TW201314208A - 用於抗原特異性抗體之以自組裝珠粒為主的多重檢測法 - Google Patents

用於抗原特異性抗體之以自組裝珠粒為主的多重檢測法 Download PDF

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Abstract

本文揭示一種製作用於抗原特異性抗體反應之多重檢測法之靈活方法。本發明方法包含經錨定蛋白(dockerin)或黏結蛋白(cohesin)塗佈之基材或一組珠粒與黏結蛋白或錨定蛋白-抗原融合蛋白培育以藉由非共價交互作用基本上不可逆地附接該融合蛋白。本發明可以使用一種經錨定蛋白或黏結蛋白塗佈之珠粒用於多組黏結蛋白-或錨定蛋白-抗原，不需要將新抗原直接化學偶聯至新珠粒。

Description

用於抗原特異性抗體之以自組裝珠粒為主的多重檢測法
本發明一般係關於用於分子分析之新穎工具領域，及更特定言之，係關於用於多重分析之包含黏結蛋白(cohesin)或錨定蛋白(dockerin)之珠粒之設計、製造及用途。
本發明係在政府支持下，依據NIH授予批准案案號1U19AI057234-010000進行，政府在本發明中享有一定權利。
本申請案包括一序列表，已以ASCII格式經由EFS-網站提交，其全文以引用的方式併入本文中。該ASCII副本於2012年8月21日創建，命名為BHCS1126_Sequence_Listing.txt，大小為299KB。
本發明係關於製作用於抗原特異性抗體反應之多重檢測法之方法。親和層析法係一種用於單離生物活性化合物之分離技術。分離法取決於各種因素，包括結合常數、管柱選擇性、良好的管柱滯留性、管柱容量及洗脫條件。例如，配體與生物分子間之強親和力可能需要嚴苛洗脫條件(諸如，低/高pH或極高鹽濃度)，其在重組蛋白質之情況中可能導致展開或變性，然而，親和力過弱可能不足以有效滯留在管柱上。例如，使用針對特定生物檢測法之特異試劑塗佈不同組別之微珠粒，可自樣品中捕捉並檢測出特異性分析物。珠粒係直接化學偶聯至微珠粒，而新抗原需直接化學偶聯至新珠粒。
例如，美國專利申請公開案第2010/0062451號，標題為 「珠粒-配體-新生蛋白質複合物(Bead-Ligand-Nascent Protein Complexes)」揭示珠粒-配體-新生蛋白質複合物，並描述製造及檢測珠粒-配體-新生蛋白質複合物之方法。採用附著於(例如)珠粒表面之PCR-擴增產物來產生新生蛋白質，其進而被珠粒捕捉，並藉由(例如)螢光檢測。
美國專利申請公開案第2005/0106700號揭示以C-端及N-端錨定蛋白融合物於親和管柱上純化標靶蛋白質上之用途。
國際專利申請案第WO 2009/028532號揭示使用錨定蛋白多肽之純化系統及方法，該多肽特徵在於源自約休梭狀芽孢桿菌(Clostridium josui )之錨定蛋白之第二子域之14-位置上胺基酸被另一胺基酸取代。
美國專利申請公開案第2011/0151538號，標題為「利用黏結蛋白-錨定蛋白交互作用之親和性純化法(Affinity Purification by Cohesin-Dockerin Interaction)」揭示截短之錨定蛋白多肽、重組多肽及具有截短之錨定蛋白多肽之親和系統、其生產方法、及使用其純化、分離及檢測所欲分子之方法，其中固體基材為具有碳水化合物結合模組(CBM)及蛋白質束之纖維素。該申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明揭示一種製作用於抗原特異性抗體反應之多重檢測法之靈活方法，該方法藉由使用經錨定蛋白塗佈的珠粒用於多組黏結蛋白-抗原，因此不需要新抗原直接化學性偶聯至新珠粒。本發明提供一種製作用於抗原特異性抗體 反應之多重檢測法之極靈活方法，及用於該方法之組合物。在標準多重技術(諸如，LuminexTM 或等效物)中，多達500個不同組別之顏色編碼的微珠粒已塗佈針對特定生物檢測法之特異試劑(可自樣品中捕捉並檢測出特異性分析物)，本發明與之相反，係利用黏結蛋白與錨定蛋白兩種蛋白質之間基本上不可逆的結合性，以增加珠粒之靈活性。在本發明中，所有組別之珠粒首先塗佈包含錨定蛋白或黏結蛋白域之蛋白質。接著各珠粒組再與黏結蛋白-抗原融合蛋白質簡單培養，其基本上藉由非共價交互作用形成不可逆性附接。因此，多組黏結蛋白或錨定蛋白-抗原可使用一組塗佈錨定蛋白或黏結蛋白之珠粒組，不需要將新抗原直接化學性偶聯至新珠粒。
在一項實施例中，本發明包括一種用於自樣品、基質、混合物或其任何組合中檢測、分離或純化一或多種分析物之方法，該方法包括：取得包含黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第一成員之固體基材，其中該第一成員係附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段，其中該固體基材係選自由下列各物組成之群：珠粒、細胞、細胞外基質、纖維基質、容器、親和管柱或其任何組合；提供黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第二成員，其中該第二成員係存在於樣品、基質、混合物或其任何組合，其中該第二成員可以結合樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種待檢測、待分離或待純化的分析物；使該黏結蛋白-錨定蛋白 結合對之第二成員與疑具有分析物之樣品、基質或混合物接觸；及在該基材上形成複合物，其包含黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第一及第二成員與該分析物，其中檢測到分析物之存在。在一態樣中，該方法進一步包括在複合物中添加檢測試劑，以確定存在或不存在分析物，其中檢測試劑包含第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合。在另一態樣中，分析物包含核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素及脂質。在另一態樣中，第一成員包含錨定蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之黏結蛋白域。在另一態樣中，第一成員包含黏結蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之錨定蛋白域。在另一態樣中，第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，而分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。在另一態樣中，該方法係在包括燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿或多孔板之容器中進行。在另一態樣中，基材包含一或多組珠粒，其中珠粒包括奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。在另一態樣中，一或多組珠粒包括聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚 合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮(polyphosophaze)、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)合成、聚合物聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳及其任何組合或修飾物。在另一態樣中，一或多種分析物包括抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列及/或酶，其中抗原包括一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原。在另一態樣中，錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短之錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白可為經取代的黏結蛋白、截短之黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌(Clostridium thermocellum )、 解纖維梭菌(C.cellulolyticum )、嗜纖維梭菌(C.cellulovorans )、溶紙梭菌(C.papyrosolvens )及產纖維二糖芽孢梭菌(Clostridium cellobioparum )、溶紙梭菌(C.papyrosolvens) 、約氏梭菌(C.josui )、解纖維醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus )、溶纖維擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens )、黃色瘤胃球菌(R.flavefaciens )、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus )、嗜超高溫古生菌(Archaeoglobus fulgidus )蛋白質、纖維質體黏結蛋白域。
在一項實施例中，本發明包含一種用於在樣品、基質、混合物或其任何組合中檢測、分離或純化一或多種分析物之以多重珠粒為主的方法，該方法包括：提供一、複數個或一組包含奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒之珠粒；將黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第一成員附接至該珠粒，其中該第一成員係附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段；提供至少一種黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第二成員，第二成員係附接至樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種待檢測、待分離或待純化之分析物；使黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第一成員與包含第二黏結蛋白/錨定蛋白結合對之樣品、基質或混合物接觸；及形成包含至少一種黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第二成員以非共價方式不可逆性附接至至少一種黏結蛋白/錨定蛋白結合對之第一成員之複合物。在一態樣中，該方法進一步包 括向該複合物添加檢測試劑，以確定存在或不存在分析物，其中檢測試劑包括第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合；藉由一或多種物理或化學方法自該複合物釋放包含分析物之第二成員；及自包含黏結蛋白、錨定蛋白、蛋白質、抗原、肽、抗體或其任何組合之混合物中分離分析物。在另一態樣中，分析物包括核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素及脂質。在另一態樣中，第一成員包含錨定蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之黏結蛋白域。在另一態樣中，第一成員包含黏結蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之錨定蛋白域。在另一態樣中，第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，而分析物則與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。在另一態樣中，一或多組珠粒包括聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙 交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)、合成聚合物聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳或其任何組合或修飾物。在另一態樣中，一或多種分析物包括抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列及/或酶，其中抗原包括一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體及/或原蟲抗原。在另一態樣中，錨定蛋白係選自I型錨定蛋白域、II型錨定蛋白域、III型錨定蛋白域、經取代的錨定蛋白、截短之錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白可為I型黏結蛋白、II型黏結蛋白、III型黏結蛋白、經取代的黏結蛋白、截短之黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。
本發明之另一實施例為一種檢測系統，其包括：基材及至少一種結合至該基材之附接或固定之錨定蛋白或黏結蛋白結合域，而錨定蛋白或黏結蛋白結合對係附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段。在一態樣中，基材包含一或多個珠粒。在另一態樣中，基材包含奈米球、 奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子及帶色珠粒。在另一態樣中，分析物包括核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素及脂質。在另一態樣中，第一成員包含錨定蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之黏結蛋白域。在另一態樣中，第一成員包含黏結蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之錨定蛋白域。在另一態樣中，第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，而分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。
在一個實施例中，本發明包括以珠粒為主之檢測系統，該系統包括一或多個或一組珠粒、至少一個附接或固定之錨定蛋白或黏結蛋白結合域，其中錨定蛋白或黏結蛋白結合域可附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段。在一態樣中，一或多個珠粒包括奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。在另一態樣中，分析物包括核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素或脂質。在另一態樣中，第一成員包含錨定蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之黏結蛋白域。在另一態樣中，第一成員包含黏結蛋白域，而第二成員包含附接至分析物之錨定蛋白域。在另 一態樣中，第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，而分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。
