JP2013256479A - 抗体精製用担体並びにその製造方法及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインA変異体の配列、又はその配列を1〜3個連結した配列であり、該プロテインA変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、pH4.0〜pH5.5の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する]からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体(但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く)。
【選択図】図1
Description
[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジンおよびシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり:
R2部分の配列は、プロテインA由来の固定化対象タンパク質の配列であり、抗体との結合特性を保持するようにリジン残基とシステイン残基を全く含まないようにした配列であり:
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり;
R4部分の配列はシステイン−X(Xは、リジンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列であり:
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり;
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である]
からなるタンパク質を用いて、R4部分に唯一存在するシステイン残基のSH基をシアノ化し、シアノシステイン化したタンパク質を、アミノ基を官能基として導入された不溶性担体と反応させることにより、R1-R2-R3で表される部分が、そのカルボキシ末端が担体のアミノ基とアミド結合により固定化するという特徴を有する配向制御固定化法である。
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
His-His-His-His-His-His
R1(大腸菌での発現開始コドン由来のメチオニン、発現とともにほとんど除去されるため、通常は存在しない):
Met
R2(プロテインAのAドメインのアミノ酸配列を、システイン及びリジンを全く含まないように改変した配列)(配列番号3):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
R3(リンカー配列、システイン及びリジンを全く含まない):
Gly-Gly-Gly-Gly
R4(シアノシステインを介した固定化反応を起こさせる配列):
Cys-Ala
R5(等電点を負にするための配列):
Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R6(精製用タグ配列):
His-His-His-His-His-His
[1] 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり:
R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインA変異体の配列、又はその配列を1〜3個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインA変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、pH4.0〜5.5の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する;
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり;
R4部分の配列はシステイン−X(Xは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列であり:
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり;
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である]
からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体(但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く)。
(a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
(b) R2部分の配列として、プロテインA変異体の配列、又はその配列を1〜3個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインA変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、pH4.0〜5.5の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列を選択し;
(c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し;
(d) R4部分の配列として、システイン−X(Xは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列を選択し;
(e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し;そして
(f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。
本発明の、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中のR2部分の配列は、固定化しようとする固定化対象プロテインAであり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることにより、R2部分が固定化された固定化タンパク質を得ることができる。上記一般式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かうアミノ酸配列を示す。
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Lys
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
AD-6-1のアミノ酸配列(配列番号6):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Glu-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
AD-6-2のアミノ酸配列(配列番号7):
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-His-Ile-Leu-Asn-Val-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Asp-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln
Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
His-His-His-His-His-His
(実施例1)
遺伝子合成
実施例に記載されている遺伝子の合成は、合成遺伝子受託製造業者にて合成を行った。以下に示した塩基配列(配列番号8)にもとづき、dsDNAを合成しpUC18vectorのBamHI-EcoRI siteへの挿入、取得されたクローンについて片鎖解析による配列を確認、塩基配列情報の照合、ミスマッチが確認された部位についてはSite directed mutagenesis等の手法により変異修正を実施、得られた取得したプラスミドDNA(約1μg)が納入された。納入されたプラスミド中の目的部分に関しては、再度シーケンシングにより配列確認を行った。
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCGGATAACAACTTTAACCGCGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGAACATGCCGAACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGGCTTTATTCAGAGCCTGCGCGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAATCTGCTGAGCGAAGCGCGTCGTCTGAATGAAAGCCAGGCGCCGGGCTGTGCGGATGACGACGACGATGATCACCACCATCACCATCATTAAGAATTC
