CN102279266A

CN102279266A - 用于检测h5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102279266A
Application number: CN2010102016627A
Authority: CN
Inventors: 何宏轩; 崔大付; 王海静; 李辉; 张璐璐; 董国英
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明提供一种用于检测H5亚型禽流感病毒的抗体生物芯片及其制备方法和用途。本发明所提供的生物芯片包括固相载体、附着于固相载体上的金膜以及与该金膜相连接的抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体，该生物芯片有助于对H5亚型禽流感病毒的快速而准确的检测鉴定，并可以对样品中H5亚型禽流感病毒进行定量分析，真正体现生物芯片特异、灵敏、快速的优点。

Description

用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物芯片领域，涉及一种用于检测分析H5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途。

背景技术

生物芯片在细菌鉴定、环境监测、病原检测等各个领域展现出广阔的应用前景。生物芯片与传统的仪器检测方法相比，其突出特点是实时、无标记、样品量少、高通量、微型化、自动化、成本低、防污染、检测速度快，在临床诊断和病毒检测方面具有极大的优势。

目前，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，但是在样品的制备、探针固定、分子标记等方面仍存在着较多问题，而且国外相关的检测仪器和芯片价格昂贵，因此严重制约了国内芯片技术的进一步发展。蛋白质芯片(Proteinchip)是为满足蛋白组学研究需要而发展起来的生物芯片技术，其原理是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，用单克隆抗体固定在载体表面充当捕获探针所构建的蛋白质芯片，称为抗体芯片(Antibody chip，抗体芯片)，其在微生物感染样品检测中具有巨大的潜在应用价值。

基于表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance，SPR)效应的免疫传感器是近年来发展起来的一种新的检测方法。应用该方法可以实时监测生物分子之间的相互作用，而不需要标记和纯化，是当前国内外生物传感分析技术的研究热点之一。其原理如下：当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应当相同。但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为谐振角(SPR angle)。谐振角会随着金属薄膜表面接触的液相的折射率的改变而改变，而折射率的变化又与结合在金属表面的生物大分子的质量成正比。检测时，先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离整个过程的变化。SPR生物传感器可以通过对反应过程中反射光的吸收获得初始数据，经过相关处理后获得各动力学参数从而对分子间相互作用情况进行分析，判定样品中检测物存在与否。

一个多世纪以来，流感一直是威胁着人类健康的重要疾病。伴随着人类流感的流行，禽流感也随之爆发，给世界上很多国家的经济造成沉重的打击，因此WHO和各大研究机构都密切关注着流感的动向。1997年香港、2004年初越南和泰国的H5N1感染人事件，突出显示了禽流感的公共卫生意义。现有的禽流感快速诊断方法主要有鸡胚分离法、分子生物学方法(包括一般的RT-PCR、荧光RT-PCR、NASBA等)、胶体金免疫层析技术等。每种诊断方法各有其优点，但又受到几个不利因素的限制，如成本高、处理周期长以及灵敏度低等，尤其在定量分析禽流感病毒含量及病毒亚型判定的即时、准确性方面尚需改进。

发明内容

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。

除非另外指出，本发明所使用的术语“生物芯片”，是指由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等固相载体上构建而成的列阵，生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白质芯片、抗体芯片或组织芯片等。

除非另外指出，本发明所使用的术语“抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体”，是指抗H5N1亚型禽流感病毒主要表面抗原蛋白血凝素的单克隆抗体，按照常规的单克隆抗体制备流程制备。

除非另外指出，本发明所使用的术语“金膜”，是指由直径在10nm-150nm左右的纳米金粒形成的金膜层。

本发明利用抗H5N1亚型禽流感单克隆抗体制备出用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，并建立了H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法，应用SPR生物传感器即时监测本发明抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体芯片表面发生的各种结合、解离反应，具有快速、简便、敏感、特异、费用较低等特点，可作为现有诊断方法的有益补充，用于分析临床样品或鸡胚、细胞培养物、生物样品中的禽流感病毒并判定其含量。