在一項實施例中，本發明包括一種在珠粒表面進行免疫檢測之方法，以同時檢測樣品、基質或混合物中超過一種之分析物，該方法包括以下步驟：在基材上提供一或多個珠粒或多組珠粒，其中該基材係選自由下列組成之群：燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿及多孔板或其任何組合或修飾物；將至少兩個錨定蛋白結合域附接或固定至該珠粒表面，其中錨定蛋白結合域可附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段；使該具有附接或固定錨定蛋白結合域之珠粒與包含多種所欲分析物之樣品、基質或混合物接觸，其中多種分析物係附接至一或多種黏結蛋白融合蛋白質；在一或多個珠粒表面形成超過一種複合物，其包含附接多種黏結蛋白融合蛋白質之分析物及多種錨定蛋白結合域；及向該珠粒添加多種檢測試劑或標記，其中每種檢測試劑或標記係針對疑似存在於樣品、基質或混合物之多種分析物具特異性並與之結合，而檢測試劑包括第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合；及藉由讀取、監測、或測量由檢測試劑或標記與分析物之結合物所發射的訊號，來檢測存在或不存在多種分析物。在一態樣中，該方法進一步包括以下可選步驟：使用合適緩衝液或水在某一免疫檢測步驟時或在其不同步驟之間進行一或多個清洗步驟；藉由使用一或多種 純分析物或標準物進行免疫檢測，以產生校準曲線或標準曲線，供測定樣品、基質或混合物中多種分析物之濃度或數量；藉由一或多種物理或化學方法，使附接至分析物之黏結蛋白融合蛋白質自複合物釋放；及自包含黏結蛋白、錨定蛋白、蛋白質、抗原、肽、抗體或其任何組合之混合物中分離分析物。在一態樣中，基材包含一或多組珠粒，其中珠粒包括奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。在另一態樣中，一或多組珠粒包括聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙 烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)、合成聚合物聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳及其任何組合或修飾物。在另一態樣中，珠粒可為自由流動的珠粒或可附接至固體基材。在另一態樣中，一或多種分析物包括抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列、酶或小分子，其中抗原包括一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原。在另一態樣中，錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白可為經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、溶紙梭菌以及產纖維二糖芽孢梭菌、溶紙梭菌、約氏梭菌、解纖維醋弧菌、溶纖維擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、嗜超高溫古生菌蛋白質、纖維質體黏結蛋白域。
在一實施例中，本發明包括一種利用一或多個珠粒之親和性純化方法，該方法包括以下步驟：在基材上提供一或多個珠粒或珠粒組，其中基材係選自由下列組成之群：燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿及多孔板、管柱及其任何組合或修飾物；將至少一個錨定因子錨定蛋白結合域附接或固定至該珠粒表面，其中錨定蛋 白結合域可附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段；藉由流動或泵送包含一或多種待純化的分析物之樣品、細胞混合物、發酵培養基、細胞提取液或其任何組合而接觸珠粒，其中至少一種待純化的分析物係偶聯或附接至黏結蛋白融合蛋白質；使包含附接之黏結蛋白融合蛋白質之分析物與一或多個包含至少一個錨定蛋白結合域之珠粒結合，以形成複合物，其中該結合產生包含一或多種不需要的物質或需自其分離分析物之物質之流經物(flow through)；及藉由一種物理或化學方法或其組合，自複合物釋放所需分析物，其中該等方法包括改變以下條件：離子強度、添加EDTA、自培養基移除Ca+2 、pH、溫度或其任何組合。在另一態樣中，一或多個珠粒係固定至固體基材或管柱填充材料。在另一態樣中，管柱中係填充一或多個珠粒或珠粒組。在另一態樣中，一或多個珠粒為聚合珠粒，且包括奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。在另一態樣中，待純化的分析物包括抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、融合蛋白質、核酸序列或酶中之一者或多者或其任何組合，其中抗原包括一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原。在另一態樣中，錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白 可為經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。在另一態樣中，黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、溶紙梭菌以及產纖維二糖芽孢梭菌、溶紙梭菌、約氏梭菌、解纖維醋弧菌、溶纖維擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、嗜超高溫古生菌蛋白質或纖維質體黏結蛋白域。
為更完整的理解本發明之特徵及優勢，現在參考本發明之詳細描述及附圖。
雖然下文詳細論述本發明各種實施例之製備及使用，但應瞭解本發明提供諸多可在各種廣泛特定上下文中得到體現之發明概念。本文所論及之特定實施例僅係製作及使用本發明之特定說明方式，並不限制本發明範圍。
為便於理解本發明，下文定義多個術語。本文所定義術語具有如本發明相關領域之一般技術者所理解之一般意義。諸如，「一個」「一種」及「該」並無意僅指單個實體，反而亦包括可能用以說明之特定實例之一般類別。雖然本文術語係用以描述本發明特定實施例，但其用法並不限制本發明，除非在技術方案中另有說明。
如本文所用，術語「類似物」亦延用至本發明肽之任何化學功能等效物或重組等效物，在多數較佳實施例中，特徵在於其具有至少一種上述活性。術語「類似物」在本文中亦係延用至如上所述之肽之任何胺基酸衍生物。一般而言，類似物將在一項實施例中具有至少70%序列一致性， 其他實施例可具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性。序列一致性百分比可由熟悉此相關技術者測定。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指包括一級、二級或三級結構與位於由病原菌DNA或RNA所編碼任何多種病原菌多肽內類似之肽或蛋白質抗原。相似程度通常達到使直接針對此類多肽之單株或多株抗體亦可結合該肽或蛋白質抗原、與其反應或識別。
如本文所用，術語「重組多肽」係指已在經過編碼該多肽之核酸轉形或轉染之宿主細胞中產生之多肽，或指由同源重組作用產生之多肽。
如本文所用，術語「錨定蛋白-黏結蛋白對」係用以表示錨定蛋白域與黏結蛋白域之結合，且應瞭解，錨定蛋白域、黏結蛋白域或兩者可被截短、經取代、經修飾或被改變。此外，雖然實施例係以多種方式描述，但應瞭解，錨定蛋白-黏結蛋白對亦可視為黏結蛋白-錨定蛋白對。應瞭解，錨定蛋白或黏結蛋白可附接至基材，而該相應配對物可與黏結劑共軛，形成錨定蛋白-黏結蛋白對。
本發明之微陣列、微珠粒及珠粒技術可作為依平行方式、大規模平行方式或多工方式進行生物、化學或生化分析之工具，因為可於微陣列基材或珠粒上裝配或沉積大量不同化合物或物質。除了不同珠粒或顆粒出現空間分隔之特徵外，微珠粒技術與微陣列類似。該分析法之格式可如同微陣列，(例如)將珠粒排列或嵌入裝置(諸如，顯微鏡載 玻片或分析板)表面上或孔中。或者，該分析法可藉由(例如)懸浮於溶液中之珠粒進行。微珠粒技術之工作密度特徵可能比微陣列大得多，主要取決於最小可用珠粒尺寸及最大可用珠粒濃度或密度。
如本文所用，術語「奈米球」係用以表示直徑尺寸介於10奈米(nm)至約100,000 nm之顆粒。最佳直徑係於約10至1,000 nm之間，較佳於200至500 nm之間。本發明中用作附接奈米球之載體顆粒之聚合物微球體之直徑尺寸通常介於0.01至1000微米之範圍。雖然微粒可為任何尺寸，但較佳尺寸為0.1-500微米，更佳1-200微米及甚至更佳2-12微米。顆粒之尺寸可一致(約為相同尺寸)或為變化之尺寸，可由隨尺寸變化之特性(諸如，光散射或光折射)測得其差異。顆粒可由任何形狀規則的材料組成。較佳形狀為球形，然而，可採用任何其他形狀的顆粒，因為此參數並不影響本發明本質。
通常，該等奈米球及載體微粒係由相同材料組成，諸如，聚苯乙或膠乳。然而，其他聚合物材料亦可接受，包括選自由下列化學組分組成之群之聚合物：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物。更特定言之，較佳係溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚 對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮或其組合。組成聚合顆粒之代表組合聚合物包括(例如)聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)。由合成聚合物(諸如，聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯或膠乳)形成之多數珠粒現在可自多種市售來源買到，諸如，Bio-Rad Laboratories(Richmond,Calif.)以及LKB Produkter(Stockholm,Sweden)。由天然大分子及顆粒形成之珠粒(諸如，瓊脂糖、交聯瓊脂糖、球蛋白、脫氧核糖核酸及脂質體)可自市售來源買到，諸如，Bio-Rad Laboratories,Pharmacia(Piscataway,N.J.)以及IBF(法國)。由聚丙烯醯胺及瓊脂糖之共聚物形成之珠粒可自市售來源買到，諸如，IBF與Pharmacia。
一般而言，本發明提供製造複數種具有不同特性(如(例如)：抗體、標記、黏結劑、探針、標靶或分析物)之基材(例如，珠粒)，可作為傳遞劑、純化機制、隔離機制、親 和基質、多重陣列或類似功能。該等附接至珠粒之不同特性物質通常係離線生產，且隨後在混合含溶液之機械過程中可結合至各別反應器之珠粒，以形成錨定蛋白-黏結蛋白結合對。此過程可(例如)在獨立試管、小瓶或微量滴定盤之孔中完成。
本發明提供一種附接至基材且其組態為結合抗原或其他組合物之錨定蛋白-黏結蛋白對之親和基質系統。本發明提供一種製作抗原特異性抗體反應之多重檢測法之靈活方法。在多達500個不同組別中使用顏色編碼微珠粒之標準Luminex技術係塗佈針對特定生物檢測法之特異試劑，可捕捉及檢測樣品中特異性分析物。相反，本發明提供一組珠粒，其首先塗佈含錨定蛋白域之蛋白質。接著各珠粒組單純地與黏結蛋白-抗原融合蛋白質培養，其基本上藉由非共價交互作用進行不可逆性連接。因此，一組經錨定蛋白-或黏結蛋白塗佈的珠粒組可用於多組黏結蛋白-或錨定蛋白-抗原，不需要將新抗原直接化學性偶聯至新珠粒。在一項類似方法中，本發明提供一組珠粒，其首先塗佈含黏結蛋白域之蛋白質。接著各珠粒組單純地與錨定蛋白-抗原融合蛋白質培養，其基本上藉由非共價交互作用進行不可逆性連接。因此，一組經黏結蛋白-或錨定蛋白塗佈的珠粒組可用於多組錨定蛋白-或黏結蛋白-抗原，不需要將新抗原直接化學性偶聯至新珠粒。
本發明不需要讓抗原與珠粒進行化學交聯，且不需要自重組表現系統中純化抗原，因為錨定蛋白-珠粒可直接用 作親和基質。珠粒可直接用作親和基質，得到隨時用於檢測之珠粒。此外，此方式與化學交聯技術不同，其以不掩蓋抗原決定基之組態呈現抗原。
本發明利用錨定蛋白-黏結蛋白對交互作用。黏結蛋白域會與稱作錨定蛋白之小域(例如，56個殘基)交互作用。其係含Ca+2 之雙重對稱結構，且可依各種親和力來結合同源黏結蛋白。交互作用為非共價性，且藉由結構分析已完全確立出現在至少一種錨定蛋白-黏結蛋白對。錨定蛋白之設計為連接不同域(天然酶)之域，而黏結蛋白之設計為在線性陣列中發揮功能(無論係直接端對端，還是由各種尺寸之可變之富集PT連接子連接)。已知特定錨定蛋白可對特定黏結蛋白具有特異性(例如，來自一種細菌菌種之錨定蛋白-黏結蛋白對不可與來自不同物種之錨定蛋白-黏結蛋白對互換)。此特性可確保各種融合蛋白質與具各種不同特異性之工程改造黏結蛋白域之特異性及精確交互作用。
基於黏結蛋白-錨定蛋白複合物之晶體結構可見，一項實施例為抗原-錨定蛋白融合蛋白質(即，抗原與錨定蛋白之N-端融合)。然而，從黏結蛋白域架構內組織之結構及本質兩方面來看，黏結蛋白顯然可以端對端融合，甚至不需間隔序列。另外，顯然可利用已完全說明的技術來工程改造黏結蛋白及錨定蛋白域之小型化版本。
纖維質體係可調控纖維素及相關植物細胞壁多醣之有效降解之多酶複合物。該複合物係藉由兩種互補模組(黏結 蛋白及錨定蛋白)之間之強力蛋白質-蛋白質親和作用維持。錨定蛋白係一種出現在纖維質體細胞結構中之蛋白質域。其為內切葡聚醣酶之一部分。錨定蛋白之結合對象為黏結蛋白域。這種交互作用係建構纖維質體複合物時之基本條件。錨定蛋白域具有兩個非-EF手形鈣結合基序之串聯重複區，特徵在於環-螺旋結構。有三種錨定蛋白域：I、II及III，分別與I型黏結蛋白、II型黏結蛋白及III型黏結蛋白結合。
纖維質體之共同特徵在於其係由圍繞非催化架構蛋白質配置之許多催化組分所組成。該等蛋白質主要由約140個殘基之重複非催化域(稱為黏結蛋白域)與碳水化合物結合模組(CBM)組成。例如，約氏梭菌CipA N-端之組成為3個CBM、接著一個親水域及六個黏結蛋白域；而熱纖梭菌CipA在九個重複黏結蛋白域之第二及第三個之間包含一個CBM，及在其C端包含II型錨定蛋白域。在諸多情況中，所有來自此等細菌之黏結蛋白域之胺基酸序列彼此係呈高度同源性(尤其在同物種內)。各黏結蛋白域係可與各催化組分之錨定域(稱為錨定蛋白)交互作用之亞單位-結合域。錨定蛋白域包含兩個片段，亦稱為保守複製區(CDR)，各包含一個Ca2+ 結合環及一個α螺旋(即，鈣結合基序)。另一個α螺旋插入兩個片段中間。每個重複序列之α螺旋包含保守KR或KK二肽。錨定蛋白模組與黏結蛋白模組之物種特異性連接係受到高親和性Ca2+ -依賴性交互作用介導。纖維質體包含CBM及一系列將纖維素酶錨定至多酶複合物之黏 結蛋白模組。各種纖維素酶尤其包含結合黏結蛋白配對物之保守錨定蛋白模組。黏結蛋白-錨定蛋白交互作用之生化及結構研究已顯示，錨定蛋白可依強力親和常數與架構上之每一黏結蛋白結合。可藉由添加二價離子螯合劑(諸如，EDTA)而逆轉其結合性。
本發明提供一種用於將抗原連接至珠粒之具成本效益之方法及組合物，不需要化學交聯及自重組表現系統中純化抗原，因為錨定蛋白-珠粒可直接用作親和基質，得到隨時備用於檢測法之珠粒。此外，亦需要一種與化學交聯技術不同且不會不掩蓋抗原決定基之抗原組態。
在另一實施例中，本發明方法及組合物之固體基材為珠粒。在另一實施例中，固體基材為細胞。在另一實施例中，固體基材為細胞外基質。在另一實施例中，固體基材為纖維基質。在另一實施例中，固體基材為容器。在另一實施例中，容器係選自由下列組成之群：燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿、多孔板或晶片。在另一實施例中，固體基材係附接至親和管柱或與其連接。每種可能性均代表本發明之獨立實施例。
在另一實施例中，抗體-結合部分體係經由抗體-結合部分體與截短錨定蛋白多肽之融合而附接至本發明之固體基材。截短錨定蛋白多肽可附接至已附接在固體基材上之含黏結蛋白之蛋白質束。