AD-1(アミノ酸配列を配列番号2に示す)を元にしたプロテインAのAドメインのアミノ酸置換は、置換部位のアミノ酸をコードするDNA配列を目的のコドン配列に転換して両方に24塩基ずつ元の配列を持つDNAプライマーとその相補DNAプライマーを用いて、クイックチャンジ法(Stratagene社のQuickChang Site-directed Mutagenesis kitに記載に記載されている方法)に従って行った。
組換えプラスミドを形質転換した大腸菌JM109株を、2Lの培地(20gの塩化ナトリウム、20g酵母エキス、32gのトリプトン、100mgのアンピシリンナトリウムを含んでいる)で、35℃で一晩培養した。その後、培養液を20分間低速遠心(毎分5,000回転)することにより、湿重量3〜5gの菌体を得た。これを20mLの10mMの燐酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、フレンチプレス装置により菌体を破砕した後、20分間高速遠心(毎分20,000回転)することにより、上清を分離した。得られた上清にストレプトマイシン硫酸を最終濃度が2%になるように加え20分間撹拌後、20分間高速遠心(毎分20,000回転)することにより、上清を分離した。この後、硫酸アンモニウム処理を行い、得られた上清をニッケルキレートカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社より購入)にアプライし、洗浄用緩衝液(5mMイミダゾール、20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.4)を20ml以上用いて、カラムを十分洗浄し、洗浄後、溶出用緩衝液(0.5Mイミダゾール、20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.4)を20mlアプライすることにより、目的のタンパク質を溶出した。その後、このタンパク質溶液からイミダゾールを除去するため、5Lの10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に対して透析を行った。透析膜にはMWCO3500(Spectrum Laboratories社より購入)を用いた。透析後、遠心真空乾燥機を用いて目的のタンパク質を乾燥させた。
目的タンパク質の結合特性解析には、表面プラズモン共鳴バイオセンサーであるBiacore(ビアコア社)を用い、ビアコア社の提供するプロトコールに従って解析を行った。
アレイ解析装置を用いた測定は以下のように行った。
各変異型タンパク質をpH7.0の10mMリン酸緩衝液に溶解し、BCA法で濃度を測定し、最終濃度が2mg/mlになるように調整した。約2mg/mlの各タンパク質溶液をアレイ用基板(シリカモノリス多孔質体の薄層)に対して、8行12列の96箇所に1.2mm間隔で0.2μLずつスポットした。その際、1枚のアレイ上に同じ変異型タンパク質を二箇所にスポットし、データの再現性を確認できるようにした。また、比較用タンパク質としてAD-1タンパク質を各行の中2か所にスポットし、変異型タンパク質のデータとAD-1のデータとを比較できるようにした。スポットした後、タンパク質の還元反応、シアノ化反応、シアノシステインを介した配向制御固定化反応、高塩濃度の緩衝液による洗浄、及び残存アミノ基のマスク反応を逐次行うことにより、タンパク質をアレイ用基板に固定化した。
各変異体をスポット固定化したアレイ基板を、アレイ解析装置にセットし、装置の送液系に接続し、以下に記載する解析のための溶液を自動通液しながらアレイに280nmの紫外光を照射し、その透過光をCCDで継時的に撮影しアレイの画像をPCに取り込んでいった。初期化緩衝液(150mM 塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH7.0)、抗体溶液(ヒトポリクローナル抗体を0.2mg/mlになるようにランニング緩衝液で希釈した溶液)、洗浄用緩衝液(1M 塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH7.0)、溶出用緩衝液(0.1M クエン酸ナトリウム、pH5.0)、再生用緩衝液(0.1M グリシン、pH2.5)、各々を0.6ml/minの速さで25分間、この順に通液し、8秒間隔でアレイの画像を継時的に撮影し、画像としてPCに取り込み保存した。
データの解析においては、装置に付属した解析用ソフトフェアを用いて、アレイ画像の中にスポットを自動検出し、スポット領域のピクセルの平均輝度、及び、スポット周辺のピクセルの平均輝度を計算し、その比の対数をスポットのシグナル強度として求めた。この値は、スポット上のタンパク質の量に比例することが確認されている。各スポットのシグナル強度をアレイ基板に対して通液を開始してからの経過時間に対してプロットした。経過時間に対するシグナル強度のプロットから得られる曲線を解析することにより変異体タンパク質の特性を評価した。このシグナル強度の時間経過を求めることにより、抗体が吸着、解離する状況を定量的に解析することができる。
実施例1の結果を元に、さらに、E15H変異に他の1アミノ酸置換変異を行った。付け加える変異としては、M19(配列番号1に示すアミノ酸配列の19番目のメチオニン)とG29(配列番号1に示すアミノ酸配列の29番目のグリシン)の部位の置換変異について検討した。M19は、AD-1中に唯一存在する空気酸化を受けやすいメチオニン残基であり、この部位のアミノ酸置換により、化学的な性質として抗酸化性能が付加されることが期待されるからである。G29の部位は、アレイ解析の結果、pH5.0における溶出特性が改良する変異が期待される部位の一つとして示された部位である。M19の部位ではpH5における溶出のし易さのパラメータであるT0.5が改良された変異として,M19V(19番目のメチオニンのV(バリン)への置換)が、G29の部位では、G29A(29番目のグリシンのA(アラニン)への置換)、G29D(29番目のグリシンのD(アスパラギン酸)への置換及びG29E(29番目のGのE(グルタミン酸への置換)が選択された。結果を表1に示す。
(2)(サンプルアプライ)、サンプルループを用いて、ポリクローナルIgG抗体溶液(1ml)を通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
(3)(洗浄)、10mMリン酸ナトリウムバッファーを10ml通液した後、溶媒切り替えバルブを切り替え、
(4)(溶出)、あらかじめ設定したそれぞれのpHのクエン酸緩衝液を10ml通液し、溶媒切り替えバルブを切り替え、
(5)(再生)、再生用溶液(0.1Mクエン酸溶液)を、10ml通液し、溶媒バルブを切り替え、
(6)(完了)、(1)の10mMリン酸ナトリウムバッファーを10ml通液し、クロマトグラフィーの通液操作を完了した。
図3A、B及びCは、それぞれ図2のAのpH3.0、4.0及び4.5の時のクロマトグラムを示している。図3中、(1)は、pH3.0、4.0又は4.5の溶出液を流した時の溶出ピークを示し、(2)は再生溶液(pH2.5)を流した時の溶出ピークを示す。この(1)と(2)溶出ピークの面積(それぞれ、S1及びS2とする)を用いて、回収率を100*S1/(s1+S2)で計算し、その値を溶出溶液のpHに対してプロットした図が図2である。
シリカゲル(ダイソー株式会社製)50gと3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン10gを水溶媒中還流条件下(95℃)で、4時間反応させ、エポキシ化シリカゲル50gを調製した。
上記で作製した固定化シリカゲルのIgG結合能を以下のようにして測定した。
AD-3のプロテインAのAドメイン固定化担体を5mmφx20mmのガラスカラム(GEHealthcare製、0.4ml)に充填した。様々な接触時間条件下(1.0、2.4、6.0min)で、pH7のリン酸ナトリウムバッファーに溶解させた既知濃度のポリクローナルヒトIgG抗体(オリエンタル酵母製、0.5mg/ml)を負荷させた。その際の破過曲線から10%破過点を算出し、それにより各接触時間毎に以下の動的結合容量(DBC)を得た。なお、この表から静的結合容量は約60mg/mlと推測できた。結果を表2に示す。
Claims (21)
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列
[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列であり:
R2部分の配列は、固定化対象タンパク質であるプロテインA変異体の配列、又はその配列を1〜3個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインA変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、pH4.0〜pH5.5の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する;
R3部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり;
R4部分の配列はシステイン−X(Xは、アラニンであるか、もしくはアラニンとシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列であり:
R5部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり;
R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である]
からなるタンパク質であって、R1-R2-R3で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体(但し、モノリス構造体を有する固定化担体を除く)。 - プロテインA変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインA変異体に抗体を結合させ、pH5.0の0.1Mクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間T0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号3で表されるプロテインA変異体のT0.5及び解離定数よりも低いプロテインA変異体である、請求項1記載の固定化担体。
- プロテインA変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインAのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、請求項1又は2に記載の固定化担体。
- プロテインA変異体が、プロテインAのAドメインの変異体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の固定化担体。
- R2部分の配列が、配列番号4〜7のいずれかの配列からなるプロテインAのAドメインの変異体タンパク質の配列、又は配列番号4〜7のいずれかの配列からなるプロテインAのAドメインの変異体タンパク質の配列を1〜3個連結した配列である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、1級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させるための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R3部分の配列が、1〜10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、アスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数1〜10個の配列であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R5部分の配列が、1〜10個のアスパラギン酸からなる配列であることを特徴とする、請求項8記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列において、R6部分の配列が、4個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 担体がシリカ担体、ガラスビーズ、及びポリマーからなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の固定化担体。
- 一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を担体に静電相互作用により吸着させることを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の固定化担体を作製する方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、1級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させて製造された、プロテインAの変異体が固定化された固定化担体。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在する唯一のシステイン残基のスルフフィドリル基をチオシアノ基に変換し、1級アミンを官能基として有する任意の固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシステイン残基よりアミノ末端側に存在するアミノ酸配列部分であるR1-R2-R3部分をアミド結合により結合させることを含む、請求項12に記載の固定化担体を作製する方法。
- 請求項13記載の固定化担体が充填された、抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラム。
- 請求項15記載の抗体精製用アフィニティークロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液をアプライし、抗体をプロテインA変異体に結合させ、次いで溶出緩衝液により抗体を解離溶出させることを含む、抗体の精製方法。
- 固定化担体にR1-R2-R3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化するために用いる一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計する方法であって、R1、R2、R3、R4、R5及びR6部分のアミノ酸配列を以下の条件に適合するように選択することを含む方法:
(a) R1部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成される配列を選択し;
(b) R2部分の配列として、プロテインA変異体の配列、又はその配列を1〜3個連結した配列であり、リジン及びシステイン残基を含まない配列であり、該プロテインA変異体は、抗体と中性条件で強く結合し、pH4.0〜pH5.5の範囲の弱酸性の条件で、中性条件で結合した抗体と解離するという特性を有する、配列を選択し;
(c) R3部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列を選択し;
(d) R4部分の配列として、システイン−X(Xは、アラニンもしくはシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列を選択し;
(e) R5部分の配列は存在させないか、または存在させる場合はリジン及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式R1-R2-R3-R4-R5-R6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列を選択し;そして
(f) R6部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列を選択する。 - プロテインA変異体が、アレイ基板に固定化したプロテインA変異体に抗体を結合させ、pH5.0の0.1Mクエン酸ナトリウム溶液で溶出したときの結合していた抗体の半分の量が解離するまでの経過時間T0.5及び、抗体との解離定数が、配列番号3で表されるプロテインA変異体のT0.5及び解離定数よりも低いプロテインA変異体である、請求項17記載の方法。
- プロテインA変異体が、Staphylococcus aureus由来のプロテインAのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸を置換したアミノ酸配列からなる変異体である、請求項17又は18に記載の方法。
- プロテインA変異体が、プロテインAのAドメインの変異体である、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- R2部分の配列が、配列番号4〜7のいずれかの配列からなるプロテインAのAドメインの変異体タンパク質、又は配列番号4〜7のいずれかの配列を1〜3個連結した配列からなるプロテインAのAドメインの変異体タンパク質の配列である、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
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