具体地，本发明的一个目的在于，提供一种用于检测H5亚型禽流感病毒的检测生物芯片。

本发明的另一个目的在于，提供制备上述生物芯片的方法及其用途。

本发明的又一个目的在于，提供基于表面等离子谐振原理，采用上述生物芯片检测H5亚型禽流感病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

一方面，本发明提供了一种用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，其包括固相载体、附着于固相载体上的金膜以及与该金膜相连接的抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。

优选地，在上述生物芯片中，所述金膜的厚度为50-100nm。

优选地，所述生物芯片还包括位于所述金膜上的修饰层，可以选自聚丙烯酰胺、琼脂糖及葡聚糖或其衍生物；优选为羧甲基葡聚糖。

优选地，所述生物芯片的固相载体选自玻璃、陶瓷、金属片、尼龙膜和硝酸纤维素膜，优选为玻璃，其规格为18mm×18mm×0.14mm。

另一方面，本发明提供制备上述生物芯片的方法，所述方法包括以下步骤：1)在生物芯片的固相载体上附着金膜；2)将抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体固定在步骤1)所得到的金膜表面。

优选地，在上述方法中，所述步骤1)是通过真空蒸发镀膜法在生物芯片的固相载体上附着金膜；

优选地，在上述方法中，所述步骤1)中还包括用羧甲基葡聚糖修饰金膜表面的步骤；更优选地，所述步骤2)是通过氨基偶联的方法在经羧甲基葡聚糖修饰的金膜上固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。

本发明还提供了上述生物芯片在检测H5亚型禽流感病毒及确定其含量中的用途。

又一方面，本发明还提供了使用上述生物芯片的方法，所述方法包括以下步骤：1)待测样品的处理；2)将上述生物芯片安装在表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器)上；3)将步骤1)中得到的样品加入至步骤2)中的生物芯片上进行反应；优选地，所述反应条件如下：反应流速10μl/分钟～100μl/分钟，反应体积为500～1000μl，室温下(20～30℃)反应20～60分钟；4)利用表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器)对所述检测生物芯片上反应发生区进行偏振光检测。

优选地，在上述方法中，所述步骤1)是通过样品处理缓冲液对待测样品进行处理的，所述样品处理缓冲液成分为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L及2％(v/v)Triton X-100，pH 7.2；更优选地，所述样品处理缓冲液与样品的体积比为1∶1，处理时间优选为室温(20～30℃，优选为25℃)处理90分钟或90分钟以上。

此外，本发明还可采用以下技术方案来实现。

本发明提供了一种以抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体为捕获探针的检测芯片，在所述芯片固相载体上连接抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。

上述抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体与附着在芯片固相载体上的金膜连接。在金膜表面修饰一层具有亲水性的羧甲基葡聚糖，能避免蛋白与金膜接触而失活。通过空间网状的葡聚糖分子固定生物大分子，生物分子在葡聚糖表面固定采用氨基偶联的方法，即在乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与葡聚糖表面的基质羧基形成一个酯键，这个酯键会自发的与蛋白质的氨基或其他亲核基团形成共价连接键，没有反应的活性酯键用乙醇胺灭活。

本发明还提供了一种基于表面等离子体谐振原理所述应用以抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体为捕获探针的检测生物芯片进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在芯片固相载体表面铺制金膜(厚度约为50nm)；在金膜表面修饰一层羧甲基化葡聚糖，通过空间网状的葡聚糖分子在金膜表面固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为捕获探针；

(2)将待检样品与样品处理缓冲液(成分如下：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L及2％(v/v)TritonX-100，pH 7.2)按照体积比1∶1混合均匀，在室温下(25℃)作用90分钟或以上，或检测当日直接将采集样品拭子液与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合均匀，在室温下放置至检测；

(3)将检测生物芯片按照仪器使用说明书使用操作方法安装在SPR-2002型生物传感器上；

(4)将上述步骤(2)所制备的样品处理液用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)稀释1000倍，得样品稀释液，检测体积需500～1000μl；

(5)将上述步骤(4)制备的样品稀释液加入至步骤(3)所述的检测生物芯片上，反应流速10μl～100ul/分钟，反应体积为500～1000μl，在室温(25℃)条件下反应20～60分钟；