在另一實施例中，本發明方法及組合物之固體基材包括纖維素，附接至固體基材之蛋白質進一步包括碳水化合物 結合模組(CBM)。在另一實施例中，蛋白質與固體基材之附接方式係經由CBM與纖維素間之交互作用。每種可能性均代表本發明之獨立實施例。
本發明方法及組合物之所需分子為如本文所揭示任何可(直接或間接)共價結合至截短錨定蛋白(例如，截短錨定蛋白、經取代的錨定蛋白或經修飾的錨定蛋白)域之分子。在各種實施例中，所需分子為任何需純化或需經過處理以與固體基材連接之分子類型。在另一實施例中，本發明方法及組合物之所需分子為任何可(直接或間接)共價附接至黏結蛋白(例如，截短黏結蛋白、經取代的黏結蛋白或經修飾的黏結蛋白)域之分子。在各種實施例中，所需分子為任何需純化或需經過處理以與固體基材連接之分子類型。
在特定實施例中，所需分子為肽。在另一實施例中，所需分子為蛋白質。在另一實施例中，肽為酶。在另一實施例中，分子為肽激素。在另一實施例中，分子為重組肽。在另一實施例中，分子為核酸。在另一實施例中，分子為信使序列。在另一實施例中，分子為藥物。在另一實施例中，分子為細胞受體。在另一實施例中，分子為細胞。在另一實施例中，所需分子為任何需純化或需經過處理以與固體基材連接之分子類型。
如本文所提供，各種不同蛋白質可在溫和條件下以高效率成功地純化，接著才與本發明錨定蛋白域融合。錨定蛋白域之鑒定方法係此項技術中熟知。另一實施例中，本發 明方法及組合物中所用之錨定蛋白-黏結蛋白對係來自相同物種。已證實，錨定蛋白與架構上每一黏結蛋白結合；因此，任何來自指定物種之黏結蛋白預期應與任何來自該物種之錨定蛋白結合。黏結蛋白-錨定蛋白交互作用不具物種特異性，然而，在一些情況中，交互作用可係物種特異性。
在另一實施例中，在EDTA存在下，錨定蛋白域(或經取代或經修飾的錨定蛋白域)與野生型黏結蛋白之Ka 低至足以作為可逆性親和標記。在另一實施例中，該組合之Ka 低於107 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於3X106 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於106 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於3X105 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於105 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於3X104 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於104 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於5X103 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於2X105 M-3 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於103 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於5X102 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於2X102 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於102 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於5X101 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於2X101 M-1 。在另一實施例中，該組合之Ka 低於101 M-1 。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，本發明方法及組合物之黏結蛋白域為I型黏結蛋白域。在另一實施例中，黏結蛋白域為II型黏結 蛋白域。在另一實施例中，黏結蛋白域為此技術中已知之任何其他類型之黏結蛋白域。各可能性代表本發明之各別實施例。
本發明使用來自不同物種或序列之黏結蛋白-錨定蛋白來製備多價組合物。雖然本發明包括使用來自多種纖維素降解微生物之所有黏結蛋白-錨定蛋白序列，但描述來自熱纖梭菌微生物之特定黏結蛋白及錨定蛋白以及連接序列之應用。成對之黏結蛋白-錨定蛋白存在於多種纖維素降解物種中。雖然彼等序列相似，但彼等可具有不跨越物種之特異性。此提供以控制空間及數量之方式建立具有不同特異性之新穎構築體之機會。藉由擴展，可使用多種黏結蛋白-錨定蛋白特異性以製備具有較高度抗原特異性之二價基材。纖維素降解細菌及類似生物亦使用纖維素結合域來構成降解機轉。本發明涵蓋使用實體以組裝空間及數量有序複合物及多亞單位受體。
在另一實施例中，黏結蛋白域係來自選自以下組成之群之物種：熱纖梭菌、解纖維梭菌及嗜纖維梭菌。在另一實施例中，黏結蛋白域係來自選自以下組成之群之物種：熱纖梭菌、溶紙梭菌及產纖維二糖芽孢梭菌。在另一實施例中，黏結蛋白域係來自選自以下組成之群之物種：熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、溶紙梭菌、約氏梭菌、解纖維醋弧菌、溶纖維擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌及產纖維二糖芽孢梭菌。
在另一實施例中，黏結蛋白域係來自選自下列蛋白質之 黏結蛋白域：熱纖梭菌之CipA(或架構蛋白(scaffoldin))、解纖維梭菌之CipC、嗜纖維梭菌之CbpA及約氏梭菌之CipA。在另一實施例中，本發明方法及組合物之黏結蛋白域係來自嗜超高溫古生菌蛋白質。在另一實施例中，本發明方法及組合物中使用纖維質體黏結蛋白域。在另一實施例中，使用來自纖維質體蛋白質之I型黏結蛋白域。在另一實施例中，本發明方法及組合物中使用非纖維質體黏結蛋白域。
在一項非限定實施例中，本發明之基材係經過工程處理為具有一或多個模組化黏結蛋白-錨定蛋白蛋白質域，以製備特異性且限定之蛋白質複合物。在一些實施例中，黏結蛋白或錨定蛋白蛋白質域可能來自不同物種，允許物種特異性黏結蛋白-錨定蛋白蛋白質進行特異性配對。
基材亦可稱為奈米球、奈米顆粒、微球體、微粒、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子及帶色珠粒。基材可作為分子反應之媒介體。微球體之說明及其製造方法可參見(例如)美國專利案第7,141,431號中找到，其內容以引用的方式併入本文中。
藉由使各個分子與成對之黏結蛋白：錨定蛋白之另一半互補部分結合，即可使用基材來負載各個分子(例如，珠粒、肽、蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸(寡核苷酸、適體、含鹼或不含鹼之載體或主鏈修飾物)或其組合。例如，錨定蛋白或黏結蛋白可製成融合蛋白質，或者化學性 附接至抗原、肽、蛋白質、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、另一抗體、細胞或其片段。
基材可具有一或多個黏結蛋白、錨定蛋白或黏結蛋白及錨定蛋白域兩者，以形成具有一或多個互補黏結蛋白/錨定蛋白-分子及一個結合域之複合物。結合域可用於與蛋白質、抗體、核酸、染料、金屬、標記、活性劑或其他組合物共軛。例如，結合域可為用於結合抗原之抗體。在另一實施例中，結合域可用於純化與黏結蛋白/錨定蛋白-分子及基材所連接之抗體結合之抗原。
使用本發明測試之生物樣品(例如)包括血漿、血清、淚液、黏液、唾液、尿液、胸膜液、脊髓液、胃液、汗液、精液、陰道分泌物、來自潰瘍及/或其他表面疹子、水泡、膿包之液體及/或組織提取物(諸如，正常、惡性及/或可疑組織之切片)。
用於此等生物檢測法之所需分析物包括(例如)抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列及/或酶。抗原性分析物包括(例如)細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體及/或原蟲抗原。
抗原實例包括腫瘤蛋白，例如，突變癌基因；與腫瘤相關之病毒蛋白質；及腫瘤黏蛋白及糖脂類。抗原可為與彼等來自上述病毒類型之腫瘤相關之病毒蛋白質。某些抗原之特徵可為腫瘤(其中一個子群為通常並非由腫瘤前驅細胞表現之蛋白質)，或可為在腫瘤前驅細胞中正常表現，但具有腫瘤之變異特徵之蛋白質。其他抗原包括具有改變 之活性或亞細胞分佈之正常蛋白質之突變變體，例如，產生腫瘤抗原之基因突變。腫瘤抗原之特定非限定性實例包括：CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6及12、MUC(黏蛋白)(例如，MUC-1、MUC-2等等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V嵌段V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V段V序列)、前列腺Ca psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素(catenin)、MUM-1-B(黑色素瘤普遍變異基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗藥性蛋白質(LRP)、Bcl-2及Ki-67。此外，免疫原性分子可為涉及自體免疫疾病之起始及/或蔓延之自身抗原，其發病主要係由於抗體針對由相關靶器官、組織或細胞所表現之分子(例如，SLE或MG)之特異性活性。在此等疾病中，需要將正在對相關自身抗原產生之抗體介導型(即，Th2-型)免疫反應導向細胞型(即，Th1-型)免疫反應。或者，可能需要藉由預防性誘發針對正常自身抗原之Th1反應，以防止尚未患有但疑似容易罹患相關自體免疫疾病之個體內開始產生自身抗原之Th2反應或降低其反應程度。所需之自身抗原包括(但不限於)(a)就SLE而言，為史密斯(Smith)蛋白質、RNP核糖核蛋白、及SS-A及SS-B蛋白質；及(b)就MG而言，為乙醯膽鹼受體。其他涉及一 或多種自體免疫反應之雜項抗原實例包括(例如)內源激素(諸如，黃體生成素、濾泡刺激素、睪酮、生長激素、催乳激素及其他激素)。涉及自體免疫疾病、過敏及移植排斥之抗原均可用在本發明組合物及方法中。例如，可在本發明中使用涉及以下任何一或多種自體免疫疾病或病症之抗原：糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、關節炎(包括類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬關節炎)、多發性硬化、重症肌無力、全身紅斑性狼瘡、自體免疫甲狀腺炎、皮膚炎(包括異位性皮膚炎及濕疹性皮炎)、牛皮癬、薛格連氏症候群(sjogren's syndrome)(包括薛格連氏症候群續發之乾燥性角膜結膜炎)、斑禿、由於節肢動物叮咬反應產生之過敏性反應、克羅恩氏病(Crohn's disease)、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、潰瘍性結腸炎、氣喘、過敏性哮喘、皮膚型紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥疹、麻風逆轉反應、麻瘋結節性紅斑、自體免疫性萄膜炎、過敏性腦脊髓炎、急性出血性壞死腦炎、特發性兩側進行性感音神經性聽覺喪失(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生障礙性貧血、純紅血球貧血、特發性血小板減少、多軟骨炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、慢性活動性肝炎、史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、特發性脂乳瀉、扁平苔癬、克羅恩氏病(Crohn's disease)、葛瑞夫茲氏眼病(Graves opthalmopathy)、結節病、原發性膽汁性肝硬化、後葡萄 膜炎及肺間質纖維化。涉及自體免疫疾病之抗原實例包括榖胺酸脫羧酶65(GAD 65)、天然DNA、髓鞘鹼性蛋白質、髓鞘蛋白脂質蛋白質、乙醯膽鹼受體組分、甲狀腺球蛋白及促甲狀腺激素(TSH)受體。涉及過敏之抗原實例包括花粉抗原(諸如，日本柳杉花粉抗原、豬草花粉抗原、黑麥草花粉抗原)、動物性抗原(諸如，塵蟎抗原及貓抗原)、組織相容性抗原、及青黴素與其他治療藥物。涉及移植排斥之抗原實例包括待移植至移植受體之抗原組分，諸如，心臟、肺、肝臟、胰臟、腎臟及神經移植組分。抗原可為用於治療自體免疫疾病之已改變肽配體。
在一實例中，本發明可用於任何用於抗原之多重檢測法之系統。例如，添加針對所需分子而預先塗佈已結合至珠粒之分析物-特異性捕捉錨定蛋白或黏結蛋白之顏色編碼的珠粒。黏結蛋白或錨定蛋白係結合至珠粒，而分析物結合至成對黏結蛋白-錨定蛋白之另一半。藉由與錨定蛋白或黏結蛋白結合(例如，成為融合蛋白質)，可在同一樣品中同時檢測多重分析物。分析物(例如，抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸、酶或小分子)可(共價或非共價)結合、負載或連接至珠粒上成對之錨定蛋白或黏結蛋白對。
下一步，在珠粒中添加分析物-特異性抗體，以捕捉所需分析物。在一實施例中，添加針對所需分析物具特異性之生物素化檢測抗體，並形成抗體-抗原夾心結構。
在生物素化試劑之情況中，添加與抗生物鏈黴素共軛之 可檢測試劑(例如，藻紅蛋白(PE))。在另一實施例中，錨定蛋白-黏結蛋白對可替代生物素-抗生物鏈黴素，其中該結合對之一部分係結合至可檢測標記(螢光標記、磁標記、放射活性標記、高電子密度標記、酶標記及類似物)。
可使用(例如)基於雙雷射流的檢測儀器(dual-laser flow-based detection instrument)(諸如，Luminex 200TM 或Bio-Rad® Bio-Plex®分析器)讀取珠粒。其中第一雷射為珠粒分類，並測量所檢測分析物。第二雷測量源自可檢測標記之訊號強度。來自可檢測標記之訊號通常與分析物之結合量成比例。例如，分析物可為淋巴細胞活素，諸如，例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35及/或IL-36及其變體。可用作分析物之細胞激素及其他試劑之實例包括(例如)顆粒球-群落刺激因子、巨噬細胞-群落刺激因子、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子、白血病抑制因子、紅血球生成素、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、抑瘤素M、白血病抑制因子、IFN-α、-β或-γ、淋巴細胞毒素-α或-β、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-1BBL、TGF-α或-β、IL-1 RA、巨噬細胞抑制因子及/或其混合物。珠粒可為顏色編碼的珠粒或包括識別珠粒之可檢測標記或條碼。 不同珠粒可塗佈錨定蛋白或黏結蛋白，並向經塗佈的珠粒中添加結合至錨定蛋白-黏結蛋白對之另一半之特異性分析物，以製作針對單一分析物之特異性珠粒。
編碼C1.C2.C3.Cn之序列實例係來自纖維質體錨定架構B前體(溶纖維擬桿菌)之之公開序列>gi|50656899|gb|AAT79550.1|。下文以粗體字顯示前導分泌序列，而以斜體加粗體下劃綫突顯各種不同黏結蛋白域。斜體-下劃綫區域為分隔某些黏結蛋白域之連接子。熟悉此相關技術者很容易即可製備一或多種此等域成為單個域、連體、多聚體，並藉由(例如)添加識別域(諸如，組胺酸標記及類似物)以供單離。編碼域(黏結蛋白或錨定蛋白)之核酸序列很容易合成，並可針對所採用之特定表現系統(例如，細菌、真菌、蠕蟲或哺乳動物)而定製。
MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFA ATPQVNIIIGSAQGIPGSTVKVPINLQNVPEIGINNCDFTIKFDSDILDFNSVEAGDIVPLPVASFSSNNS KDIIKFLFSDATQGNMPINENGLFAVISFKIKDNAQKGISNIKVSSYGSFSGMSGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTS KLDVKVGNVEGIAGTEVNVPITFENVPDNGINNCNFTLSYDSNALEFLTTEAGNIIPLAIADYSSYRSMEGKIKFLFSDSSQGTRSIKNDGVFANIKFKIKGNAIRDTYRIDLSELGSFSSKQNNNLKSIATQFLSGSVNVKDIE SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP GNKMKIQIGDVKANQGDTVIVPITFNEVPVMGVNNCNFT LAYDKNIMEFISADAGDIVTLPMANYS YNMPSDGLVKFLYNDQAQGAMSIKEDGTFANVKFKIKQSAAFGKYSVGIKAIGSISALSNSKLIPIESIFKDGSIT VTNKPI VNIEIGKVKVKAGDKIKVPVEIKDIPSIGINNCNFTLKYNSNVLKYVSNEAGTIVPAPLANLSINKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFVNLEFQAVNDANIGVYGLELDTIGAFSGISSAKMTSIEPQFN NGSIEIFNSAQTPVPSNTEV QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSTPKPNPLYNLNVNIGEISGEAGGVIEVPIEFKNVPDFGINNCDFSVKYDKSIFEYVTYEAGSIVKDSIVNLACMENSGIINLLFNDATQSSSPIKNNGVFAKLKFKINSNAASGTYQINAEGYGKFSGNLNGKLTSINPIFENGIINIGNVT VKPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGTPTVTPI YWMNVLIGNMNAAIGEEVVVPIEFKNVPPFGINNCDFKLVYDSNALELKKVEAGDIVPEPLANLSSNKSEGKIQFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTAASGIYNIRKDSVGSFSGLIDNKMTSIGPKFTDGSIVVG TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPIATPTIKGTPTATP MYWMNVVIGKMNAEVGGEVVVPIEFNNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTTATGVYDLRKDLVGSFSGLKDNKMTSIGAEFTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTVTATPSDTIPTVTPTATATPSAIVTTITPTATAKPIATPTIKGTPTATP MYWMNVVIGKMNAEVGGEVVVPIEFKNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDIRKDLIGSFSGLKDSKMTSIGAEFTNGSI TVATTAPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPGTATPGTATPTATATPGAATPTETATPSVMIPTVTPTATATPTATATPTVKGTPTIKPVY KMNVVIGRVNVVAGEEVVVPVEFKNIP AIGVNNCNFVLEYDANVLEVKKVDAGEIVPDALINFGSNNSDEGKVYFLFNDALQGRMQIANDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAFSGLVDKLVPISAEFTDGSISVESAK STPTATATGTNVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVKGTPTATPLYSMNVIIGKVNAEASGEVVVPVEFKDVPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVPVPLGNFSSNNKDEGKIYFLFSDGTQGRMQIVNDGIFAKIKFKVKSTASDGTYYIRKDSVGAFSGLIEKKIIKIGAEFTDGSITVRSL TPTPTVTPNVASPTPTKVVAEPTSNQPAGPGPITGTIPTATTTATATPTKASVATATPTATPIVVVEPTIVRPGYNKDADLAVFISSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKVNATNVKIAAQIPKFTKVYDAAKGAVKGSEIVWMIGNLAVGESYTKEYKVKVDSLTKSEEYTDNTVTISSDQTVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYSNRFTPGSHSSYILGYKDKTFKPKQNVTRAEVAAMFARIMGLTVKDGAKSSYKDVSNKHWALKYIEAVTKSGIFKGYKDSTFHPNAPITRAELSTVIFNYLHLNNIAPSKVHFTDINKHWAKNYIEEIYRFKLIQGYSDGSFKPNNNITRAEVVTMINRMLYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE(SEQ ID NO：1)
黏結蛋白域(C)與稱為錨定蛋白(D)之小域(例如，56個殘基)交互作用。其為含Ca++ 雙重對稱結構，且可依各種親和性與同源黏結蛋白(例如，6E6 M、2E7M)結合。錨定蛋白與多重黏結蛋白(如在架構上所發現者)之間之親和性可能高得多(例如，>E9 M)。交互作用係非共價性，且只限定於至少一種C-D(由結構分析測得)。錨定蛋白被設計為連接不同域(天然酶)之域，而黏結蛋白被設計為在線性陣列 中產生功能(無論係直接端對端，還是由各種尺寸(例如，12、17、25、28、36)之柔性富集PT之連接子連接)。已知特定錨定蛋白可對特定黏結蛋白具有特異性(例如，來自一種細菌菌種之C-D對不一定會與來自不同物種之C-D對互換)。此特性可確保各種D-抗原融合蛋白質與具多樣特異性之含黏結蛋白域之經過工程處理之mAb之特異性，及精確交互作用。
錨定蛋白：
GDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVDVTILSRYLIRVIEKLPI(SEQ ID NO：2)
操作時，本發明包括使用噬菌體表現技術，擷用由文獻中得知、新近從天然中發現或發展成具有新穎特異性之C-D對。若需要，亦可使用後來的技術加強('發展')C-D交互作用之親和力。同樣，可利用在C-D交互作用之反面建構半胱胺酸殘基(基於公開C-D結構建模)，而在C-D之間建立共價鍵，進而強化交互作用。另外，可利用mAb(及因此所連接的C-域)之二聚合性質來達成加強親和力之目的。在此實施例中，(例如)使用第二個相同錨定蛋白域(D-抗原-D，或D-D-抗原)，或者使用均二聚合域來設計D-抗原融合蛋白質。假如域間之連接子並未受限，則該組態將較佳導致兩個D域同時結合到同一mAb上，使其穩定性比此單一交互作用大幅提升。
基於黏結蛋白-錨定蛋白複合物之晶體結構(例如，參見PNAS 2003,13809-13814,Cellulosome assembly revealed by the crystal structure of the cohesin-dockerin complex.Ana L.Carvalho,Fernando M.V.Dias,José A.M.Prates,Tibor Nagy,Harry J.Gilbert,Gideon J.Davies,Luís M.A.Ferreira,Maria J.Romão及Carlos M.G.A.Fonte)，抗原-錨定蛋白融合蛋白質(即，抗原與錨定蛋白之N-端融合)即為一明顯實施例。然而，從架構內黏結蛋白域組織之結構及本質兩方面來看，黏結蛋白顯然可依端對端融合，甚至不需要間隔序列。另外，顯然可利用已詳細說明的技術來工程處理黏結蛋白及錨定蛋白域之小型化版本(參見(例如)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.94,pp.10080-10085,September 1997.Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain.Melissa A.Starovasnik,Andrew C.Braisted及James A.Wells)。
本文已證實，連接序列傾向於由富集ST豐度而達成O-連接之糖基化。此外，C及D域兩者皆具有潛在之N-連接位點。此等特徵之優點在於藉由碳水化合物之修飾來提高哺乳動物細胞所表現之工程處理mAb之溶解度。當然，需要由其功能(與同源D之結合)檢查C域之糖基化結果，且若需要，藉由定點誘變法來修正。本發明之誘人特徵在於D-A可在任何被認為是最好的系統中表現。以下是錨定蛋白域。
本發明者已開發出一種以珠粒為主之靈活、敏感、精確、高物料通量、節約樣品之多重檢測法，用於同時針對多種抗原來測定抗體。此在圖1A及1B中以圖示代表。
圖1A及1B顯示，黏結蛋白及錨定蛋白係來自纖維素-降 解細菌之蛋白質模組，其以高親和力(KD ~30 pM)非共價性結合。在圖1A中，一組多達100個不同螢光微球體(例如，Luminex®珠粒)與已與錨定蛋白融合之纖維素-結合域(CBD-Doc)化學性交聯。每種黏結蛋白-抗原融合蛋白質與一種特定顏色的CBD-Doc珠粒混合(例如，珠粒區域21)。清洗珠粒並與同樣經其他所需黏結蛋白-抗原融合蛋白質塗佈之CBD-Doc珠粒彙集。在圖1B中，使用每種血清樣品之連續稀釋液培養珠粒-抗原組，清洗，使用(例如)抗人類IgG-PE共軛物培養，再次清洗，接著在流式細胞儀中讀數，測量與每種珠粒顏色相關之螢光強度。
下文提出用於確認抗體偶聯之取樣法。在此過程中應防止微球體長時間曝光。
(i)選擇合適抗體-偶聯微球體組。
(ii)藉由渦轉及超音波使處理微球體約20秒，使其再次懸浮。
(iii)在PBS-1% BSA中，藉由將偶聯微球體母液稀釋至每組100個微球體/μL之最終濃度，製備工作微球體混合物(注意：每種反應需50 μL工作微球體混合物)。可使用PBS-1% BSA或PBS-BN(PBS、1% BSA、0.05%疊氮化合物，pH 7.4)作為檢測緩衝液。不使用疊氮化合物。
(iv)於PBS-1% BSA中製備經藻紅蛋白標記的抗物種IgG檢測抗體之兩倍稀釋液，濃度為4至0.0625 μg/mL(注意：每種反應需50 μL稀釋檢測抗體)。
(v)每孔使用100 μL PBS-1% BSA預先沾濕1.2 μm微孔濾 板，藉由真空歧管抽吸。
(vi)將等分50 μL工作微球體混合物加至濾板之合適孔中。
(vii)將50 μL稀釋檢測抗體加至濾板之合適孔中。
(viii)使用多通道移液器上下移動數次輕輕混合反應物。
(ix)蓋上濾板，並在平板振盪器上，於室溫下培養30分鐘。(進行1.5小時)
(x)藉由真空歧管抽吸上清液。
(xi)使用100 μL PBS-1% BSA清洗孔兩次，並藉由真空歧管抽吸。
(xii)藉由使用多通道移液器輕輕地上下移動5次，將微球體再次懸浮於100 μL PBS-1% BSA中。
(xiii)根據系統使用手冊，在Luminex分析器上分析50-75 μL懸浮液。
上述多重檢測方式非常可靠。再次單獨檢測樣品時，得到實質上形同的結果。監測珠粒組，以確保每種黏結蛋白-抗原融合蛋白質之等量負載，由此可直接比較類似抗原之效價(例如，PR8之HA-1相對於H1N1豬流感之HA-1)。若分別檢測相關抗原時之交叉反應抗原之數據相同，則證實可採用此多重形式導出此數據。
此外，在檢測法期間不會在珠粒組之間檢測到黏結蛋白-抗原之交換作用。錨定蛋白-黏結蛋白結合性需要8M胍才能破壞交互作用，且可抵抗強酸及強鹼條件。本文所述之檢測法比使用相同抗原之標準固相ELISA敏感至少10倍。圖2比較由珠粒檢測法或習知使用商業試劑之ELISA 所得到之患者血清HIV Gag p24-特異性抗體效價。圖3顯示由本發明珠粒檢測法測試健康供體內流感抗原-特異性IgG濃度。血清連續稀釋液一般從1：10開始，總共使用20 μl血清。由於抗原係經由錨定蛋白-黏結蛋白交互作用偶聯至珠粒，故所有抗原之抗原決定基均可用於結合抗體，不受非特異性分析板之結合性或化學交聯效應之影響。
重組人類IgG-黏結蛋白融合蛋白質可作為檢測法之內標物。例如，供開展並執行流感抗原M1(PR8)、NP(PR8、H1N1豬流感、H1N1禽流感)、M2e(PR8、H1N1豬流感)、HA-1(PR8、H1N1禽流感、H1N1豬流感及季節性流感株)之抗原-特異性檢測法。已針對所有此等包括來自新型季節性流感株之HA-1蛋白質之抗原建立純蛋白質及大腸桿菌(E.coli )表現構築體或穩定轉染之CHO-S細胞株，同時驗證有效之純化法。
在另一實例中，可在多重珠粒檢測法範圍內完成同型-特異性抗原-特異性檢測法。現行標準檢測法型態係使用泛抗-IgG Fc試劑(偶聯至PE，供讀取螢光值)來檢測已結合之抗體。擷用市售同型-特異性檢測試劑(例如，抗-IgM-PE、抗-IgA-PE)，本發明有能力檢測Ig亞類-特異性抗體。為此，本發明者已將各同型之H鏈恆定區系統性移植到相同可變區(例如來自已存在之抗人類CD40抗體構築體)以製備一組重組抗體。此等試劑可以組裝具有相同抗原特異性之經完全匹配的抗體塗佈之多重珠粒組(例如，以黏結蛋白-CD40胞外域融合蛋白質塗佈珠粒，接著利用各同型之 抗-CD40抗體達到飽和結合度)。這樣可靈敏且準確地評估新穎同型-特異性檢測試劑，並確保其品質。已發現，市售同型-特異性檢測試劑品質不一，故本發明模式可嚴格控制此等用於交叉反應之試劑之品質。
基於已在上文中成功發展用於抗原-特異性多重珠粒檢測法之同組黏結蛋白-抗原與CBD-錨定蛋白試劑，本發明可定量抗原特異性血液B細胞。而且不需要製備新穎蛋白質試劑。
圖4中顯示用於捕捉及檢測抗原-特異性B細胞之試劑。可使用呈現黏結蛋白-抗原融合蛋白質(Ag-1)之珠粒，從活體外樣品富集抗原-特異性B細胞，同時經由抗生物鏈黴素-藻紅蛋白(SA-PE)：生物素-CBD-Doc：黏結蛋白-抗原複合物所組裝之抗原四聚物可用於流式細胞儀，以篩選或定量抗原-特異性B細胞。抗原-珠粒複合物亦可在塗佈生物素之不同Q點上組裝，允許可能發展若干抗原-特異性B細胞種類之多重流動分析法。另外，針對每種特異性來混合四聚物(但有兩種不同顏色)之組合策略[Newell等人，Nature Methods 6 ,497-499(2009)]可方便應用於吾等之抗原四聚物，以減少背景染色，並增加可同時檢測之抗原之數量。
圖5證實本發明使用由可識別細胞表面上所表現受體之黏結蛋白-錨定蛋白組成之四聚物之方法。圖5中所示之曲線係來自感染流感之非人類靈長動物之抗原-特異性血清抗體之以珠粒為主之多重檢測法。呈現三種不同HA抗 原，以及M1、M2胞外域、NP及NA。
