CN114088947A - 一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法,包括以下步骤:首先,优化混合抗体的捕获条件,其次,在最优的捕获条件下,将一定比例混合的多种抗体共价偶联到芯片上,通过混合抗体同时捕获带有相应标签的VHH/scFv,最后,将抗原作为分析物进行SPR检测。本发明提供的筛选方法能够稳定捕获VHH/scFv,操作上无需对VHH/scFv进行纯化或IgG构建,节省了时间和成本,并且可以防止遗漏表达较差但亲和力较好的样品,有助于抗体研发阶段大量VHH/scFv样品的动力学结合检测和筛选。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法。
背景技术
表面等离子共振技术,英文简写SPR,通过光学系统检测SPR角的变化,来间接检测吸附于金属表面的物质的质量变化,再通过进一步的拟合计算,最终可以得到两个分子结合的动力学参数,从而检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况,目前,SPR已被用于研究多种生物分子间的相互作用,包括受体、抗体、抗原、酶、生长因子、糖蛋白、核酸、小分子药物、膜、细胞和病毒,由于无需标记、实时检测、样品量少、灵敏度高、方便快捷等优点,以Biacore为代表的SPR技术被广泛应用于基础科研、药物研发、生产质检等多个领域,近年来,由于越来越多的需求指向了解早期分子的动力学结合特征,Biacore检测被开始更多的用于抗体药物研发的早期筛选阶段。
VHH,纳米抗体,天然存在于骆驼体内,能够通过一个单独的重链可变区结构域识别抗原,相较于完整的IgG抗体,VHH在微生物中表达良好,并具有很高的稳定性和溶解性;scFv,单链抗体,由重链和轻链的可变区组成,这些可变区通过一段柔性肽连接在一起,和VHH相似,scFv也可以在微生物中表达良好,因此可以通过蛋白质工程改善scFv的特性,例如增加亲和力和改变特异性等。VHH/scFv形式的抗体也多出现于抗体研发的筛选阶段。
目前VHH/scFv形式的抗体进行SPR筛选,主要有三种方式:一种是通过捕获分子捕获VHH/scFv的单一标签进行SPR检测,捕获分子与VHH/scFv的表观解离速率常数通常难以达到理想值,从而对VHH/scFv和抗原的解离速率常数的检测范围产生限制。因此,另外两种方法都并非直接捕获VHH/scFv,其中一种方法是将抗原共价偶联或者捕获到芯片上,然后将纯化的VHH/scFv作为分析物,进行SPR检测;另一种方法是将VHH/scFv进行IgG构建后,通过捕获Fc来捕获IgG构建后VHH/scFv,然后将抗原作为分析物进行检测。后面两种方法,无论选择哪一种,都需要额外的步骤,比如纯化或者IgG构建,不仅产生额外的时间和费用,也导致了这些方法的通量很难达到大量筛选的要求,并且这些筛选方法还容易遗漏在微生物中表达较差但亲和力好的样品。
因此,需要开发一种基于SPR技术的,能够稳定捕获VHH/scFv的用于筛选的新方法,提高检测通量的同时扩大检测范围,降低高亲和力样品的遗漏率,为抗体研发筛选阶段降低时间和成本。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法,技术方案如下:
一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法,包括以下步骤:
1)优化捕获条件:
先将单独的抗Myc标签抗体和单独的抗His标签抗体以不同比例混合,获得混合抗体,对芯片进行活化后,再使用所述混合抗体包被于所述芯片上,使用缓冲液将VHH稀释至不同浓度,使VHH流经所述芯片,并与包被在芯片上的抗体发生特异性结合,进行SPR检测并分析计算包被抗体与VHH的表观解离速率常数即表观kd;
比较混合比例不同的抗体和不同浓度VHH的表观解离速率常数,选取使用不同浓度VHH时表观解离速率常数都较小的混合比例作为最优捕获条件;
2)在最优捕获条件下,利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv的筛选:
先将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以步骤1)中获得的最优混合比例混合,再将混合抗体包被到活化后的芯片上,使VHH/scFv流经所述芯片,并与包被在芯片上的混合抗体发生特异性结合;
以不同浓度的抗原作为分析物进行SPR检测,分析计算VHH/scFv与抗原的解离速率常数kd。
具体地,步骤1)中,抗Myc标签抗体和抗His标签抗体的混合比例分别为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、仅添加抗His标签抗体和仅添加抗Myc标签抗体。
具体地,步骤1)中,所述活化是指利用活化剂活化SPR传感芯片,所述包被是指将混合抗体与SPR传感芯片进行共价偶联。