(6)流动反应池中通入pH 7.420mM磷酸缓冲液(19ml 0.2mol/L的NaH₂PO₄和81ml 0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O充分混合，稀释10倍后使用)，流速10μl～100ul/分钟，室温清洗除去未结合的样品；

(7)利用表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器)对所述检测生物芯片上反应发生区进行偏振光检测，分析抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体与样品中H5亚型禽流感病毒特异性片段的结合反应，计算样品中的H5亚型禽流感病毒含量。

在上述方法的步骤(1)中，在芯片固相载体表面铺制具有表面等离子体谐振感应性的金膜方法包括以下步骤：

1)在玻璃片上甩以均匀的光刻胶，用光刻法除去在玻璃片表面需要覆盖金膜的区域的光刻胶；

2)采用真空蒸发镀膜的方法，在18mm×18mm×0.14mm的玻璃片上先沉积上大约2nm的铬，然后沉积上50nm的纯度为99.9999％的金。在金膜正式使用前，用新配制的piranha溶液(30％H₂O₂∶98％H₂SO₄＝1∶3，v/v)处理2分钟，或用离子刻蚀机对芯片表面进行处理，去除有机污染物；

3)用大量去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后自然晾干，随后用羧甲基化的葡聚糖修饰芯片表面的金膜；

4)芯片活化：HBS缓冲液(其成分如下：10mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂Surfactant P20，3mM EDTA)清洗芯片，随后用0.4M乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride，EDC)和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)的混合液(1∶1；v/v)在室温条件下对芯片表面的酯键进行活化，活化时长10分钟。

在上述方法的步骤(1)中，通过空间网状的羧甲基葡聚糖分子在金膜表面固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为捕获探针制备检测芯片的方法步骤如下：

1)用PBS缓冲液将抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体(浓度4mg/ml)稀释1000倍；

2)用醋酸缓冲液(pH 3.8-4.4)调整单抗溶液pH值至4.2，铺在金膜表面，在室温下固定20～30分；

3)通入0.1M乙醇胺对没有反应的活性酯键在室温下灭活10分钟，用20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)清洗除去乙醇胺，至此制备好用于检测的生物芯片，4℃储存。

在上述方法的步骤(2)中，样品的处理方法包括以下几种：

1)待检测组织样品：取待检测组织样品置研磨器中剪碎并研磨，加入适量PBS缓冲液继续研磨，至呈匀浆状态后，取匀浆液与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测；

2)待检测分泌物、排泄物样品：取灭活后分泌物、排泄物，将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，取拭子液与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测；

3)待测尿囊液和细胞培养液样品处理：取尿囊液或细胞培养液与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测。

上述步骤(5)中处理样品与生物芯片上的抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体进行反应的步骤包括：

将上述样品处理液用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1000倍，得样品稀释液，检测体积需500～1000μl。

将稀释后的样品稀释液注入微流动反应流通池中，循环反应的流速10μl～100μl/分钟，在常温下反应20～60分钟。

在上述方法的步骤(7)中，表面等离子体谐振检测包括以下步骤：

1)利用表面等离子体谐振设备(SPR-2002型生物传感器)对所述检测生物芯片上反应发生区进行定点偏振光检测，实时监测抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体与样品中H5亚型禽流感病毒特异性片段的结合反应；

2)对扫描结果进行分析，确定样品中的H5亚型禽流感病毒含量。

由此可见，通过本发明，可以绕过对样品进行处理和对病毒进行扩增，简化样品处理步骤，提高检测的灵敏度和特异性；且以光学信号作为检测信号，易于检测，使结果检测、分析技术大为简化，具体说明如下：

(1)本发明采用抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为捕获探针以捕获H5亚型禽流感病毒特异性片段，充分利用了免疫学抗原抗体结合反应的特异性；

(2)本发明采用抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为捕获探针，较之RT-PCR、荧光RT-PCR等，不但避免了PCR反应，测序反应等繁杂的过程，而且降低了对样品的处理要求，只需要在样品采集时按照操作要求直接加入样品处理缓冲液即可以得到适于SPR生物传感器检测的样品，简化了操作步骤；