圖5證實以珠粒為主之多重檢測法同時測量抗原-特異性效價(藉由限制稀釋法，或最高稀釋法，以產生可量測反應)以及交叉反應之能力。例如，該血清包含高效價之HA1(豬流感)特異性抗體(以綠色正方形表示)(此動物感染豬流感，且在感染前沒有檢測到抗-流感抗原抗體)，而與不同HA1發生交叉反應之抗體之較低效價則以紅色顯示。FI平頂期亦顯示抗體反應之複雜性(一種更複雜的反應，其反映抗原上結合更大量抗原決定基)。
圖6A-6C提供多重珠粒抗原-特異性IgG檢測法之實例。在圖6A中，稀釋來自感染流感猴子之血清樣品，並與經與各種流感蛋白質NP5、核蛋白質；來自PR8株血球凝集素之HA1 PR8、HA1域；來自豬流感株(CAL04)血球凝集素之HA1 SF、HA1域；來自H3流感株血球凝集素之HA3、HA1域；來自PR8之M2蛋白質之M2e、胞外域；M1、基質蛋白質1；Coh、不帶抗原之黏結蛋白等融合之黏結蛋白塗佈之珠粒組混合。圖6B及6C比較接種含來自PR8之HA1疫苗之前(圖6B)及之後(圖6C)之猴子血清。
C191 Ecoli-pET28[6xHis-CBD-錨定蛋白]ATG GGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGTGGCAATGCAACACCGACCAAGGGAGCAACACCAACAAATACAGCTACGCCGACAAAATCAGCTACGGCTACGCCCACCAGGCCATCGGTACCGACAAACACACCGACAAACACACCGGCAAATACACCGGTATCAGG CAATTTGAAGGTTGAATTCTACAACAGCAATCCTTCAGATACTACTAACTCAATCAATCCTCAGTTCAAGGTTACTAATACCGGAAGCAGTGCAATTGATTTGTCCAAACTCACATTGAGATATTATTATACAGTAGACGGACAGAAAGATCAGACCTTCTGGTGTGACCATGCTGCAATAATCGGCAGTAACGGCAGCTACAACGGAATTACTTCAAATGTAAAAGGAACATTTGTAAAAATGAGTTCCTCAACAAATAACGCAGACACCTACCTTGAAATAAGCTTTACAGGCGGAACTCTTGAACCGGGTGCACATGTTCAGATACAAGGTAGATTTGCAAAGAATGACTGGAGTAACTATACACAGTCAAATGACTACTCATTCAAGTCTGCTTCACAGTTTGTTGAATGGGATCAGGTAACAGCATACTTGAACGGTGTTCTTGTATGGGGTAAAGAACCCGGTGGCAGTGTAGTACCATCAACACAGCCTGTAACAACACCACCTGCAACAACAAAACCACCTGCAACAACAAAACCACCTGCAACAACAATACCGCCGTCAGATGATCCGAATGCAGCTAGCAATTCTCCTCAAAATGAAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTCCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACGCAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATTTGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATATAA (SEQ ID NO：3)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASGNATPTKGATPTNTATPTKSATATPTRPSVPTNTPTNTPANTPVSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGOKDOTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEP GAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTKPPATTIPPSDDPNA ASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO：4)
SEQ ID NO：3表示纖維素結合域-錨定蛋白域融合蛋白質，其係高效表現在大腸桿菌(E.coli)中之充足且可溶性之胞內蛋白質[使用pET28載體系統]。下劃綫區域為GENE ID：4809951 Cthe_3077 |纖維質體錨定蛋白質，黏結蛋白區域[熱纖梭菌ATCC 27405]殘基322-561；以粗體字表示之殘基為sp|P0C2S4.1|GUND_CLOTM記錄名：全名=內切葡聚糖酶D殘基551-625。
為生產該蛋白質，使大腸桿菌(E.coli) 菌株之pET28[6xHis-CBD-錨定蛋白]質體在L培養基中生長至對數生長中期，使用IPTG誘導~3小時，接著藉由離心法收集。在含1 mM EDTA及標準蛋白酶抑制劑混合液之50 mM Tris.HCl pH 7.5緩衝液中，藉由(例如)超音波破碎細胞，接著藉由離心澄清(SS34轉子，14,500 r.p.m.20分鐘)。使上清液通過Q瓊脂糖，調整至50 mM NaH2 PO4 ，pH 8.0；300 mM NaCl；10 mM咪唑，接著負載至帶Ni++ 金屬螯合管柱，使用50 mM NaH2 PO4 ，pH 8.0；300 mM NaCl；20 mM含0.5% ASB14之咪唑緩衝液清洗，降低LPS濃度，接著以達50 mM NaH2 PO4 ,pH 8.0；300 mM NaCl；250 mM咪唑之梯度洗脫。混合含洗脫蛋白質之溶離份，並將緩衝 液換成10 mM硼酸鹽pH 7.4。此蛋白質保留黏結蛋白結合活性及(可能)纖維素結合活性。
本發明亦可修飾為多重蛋白質排列格式。例如，使用Versatile protein microarray based on carbohydrate-binding modules.Proteomics 2005,5,1806-1814 中所述之修飾方法。此時，簡單地將黏結蛋白-抗原蛋白質墨點在預先塗佈含錨定蛋白域之蛋白質之表面上，其與表面係化學性交聯，或者，若為CBD.Doc，則藉由非共價方式附接至塗佈纖維素之表面。
表1呈現一系列由本發明者在大腸桿菌(E.coli) 或哺乳動物細胞系統中成功表現之黏結蛋白-抗原融合蛋白質實例。由於黏結蛋白部分健全，且可在哺乳動物細胞中作為功能性表現之分泌產物，或者可為大腸桿菌(E.coli) 之可溶性或再折叠之產物，由此帶來多樣性，因為可選擇充足表現及適當折叠之抗原融合對象之最佳系統。下文亦呈現與黏結蛋白-抗原融合蛋白質對應之序列。
自身抗原：Ecoli-pET28[Cohesin-hGadB-6xHis]C914 MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGLDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDALEASQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNFLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPNAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAYGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDKHHHHHH(SEQ ID NO：5)
細菌：Ecoli-pET28[6xHis-Cohesin-Flgn-1-Flgn-2]C1036 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQASQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNS AITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQAS(SEQ ID NO：6)
細菌毒素：Ecoli-pET28[Cohesin-P.aeruginosaPE38]C340 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：7)
癌症：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-hADH3]C1328 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASELEVRRVRQAFLSGRSRPLRFRLQQLEALRRMVQEREKDILTAIAADLCKSEFNVYSQEVITVLGEIDFMLENLPEWVTAKPVKKNVLTMLDEAYIQPQPLGVVLIIG AWNYPFVLTIQPLIGAIAAGNAVIIKPSELSENTAKILAKLLPQYLDQDLYIVINGGVEETTELLKQRFDHIFYTGNTAVGKIVMEAAAKHLTPVTLELGGKSPCYIDKDCDLDIVCRRITWGKYMNCGQTCIAPDYILCEASLQNQIVWKIKETVKEFYGENIKESPDYERIINLRHFKRILSLLEGQKIAFGGETDEATRYIAPTVLTDVDPKTKVMQEEIFGPILPIVPVKNVDEAINFINEREKPLALYVFSHNHKLIKRMIDETSSGGVTGNDVIMHFTLNSFPFGGVGSSGMGAYHGKHSFDTFSHQRPCLLKSLKREGANKLRYPPNSQSKVDWGKFFLLKRFNKEK(SEQ ID NO：8)
癌症：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-hHomosapienssyndecanbindingprotein]C1327 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASSLYPSLEDLKVDKVIQAQTAFSANPANPAILSEASAPIPHDGNLYPRLYPELSQYMGLSLNEEEIRANVAVVSGAPLQGQLVARPSSINYMVAPVTGNDVGIRRAEIKQGIREVILCKDQDGKIGLRLKSIDNGIFVQLVQANSPASLVGLRFGDQVLQINGENCAGWSSDKAHKVLKQAFGEKITMTIRDRPFERTITMHKDSTGHVGFIFKNGKITSIVKDSSAARNGLLTEHNICEINGQNVIGLKDSQIADILSTSGTVVTITIMPAFIFEHIIKRMAPSIMKSLMDHTIPEV(SEQ ID NO：9)
癌症：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-hLOC552889]C1326 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASEEISLANLDTNKLEAIAQEIYVDLIEDSCLGFCFEVHRAVKCGYFYLEFAETGSVKDFGIQPVEDKGACRLPLCSLPGEPGNGPDQQLQRSPPEFQ(SEQ ID NO：10)
癌症：Ecoli-pET28[Cohesin-hCyclinB1-v1-6xHis]C708 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLEPEPEPEPEPVKEEKLSPEPILVDTASPSPMETSGCAPAEEDLCQAFSDVILAVNDVDAEDGADPNLCSEYVKDIYAYLRQLEEEQAVRPKYLLGREVTGNMRAILIDWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKKMLQLVGVTAMFIASKYEEMYPPEIGDFAFVTDNTYTKHQIRQMEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDYDMVHFPPSQIAAGAFCLALKILDNGEWTPTLQHYLSYTEESLLPVMQHLAKNVVMVNQGLTKHMTVKNKYATSKHAKISTLPQLNSALVQDLAKAVAKVHHHHHH(SEQ ID NO：11)
癌症：Ecoli-pET28[Cohesin-hCyclinB1-v4-6xHis]C736 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDS GTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLEMALRVTRNSKINAENKAKINMAGAKRVPTAPAATSKPGLRPRTALGDIGNKVSEQLQAKMPMKKEAKPSATGKVIDKKLPKPLEKVPMLVPVPVSEPVPEPEPEPEPEPVKEEKLSPEPILVDTASPSPMETSGCAPAEEDLCQAFSDVILAVNDVDAEDGADPNLCSEYVKDIYAYLRQLEEEQAVRPKYLLGREHHHHHH(SEQ ID NO：12)
癌症：Ecoli-pET28[Cohesin-hCyclinD1-6xHis]C515 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLEMEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCVQKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELLLVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMVAAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDIHHHHHH(SEQ ID NO：13)
癌症：Ecoli-pET28[Cohesin-hgp100-PeptideA-6xHis]C180 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANND LVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAARSAFTIMDQVPFSVSVSASRKGAAALEHHHHHH(SEQ ID NO：14)
癌症：Ecoli-pET28[Cohesin-hMART-1-PeptideB-6xHis]C181 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAARTAEELAGIGILTVILGASRKGAAALEHHHHHH(SEQ ID NO：15)
癌症：Mam-cetHS-puro[SLAML-6xHis-Cohesin-hNY-ESO-1-6xHis]C1179 LDITSHHHHHHDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRRHHHHHH(SEQ ID NO：16)
癌症：Mam-cetHS-puro[SLAML-6xHis-Cohesin-hPSA]C1163 LDITSHHHHHHDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVE VGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASDTTEPATPTTPVTTPTTTLLAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO：17)