具体地,所述SPR传感芯片为CM5芯片,所述CM5芯片在完成结合和解离后,使用浓度为10mmol/L的甘氨酸溶液进行芯片再生,所述甘氨酸溶液的pH值设置为1.5。
具体地,步骤1)中,所述VHH的稀释浓度分别为0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL。
具体地,步骤1)中,所述VHH和混合抗体结合后,解离时间设置为600-3600s。
具体地,步骤2)中,所述最优混合比例是指按照4:1~7:1的比例混合抗Myc标签抗体和抗His标签抗体,且混合抗体的饱和浓度为30μg/mL。
具体地,步骤2)中,所述VHH/scFv和抗原的结合时间设置为120s,解离时间设置为1200-1800s。
具体地,步骤2)中,所述抗原为不含有Myc标签和His标签的抗原,包括但不限于无标签抗原和半Fc标签抗原。
目前现有技术通常在筛选前期采用ELISA,FACS,后期再配合使用SPR进行VHH/scFv亲和力筛选,存在以下问题:ELISA和FACS方法检测VHH/scFv,仅能够得到定性的结果,且结果容易受到上清表达量高低的影响,容易遗漏一些亲和力较好但表达低的分子;现有的SPR方法检测VHH/scFv,如只通过捕获分子结合VHH/scFv中单一标签进行SPR检测,捕获分子和VHH/scFv的表观解离速率常数通常难以达到理想值,从而对VHH/scFv与抗原的解离速率常数的检测范围产生限制。所以通常要先对VHH/scFv进行纯化或者进行IgG抗体的构建,这又在一定程度上限制了检测通量,同时也会产生额外的时间和成本,也容易遗漏一些亲和力较好但表达量低不易纯化的分子;
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1.因为SPR不受表达量限制,可以实时监测分子间相互作用,将SPR用于前期筛选能够防止遗漏一些亲和力较好但表达较差的分子;
2.通过混合抗体同时结合VHH/scFv上的两种标签,提高了捕获VHH/scFv的稳定性,从而扩大了VHH/scFv的解离速率常数kd值的检测范围,提高解离速率常数kd值的准确度;
3.使用混合抗体对上清中的VHH/scFv进行捕获筛选,不需要对VHH/scFv进行纯化,也不需要进行IgG的构建,节约了时间和成本,有助于抗体研发阶段大量VHH/scFv样品的动力学结合检测的筛选。
附图说明
图1是本发明中不同比例混合抗体捕获不同浓度VHH的表观解离速率常数(表观kd)的结果图;
图2是本发明的VHH/scFv的SPR筛选过程示意图;
图3是本发明的实施例2中传统SPR方法与本发明提供的方法测定的VHH与抗原的解离速率常数(kd)的相关性分析图;
图4是本发明的实施例2中传统SPR方法与本发明提供的方法测定的scFv与抗原的解离速率常数(kd)的相关性分析图;
图5是本发明的实施例3中传统SPR方法与本发明提供的方法测定的VHH与抗原的解离速率常数(kd)的相关性分析图;
图6是本发明的实施例3中传统SPR方法与本发明提供的方法测定的scFv与抗原的解离速率常数(kd)的相关性分析图;
图中,图3和图4所示的本发明提供的方法中均采用无标签抗原作为分析物进行SPR检测;图5和图6所示的本发明提供的方法中均采用半Fc标签抗原作为分析物进行SPR检测。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段,如无特殊说明,均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中所提及的Myc标签指包含EQKLISEEDL序列的多肽标签,组氨酸His标签指包含6~8个连续组氨酸的多肽标签。
以下实施例中所提及的kd1为通过传统SPR方法检测得到解离速率常数,kd2为本发明提供的方法检测得到的解离速率常数。
实施例1优化混合抗体捕获VHH/scFv的捕获条件
首先,制备不同混合比例的用于捕获VHH的混合抗体,将单独的抗Myc标签抗体和单独的抗His标签抗体按照不同比例混合,使得抗Myc标签抗体含量与抗His标签抗体含量的比值分别为:1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1,再制备仅含有抗His标签抗体的溶液和仅含有抗Myc标签抗体的溶液,并保证所有单一或者混合抗体饱和浓度均为30μg/ml,待上机检测;其次,将Cytiva CM5芯片活化后,使用氨基偶联试剂将捕获抗体包被到芯片上;最后,检测包被的捕获抗体和VHH的表观解离速率常数,使VHH流经芯片,结合一段时间后,解离600-3600s,每次结合解离后,芯片表面用10mM甘氨酸(pH 1.5)进行再生。
