CN104297215A - 表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法 - Google Patents

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孙涛
曹丙蕾
孙明君
徐彪
房保海
王群
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Abstract

本发明公开了一种表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法，包括下列步骤：（1）鼠抗抗体的偶联：鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联；（2）禽法氏囊单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定；（3）样品的检测：将待测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯片的流池，测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值，根据上述信号差值确定所述病毒是否存在及其含量。本发明的检测方法在检测其他禽源病毒时无阳性响应信号，特异性强；对禽法氏囊病毒重组蛋白的检测极限达0.625nmol/L，灵敏度高。

Description

表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法
技术领域
本发明涉及一种表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法，属于生物技术检测领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏羹病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、接触传染性疾病。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。目前本病作为危害养禽业的三大主要疫病之一，呈世界性分布，该病引起雏鸡的免疫抑制，使病鸡对大肠杆菌、腺病毒、沙门氏菌、鸡球虫等病原更易感，对马立克疫苗、禽法氏囊病毒疫苗等接种的反应能力下降，发病率高，几乎达100％，死亡率一般为5％～15％，但现在流行的通过变异产生的的超强毒株死亡率达到60％-100％，是当前养禽业最重要的疾病之一。
目前用于监控IBDV的常用方法免疫学方法如琼脂扩散试验、病毒中和试验、免疫组化、酶联免疫吸附试验等方法，存在耗时长、操作繁琐、灵敏度和特异性差的缺点，且均不能实时监测生物大分子之间的相互作用，动态观察大分子之间结合与解离的平衡关系，较为准确地测定分子间相互作用的亲和力。目前已成为筛选各类抗体建立免疫学反应的瓶颈和关键。同时传统的免疫血清学诊断方法大多需要标记各类抗体，无法在大规模推广应用前实现对抗体或参考抗原的筛选工作，因而需要研究一种相对廉价，并能够对法氏囊病毒的血清学诊断方法在建立推广之前进行高通量快速筛选、准确鉴别的集成化诊断技术。
表面等离子体共振技术(SPR)是利用在金属膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。SPR仪由自动采样机械手、高分辨率的CCD照相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR生物传感器芯片构成。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用表面等离子体共振技术来检测禽法氏囊病毒的方法，同时，所述的方法也可快速筛选一株适配的新城疫单克隆抗体。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法，包括下列步骤：
(1)鼠抗抗体的偶联：鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联；
(2)禽法氏囊单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定；
(3)样品的检测：将待测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯片的流池，测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值，根据上述信号差值确定所述病毒是否存在及其含量。
具体的，上述步骤具体为：
鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联的具体步骤为：在室温20-25摄氏度条件下，将试剂放在样品架上，设定加样流速为10μL/min，以inject方式进样，顺次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入过量的鼠抗抗体偶联在活化后的芯片表面上，偶联完毕后用60μL Ethanolamine HCl封闭，使过量的反应基团失活；分析偶联效果时，通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点，并在注射Ethanolamine HCl结束后放置第二个报道点，如信号差在1000-5000RU，则结合鼠抗的水平良好。通常芯片偶联抗体后可进行100次左右的结合及再生实验。
法氏囊单克隆抗体与步骤(1)中的鼠抗抗体结合的具体步骤为：准备0.1-0.5μg/ml的含法氏囊单克隆抗体的腹水样品和0.5μM的法氏囊重组蛋白抗原，经0.22μm的微孔过滤备用。在配体通道上尝试进样10μL单抗腹水样品。然后同时在空白参比通道和配体通道上进样3min抗原，解离5min，设定流速为10μL/min。为最大限度降低背景值，应控制捕获单抗后抗原检测的RU信号差值处在30～50RU的合理区间，以此确定为合适的单抗捕获浓度，后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样。最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。
检测样品的具体步骤为：待检抗原经0.22μm的微孔过滤备用。设定流速为10μL/min，在相应的的配体通道上进样10μL确定好浓度的法氏囊单抗。分别注射25μL的HBS缓冲液(作为阴性对照)和待检抗原，顺次进样与单抗结合，并限定120s解离时间，最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。通过在开始注射单抗后放置一个基线报道点，并在注射待检样品后放置第二个报道点。阴性对照无任何差值，阳性样品信号有差值，以此确定有禽法氏囊病毒的存在。
优选的，生物传感器芯片为CM5芯片。
本发明的有益效果是：能够很快捷地发现鼠抗抗体与单抗分子间能否发生结合。通过直接捕获杂交瘤上清、腹水抗体，在5～10分钟内即可快速筛选一株适配的单克隆抗体，运行成本更低，芯片亦可反复使用，这为大面积推广所筛选的抗体在其他免疫学实验中的应用提供了重要的参考数据。
本发明的检测方法在检测其他禽源病毒时无阳性响应信号，特异性强；对禽法氏囊病毒重组蛋白的检测极限达0.625nmol/L，灵敏度高。
附图说明
图1是本发明的特异性实验结果。
具体实施方式
实施例1
表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法，包括下列步骤：
1.鼠抗抗体的偶联
(1)样品无需预处理，利用HBS作为缓冲分析buffer，偶联鼠抗抗体固定于CM5芯片。设定偶联引导模式：在Surface Preparation窗口中，同时选择Immobilisation和芯片Sensor Chip:CM5及Amine Coupling方法，同时设置不偶联鼠抗的空白参比通道。
(2)将所有试剂平衡到室温20-25℃，设定加样流速为10μL/min。
(3)以inject方式进样，顺次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入过量的鼠抗抗体偶联在活化后的芯片表面上，偶联完毕后用60μL Ethanolamine HCl封闭，使过量的反应基团失活；
(4)分析偶联效果时，通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点，并在注射Ethanolamine HCl结束后放置第二个报道点，如信号差在1000-5000RU之间，则结合鼠抗的水平良好。通常芯片偶联抗体后可进行100次左右的结合及再生实验。
2.单克隆抗体的捕获及适当捕获浓度的确定
因每次检测均需要作预实验，故每次捕获单克隆抗体均需要确定合适的捕获浓度。
(1)准备0.1～0.5μg/ml的含法氏囊单克隆抗体的腹水样品和0.5μM的法氏囊重组蛋白抗原，用0.22μm的微孔过滤备用。
(2)在配体通道上尝试进样10μL单抗腹水样品。然后同时在空白参比通道和配体通道上进样3min抗原，解离5min，设定流速为10μL/min，
(3)为最大限度降低背景值，应控制捕获单抗后抗原检测的RU信号差值处在30～50RU的合理区间，以此确定为合适的单抗捕获浓度，后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样。最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。
3.样品的检测
(1)待检样品经0.22μm的微孔过滤备用。
(2)在相应的预要捕获法氏囊单抗的配体通道上进样，设定流速为10μL/min，进样10μL确定好浓度的法氏囊单抗。
(3)分别注射25μL的HBS缓冲液(作为阴性对照)和待检抗原，顺次进样与单抗结合，并限定120s解离时间，最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。
(4)通过在开始注射单抗后放置一个基线报道点，并在注射待检样品后放置第二个报道点。阴性对照无任何差值，阳性样品信号有差值，以此确定有禽法氏囊病毒的存在。
实施例2特异性试验
在SPR芯片表面分析不同毒株的抗原，将传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽白血病(ALV)、鸭病毒性肝炎(DVH)、鸭病毒性肠炎(DEV)的病原材料，尿囊液及细胞培养液均经0.22um的微孔滤膜过滤上样处理，除法氏囊病毒外均无特异的显著的结合反应，在SPR分析图谱中未出现与上述亚型一致的特征峰图。SPR的特异性实验结果见图1(纵轴为仪器的RU响应值)。
实施例3灵敏性分析
取三株法氏囊单抗，浓度依次倍比稀释成250、125、62.5、31.25、15.625至7.8125nmol/mL并依次进样获取该单抗的结合和解离常数KD值(如表1)，并由公式测得结合速率与解离速率，便于筛选免疫反应效果更好的单抗。由公式(A为溶液中的待分析物由流动系统控制，AB的浓度可由仪器直接检测响应信号RU得到，B为偶联在传感芯片上的分子，相当于最大结合反应理论值Rmax)由此推导得出
表1三株IBDV单抗的动力学数据
同时捕获KD值最小的单抗，固定抗原上样浓度(依次梯度倍比稀释成20nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、2.5nmol/L、1.25nmol/L、0.625nmol/L，依次进样不同浓度的抗原进行灵敏性分析。