癌症：Mam-cetHS-puro[SLAML-COHESIN-hSurvivin-6xHis]C875 LDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDALEMGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMDHHHHHH(SEQ ID NO：18)
癌症：Mam-pCDM8[SLAML-Cohesin-hGp100]C294 GLDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDALEKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTI INGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAPVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO：19)
對照：Ecoli-pET28[Cohesin-6xHis]C21 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASMTGGQQMGRDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH(SEQ ID NO：20)
對照：Ecoli-pET28[Cohesin]C189 MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASMTGGQQMGRDPNSSLRPHSSTTTTTTEIRLLTKPERKLSWLLPPLS NN(SEQ ID NO：21)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-HCV-NS5B-Palm]C1843 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASVLDSHYQDVLKEVKAAASKVKANALYDVVSKLPLAVMGSSYGFQYSPGQRVEFLVQAWKSKKTPMGFSYDTRCFDSTVTESDIRTEEAIYQCCDLDPQARVAIKSLTERLYVGRCRASGVLTTSCGNTLTCYIKARAACRAAGLQDCTMLVCGDDLVVICESAGVQEDAASLRAFTEAMTRYSAPPGDPPQPEYDLELITAS(SEQ ID NO：22)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-HCV-NS5B(1+2)]C1641 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASSMSYSWTGALVTPCAAEAALVYSTTSRSACQRQKKVTFDRLQVLDSHYQDVLKEVKAAASKVKANLLSVEEACSLTPPHSAKSKFGYGAKDVRCHARKAVNHINSVWKDLLEDSVTPIDTTIMAKNEVFCVQPEKGGRKPARLIVFPDLGVRVCEKMALYDVVSKLPLAVMGSSYGFQYSPGQRVEFLVQA WKSKKTPMGFSYDTRCFDSTVTESDIRTEEAIYQCCDLDPQARVAIKSLTERLYVGGPLTNSRGENCGYRRCRASGVLTTSCGNTLTCYIKARAACRAAGLQDCTMLVCGDDLVVICESAGVQEDAASLRAFTEAMTRYSAPPGDPPQPEYDLELITSCSAS(SEQ ID NO：23)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-hHCVE1b]C1920 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASVGQLFTFSPRRHWTTQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNWSPTTAVVAQLLRIPQAILDMIAGAS(SEQ ID NO：24)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-hHCVE2]C1923 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASETHVTGGSAARTTAGLAGLFTPGAKQNIQLINTNGSWHINRTALNCNDSLNTGWVAGLFYYHKFNSSGCPERLASCRPLTDFDQGWGPISYANGSGPDQRPYCWHYPPKPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYNWGENDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVG NNTLHCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCLVDYPYRLWHYPCTINYTIFKIRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTQWQVLPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSSIASWAIKWEYVVLLFLLAS(SEQ ID NO：25)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-ViralHCVprotease]c1662 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASAPITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQIVSTAAQTFLATCINGVCWTVYHGAGTRTIASPKGPVIQMYTNVDQDLVGWPAPQGARSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVENLETTMRSPVFTDNSSPPAVPQSASSTOPEFAA(SEQ ID NO：26)
C型肝炎病毒：Ecoli-pET28[CthermoCohesin-ViralHCVhelicase]C1664 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITT GSPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDATSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSTTGEIPFYGKAIPLEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLVALGINAVAYYRGLDVSVIPTSGVVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTLPQDAVSRTQRRGRTGRGKPGIYRFVAPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVCQDHLEFWEGVFTGLTHIDAHFLSQTKQSGENLPYLVAYQATVCARAQAPPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKYIMTCMSADLEVVTAAALEHHHHHH(SEQ ID NO：27)
HIV：Ecoli-pET28[6xHis-Cohesin-Pep-gag17]C1079 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVAS(SEQ ID NO：28)
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結核病：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-m.tbMtb72f]C2236 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKV KEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASTAASDNFQLSQGGQGFAIPIGQAMAIAGQIRSGGGSPTVHIGPTAFLGLGVVDNNGNGARVQRVVGSAPAASLGISTGDVITAVDGAPINSATAMADALNGHHPGDVISVTWQTKSGGTRTGNVTLAEGPPAEFMVDFGALPPEINSARMYAGPGSASLVAAAQMWDSVASDLFSAASAFQSVVWGLTVGSWIGSSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGQAELTAAQVRVAAAAYETAYGLTVPPPVIAENRAELMILIATNLLGQNTPAIAVNEAEYGEMWAQDAAAMFGYAAATATATATLLPFEEAPEMTSAGGLLEQAAAVEEASDTAAANQLMNNVPQALQQLAQPTQGTTPSSKLGGLWKTVSPHRSPISNMVSMANNHMSMTNSGVSMTNTLSSMLKGFAPAAAAQAVQTAAQNGVRAMSSLGSSLGSSGLGGGVAANLGRAASVGSLSVPQAWAAANQAVTPAARALPLTSLTSAAERGPGQMLGGLPVGQMGARAGGGLSGVLRVPPRPYVMPHSPAAGDIAPPALSQDRFADFPALPLDPSAMVAQVGPQVVNINTKLGYNNAVGAGTGIVIDPNGVVLTNNHVIAGATDINAFSVGSGQTYGVDVVGYDRTQDVAVLQLRGAGGLPSAAIGGGVAVGEPVVAMGNSGGQGGTPRAVPGRVVALGQTVQASDSLTGAEETLNGLIQFDAAIQPGDSGGPVVNGLGQVVGMNTAAS(SEQ ID NO：73)
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結核病：Ecoli-pET28[6xHis-CthermoCohesin-m.tbRv0475]C2199 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASCSCMAENSNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRVEESRARLTKLQEDLPEQLTELREKFTAEELRKAAEGYLEAATSRYNELVERGEAALERLRSQQSFEEVSARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPKKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQKCSC(SEQ ID NO：75)
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預計此說明書中所論及之任何實施例可採用本發明任何方法、套組、試劑或組合物進行，反之亦然。另外，可採用本發明組合物實現本發明方法。
應瞭解，本文所述之特定實施例係以說明方式顯示，並非限制本發明。各實施例中可使用本發明主要特徵，不脫離本發明範圍。熟悉此技術者僅使用常規實驗將認知或可確認本文所述特定程序之許多相等物。此等相等物視為在本發明範圍內，且涵蓋在技術方案中。
本說明書中所有提到的公開案及專利申請案係顯示熟習本發明相關技術者之技術層面。所有公開案及專利申請案係以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別地將各個公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。
單字「一個」或「一種」之使用，在技術方案及/或說明書中與術語「包括(包含)」連用時，可意指「一個(種)」，但其亦與「一或多個(種)」、「至少一個(種)」及「一或多於一個(種)」之涵義一致。術語「或」之使用，除非明確表示僅指替代物或者替代物相互排斥，否則在技術方案中係指「及/或」，儘管本文支持僅指替代物及「及/或」之定義。在本申請案全文中，術語「約」係用以表示一數值包括測量該數值所用裝置、方法之固有誤差，或存在於研究對象中之差異。
如本說明書及技術方案中所用，單字「包含(comprising)」(及包含(comprising)之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有(having)之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括(including)之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有(containing)之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)係總括或開放式，且不排除額外之未列舉要素或方法步驟。
如本文所用，術語「或其組合」係指該術語前面所列項之所有排列及組合。例如，「A、B、C或其組合」意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC之至少一者，且若在特定文中順序重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。仍以該例說明，特別包括含有一或多項或術語重複之組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟悉此技術者將瞭解，除非由文中明顯可見，否則項目或術語之任何組合之數量並無限制。
在不需要過度實驗的情況下，可按照本發明製作並實施本文所有所揭示及主張之組合物及/或方法。雖然本發明組合物及方法已依據較佳實施例描述，但熟習此項技術者將明白，可不脫離本發明之理念、精髓及範圍下對組合物及/或方法以及本文所揭示之步驟或步驟之順序進行更動。所有此等對熟習此項技術者顯而易見之類似替代及修 飾皆認為係在如隨附申請專利範圍中所定義之本發明精 髓、範圍及理念內。
參考文獻
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美國專利申請公開案第2011/0151538號：Affinity Purification by Cohesin-Dockerin Interaction。