采用上述方法,分别利用单一抗体以及不同混合比例的混合抗体捕获不同浓度的VHH,计算其表观解离速率常数(表观kd)并进行数据分析,使用表观kd来判断VHH被捕获的稳定程度,表观kd越小代表捕获稳定程度越高;如图1所示,利用不同比例的混合抗体分别对不同浓度的VHH进行捕获,分析计算得到的表观kd如下表1所示,结合表1与图1分析得知,当抗Myc标签抗体:抗His标签抗体混合比例为4:1-7:1时,混合抗体捕获VHH的稳定性最佳,表观kd达到了接近1×10-51/s的水平,且在不同VHH浓度下,捕获能力大致相当,这也为后续上清筛选提供了便利。
表1:不同比例混合抗体捕获不同浓度VHH的表观解离速率常数(表观kd)的结果
实施例2无标签抗原作为分析物利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv筛选
在实施例1研究得到的最优捕获条件下,选取抗Myc标签抗体和抗His标签抗体5:1的比例进行混合并制备芯片。接下来将上清VHH/scFv进行捕获,捕获完成后,以无标签抗原作为分析物,对VHH/scFv进行kd检测筛选。
如图2所示,为本发明提供的混合抗体捕获法整体流程示意图,首先,将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以5:1的比例进行混合,并保证抗体饱和浓度为30μg/ml,使用氨基偶联试剂盒,将混合抗体以共价偶联的方式包被到CM5芯片上;其次,使VHH/scFv上清流经Fc2通道,使其被混合抗体捕获到Fc2通道;最后,以无标签抗原作为分析物进行检测,使多个浓度的无标签抗原先后流经Fc1通道和Fc2通道,结合时间设置为120s,结合后,再解离1200-1800s,每次结合解离后,芯片表面用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生,对结果进行分析,计算解离速率常数kd2。
使用传统SPR方法筛选VHH/scFv,并分别检测解离速率常数kd1,与本发明的方法检测得到的解离速率常数kd2进行比较。
利用传统的SPR方法筛选VHH时,选择了先对VHH进行纯化,再对Fc标签抗原进行捕获,以纯化的VHH作为分析物进行检测的方法。传统SPR方法检测得到的解离速率常数kd1和本发明提供的方法检测得到的解离速率常数kd2如下表2所示:
表2:传统SPR方法筛选VHH得到的kd1和本发明提供的方法(无标签抗原)筛选VHH得到的kd2
利用传统的SPR方法筛选scFv时,选择了先对scFv进行IgG构建,再捕获IgG构建后的scFv,以抗原作为分析物进行检测的方法。传统SPR方法检测得到的解离速率常数kd1和本发明提供的方法检测得到的解离速率常数kd2如下表3所示:
表3:传统SPR方法筛选scFv得到的kd1和本发明提供的方法(无标签抗原)筛选scFv得到的kd2
如图3和图4所示,对传统方法和本发明提供的混合抗体捕获法分别检测得到的VHH/scFv解离速率常数进行相关性分析,可以看出,当使用无标签的抗原作为分析物时,传统方法得到的kd1和使用混合抗体捕获上清中的VHH/scFv检测得到的kd2数值偏差几乎都能保持在3倍以内,而且R2>85%,尤其是VHH的R2>90%,表明本发明提供的方法与传统方法得到的kd有较好的数据相关性。
实施例3半Fc标签抗原作为分析物利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv筛选
在实施例1研究得到的最优捕获条件下,选取抗Myc标签抗体和抗His标签抗体5:1的比例进行混合并制备芯片。接下来将上清VHH/scFv进行捕获,捕获完成后,以半Fc标签抗原作为分析物,对VHH/scFv进行kd检测筛选。其中,半Fc标签为人源Fc。
首先,将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以5:1的比例进行混合,并保证抗体饱和浓度为30μg/ml,使用氨基偶联试剂盒,将混合抗体以共价偶联的方式包被到CM5芯片上;其次,使VHH/scFv流经Fc2通道,使其被混合抗体捕获到Fc2通道;最后,以半Fc标签抗原作为分析物进行检测,使多个浓度的无标签抗原先后流经Fc1通道和Fc2通道,结合时间设置为120s,结合后,再解离1200-1800s,每次结合解离后,芯片表面用10mM甘氨酸(pH1.5)再生,对结果进行分析,计算解离速率常数kd2。
使用传统SPR方法筛选VHH/scFv,并分别检测解离速率常数kd1,与本发明提供的方法检测得到的解离速率常数kd2进行比较。
利用传统的SPR方法筛选VHH时,选择了先对VHH进行纯化,再对Fc标签抗原进行捕获,以纯化的VHH作为分析物进行检测的方法。传统SPR方法检测得到的解离速率常数kd1和本发明提供的方法检测得到的解离速率常数kd2如下表4所示:
表4:传统SPR方法筛选VHH得到的kd1和本发明提供的方法(半Fc标签抗原)筛选VHH得到的kd2
利用传统的SPR方法筛选scFv时,选择了先对scFv进行IgG构建,再捕获IgG构建后的scFv,以抗原作为分析物进行检测的方法。传统SPR方法检测得到的解离速率常数kd1和本发明提供的方法检测得到的解离速率常数kd2如下表5所示:
表5:传统SPR方法筛选scFv得到的kd1和本发明提供的方法(半Fc标签抗原)筛选scFv得到的kd2
如图5所示,对传统方法和本发明提供的混合抗体捕获法分别检测得到的VHH解离速率常数进行相关性分析,可以看出,当使用半Fc标签抗原作为分析物时,传统方法得到的kd1和使用混合抗体捕获上清中的VHH检测得到的kd2数值偏差大多都能保持在3倍以内,而且R2>90%,表明对于VHH,本发明提供的方法与传统方法得到的kd有较好的数据相关性。
如图6所示,对于scFv,传统方法得到的kd1和使用混合抗体捕获上清中的scFv检测得到的kd2部分数值偏差大于3倍,R2<80%,这可能是由于半Fc标签影响了scFv和抗原的结合。考虑到scFv和VHH不同的组成,scFv可能具有更大的相互作用面积,半Fc标签可能会部分影响结合,然而,从整体实验结果看,大多数样品用传统方法和本发明提供的方法得到的kd的相对大小排序是基本一致的。
本发明提供的基于SPR技术的利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法,相比于传统的ELISA,FACS和SPR筛选方法而言,能够在筛选阶段避免遗漏亲和力较高而表达较差的分子,同时能够稳定捕获VHH/scFv,扩大了VHH/scFv的解离速率常数的检测范围,且无需对VHH/scFv进行纯化或IgG的构建,节省了时间和成本,有助于抗体药物研发阶段对大量VHH/scFv样品的动力学结合检测和筛选。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)优化捕获条件:
先将单独的抗Myc标签抗体和单独的抗His标签抗体以不同比例混合,获得混合抗体,对芯片进行活化后,再使用所述混合抗体包被于所述芯片上,使用缓冲液将VHH稀释至不同浓度,使VHH流经所述芯片,并与包被在芯片上的抗体发生特异性结合,进行SPR检测并分析计算包被抗体与VHH的表观解离速率常数即表观kd;
比较混合比例不同的抗体和不同浓度VHH的表观解离速率常数,选取使用不同浓度VHH时表观解离速率常数都较小的混合比例作为最优捕获条件;
2)在最优捕获条件下,利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv的筛选:
先将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以步骤1)中获得的最优混合比例混合,再将混合抗体包被到活化后的芯片上,使VHH/scFv流经所述芯片,并与包被在芯片上的混合抗体发生特异性结合;
以不同浓度的抗原作为分析物进行SPR检测,分析计算VHH/scFv与抗原的解离速率常数kd。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中,抗Myc标签抗体和抗His标签抗体的混合比例分别为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、仅添加抗His标签抗体和仅添加抗Myc标签抗体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中,所述活化是指利用活化剂活化SPR传感芯片,所述包被是指将混合抗体与SPR传感芯片进行共价偶联。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述SPR传感芯片为CM5芯片,所述CM5芯片在完成结合和解离后,使用浓度为10mmol/L的甘氨酸溶液进行芯片再生,所述甘氨酸溶液的pH值设置为1.5。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中,所述VHH的稀释浓度分别为0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中,所述VHH和混合抗体结合后,解离时间设置为600-3600s。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中,所述最优混合比例是指按照4:1~7:1的比例混合抗Myc标签抗体和抗His标签抗体,且混合抗体的饱和浓度为30μg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中,所述VHH/scFv和抗原的结合时间设置为120s,解离时间设置为1200-1800s。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中,所述抗原为不含有Myc标签和His标签的抗原,包括但不限于无标签抗原和半Fc标签抗原。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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