(3)本发明从通入样品到检测结果判断仅需要20分钟，缩短了检测时间，而常规的PCR方法检测流感病毒至少需要2小时；

(4)应用本发明检测H5亚型禽流感病毒，可检测到的抗原浓度达到ng/ml，较之普通的禽流感病毒检测方法具有更高的灵敏度；

(5)本发明涉及的检测方法安全可靠，没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质的参与，试剂安全无毒；且样品加入样品处理缓冲液后即实现了病毒的灭活，大大提高了操作人员的安全性；

(6)应用本发明基于SPR的检测方法可以实现实时监测的效果，根据检测曲线做出即时判断；

(7)本发明采用抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为捕获探针，并应用表面等离子体共振原理进行信号检测，降低了芯片的使用成本。

总之，本发明所提供的生物芯片将有助于对H5亚型禽流感病毒的快速而准确的检测鉴定，并可以对样品中H5亚型禽流感病毒进行定量分析，真正体现生物芯片特异、灵敏、快速的优点。本发明应用抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体作为检测芯片的捕获探针，可以特异性的检测H5亚型禽流感病毒，检测灵敏度可以达到ng/ml，并且检测和定量同时进行，大大提高了检测速度，应用本发明所提供的抗体芯片，可以减少样品处理的繁杂程序，同时大大降低了检测人员所面临的危险。本发明可以应用到野外条件下由基层检验人员实施病原体分布的调查和早期诊断，早期发现等方面，将会进一步加快H5亚型禽流感病毒的检测进程，从而减小疫情暴发的可能性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所提供的表面等离子体谐振生物传感器抗体芯片的系统模式图；

其中，1：激光束；2：偏振片；3：棱镜；4：固相载体；5：纳米金属膜；6：捕获探针；7：杂交检测反应池；8：光信号采集器。

图2为本发明所使用的表面等离子体谐振传感器的基本结构模式图；

其中，A：三棱镜；B：芯片；C：入射偏振光；D：反射光；E：光信号采集器；F：信号放大器；G：数字信号转化器；H：计算机。

图3为本发明中H5亚型禽流感病毒浓度与传感器的响应光信号关系图。

图4为本发明中检测单抗芯片特异性验证结果图；

其中，H5N1和H9N2分别代表H5N1亚型禽流感病毒(A/plateau pika/Qinghai/04/2007)与H9N2亚型禽流感病毒(A/Chicken/Henan/1/99)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

在以下各实施例中所使用的H5N1亚型禽流感病毒(A/plateaupika/Qinghai/04/2007和A/environment/Qinghai/1/2008)[参照：郭元吉，程小雯著.《流行性感冒病毒及其实验技术》.北京：中国三峡出版社(1997)中的方法分离鉴定和制备，序列已提交Genbank]，H5N1病毒鸡胚尿囊液、H9N2(A/Chicken/Henan/1/99)病毒鸡胚尿囊液[参照：郭元吉，程小雯著.《流行性感冒病毒及其实验技术》.北京：中国三峡出版社(1997)中的方法分离制备]和抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体[参照HeddyZola等著，周宗安译.《单克隆抗体技术手册》〔M〕.江苏：南京大学出版社，1991中的方法制备]由中科院动物研究所野生动物疫病研究组制备并提供，按照世界动物卫生组织(World organization for animal health，OIE)制定的标准进行鉴定。

SPR-2002型生物传感器为中国科学院电子学研究所自行研制的设备，即在中国发明专利ZL98102366.5中公开的“表面等离子体谐振测试仪”。

实施例1：生物芯片的制备

本实施例为制备本发明所提供的用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，包括先制备出芯片表面的金膜，再用羧甲基葡聚糖修饰金膜，最后再固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。具体步骤详述如下：

(1)在玻璃片上甩以均匀的光刻胶，用光刻法除去在玻璃片表面需要覆盖金膜的区域的光刻胶；

(2)采用真空蒸发镀膜的方法，在18mm×18mm×0.14mm的玻璃片上先沉积上大约2nm的铬，然后沉积上50nm的纯度为99.9999％的金。在金膜正式使用前，用新配制的piranha溶液(30％H₂O₂∶H₂SO₄＝1∶3；v/v)处理2分钟，或用离子刻蚀机对芯片表面进行处理，去除有机污染物；