圖1A及1B顯示，黏結蛋白及錨定蛋白係來自纖維素-降解細菌之蛋白質模組，其以高親和力(KD ~30 pM)進行非共價性結合。在圖1A中，一組多達100個不同螢光微球體(例如，Luminex®珠粒)與融合錨定蛋白之纖維素-結合域(CBD-Doc)化學性交聯。每種黏結蛋白-抗原融合蛋白質與一種特定顏色的CBD-Doc珠粒混合(例如，珠粒區域21)。清洗珠粒並與同樣經其他所需黏結蛋白-抗原融合蛋白質塗佈之CBD-Doc珠粒彙集。在圖1B中，使用每種血清樣品之連續稀釋液培養珠粒-抗原組、清洗、使用(例如)抗人類IgG-PE共軛物培養、再次清洗，接著在流式細胞儀中讀數，測量與每種珠粒顏色相關之螢光強度；圖2為使用以珠粒為主的檢測法及標準ELISA比較血清抗-Gag p24之檢測法。上面三小圖為使用經黏結蛋白-Gag p24塗佈之珠粒檢測來自三位個體之免疫前血清(橙色)及免疫血清(藍色)之連續稀釋液。下面三小圖為使用經黏結蛋白-Gag p24塗佈之分析板之標準ELISA檢測相同樣品。以珠粒為主的檢測法之靈敏度始終高10倍；圖3代表使用本發明以珠粒為主的多重檢測法之血清抗-流感抗原-特異性抗體分析。稀釋來自四個正常供體之血清樣品。此為使用顯示抗原M1(PR8)、HA1-1(PR8)及HA1-1(HA5、禽類H1N1以及流感NP、禽類H1N1)之珠粒之多重檢測法。包括僅顯示黏結蛋白之珠粒，以定義非-特異性背景值。所有供體均未檢測到與H1N1禽類流感HA1-1結合之抗體；圖4中代表用於捕捉及檢測抗原-特異性B細胞之試劑。可使用呈現黏結蛋白-抗原融合蛋白質(Ag-1)之珠粒富集活體外樣品中之抗原-特異性B細胞量，同時可於流式細胞儀中使用由抗生物鏈黴素蛋白-藻紅蛋白(SA-PE)：生物素-CBD-Doc：黏結蛋白-抗原複合物所組成之抗原四聚物，以篩選或定量抗原-特異性B細胞。抗原-珠粒複合物亦可在塗佈生物素之不同Q點上組裝，容許其可能發展若干抗原-特異性B細胞種類之多重流動分析。另外，對應每種特異性之混合四聚物(有兩種不同顏色)之組合策略[Newell等人，Nature Methods 6 ,497-499(2009)]可方便應用於吾人抗原四聚物，以減少背景染色，並增加可同時檢測之抗原之數量；圖5為來自感染流感之非人類靈長動物之抗原-特異性血 清抗體之以珠粒為主之多重檢測法實例。呈現三種不同HA抗原，以及M1、M2胞外域、NP及NA；及圖6A-6C提供多重珠粒抗原-特異性IgG檢測法實例。在圖6A中，稀釋來自感染流感之猴子之血清樣品，並與經與各種流感蛋白質NP5、核蛋白質；來自PR8株血球凝集素之HA1 PR8、HA1域；來自豬流感株(CAL04)血球凝集素之HA1 SF、HA1域；來自H3流感株血球凝集素之HA3、HA1域；來自PR8 M2蛋白質之M2e、胞外域；M1、基質蛋白質1；Coh、不帶抗原之黏結蛋白融合之黏結蛋白等塗佈之珠粒組混合。圖6B及6C比較接種含來自PR8之HA1之疫苗之前(圖6B)及之後(圖6C)之猴子血清。
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<223> 合成肽
<400> 13
<210> 14
<211> 204
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
<210> 15
<211> 204
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
<210> 16
<211> 398
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
<210> 17
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
<210> 18
<211> 321
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
<210> 19
<211> 750
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
<210> 20
<211> 202
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
<210> 21
<211> 220
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
<210> 22
<211> 397
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
<210> 23
<211> 548
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
<210> 24
<211> 260
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
<210> 25
<211> 539
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
<210> 26
<211> 400
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
<210> 27
<211> 641
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
<210> 28
<211> 216
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
<210> 29
<211> 229
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
<210> 31
<211> 229
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
<210> 32
<211> 228
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
<210> 33
<211> 316
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
<400> 33
<210> 34
<211> 391
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
<210> 35
<211> 385
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
<210> 36
<211> 317
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
<210> 37
<211> 256
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
<210> 38
<211> 504
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
<210> 39
<211> 264
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
<210> 40
<211> 378
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
<210> 41
<211> 379
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
<210> 42
<211> 310
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
<210> 43
<211> 523
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
<210> 44
<211> 516
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
<210> 45
<211> 626
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
<210> 46
<211> 430
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
<210> 47
<211> 512
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
<210> 48
<211> 676
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
<210> 49
<211> 512
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
<210> 50
<211> 504
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
<210> 51
<211> 689
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
<210> 52
<211> 262
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
<210> 53
<211> 687
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
<210> 54
<211> 518
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
<210> 55
<211> 209
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
<210> 56
<211> 209
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
<210> 57
<211> 517
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
<210> 58
<211> 682
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
<210> 59
<211> 517
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
<210> 60
<211> 285
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
<210> 61
<211> 421
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
<210> 62
<211> 390
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
<210> 63
<211> 314
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
<210> 64
<211> 295
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
<210> 65
<211> 550
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
<210> 66
<211> 887
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
<210> 67
<211> 763
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
<210> 68
<211> 400
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
<210> 70
<211> 554
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
<210> 71
<211> 588
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
<210> 72
<211> 479
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 917
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
<210> 74
<211> 291
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 400
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
<210> 76
<211> 403
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 76

Claims (50)

  1. 一種用於檢測、分離或純化樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種分析物之方法，該方法包含：取得包含黏結蛋白(cohesin)-錨定蛋白(dockerin)結合對之第一成員之固體基材，其中該第一成員係附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段，其中該固體基材係選自由下列組成之群：珠粒、細胞、細胞外基質、纖維基質、容器、晶片(chip)、親和管柱及其任何組合；提供黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第二成員，其中該第二成員係存在於樣品、基質、混合物或其任何組合，其中該第二成員可以結合樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種待檢測、待分離或待純化的分析物；使該黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第二成員與疑似具有分析物之樣品、基質或混合物接觸；及在該基材上形成複合物，其包含黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第一及第二成員與該分析物，其中檢測分析物之存在。
  2. 如請求項1之方法，進一步包含：向複合物添加檢測試劑，以確定存在或不存在分析物，其中檢測試劑包含第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合。
  3. 如請求項2之方法，其中該檢測試劑為該第二成員之一 部分。
  4. 如請求項1之方法，其中該分析物包含核酸(天然及非天然、適體(aptamers))、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素或脂質。
  5. 如請求項1之方法，其中該第一成員包含錨定蛋白域，該第二成員包含結合至該分析物之黏結蛋白域。
  6. 如請求項1之方法，其中該第一成員包含黏結蛋白域，該第二成員包含結合至該分析物之錨定蛋白域。
  7. 如請求項1之方法，其中該第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，該分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。
  8. 如請求項1之方法，其中該方法係進一步定義為在包含燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿(petri dish)、培養皿或多孔板或晶片之容器中進行。
  9. 如請求項1之方法，其中該基材包含一或多組珠粒，其中珠粒包含奈米球、奈米粒子、微球體、微粒子、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。
