加入到A瓶，用偶联试剂EDC和NHS活化磁微粒表面的羧基基团，活化10min后通过洗涤去掉多余的偶联剂，3Ml buffer B加入A瓶重悬磁微粒，把缓冲液置换成利于偶联SA的缓冲环境，C瓶SA加入A瓶，让磁微粒上活化的羧基基团与SA蛋白链上的氨基更加充分连接；而且反应的时间太短，活化不完全，活化时间太长，活化的基团会水解，本发明反应时间即能保证活化完全，同时减少活化基团的水解。
步骤7：配制抗体试剂
将0.5mg/ml生物素联抗体原液用样本稀释液稀释400倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于399ml样本稀释液中稀释400倍，搅拌混匀，浓度为0.00125mg/ml。
步骤8：配制酶标试剂
将0.5mg/ml酶标抗体原液用样本稀释液稀释200倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于199ml样本稀释液中稀释200倍，搅拌混匀.浓度为0.0025mg/ml。
步骤10：配制校准品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为0.2ng/ml、25ng/ml共2个浓度点。
步骤11：配制质控品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为5ng/ml。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种磁微粒定量检测GFAP的试剂盒，所述试剂盒包括：磁分离试剂、抗体试剂、酶标试剂、底物、洗液、校准品、质控品、磁套和吸头，其特征在于：
所述磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述抗体试剂为1个含有生物素标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述酶标试剂为1个含有碱性磷酸酶标记的抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；
所述底物为1个含有光泽精的Tris缓冲液瓶；
所述洗液为1个含有吐温-20、NaCl的Tris缓冲液瓶；
所述校准品包括2个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别为0.2ng/ml、25ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述质控品包括1个质控瓶，所述质控瓶内为5ng/ml的GFAP抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述磁套为1个保护磁棒避免污染的塑料管；
所述吸头为1个转移200ul液体的塑料管。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为羧基磁球。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒直径为1-10μm。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒直径为4μm。
5.如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：配制Buffer A溶液
配制1000ml Buffer A溶液，准确称取1.5601g NaH2PO4·2H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在5.9～6.1之间，如pH值超出5.9～6.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤2：配制Buffer B溶液
配制1000mlBuffer B溶液，准确称取0.0499g NaH2PO4·2H2O和0.6023g Na2HPO4·12H2O，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤3：配制Buffer C溶液
配制1000mlBuffer C溶液，准确称取75.07g甘氨酸，加入到900ml的Buffer B中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.4～7.6之间，如pH值超出7.4～7.6，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤4：配制样本稀释液
配制1000ml样本稀释液，准确称取5.8747g NaCl、12.1141g Tris、50g BSA，加入到纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.3～7.5之间，如pH值超出7.3～7.5，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤5：配制通用稀释液
配制1000ml通用稀释液，准确称取5.8746g NaCl、12.1141g Tris、0.2042gMgCl2.6H2O、50g蔗糖、5g BSA，加入到一定量的纯水中，搅拌至完全溶解并准确量取1ml Pc-300和1ml吐温-20加入到上述溶液中，搅拌至完全溶解并定容至1000ml，用pH试纸测溶液pH值，确定pH值是否在7.9～8.1之间，如pH值超出7.9～8.1，用0.04M的NaOH或HCl进行调节至pH值范围之内，再用0.45μm的滤膜，对溶液进行过滤；
步骤6：配制磁分离试剂
配制1000ml的磁分离试剂，A瓶：用10ml Buffer A洗涤400mg的磁微粒，洗涤两次，再加入5ml Buffer A；B瓶：用400μL DMSO溶解400mg EDC和240mg NHS；C瓶：32mg SA溶于2mlbuffer B中；B瓶溶液加入A瓶，室温充分震荡反应10min，用10ml buffer A洗涤两次；3mlbuffer B加入A瓶重悬磁微粒，C瓶溶液加入A瓶，混匀，室温震荡反应1h；向A瓶加入800ulbuffer C终止5min，用10ml bufferB洗涤磁球三次，加入10ml通用稀释液；使用100ul～1000ul量程的移液器将A瓶溶液加入广口瓶，补加通用稀释液用量筒定容至溶液配制总量；
步骤7：配制抗体试剂
将0.5mg/ml生物素联抗体原液用样本稀释液稀释400倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于399ml样本稀释液中稀释400倍，搅拌混匀，浓度为0.00125mg/ml。
步骤8：配制酶标试剂
将0.5mg/ml酶标抗体原液用样本稀释液稀释200倍，吸取溶液1ml生物素联抗体原液溶于199ml样本稀释液中稀释200倍，搅拌混匀，浓度为0.0025mg/ml。
步骤10：配制校准品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为0.2ng/ml、25ng/ml共2个浓度点；
步骤11：配制质控品
采用样本稀释液将GFAP抗原分别配制为5ng/ml。
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