(3)用大量去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后自然晾干，随后用羧甲基化的葡聚糖修饰芯片表面的金膜。

(4)芯片表面酯键活化：HBS缓冲液清洗芯片，随后用0.4M乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液(1∶1；v/v)在室温下对芯片表面的酯键进行活化，活化时间为10分钟；

(5)用PBS缓冲液将抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体(浓度4mg/ml)稀释1000倍；用醋酸缓冲液(pH 3.8-4.4)调整单克隆抗体溶液pH值至4.2，铺在金膜表面，在室温下固定30分；

(6)芯片表面活性酯键的灭活：加入0.1M乙醇胺对没有反应的活性酯键在室温下灭活10分钟，用PBS缓冲液清洗除去乙醇胺，至此制备好用于检测的生物芯片，4℃储存。

实施例2：生物芯片的使用方法

本实施例为实施例1所制备的生物芯片的使用方法，具体详述如下。其中，该表面等离子体谐振生物传感器抗体芯片的系统模式图如图1所示。

1、待检测样品的处理：

(1)组织样品：取待检测组织样品置研磨器中剪碎并研磨，加入适量PBS缓冲液继续研磨，至呈匀浆状态后，取匀浆液与样品处理缓冲液(成分如下：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L及2％ Triton X-100，pH 7.2)按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测；

(2)待检测灭活后分泌物、排泄物样品：将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，取拭子液与上述样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测；

(3)尿囊液和细胞培养液样品：取尿囊液或细胞培养液与上述样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测。

2、待检测样品与生物芯片上的抗H5N1禽流感病毒单克隆抗体进行结合反应：

(1)将实施例1制备好的抗体芯片安装到SPR-2002型生物传感器棱镜表面；流动反应池中注入20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，读取此时反射光反射角度初始数值；

(2)将样品稀释液注入微流动反应流通池中，循环反应的流速10μl/分钟，在常温下反应20～60分钟；

(3)流动反应池中通入20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，室温清洗除去未结合的样品。

3、检测和结果分析：

(1)利用SPR-2002型生物传感器对所述检测生物芯片上反应发生区进行定点偏振光检测，实时监测抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体与样品中H5N1亚型禽流感病毒的结合反应；

(2)利用参照病毒浓度梯度分别测量相应响应信号变化值，绘制禽流感病毒浓度/响应信号反应曲线。实验结束后，根据实验中响应信号变化值与曲线相应位置对比，确定样品中是否存在H5N1亚型禽流感病毒以及病毒的含量。

实施例3：生物芯片的应用

本实施例为利用实施例1所制备的生物芯片检测H5N1亚型禽流感病毒尿囊液中H5N1亚型禽流感病毒的含量，具体步骤详述如下。

(1)鸡胚尿囊液样品处理：取H5N1病毒(A/plateau pika/Qinghai/04/2007)鸡胚尿囊液和鸡胚尿囊液空白对照分别与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟，即可用于检测；

(2)将检测生物芯片按照仪器使用说明书使用操作方法安装在SPR-2002型生物传感器棱镜上，其中该传感器的基本结构模式图如图2所示；

(3)将样品处理液用磷酸缓冲液稀释1000倍，得样品稀释液，将样品稀释液注入微流动反应流通池中，反应流速10μl/分钟，反应体积为1000μl，在室温下反应20～60分钟；

(4)流动反应池中通入20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，室温清洗除去未结合的样品；

(5)利用SPR-2002型生物传感器对所述检测生物芯片上反应发生区进行偏振光检测，分析抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体与样品中H5N1亚型禽流感病毒的结合反应。