  10. 如請求項9之方法，其中該一或多組珠粒包含聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚 苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯(polylactide)、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮(polyphosophaze)、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)、合成聚合物聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳及其任何組合或修飾物。
  11. 如請求項1之方法，其中該一或多種分析物包含一或多種抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列、或酶或其任何組合，其中該等抗原包含一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原、或其任何組合。
  12. 如請求項1之方法，其中該錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。
  13. 如請求項1之方法，其中該黏結蛋白可為經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。
  14. 如請求項1之方法，其中該黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌(Clostridium thermocellum )、解纖維梭菌(C.cellulolyticum )、嗜纖維梭菌(C.cellulovorans )、溶紙梭菌(C.papyrosolvens )及產纖維二糖芽孢梭菌(Clostridium cellobioparum )、溶紙梭菌(C.papyrosolvens) 、約氏梭菌(C.josui )、解纖維醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus )、溶纖維擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens )、黃色瘤胃球菌(R.flavefaciens )、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus )、嗜超高溫古生菌(Archaeoglobus fulgidus )蛋白質、或纖維質體黏結蛋白域。
  15. 分離或純化樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種分析物之以多重珠粒為主的方法，該方法包含：提供一、多個或一組珠粒，包含奈米球、奈米粒子、微球體、微粒子、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒；將黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第一成員附接至該等珠粒，其中該第一成員係附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段； 提供至少一種黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第二成員，第二成員係附接至樣品、基質、混合物或其任何組合中一或多種待檢測、待分離或待純化之分析物；使黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第一成員與包含第二黏結蛋白-錨定蛋白結合對之樣品、基質或混合物接觸；及形成包含至少一種黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第二成員附接至至少一種黏結蛋白-錨定蛋白結合對之第一成員之複合物。
  16. 如請求項15之方法，進一步包含：向該複合物添加檢測試劑，以確定存在或不存在該分析物，其中檢測試劑包括第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合；藉由一或多種物理或化學方法自該複合物釋放包含該分析物之第二成員；及自包含黏結蛋白、錨定蛋白、蛋白質、抗原、肽、抗體或其任何組合之混合物中分離該分析物。
  17. 如請求項16之方法，其中該檢測試劑為該第二成員之一部分。
  18. 如請求項15之方法，其中該分析物包含核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素或脂質。
  19. 如請求項15之方法，其中該第一成員包含錨定蛋白域，該第二成員包含結合至該分析物之黏結蛋白域。
  20. 如請求項15之方法，其中該第一成員包含黏結蛋白域， 該第二成員包含結合至該分析物之錨定蛋白域。
  21. 如請求項15之方法，其中該第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，該分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。
  22. 如請求項15之方法，其中該一或多組珠粒包含聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)、合成聚合物聚苯乙 烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳及其任何組合或修飾物。
  23. 如請求項15之方法，其中該一或多種分析物包含一或多種抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列或酶或其任何組合，其中該等抗原包含一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原或其任何組合。
  24. 如請求項15之方法，其中該錨定蛋白係選自I錨定蛋白域、II錨定蛋白域、III錨定蛋白域、經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。
  25. 如請求項15之方法，其中該黏結蛋白可為I型黏結蛋白、II型黏結蛋白、III型黏結蛋白、經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。
  26. 一種檢測系統，其包含：基材及至少一種結合至該基材之錨定蛋白-黏結蛋白結合對之附接或固定第一成員，及錨定蛋白-黏結蛋白結合對之第二成員附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段。
  27. 如請求項26之檢測系統，其中該基材包含一或多個珠粒。
  28. 如請求項26之檢測系統，其中該基材包含奈米球、奈米粒子、微球體、微粒子、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒 子、帶色粒子或帶色珠粒。
  29. 如請求項26之檢測系統，其中該分析物包含核酸(天然及非天然、適體)、碳水化合物、多醣、肽、蛋白質或類肽(天然及非天然)、礦物質、維生素或脂質。
  30. 如請求項26之檢測系統，其中該第一成員包含錨定蛋白域，該第二成員包含結合至該分析物之黏結蛋白域。
  31. 如請求項26之檢測系統，其中該第一成員包含黏結蛋白域，該第二成員包含結合至該分析物之錨定蛋白域。
  32. 如請求項27之檢測系統，其中該第二成員包含黏結蛋白或錨定蛋白域，該分析物與黏結蛋白或錨定蛋白域形成融合蛋白質。
  33. 一種在珠粒表面進行免疫檢測之方法，用於同時檢測樣品、基質或混合物中超過一種之分析物，該方法包含以下步驟：在基材上提供一或多個珠粒或多組珠粒，其中該基材係選自由下列組成之群：燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿及多孔板或其任何組合或修飾物；將至少兩個錨定蛋白結合域附接或固定至該珠粒表面，其中該錨定蛋白結合域可附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段；使該具有附接或固定錨定蛋白結合域之珠粒與包含多種所欲分析物之樣品、基質或混合物接觸，其中多種分 析物係附接至一或多種黏結蛋白融合蛋白；在一或多個珠粒表面形成超過一種複合物，其包含附接多種黏結蛋白融合蛋白質之分析物及多重錨定蛋白結合域；向該珠粒添加多種檢測試劑或標記，其中各檢測試劑或標記係對疑似存在於樣品、基質或混合物之多種分析物具特異性並與之結合，檢測試劑包含第二抗體、放射性標記、螢光團、比色試劑或其任何組合；及藉由讀取、監測、或測量檢測試劑或標記與分析物之結合物所發射的訊號，檢測存在或不存在多種分析物。
  34. 如請求項33之方法，進一步包含以下可選步驟：使用適合緩衝液或水，在其中一個免疫檢測步驟或不同步驟之間進行一或多個洗步驟；藉由使用一或多種純分析物或標準物進行免疫檢測，以產生校準曲線或標準曲線，供測定樣品、基質或混合物中多種分析物之濃度或數量；藉由一或多種物理或化學方法，使附接至分析物之黏結蛋白融合蛋白質自複合物釋放；及自包含黏結蛋白、錨定蛋白、蛋白質、抗原、肽、抗體或其任何組合之混合物中分離分析物。
  35. 如請求項33之方法，其中該檢測試劑係該第二成員之一部分。
  36. 如請求項33之方法，其中該基材包含一或多組珠粒，其中珠粒包括奈米球、奈米粒子、微球體、微粒子、奈米 珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。
  37. 如請求項33之方法，其中該一或多組珠粒包含聚合珠粒，其中聚合物係選自由下列組成之群：以碳水化合物為主的聚合物、聚脂族醇、聚(乙烯)聚合物、聚丙烯酸、聚有機酸、聚胺基酸、共聚物、嵌段共聚物、三聚物、聚醚、天然聚合物、聚醯亞胺、表面活性劑、聚酯、分支聚合物、環聚合物、聚醛及其混合物、溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚丙烯醯胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己內酯、聚酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚二甲基矽氧烷、聚異戊二烯、聚胺基甲酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苯甲基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏二氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳交酯、聚乙交酯、聚(乳交酯-共-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷氮、聚-(苯乙烯-共-乙烯苯甲基氯-共-丙烯酸)(85：10：5莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸)(99：1莫耳比)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)(90：10莫耳比)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸-共-間與對-二乙烯基苯)(89：10：1莫耳比)、聚-(苯乙烯-共-丙烯酸2-羧乙酯)(90：10莫耳比)、聚(甲基丙烯酸甲酯-共-丙烯酸)(70：30莫耳比)及聚(苯乙烯-共-丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)(45：45：10重量比)、合成聚合物聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、膠乳或其任何組合或修飾物。
  38. 如請求項33之方法，其中該等珠粒可為自由流動的珠粒或可附接至該固體基材。
  39. 如請求項33之方法，其中該一或多種分析物包含一或多種抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、核酸序列或酶或其任何組合，其中該等抗原包括一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體或原蟲抗原或其任何組合。
  40. 如請求項33之方法，其中該錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。
  41. 如請求項33之方法，其中該黏結蛋白可為經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。
  42. 如請求項33之方法，其中該黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、溶紙梭菌以及產纖維二糖芽孢梭菌、溶紙梭菌、約氏梭菌、解纖維醋弧菌、溶纖維擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、嗜超高溫古生菌蛋白質、或纖維質體黏結蛋白域。
  43. 一種利用一或多個珠粒之親和性純化方法，該方法包含以下步驟：在基材上提供一或多個珠粒或珠粒組，其中基材係選自由下列組成之群：燒杯、燒瓶、量筒、試管、離心管、皮氏培養皿、培養皿及多孔板、管柱或其任何組合或修飾物； 將至少一個錨定蛋白結合域附接或固定至該珠粒表面，其中錨定蛋白結合域可附接至蛋白質、抗體、抗原、肽、毒素、細胞激素、酶、結構蛋白質、細胞外基質蛋白質、細胞或其片段；藉由流動或泵送包含一或多種待純化的分析物之樣品、細胞混合物、發酵培養基、細胞提取液或其任何組合接觸珠粒，其中至少一種待純化的分析物係偶聯或附接至黏結蛋白融合蛋白質；使包含附接黏結蛋白融合蛋白質之分析物與一或多個包含至少一個錨定蛋白結合域之珠粒結合以形成複合物，其中該結合產生包含一或多種不需要的物質或需自其中分離分析物之物質之流經物(flow through)；及藉由一種物理或化學方法或其組合，自複合物釋放所需分析物，其中該等方法包含改變離子強度、添加EDTA、自培養基移除Ca+2 、改變pH、溫度或其任何組合。
  44. 如請求項43之方法，其中該一或多個珠粒係固定至固體基材或管柱填充材料。
  45. 如請求項43之方法，其中該一或多個珠粒或珠粒組係填充於管柱中。
  46. 如請求項43之方法，其中該一或多個珠粒為聚合珠粒，且包含奈米球、奈米粒子、微球體、微粒子、奈米珠粒、微珠粒、珠粒、聚苯乙烯珠粒、膠乳粒子、膠乳珠粒、螢光珠粒、螢光粒子、帶色粒子或帶色珠粒。
  47. 如請求項43之方法，其中該待純化的分析物包含抗原、抗體、自身抗體、肽、蛋白質、融合蛋白質、核酸序列及/或酶，其中該抗原包含一或多種細菌、病毒、真菌、黴漿菌、立克次體、衣原體及/或原蟲抗原。
  48. 如請求項43之方法，其中該錨定蛋白可為經取代的錨定蛋白、截短錨定蛋白、經修飾的錨定蛋白或其任何組合。
  49. 如請求項43之方法，其中該黏結蛋白可為經取代的黏結蛋白、截短黏結蛋白、經修飾的黏結蛋白或其任何組合。
  50. 如請求項43之方法，其中該黏結蛋白係源自或分離自熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、溶紙梭菌以及產纖維二糖芽孢梭菌、溶紙梭菌、約氏梭菌、解纖維醋弧菌、溶纖維擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、嗜超高溫古生菌蛋白質、或纖維質體黏結蛋白域。
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