Claims (3)

1.  表面离子共振技术检测禽法氏囊病毒的非诊断性方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）鼠抗抗体的偶联：鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联；
（2）禽法氏囊单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定；
（3）样品的检测：将待测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯片的流池，测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值，根据上述信号差值确定所述病毒是否存在及其含量。
2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：
（1）鼠抗抗体的偶联：
（a）样品无需预处理，利用HBS作为缓冲液，设定偶联引导模式：在Surface Preparation窗口中，同时选择Immobilisation和芯片Sensor Chip: CM5及Amine Coupling方法，同时设置不偶联鼠抗抗体的空白参比通道；
（b）将所有试剂平衡到室温20-25℃，设定加样流速为10μL/min；
（c）以inject方式进样，顺次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入过量的鼠抗抗体偶联在活化后的芯片表面上，偶联完毕后用60μL Ethanolamine HCl封闭，使过量的反应基团失活；
（d）分析偶联效果：通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点，并在注射Ethanolamine HCl结束后放置第二个报道点，如信号差达到1000-5000RU，则结合鼠抗的水平良好；
（2）新城疫单克隆抗体的捕获及适当捕获浓度的确定：
（a）将0.1~0.5μg/ml的含新城疫单克隆抗体的腹水样品和100~1000nM的新城疫重组蛋白抗原，经0.22μm的微孔过滤备用；
（b）在配体通道上进样10μL单抗腹水样品，然后同时在空白参比通道和配体通道上进样3min抗原，解离5min，设定流速为10μL/min；
（c）控制捕获单抗后抗原检测的RU信号差值处在30~50RU之间，以此确定为合适的单抗捕获浓度，后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样；最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生，去除新城疫单克隆抗体；
（3）样品的检测
（a）待检抗原经0.22μm的微孔过滤备用；
（b）在相应的预要捕获新城疫单克隆抗体的配体通道上进样，设定流速为10μL/min，进样10μL确定好浓度的新城疫单克隆抗体；
（c）分别注射25μL的HBS缓冲液作为阴性对照和待检抗原，顺次进样与新城疫单克隆抗体结合，并限定120s解离时间，最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生；
（d）通过在开始注射新城疫单克隆抗体后放置一个基线报道点，并在注射待检样品后放置第二个报道点，阴性对照无任何差值，阳性样品信号有差值，以此确定有新城疫病毒的存在。
3.  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，生物传感器芯片为CM5芯片。
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