采用SPR-2002型生物传感器测定的H5N1亚型禽流感病毒浓度与传感器的响应光信号关系图，也即表面等离子体谐振检测参照病毒浓度梯度中禽流感病毒浓度/响应信号反应曲线(标准曲线)如图3所示。该标准曲线是在对参照病毒(A/environment/Qinghai/1/2008(H5N1))多次检测结果基础之上绘制的反应响应信号与病毒裂解样品中有效成分关系图，其中y＝65.361Ln(x)+1.9717，R²＝0.9898。根据实际检测过程中响应信号的变化，参照标准曲线，可以计算出样品中病毒的含量。在20分钟内，鸡胚尿囊液空白对照引起的信号变化为100IU(与样品处理液中Triton X-100引起的信号变化90IU相当)，实际为10IU；病毒培养鸡胚尿囊液引起的信号变化为475IU，实际为375IU；根据以上标准曲线计算出该病毒培养鸡胚尿囊液样品中的H5N1亚型禽流感病毒蛋白含量为301ng/ml。

实施例4：生物芯片的特异性和灵敏性

本实施例以H9N2病毒(A/Chicken/Henan/1/99)鸡胚尿囊液为对照，检测本发明提供的生物芯片检测H5N1亚型禽流感病毒的特异性和灵敏性。

(1)鸡胚尿囊液样品处理：取H5N1病毒(A/plateau pika/Qinghai/04/2007)培养鸡胚尿囊液与H9N2病毒(A/Chicken/Henan/1/99)鸡胚尿囊液分别与样品处理缓冲液按照体积比1∶1混合，室温放置＞90分钟；

(2)将检测生物芯片按照仪器使用说明书使用操作方法安装在SPR-2002型生物传感器棱镜上；

(3)将H5N1病毒与H9N2病毒样品处理液分别用磷酸缓冲液稀释1000倍，得样品稀释液。将H9N2病毒样品稀释液注入微流动反应流通池中，反应流速10μl/分钟，反应体积为1000μl，在室温下反应10分钟，检测信号为90IU(与样品处理液中Triton X-100引起的信号变化90IU相当)，且无明显增长趋势，20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)洗涤(wash)后迅速下降，说明为非特异性结合；H5N1病毒样品稀释液注入微流动反应流通池中，反应流速10μl/分钟，反应体积为1000μl，在室温下反应40分钟，检测信号为375IU，增长趋势明显，20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)洗涤(wash)后缓慢解离，符合抗原抗体特异性结合、解离特点(结果如图4所示)，以此证明了该检测芯片的特异性和灵敏性。

Claims

1.一种用于检测H5亚型禽流感病毒的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包括固相载体、附着于固相载体上的金膜、以及与该金膜相连接的抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述金属膜的厚度为50～100nm。

3.根据权利要求1或2所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片还包括位于所述金属膜上的修饰层，选自聚丙烯酰胺、琼脂糖及葡聚糖或其衍生物；优选地，所述葡聚糖衍生物为羧甲基葡聚糖。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片的固相载体选自玻璃、陶瓷、金属片、尼龙膜和硝酸纤维素膜，优选为玻璃，其规格为18mm×18mm×0.14mm。

5.制备权利要求1至4中任一项所述生物芯片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)在生物芯片的固相载体上附着金膜；

2)将抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体固定在步骤1)所得到的金膜表面。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤1)是通过真空蒸发镀膜法在生物芯片的固相载体上附着金膜；优选地，所述步骤1)还包括用聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖或其衍生物修饰金膜的步骤；更优选地，所述步骤2)是通过氨基偶联的方法在修饰的金膜上固定抗H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体。

7.权利要求1至4中任一项所述生物芯片在检测H5亚型禽流感病毒及确定其含量中的用途。

8.使用权利要求1至4中任一项所述生物芯片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)待测样品的处理；

2)将权利要求1至4中任一项所述生物芯片安装在表面等离子体谐振设备上；

3)将步骤1)中得到的样品加入至步骤2)中的生物芯片上进行反应；优选地，所述反应条件如下：反应流速10～100μl/分钟，反应体积为500～1000μl，在室温下反应20～60分钟；

4)利用表面等离子体谐振设备对所述检测生物芯片上反应发生区进行偏振光检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述步骤1)是通过样品处理缓冲液对待测样品进行处理，所述样品处理缓冲液成份如下：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L及2％(v/v)Triton X-100，pH 7.2；优选地，所述样品处理缓冲液与样品的体积比为1∶1，处理时间优选为90分钟或90分钟以上。